Summary
Настоящий протокол описывает проектирование, изготовление и характеристику микрофлюидной системы, способной выравнивать, обездвиживать и точно сжимать сотни эмбрионов Drosophila melanogaster с минимальным вмешательством пользователя. Эта система позволяет получать изображения с высоким разрешением и восстанавливать образцы для постстимуляционного анализа и может быть масштабирована для размещения других многоклеточных биологических систем.
Abstract
Во время эмбриогенеза скоординированное движение клеток генерирует механические силы, которые регулируют экспрессию и активность генов. Для изучения этого процесса были использованы такие инструменты, как аспирация или компрессия чехла, для механической стимуляции целых эмбрионов. Эти подходы ограничивают экспериментальное проектирование, поскольку они неточны, требуют ручного обращения и могут обрабатывать только пару эмбрионов одновременно. Микрофлюидные системы имеют большой потенциал для автоматизации таких экспериментальных задач при одновременном повышении пропускной способности и точности. В этой статье описывается микрофлюидная система, разработанная для точного сжатия целых эмбрионов Drosophila melanogaster (плодовой мухи). Эта система оснащена микроканалами с пневматически приводимыми деформируемыми боковыми стенками и обеспечивает выравнивание эмбриона, иммобилизацию, компрессию и сбор постстимуляции. Распараллеливая эти микроканалы в семь полос, устойчивые или динамические схемы сжатия могут быть применены к сотням эмбрионов дрозофилы одновременно. Изготовление этой системы на стеклянном крышке облегчает одновременную механическую стимуляцию и визуализацию образцов с помощью микроскопов высокого разрешения. Более того, использование биосовместимых материалов, таких как PDMS, и способность пропускать жидкость через систему делают это устройство способным к долгосрочным экспериментам с образцами, зависящими от среды. Такой подход также устраняет необходимость ручного монтажа, который механически напрягает образцы. Кроме того, возможность быстрого сбора образцов с микроканалов позволяет проводить постстимуляционный анализ, включая омические анализы, которые требуют больших количеств образцов, недостижимых с использованием традиционных подходов механической стимуляции. Геометрия этой системы легко масштабируется для различных биологических систем, что позволяет многочисленным полям извлекать выгоду из функциональных особенностей, описанных в настоящем описании, включая высокую пропускную способность образца, механическую стимуляцию или иммобилизацию и автоматическое выравнивание.
Introduction
Живые системы постоянно испытывают и реагируют на различные механические входы на протяжении всей своей жизни1. Механотрансдукция была связана со многими заболеваниями, включая нарушения развития, потерю мышечной и костной массы, а также невропатологии через сигнальные пути, прямо или косвенно затронутые механической средой2. Однако гены и белки, которые регулируются механической стимуляцией3 в механочувствительных сигнальных путях4, остаются в значительной степени неизвестными5, препятствуя выяснению механизмов механической регуляции и идентификации молекулярных мишеней для заболеваний, связанных с патологической механотрансдукцией 6,7 . Одним из ограничивающих факторов в проецировании механобиологических исследований на связанные физиологические процессы является использование отдельных клеток с обычными культуральными блюдами вместо интактных многоклеточных организмов. Модельные организмы, такие как Drosophila melanogaster (плодовая муха), внесли большой вклад в понимание генов, сигнальных путей и белков, участвующих в развитии животных 8,9,10. Тем не менее, использование дрозофилы и других многоклеточных модельных организмов в механобиологических исследованиях было затруднено проблемами с экспериментальными инструментами. Традиционные методы подготовки, сортировки, визуализации или применения различных стимулов требуют в основном ручных манипуляций; эти подходы отнимают много времени, требуют специальных знаний, вносят вариативность и ограничивают экспериментальный дизайн и размер выборки11. Последние достижения в области микротехнологий являются отличным ресурсом для создания новых биологических анализов с очень высокой пропускной способностью и строго контролируемыми экспериментальными параметрами 12,13,14.
В этой статье описывается разработка усовершенствованного микрофлюидного устройства для выравнивания, иммобилизации и точного применения механической стимуляции в виде одноосного сжатия к сотням целых эмбрионов дрозофилы 15 (рисунок 1). Интеграция микрофлюидной системы со стеклянным чехлом позволила получить конфокальную визуализацию образцов с высоким разрешением во время стимуляции. Микрофлюидное устройство также позволило быстро собирать эмбрионы после стимуляции для проведения анализов -омики (рисунок 2). Объяснения конструктивных соображений этого устройства, а также изготовления с использованием мягкой литографии и экспериментальной характеристики описаны в настоящем документе. Поскольку изготовление силиконовой пластинчатой формы такого устройства требует равномерного покрытия толстого фоторезиста (толщина >200 мкм) на больших площадях с высоким соотношением сторон (AR) траншей (AR >5), этот метод значительно изменил традиционный протокол изготовления фотолитографической формы. Таким образом, этот метод облегчил обработку, адгезию, покрытие, рисунок и развитие фоторезиста. Кроме того, обсуждаются потенциальные подводные камни и их решения. Наконец, универсальность этой стратегии проектирования и изготовления была продемонстрирована с использованием других многоклеточных систем, таких как камеры яйцеклеток дрозофилы и органоиды мозга16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка силиконовой пластинчатой формы
- Очистите кремниевую пластину (см. Таблицу материалов) сначала ацетоном, а затем изопропиловым спиртом (IPA).
- Поместите кремниевую пластину на конфорку при температуре 250 °C в течение 30 минут для обезвоживания (рисунок 3A).
- Покройте кремниевую пластину гексаметилдисилазаном (HDMS) в паровой прайм-печи (см. Таблицу материалов) (температура процесса: 150 °C, рабочее давление: 2 Torr, время процесса: 5 мин, объем HDMS: 5 мкл) (рисунок 3B).
- Поместите бутылку фоторезиста СУ-8 2100 (см. Таблицу материалов) в духовку с температурой 60 °C на 15 мин, чтобы уменьшить ее вязкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: При нагревании в духовке вязкость фоторезиста уменьшается. Фоторезисты с пониженной вязкостью могут быть обработаны легче и могут быть более точно налиты поверх пластины. - Поместите кремниевую пластину на конфорку при температуре 60 °C и налейте 1 мл нагретого фоторезиста на каждый дюйм пластины, пока фоторезист не покроет большую часть поверхности (рисунок 3C).
- Перенесите кремниевую пластину с фоторезистичным покрытием на спин-коатер (см. Таблицу материалов).
- Применяйте предварительное вращение сначала при 250 об/мин в течение 30 с, а затем при 350 об/мин в течение еще 30 с, оба с ускорением 100 об/с (рисунок 3D).
- Удалите лишний фоторезист с краев кремниевой пластины с помощью тампона из чистой комнаты.
- Примените вращение сначала при 500 об/мин в течение 15 с ускорением 100 об/с, а затем при 1450 об/мин в течение 30 с ускорением 300 об/с (рисунок 3E).
- Удалите бусину края тампоном из чистой комнаты.
- Поместите кремниевую пластину на конфорку с температурой 50 °C и распылите ацетон на пластину, чтобы устранить недостатки и обеспечить равномерное покрытие (рисунок 3F).
- Медленно повышайте температуру конфорки до 95 °C со скоростью 2 °C/мин.
- Мягко запекайте кремниевую пластину при 95 °C в течение 50 мин (рисунок 3G).
- Медленно охлаждайте конфорку до комнатной температуры со скоростью 2°C/мин.
- Поместите кремниевую пластину на выравниватель маски (см. Таблицу материалов) и поместите фотомаску поверх нее (см. Дополнительный рисунок 1 для геометрии фотомаски).
- Подвергайте кремниевую пластину воздействию ультрафиолетового света 350 мДж/см2 (35 мВт/см2 в течение 10 с) через фотомаску с помощью выравнивателя контактной маски (рисунок 3H).
- Нанесите последовательные выпекания после воздействия на кремниевую пластину, поместив пластину на горячую плиту при 50 °C в течение 5 мин, при 65 °C в течение дополнительных 5 мин и, наконец, при 80 °C еще на 20 мин (рисунок 3I).
- Медленно охлаждайте кремниевую пластину до комнатной температуры со скоростью 2 °C/мин.
- Поместите магнитную мешалку с немного меньшим диаметром, чем силиконовая пластина, в стакан. Поверните кремниевую пластину вверх дном и поместите ее поверх стакана.
- Поместите стакан внутрь другого более крупного стакана и заполните большой стакан свежим решением для разработчиков (см. Таблицу материалов). Оставьте кремниевую пластину погруженной в разработчика на 30 минут с включенной мешалкой (рисунок 3J).
- Перенесите кремниевую пластину в ультразвуковую ванну соникатора, заполненную свежим разработчиком, в течение 1 ч при 40 кГц (рисунок 3K).
- Тщательно промойте кремниевую пластину раствором IPA для получения окончательной формы кремниевой пластины (рисунок 3L).
2. Изготовление микрофлюидного чипа
- Поместите силиконовую пластинчатую форму в осушитель вместе с 10 каплями (~ 500 мкл) трихлора (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силана (PFOCTS, см. Таблицу материалов) в небольшой весовой лодке поблизости.
- Подключите осушитель к вакуумному насосу при температуре около 200 торр в течение 30 минут.
- Выключите клапан осушителя и отсоедините вакуумный насос на ночь для покрытия PFOCTS.
- Готовят предварительно отвержденный раствор полидиметилсилоксана (PDMS), смешивая основание PDMS с отверждающим агентом (см. Таблицу материалов) в соотношении 10:1.
- Дегазировать смесь, поместив ее в центрифугу (500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта центрифугирование позволяет пузырькам мигрировать на верхнюю поверхность и, следовательно, удаляться в течение короткого периода времени. - Вылейте дегазированный раствор PDMS на форму кремниевой пластины.
- Дегазируйте его снова, чтобы удалить пузырьки воздуха, попавшие на поверхность плесени.
- Отверните PDMS в духовке с температурой 60 °C в течение 1 ч и 50 мин (рисунок 3M).
- Используйте скальпель, чтобы вырезать границы отвержденной области PDMS, соответствующей микрофлюидной геометрии чипа (рисунок 3N).
- Очистите деталь PDMS и поместите ее вверх дном на режущий коврик.
- Используйте бритву, чтобы разрезать деталь PDMS в ее окончательную форму (рисунок 3O).
- Пробивайте входные и выпускные отверстия на PDMS с помощью биопсийного перфоратора (см. Таблицу материалов) или иглы с тупым наконечником (рисунок 3P).
- Для отверстия для входа эмбриона используйте перфоратор диаметром 4 мм.
- Для выходных отверстий эмбриона используйте перфоратор диаметром 1,3 мм.
- Для отверстия для впускного отверстия газа используйте перфоратор 2 мм.
- Используйте кусок скотча, чтобы удалить любые частицы, которые могут остаться на узорчатой поверхности PDMS.
- Очистите прямоугольный стеклянный затвор размером 24 мм x 60 мм сначала ацетоном, а затем IPA.
- Высушите поверхность стекла пневматическим пистолетом, подключенным к источнику фильтрованного воздуха.
- Нанесите обезвоживающую выпечку на стеклянный предметный предмет, поместив его на конфорку при температуре 250 °C в течение 2 ч (рисунок 3Q).
- Накройте стеклянную горку стаканом, чтобы предотвратить загрязнение поверхности.
- Поместите PDMS с узорчатой стороной вверх, и обезвоженное стекло скользит в плазменный очиститель (см. Таблицу материалов).
- Обработайте PDMS и стеклянный слайд кислородной плазмой при 18 Вт в течение 30 с.
- Поместите PDMS на стеклянный слайд с его узорчатой поверхностью, обращенной к стеклянному слайду, чтобы запечатать микроканалы с помощью ковалентного склеивания (рисунок 3R).
- Используйте пинцет, чтобы осторожно прижать деталь PDMS к стеклянному слайду, чтобы обеспечить полный конформационный контакт.
- Храните готовый микрофлюидный чип при комнатной температуре в течение ночи, чтобы склеивание достигло своей конечной прочности.
3. Подготовка эмбрионов плодовой мухи
- Позвольте взрослым мухам Oregon-R отложить яйца на тарелках с агаром из яблочного сока (1,5% агара, 25% яблочного сока, 2,5% сахарозы) и собрать пластины в нужное время развития после откладки яиц для данного эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящих экспериментов пластины собирали через 140 мин для подготовки и сортировки эмбрионов на стадии клеточности17. - Насыпьте агар яйцом эмбриона (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) и осторожно перемешайте эмбрионы кистью, чтобы выбить их из агара.
- Перенесите эмбрионы в 50% раствор отбеливателя в течение 90 с, периодически помешивая. Процедите эмбрионы через тканевое сито и тщательно смойте раствор отбеливателя водой.
- Перенесите эмбрионы в стеклянную чашку Петри толщиной 90 мм с достаточным количеством яиц эмбрионов, чтобы полностью покрыть эмбрионы.
- Исследуем эмбрионы с трансиллюминкацией на рассекающем микроскопе и отбираем эмбрионы нужной стадии развития для загрузки в микрофлюидное устройство.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой заявке были отобраны эмбрионы на стадии клеточности. Подробное описание того, как обеспечить правильный выбор стадии развития, можно найти в лабораторном справочнике по дрозофиле17.
4. Применение механической стимуляции к эмбрионам плодовой мухи с использованием микрофлюидного чипа
- Праймируйте все семь микроканалов эмбриона, заполнив их 0,4 мкм отфильтрованным IPA через главный входной порт эмбриона.
- Замените IPA фильтрованной деионизированной (DI) водой толщиной 0,4 мкм.
- Замените воду DI раствором для мытья яиц эмбриона.
- Соберите около 100 предварительно отобранных эмбрионов из стеклянной чашки Петри с помощью стеклянной пипетки.
- Пипетка эмбрионов в входной порт эмбриона (рисунок 4А).
- Примените отрицательное давление приблизительно 3 PSI (т.е. вакуум) к входу газа с помощью портативного вакуумного насоса, чтобы открыть микроканалы эмбриона.
- Наклоните микрофлюидный чип вниз, чтобы эмбрионы автоматически выровнялись и осели в микроканалах эмбриона (рисунок 4B).
- Если микроканальные входы эмбриона забиваются несколькими эмбрионами, входящими одновременно, наклоните микрофлюидный чип вверх, а затем снова вниз, чтобы очистить засорение.
- Исходя из требуемой пропускной способности, введите до 300 эмбрионов в микроканалы эмбрионов.
- Как только загрузка эмбриона будет завершена, удалите вакуум, чтобы обездвижить эмбрионы.
- Наклоните микрофлюидный чип обратно в горизонтальное положение (рисунок 4C).
- Подключите портативный источник положительного давления (см. Таблицу материалов) с манометром к входному отверстию газа для применения сжатия 3 PSI (рисунок 4D).
- Непрерывно проверяйте манометр, чтобы обеспечить постоянный уровень сжатия.
- Если эксперименты с визуализацией в реальном времени будут проводиться на механически стимулированных эмбрионах, поместите микрофлюидный чип на стандартный стеклянный слайд-держатель для микроскопа с газовым входом, соединенным с источником давления.
- Как только эксперимент по сжатию завершен, эмбрионы могут быть собраны для последующего анализа. Для этого сначала приложите вакуум к входному отверстию газа, чтобы освободить эмбрионы.
- Затем наклоните микрофлюидный чип вверх, чтобы эмбрионы двигались к порту введения эмбриона (рисунок 4E).
- Соберите эмбрионы из микрофлюидного чипа с помощью стеклянной пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора, влияние сжатия на эмбриональное развитие и жизнеспособность может быть исследовано путем выращивания плодовых мушек во взрослую жизнь. Высокая пропускная способность микрофлюидного устройства обработки также позволяет использовать эмбрионы в последующих анализах на основе омики, которые требуют большого количества образцов (рисунок 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микрофлюидная система разделена на два подотсека, разделенных деформируемыми боковыми стенками PDMS. Первый отсек представляет собой жидкую систему, в которую вводятся эмбрионы дрозофилы , автоматически выравниваются, выстраиваются и сжимаются. Второй отсек представляет собой газовую систему, где давление газа по обе стороны от компрессионных каналов контролируется с помощью тупиковых микроканалов для точного контроля эффективной ширины компрессионных каналов. Микрофлюидное устройство герметизировано стеклянным слайдом в нижней части, что позволяет получать изображения образцов в реальном времени с высоким разрешением (дополнительный рисунок 2) для соответствующих размеров микрофлюидного устройства.
Многоклеточные организмы, такие как эмбрионы дрозофилы , отбираются на желаемой эмбриональной стадии развития. В случае эмбрионов дрозофилы все стадии развития одинаково совместимы с этим подходом, поскольку размер эмбриона не меняется до тех пор, пока они не вылупятся. Отобранные образцы вводят в микрофлюидное устройство через большое входное отверстие (т.е. диаметром 4 мм) с помощью стеклянной микропипетки. Затем устройство наклоняется вниз, чтобы позволить эмбрионам течь в семь каналов сжатия, организованных параллельным образом. Сужающееся предсердие, которое соединяет входное отверстие эмбриона с компрессионным каналом, обеспечивает автоматическое выравнивание эмбрионов до того, как они достигнут входа в компрессионные каналы. Вакуум, приложенный к входному отверстию газа, отклоняет деформируемые боковые стенки наружу, увеличивая эффективную ширину микроканала и позволяя эмбрионам последовательно входить в компрессионные каналы. Семь каналов сжатия имеют длину 22 мм и параллельно могут вместить до 300 эмбрионов дрозофилы за один прогон. Компрессионные каналы заканчиваются узким местом, где ширина микроканала уменьшается до уровня, намного меньшего, чем у образцов, что позволяет жидкости протекать, сохраняя эмбрионы. Благодаря этому подходу эмбрионы концентрируются в компрессионных каналах. После введения эмбрионов вакуум на входе газа удаляется, а боковины микроканала возвращаются в исходное положение и обездвиживают выровненные эмбрионы с обеих сторон. Сжатие может быть достигнуто путем приложения положительного давления к входу газа, что отклоняет деформируемые боковые стенки внутрь и уменьшает эффективную ширину микроканала. Степень сжатия, применяемого к эмбрионам, может быть точно отрегулирована путем настройки размеров микроканала, толщины деформируемых боковых стенок, модуля Юнга PDMS и приложенного давления. После эксперимента по сжатию эмбрионы могут быть собраны для последующего анализа путем применения вакуума к входу газа и наклона микрофлюидного устройства в другом направлении.
Это микрофлюидное устройство было изготовлено с использованием мягкой литографии18. Однако изготовление толстых структур с высоким соотношением сторон с использованием ультратолкотного фоторезиста требует серьезных отклонений от протоколов, определенных для стандартного изготовления (рисунок 3). Наряду с гексаметилдисилазановым покрытием (HDMS), кремниевые пластины были очищены перед отжимным покрытием для удаления органических остатков и обожжены для удаления поверхностной влаги. Эти дополнительные шаги улучшили склеивание толстого слоя фоторезиста с кремниевой пластиной. Фоторезист также нагревался перед заливкой, чтобы уменьшить вязкость, что имело решающее значение для покрытия всей поверхности пластины. Толщина целевого фоторезистического покрытия была достигнута с помощью трех этапов вращения, где каждая стадия вращения постепенно удаляла избыток фоторезиста, не загрязняя поверхность пластины. Вдохновленный ранее опубликованными методами19, ацетон был распылен, который является одним из растворителей фоторезиста, на кремниевую пластину для устранения дефектов фоторезиста и повышения однородности покрытия. Во время последовательных этапов выпечки температура изменялась медленно, чтобы свести к минимуму тепловое напряжение, которое могло привести к расслоению фоторезиста из кремниевой пластины. Из-за подобных опасений температура выпечки была снижена при одновременном увеличении ее продолжительности. Одним из самых сложных шагов в фотолитографическом изготовлении траншей с высоким соотношением сторон было удаление неотвержденного фоторезиста после воздействия ультрафиолета. Чтобы максимизировать проникновение решения разработчика в траншеи, кремниевую пластину переворачивали вверх дном и непрерывно смешивали с решением разработчика с помощью мешалки. Таким образом, новое решение разработчика может реагировать и удалять неизлечимый фоторезист. За этим шагом последовала ультразвуковая ванна, где был удален оставшийся фоторезист. После того, как силиконовая пластинчатая форма была успешно сгенерирована, стандартный процесс формования реплики состоял из смешивания отверждающего агента, дегазации, заливки, отверждения, отслаивания, штамповки и плазменного связывания для изготовления конечного микрофлюидного устройства20.
Функциональность микрофлюидного устройства экспериментально определяли путем загрузки эмбрионов дрозофилы в компрессионные каналы и приложения положительного давления к газовым каналам. Измерения уменьшающейся ширины эмбрионов под микроскопом (рисунок 5А) демонстрируют, как давление газа может быть использовано для получения целевого уровня сжатия (рисунок 5В). Покадровые изображения выровненных эмбрионов, подвергающихся сжатию, также демонстрируют совместимость этой системы с конфокальной микроскопией.
Рисунок 1: Конструкция и функции микрофлюидного устройства. Микрофлюидное устройство состоит из семи параллельных компрессионных микроканалов, которые могут одновременно тестировать до 300 целых эмбрионов дрозофилы . (A) Эмбрионы вводились в устройство через основное входное отверстие эмбриона, и они автоматически выравниваются вдоль задней передней оси при входе в микроканалы. (B) Эмбрионы свободно двигались при подаче отрицательного давления через входное отверстие газа, поскольку это отклоняло деформируемые боковины микроканала наружу. Это позволяло осуществлять их погрузку, а также разгрузку в виде одной полосы движения. Когда отрицательное давление было удалено, эмбрионы были обездвижены в микроканалах. При положительном давлении боковые стенки микроканала сжимали эмбрионы, отклоняясь внутрь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Технологический поток экспериментов по микрофлюидному сжатию для механобиологических исследований. (A) Высокопроизводительное устройство микрофлюидной механостимуляции изготовлено из PDMS и стеклянного слайда для обработки сотен многоклеточных биологических образцов. (B) Устройство предназначено для работы с различными многоклеточными системами, такими как камеры яйцеклеток дрозофилы , эмбрионы дрозофилы или органоиды головного мозга. Это устройство может применять устойчивые или динамические схемы сжатия к биосистемам. (C) Системы могут быть визуализированы с помощью конфокального микроскопа с течением времени по мере их сжатия. Могут быть проанализированы уровни экспрессии и локализация флуоресцентно меченых белков в ответ на сжатие. После сбора системы могут быть проанализированы для постстимуляционного тестирования и визуализации. Высокая пропускная способность микрофлюидного устройства обработки также позволяет лизировать системы и использовать их в биологических анализах на основе омики, которые требуют большого количества образцов, как показано на рисунке с примером изображения 2-мерного дифференциального гелевого электрофореза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процесс изготовления формы для кремниевых пластин с толстым фоторезистом и траншеями с высоким соотношением сторон. (A,B) Общий процесс изготовления начался с подготовки кремниевой пластины к фоторезистическому покрытию. (С-Г) На кремниевую пластину равномерно наносили толстое фоторезистическое покрытие. (Н,И) Фоторезист был смоделирован с УФ-экспозицией через фотомаску. (Дж-Л) Неотвержденный фоторезист был удален из кремниевой пластины. (М-) Часть PDMS была изготовлена с помощью мягкой литографии. (В,Р) Устройство было запечатано на стеклянной горке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Работа микрофлюидного устройства. (А) Сначала эмбрионы пипетировали в основное входное отверстие эмбриона. (B) Во-вторых, отрицательное давление было приложено к входному отверстию газа, и микрофлюидное устройство было наклонено вниз, чтобы позволить эмбрионам выровняться и загрузиться в микроканалы. (C) В-третьих, было снято отрицательное давление, чтобы обездвижить эмбрионы. (D) В-четвертых, положительное давление прикладывалось к газовым каналам для сжатия эмбрионов. (E) Наконец, эмбрионы были собраны из микрофлюидного устройства путем переключения обратно к отрицательному давлению и наклона микрофлюидного устройства вверх. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Экспериментальное измерение уровня компрессии эмбриона. (А) Репрезентативные эмбрионы внутри микрофлюидного устройства при различных уровнях давления газа. Хотя эмбрионы не испытывают значительного сжатия в вакууме или в состояниях нервного давления, они сжимаются при положительном давлении. (B) Количество одноосной сжимающей деформации, приложенной к эмбрионам при различных уровнях давления газа (полосы погрешности представляют собой стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Сжатие органоидов мозга в микрофлюидном устройстве, разработанном и изготовленном в соответствии с той же стратегией. (А) Сжатие органоидов мозга на возрастающих уровнях по мере увеличения давления газа. (B) Ширина органоидов мозга внутри микроканалов при различных уровнях давления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Вид сверху фотомаски, используемой при фотолитографическом изготовлении кремниевой пластинчатой формы. Существует пять идентичных микрофлюидных геометрий устройств, расположенных в пределах области диаметром 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Вид сверху микрофлюидного устройства, используемого в данном исследовании, с соответствующими размерами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В статье описывается разработка микрофлюидного устройства для автоматического выравнивания, обездвиживания и точного применения механической стимуляции к сотням целых эмбрионов дрозофилы . Интеграция микрофлюидной системы с тонким стеклянным покровом позволила во время стимуляции визуализировать эмбрионы с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения. Микрофлюидное устройство также позволило собирать эмбрионы сразу после стимуляции для проведения последующих биологических анализов. Подробно описаны конструктивные соображения, способ изготовления и характеристика этого устройства. Протокол изготовления пресс-формы из кремниевых пластин позволил получить равномерное толстое покрытие фоторезиста с высоким соотношением сторон траншей.
Чтобы этот подход к изготовлению был успешным, важно снизить температуру этапов выпечки и свести к минимуму скорость нагрева и охлаждения кремниевой пластины после того, как она покрыта фоторезистом. Если это не сделано должным образом, покрытие фоторезиста может легко расслоиться и изменить геометрию формы. После того, как силиконовая пластинчатая форма успешно изготовлена, она может быть скопирована в более прочные материалы, чтобы предотвратить повреждение оригинальной формы во время последовательных этапов формования реплик PDMS, которые также содержат циклы нагрева и охлаждения21. Изготовление микрофлюидного устройства PDMS путем литья реплик зависит от успешного отслаивания боковых стенок с высоким соотношением сторон от пресс-формы. Чтобы этот этап изготовления был надежным, важно правильно покрыть поверхность кремниевой пластины силонизирующим агентом для облегчения отслаивания. Покрытие также должно быть обновлено после изготовления примерно 20 устройств PDMS для компенсации частичного удаления силанового слоя на каждом этапе отслаивания. В противном случае боковины могут застрять внутри фоторезистического рисунка, что сделает форму непригодной для использования. Поскольку уровень сжатия, применяемый к образцам, зависит от механических свойств боковых стенок, важно поддерживать согласованность параметров процесса формования реплик PDMS. Соотношение отверждающих агентов, температура и продолжительность должны тщательно контролироваться во время изготовления. Кроме того, поскольку эта стратегия устройства предназначена для одновременного применения механической стимуляции к большому количеству многоклеточных организмов, их агрегация внутри микроканалов может привести к засорению. Хотя эта проблема не испытывалась с организмами, используемыми в настоящем документе, если это произойдет, существуют потенциальные решения из литературы для преодоления этой проблемы, такие как использование растворов носителей во время введения образцов22.
Хотя эмбрионы дрозофилы использовались в этой работе как целый многоклеточный организм, представленная здесь стратегия проектирования и изготовления может быть применена к механической стимуляции других многоклеточных систем путем соответствующего изменения размеров устройства (рисунок 2). Это может быть достигнуто путем расширения ширины и высоты центрального микроканала, чтобы соответствовать ширине и высоте многоклеточных систем. Благодаря этому подходу образцы могут поступать в микроканалы и аналогичным образом сжиматься путем отклонения деформируемых боковых стенок с положительным пневматическим давлением. Чтобы продемонстрировать этот подход, аналогичные устройства были изготовлены для камер яиц дрозофилы , а также органоидов мозга. Эти системы позволили точное механическое сжатие этих биологических систем аналогично экспериментам с эмбрионом дрозофилы (рисунок 6). Кроме того, поскольку этот подход позволяет пополнять среды вокруг обездвиженных образцов, он может быть очень полезен для экспериментов по химической стимуляции, которые требуют быстрого обмена средами без нарушения образцов. В целом, этот универсальный подход сочетает в себе точность и высокопроизводительные возможности автоматизации микрофлюидных систем, обеспечивая при этом новые механобиологические исследования различных многоклеточных систем, таких как небольшие образцы тканей, органоиды, эмбрионы и ооциты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют финансовых интересов в продуктах, описанных в этой рукописи, и им больше нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (CMMI-1946456), Управлением научных исследований ВВС (FA9550-18-1-0262) и Национальным институтом здравоохранения (R01AG06100501A1; Р21АР08105201А1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D.
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H.
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
