Summary
Den nuværende protokol beskriver design, fabrikation og karakterisering af et mikrofluidisk system, der er i stand til at tilpasse, immobilisere og præcist komprimere hundredvis af Drosophila melanogaster embryoner med minimal brugerintervention. Dette system muliggør billeddannelse i høj opløsning og gendannelse af prøver til analyse efter stimulering og kan skaleres til at rumme andre flercellede biologiske systemer.
Abstract
Under embryogenese genererer koordineret cellebevægelse mekaniske kræfter, der regulerer genekspression og aktivitet. For at studere denne proces er værktøjer som aspiration eller coverslip-kompression blevet brugt til mekanisk at stimulere hele embryoner. Disse tilgange begrænser eksperimentelt design, da de er upræcise, kræver manuel håndtering og kun kan behandle et par embryoner samtidigt. Mikrofluidiske systemer har et stort potentiale for at automatisere sådanne eksperimentelle opgaver, samtidig med at gennemstrømningen og præcisionen øges. Denne artikel beskriver et mikrofluidisk system udviklet til præcist at komprimere hele Drosophila melanogaster (frugtflue) embryoner. Dette system har mikrokanaler med pneumatisk aktiverede deformerbare sidevægge og muliggør embryojustering, immobilisering, kompression og indsamling efter stimulering. Ved at parallelisere disse mikrokanaler i syv baner kan stabile eller dynamiske kompressionsmønstre anvendes på hundredvis af Drosophila-embryoner samtidigt. Fremstilling af dette system på en glasdæksel letter samtidig mekanisk stimulering og billeddannelse af prøver med højopløsningsmikroskoper. Desuden gør brugen af biokompatible materialer, som PDMS, og evnen til at strømme væske gennem systemet denne enhed i stand til langsigtede eksperimenter med medieafhængige prøver. Denne fremgangsmåde eliminerer også kravet om manuel montering, som mekanisk belaster prøverne. Desuden muliggør evnen til hurtigt at indsamle prøver fra mikrokanalerne poststimuleringsanalyser, herunder -omics-assays, der kræver store prøveantal, der er uopnåelige ved hjælp af traditionelle mekaniske stimuleringsmetoder. Geometrien i dette system er let skalerbar til forskellige biologiske systemer, hvilket gør det muligt for adskillige felter at drage fordel af de funktionelle funktioner, der er beskrevet heri, herunder høj prøvegennemstrømning, mekanisk stimulering eller immobilisering og automatiseret justering.
Introduction
Levende systemer oplever og reagerer konstant på forskellige mekaniske input gennem hele deres levetid1. Mekanotransduktion har været forbundet med mange sygdomme, herunder udviklingsforstyrrelser, muskel- og knogletab og neuropatologier gennem signalveje direkte eller indirekte påvirket af det mekaniske miljø2. De gener og proteiner, der reguleres ved mekanisk stimulering3 i de mekanosensitive signalveje4, forbliver imidlertid stort set ukendte5, hvilket forhindrer belysning af de mekaniske reguleringsmekanismer og identifikation af molekylære mål for sygdomme forbundet med patologisk mekanotransduktion 6,7 . En begrænsende faktor i at projicere mekanobiologistudier på de relaterede fysiologiske processer er at bruge individuelle celler med konventionelle kulturretter i stedet for intakte flercellede organismer. Modelorganismer, såsom Drosophila melanogaster (frugtflue), har bidraget meget til at forstå generne, signalvejene og proteinerne involveret i dyreudvikling 8,9,10. Ikke desto mindre er brugen af Drosophila og andre flercellede modelorganismer i mekanobiologiforskning blevet forhindret af udfordringer med eksperimentelle værktøjer. Konventionelle teknikker til forberedelse, sortering, billeddannelse eller anvendelse af forskellige stimuli kræver for det meste manuel manipulation; Disse tilgange er tidskrævende, kræver ekspertise, introducerer variabilitet og begrænser det eksperimentelle design og prøvestørrelse11. Nylige mikroteknologiske fremskridt er en stor ressource til at muliggøre nye biologiske assays med meget høj gennemstrømning og stærkt kontrollerede eksperimentelle parametre12,13,14.
Denne artikel beskriver udviklingen af en forbedret mikrofluidisk enhed til at justere, immobilisere og præcist anvende mekanisk stimulering i form af uniaxial kompression til hundredvis af hele Drosophila-embryoner 15 (figur 1). Integration af det mikrofluidiske system med en glasdæksel tillod konfokal billeddannelse i høj opløsning af prøverne under stimuleringen. Den mikrofluidiske enhed muliggjorde også hurtig indsamling af embryonerne efter stimuleringen til løbende -omics-assays (figur 2). Forklaringer af designovervejelserne for denne enhed samt fremstillingen ved hjælp af blød litografi og eksperimentel karakterisering er beskrevet heri. Da fremstilling af en siliciumskiveform af en sådan anordning kræver en ensartet belægning af tyk fotoresist (tykkelse >200 μm) over store områder med høje billedformat (AR) skyttegrave (AR >5), ændrede denne metode betydeligt den traditionelle fotolitografiske formfremstillingsprotokol. På denne måde lettede denne metode håndtering, vedhæftning, belægning, mønster og udvikling af fotoresisten. Derudover diskuteres potentielle faldgruber og deres løsninger. Endelig blev alsidigheden af denne design- og fabrikationsstrategi demonstreret ved hjælp af andre multicellulære systemer såsom Drosophila æggekamre og hjerneorganoider16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af siliciumskiveformen
- Siliciumskiven rengøres (se Materialeoversigt) først med acetone og derefter med isopropylalkohol (IPA).
- Siliciumskiven anbringes på en 250 °C kogeplade i 30 minutter til tørringsbagning (figur 3A).
- Belæg siliciumskiven med hexamethyldisilazan (HDMS) i en dampovn (se Materialetabel) (procestemperatur: 150 °C, procestryk: 2 Torr, procestid: 5 min., HDMS-volumen: 5 μL) (figur 3B).
- Anbring en flaske SU-8 2100 fotoresist (se Materialetabel) i en 60 °C ovn i 15 minutter for at reducere viskositeten.
BEMÆRK: Ved opvarmning i ovnen falder viskositeten af fotoresisten. Fotoresists med sænket viskositet kan håndteres lettere og kan hældes mere præcist oven på waferen. - Siliciumskiven anbringes på en 60 °C kogeplade, og hæld 1 ml af den opvarmede fotoresist for hver tomme af waferen, indtil fotoresisten dækker det meste af overfladen (figur 3C).
- Overfør den fotoresist-belagte siliciumskive til en spincoater (se Materialetabel).
- Påfør forspin først ved 250 o / min i 30 s og derefter ved 350 o / min i yderligere 30 s, begge med 100 o / s acceleration (figur 3D).
- Fjern den overskydende fotoresist fra kanterne af siliciumskiven ved hjælp af en renrumspind.
- Påfør et spin først ved 500 o / min i 15 s med 100 o / s acceleration og derefter ved 1450 o / min i 30 s med 300 o / min acceleration (figur 3E).
- Fjern kantperlen med en renrumspind.
- Anbring siliciumskiven på en 50 °C kogeplade, og spray acetone på skiven for at fjerne ufuldkommenheder og fremme ensartet belægning (figur 3F).
- Skru langsomt op for kogepladens temperatur til 95 °C med en hastighed på 2 °C/min.
- Bag siliciumskiven blødt ved 95 °C i 50 minutter (figur 3G).
- Varm plade afkøles langsomt til stuetemperatur med en hastighed på 2 °C/min.
- Placer siliciumskiven på en maskejustering (se Materialetabel), og placer fotomasken oven på den (se supplerende figur 1 for fotomaskegeometrien).
- Siliciumskiven udsættes for 350 mJ/cm 2 UV-lys (35 mW/cm2 for 10 s) gennem fotomasken ved hjælp af kontaktmaskens justeringsmiddel (figur 3H).
- Påfør på hinanden følgende bagninger efter eksponering på siliciumskiven ved at anbringe waferen på en kogeplade ved 50 °C i 5 minutter, ved 65 °C i yderligere 5 minutter og til sidst ved 80 °C i yderligere 20 minutter (figur 3I).
- Siliciumskiven afkøles langsomt til stuetemperatur med en hastighed på 2 °C/min.
- Anbring en magnetisk omrører med en lidt mindre diameter end siliciumskiven i et bægerglas. Vend siliciumskiven på hovedet, og læg den oven på bægeret.
- Bægerglasset anbringes i et andet større bægerglas, og det større bægerglas fyldes med en frisk udviklerløsning (se Materialeoversigt). Lad siliciumskiven være nedsænket i udvikleren i 30 minutter med omrøreren tændt (figur 3J).
- Overfør siliciumskiven til en ultralydsbad sonikator fyldt med den friske udvikler i 1 time ved 40 kHz (figur 3K).
- Siliciumskiven vaskes grundigt med en IPA-opløsning for at opnå den endelige siliciumskiveform (figur 3L).
2. Fremstilling af den mikrofluidiske chip
- Anbring siliciumskiveformen i en tørremiddel sammen med 10 dråber (~ 500 μL) trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan (PFOCTS, se Materialetabel) i en lille vejebåd i nærheden.
- Tilslut ekssikkatoren til en vakuumpumpe ved ca. 200 Torr i 30 min.
- Sluk for tørreventilen, og frakobl vakuumpumpen natten over for PFOCTS-belægning.
- Den forhærdede polydimethylsiloxanopløsning (PDMS) fremstilles ved at blande PDMS-basen med hærdningsmidlet (se Materialetabel) i forholdet 10:1.
- Afgass blandingen ved at placere den i en centrifuge (500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur).
BEMÆRK: Denne centrifugering gør det muligt for bobler at migrere til den øverste overflade og følgelig fjernes på kort tid. - Hæld den afgassede PDMS-opløsning på siliciumskiveformen.
- Afgass det igen for at fjerne luftboblerne fanget på formoverfladen.
- Hærd PDMS i en 60 °C ovn i 1 time og 50 min (figur 3M).
- Brug en skalpel til at skære grænserne for det hærdede PDMS-område svarende til den mikrofluidiske chipgeometri (figur 3N).
- Skræl PDMS-delen og læg den på hovedet på en skæremåtte.
- Brug en barbermaskine til at skære PDMS-delen i sin endelige form (figur 3O).
- Stans indløbs- og udløbshullerne på PDMS ved hjælp af en biopsistans (se Materialetabel) eller en nål med en stump spids (figur 3P).
- Til embryoindløbshullet skal du bruge en punch på 4 mm i diameter.
- Til embryoudløbshullerne skal du bruge en stans med en diameter på 1,3 mm.
- Til gasindløbshullet skal du bruge en 2 mm stans.
- Brug et stykke scotch tape til at fjerne eventuelle partikler, der kan forblive på PDMS'ens mønstrede overflade.
- Rengør et 24 mm x 60 mm rektangulært glasglas først med acetone og derefter med IPA.
- Tør glasoverfladen med en luftpistol forbundet til en filtreret luftkilde.
- Påfør en dehydreringsbage på glasglasset ved at placere det på en 250 ° C kogeplade i 2 timer (figur 3Q).
- Glasglasset dækkes med et bægerglas for at forhindre overfladeforurening.
- Placer PDMS med den mønstrede side opad, og det dehydrerede glas glider ind i en plasmarenser (se Materialetabel).
- Behandl PDMS og glasglasset med iltplasma ved 18 W i 30 s.
- Placer PDMS på glasrutsjebanen med den mønstrede overflade vendt mod glasrutsjebanen for at forsegle mikrokanalerne via kovalent binding (figur 3R).
- Brug pincet til forsigtigt at skubbe PDMS-delen mod glasrutsjebanen for at sikre fuld konformationskontakt.
- Opbevar den færdige mikrofluidiske chip ved stuetemperatur natten over for at give bindingen mulighed for at nå sin endelige styrke.
3. Tilberedning af frugtflueembryoner
- Lad voksne fluer lægge æg på æblejuiceplader (1,5% agar, 25% æblejuice, 2,5% saccharose) og saml pladerne på det ønskede udviklingstidspunkt efter æglægning til det givne forsøg.
BEMÆRK: Til de nuværende forsøg blev pladerne indsamlet efter 140 minutter for at forberede og sortere efter embryoner på cellulariseringsstadiet17. - Oversvøm agaren med embryoægvask (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) og omrør forsigtigt embryonerne med en pensel for at løsne dem fra agaren.
- Overfør embryonerne til en 50% blegemiddelopløsning i 90 s, omrør lejlighedsvis. Sil embryonerne gennem en vævssigte og vask blegemiddelopløsningen grundigt væk med vand.
- Overfør embryonerne til en 90 mm glas petriskål med tilstrækkelig embryoægvask til fuldt ud at dække embryonerne.
- Undersøg embryonerne med transillumination på et dissekerende mikroskop og vælg embryoner af det ønskede udviklingsstadium til indlæsning i mikrofluidanordningen.
BEMÆRK: I denne applikation blev embryoner på cellulariseringsstadiet valgt. De detaljerede beskrivelser af, hvordan man sikrer korrekt udvælgelse af udviklingstrin, findes i laboratoriehåndbogen for Drosophila17.
4. Anvendelse af mekanisk stimulering på bananflueembryoner ved hjælp af den mikrofluidiske chip
- Prime alle syv embryomikrokanaler ved at fylde dem med 0,4 μm filtreret IPA gennem hovedindløbsporten.
- Udskift IPA med 0,4 μm filtreret deioniseret (DI) vand.
- Udskift DI-vandet med embryoægvaskopløsning.
- Saml ca. 100 forudvalgte embryoner fra glaspetriskålen ved hjælp af en glaspipette.
- Embryonerne pipetteres ind i embryonets indløb (figur 4A).
- Påfør et ca. 3 PSI undertryk (dvs. vakuum) på gasindløbet ved hjælp af en bærbar vakuumpumpe for at åbne embryomikrokanalerne.
- Vip den mikrofluidiske chip nedad, så embryonerne automatisk justeres og sætter sig ind i embryomikrokanalerne (figur 4B).
- Hvis embryomikrokanalindløbene bliver tilstoppet af flere embryoner, der kommer ind samtidigt, skal du vippe den mikrofluidiske chip opad og derefter nedad igen for at rydde tilstopningen.
- Baseret på den krævede gennemstrømning introduceres så mange som 300 embryoner i embryomikrokanalerne.
- Når embryobelastningen er afsluttet, skal du fjerne vakuumet for at immobilisere embryonerne.
- Vip den mikrofluidiske chip tilbage til vandret position (figur 4C).
- Tilslut en bærbar højtrykskilde (se Materialeoversigt) med en manometer til gasindløbet for at anvende 3 PSI-kompression (figur 4D).
- Kontroller løbende manometeret for at sikre, at der anvendes et ensartet kompressionsniveau.
- Hvis der udføres levende billeddannelseseksperimenter på de mekanisk stimulerede embryoner, skal du placere den mikrofluidiske chip på en standard mikroskopglasglasholder med gasindløbet forbundet til trykkilden.
- Når kompressionseksperimentet er afsluttet, kan embryonerne indsamles til nedstrøms analyse. For at gøre dette skal du først anvende vakuumet på gasindløbet for at frigøre embryonerne.
- Vip derefter den mikrofluidiske chip opad, så embryonerne kan bevæge sig mod embryonindføringsporten (figur 4E).
- Saml embryonerne fra den mikrofluidiske chip ved hjælp af en glaspipette.
BEMÆRK: Ved indsamling kan virkningerne af kompression på embryonal udvikling og levedygtighed undersøges ved at dyrke frugtfluerne ind i voksenalderen. Den mikrofluidiske enheds højkapacitetsbehandlingskapacitet gør det også muligt at anvende embryoner i nedstrøms omics-baserede assays, der kræver et stort antal prøver (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det mikrofluidiske system er opdelt i to underrum adskilt af deformerbare PDMS-sidevægge. Det første rum er det flydende system, hvor Drosophila-embryoner introduceres, automatisk justeres, stilles op og komprimeres. Det andet rum er et gassystem, hvor gastrykket på hver side af kompressionskanalerne styres via blindgyde-mikrokanaler for præcist at kontrollere kompressionskanalernes effektive bredde. Den mikrofluidiske enhed er forseglet med et glasglas i bunden, hvilket muliggør levende billeddannelse i høj opløsning af prøverne (supplerende figur 2) for de relevante dimensioner af den mikrofluidiske enhed.
Multicellulære organismer såsom Drosophila embryoner vælges på det ønskede embryonale udviklingsstadium. I tilfælde af Drosophila-embryoner er alle udviklingsstadier lige forenelige med denne tilgang, da embryostørrelsen ikke ændres, før de klækkes. Udvalgte prøver indføres i den mikrofluidiske enhed gennem det store indløb (dvs. 4 mm diameter) ved hjælp af en glasmikropipette. Enheden vippes derefter nedad for at lade embryonerne strømme ind i de syv kompressionskanaler, der er organiseret parallelt. Det indsnævrende atrium, der forbinder embryoindløbet med kompressionskanalen, sikrer automatisk justering af embryonerne, før de når indgangen til kompressionskanalerne. Vakuumet, der påføres gasindløbet, afbøjer de deformerbare sidevægge udad, hvilket øger den effektive mikrokanalbredde og tillader embryonerne at komme ind i kompressionskanalerne sekventielt. De syv kompressionskanaler er 22 mm lange og kan parallelt rumme op til 300 Drosophila-embryoner i en enkelt kørsel. Kompressionskanaler slutter i en flaskehals, hvor mikrokanalens bredde falder til et niveau, der er meget mindre end prøvernes, hvilket tillader væske at strømme igennem, mens embryonerne bevares. Gennem denne tilgang koncentreres embryonerne inden for kompressionskanalerne. Efter indførelsen af embryonerne fjernes vakuumet i gasindløbet, og mikrokanalsidevæggene vender tilbage til deres oprindelige position og immobiliserer de linede embryoner fra begge sider. Kompression kan opnås ved at anvende positivt tryk på gasindløbet, som afbøjer de deformerbare sidevægge indad og reducerer den effektive mikrokanalbredde. Mængden af kompression, der påføres embryoner, kan reguleres præcist ved at skræddersy mikrokanaldimensionerne, tykkelsen af de deformerbare sidevægge, Youngs modul i PDMS og det påførte tryk. Efter kompressionseksperimentet kan embryonerne opsamles til nedstrøms analyse ved at påføre et vakuum på gasindløbet og vippe den mikrofluidiske enhed i en anden retning.
Denne mikrofluidiske enhed blev fremstillet ved hjælp af blød litografi18. Fremstilling af tykke strukturer med funktioner med højt billedformat ved hjælp af ultratyk fotoresist kræver imidlertid store afvigelser fra protokoller, der er defineret for standardfremstillingen (figur 3). Sammen med hexamethyldisilazan (HDMS) belægning blev siliciumskiverne renset før spincoating for at fjerne organiske rester og bagt for at fjerne overfladefugtighed. Disse ekstra trin forbedrede bindingen af det tykke fotoresistlag til siliciumskiven. Fotoresisten blev også opvarmet før hældning for at reducere viskositeten, hvilket var afgørende for at dække hele waferoverfladen. Målet fotoresist belægning tykkelse blev opnået gennem tre spinning trin, hvor hvert spinning trin gradvist fjernet overskydende fotoresist uden at forurene wafer overfladen. Inspireret af tidligere offentliggjorte metoder19 blev acetone sprøjtet, som er et af opløsningsmidlerne i fotoresisten, på siliciumskiven for at eliminere fotoresist ufuldkommenheder og øge belægningens ensartethed. Under de på hinanden følgende bagetrin blev temperaturen ændret langsomt for at minimere termisk stress, hvilket kunne føre til delaminering af fotoresisten fra siliciumskiven. På grund af lignende bekymringer blev bagetemperaturen reduceret, samtidig med at dens varighed blev øget. Et af de mest udfordrende trin i den fotolitografiske fremstilling af skyttegrave med højt billedformat var fjernelsen af den uhærdede fotoresist efter UV-eksponering. For at maksimere udviklerløsningens indtrængning i skyttegravene blev siliciumskiven vendt på hovedet og løbende blandet med udviklerløsningen med en omrører. På denne måde kunne den friske udviklerløsning reagere med og fjerne den uhærdede fotoresist. Dette trin blev efterfulgt af et ultralydsbad, hvor den resterende fotoresist blev fjernet. Når siliciumskiveformen blev genereret med succes, bestod standardreplikastøbningsprocessen af hærdningsmiddelblanding, afgasning, hældning, hærdning, skrælning, stansning og plasmabinding til fremstilling af den endelige mikrofluidiske enhed20.
Funktionaliteten af den mikrofluidiske enhed blev eksperimentelt bestemt ved at indlæse Drosophila-embryoner i kompressionskanalerne og anvende positivt tryk på gaskanalerne. Målinger af embryonernes faldende bredde under et mikroskop (figur 5A) viser, hvordan gastrykket kan bruges til at opnå et målkompressionsniveau (figur 5B). Time-lapse-billeder af justerede embryoner, der gennemgår kompression, viser også dette systems kompatibilitet med konfokal mikroskopi.
Figur 1: Designet og funktionen af den mikrofluidiske enhed. Den mikrofluidiske enhed består af syv parallelle kompressionsmikrokanaler, der kan teste op til 300 hele Drosophila-embryoner samtidigt. (A) Embryoner blev indført i udstyret via hovedembryoindtaget, og de justerede automatisk langs den bageste forreste akse, når de kom ind i mikrokanalerne. (B) Embryoner bevægede sig frit, når der blev påført undertryk gennem gasindløbet, da dette afbøjede de deformerbare mikrokanalsidevægge udad. Dette gjorde det muligt for deres lastning såvel som losning som en enkelt bane. Når det negative tryk blev fjernet, blev embryonerne immobiliseret i mikrokanalerne. Når der blev påført positivt tryk, komprimerede mikrokanalsidevæggene embryonerne ved at afbøje indad. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Procesflow af mikrofluidiske kompressionseksperimenter til mekanobiologistudier. (A) Den mikrofluidiske mekanostimuleringsenhed med høj kapacitet er lavet af PDMS og et glasglas til behandling af hundredvis af flercellede biologiske prøver. (B) Enheden er skræddersyet til at arbejde med forskellige flercellede systemer såsom Drosophila æggekamre, Drosophila embryoner eller hjerneorganoider. Denne enhed kan anvende stabile eller dynamiske kompressionsmønstre på biosystemerne. (C) Systemerne kan afbildes med et konfokalmikroskop over tid, når de komprimeres. Ekspressionsniveauerne og lokaliseringen af fluorescerende mærkede proteiner som reaktion på kompression kan analyseres. Ved indsamling kan systemerne analyseres til test og billeddannelse efter stimulering. Den mikrofluidiske enheds højkapacitetsbehandlingsevne gør det også muligt at lysere systemerne og anvendes i omics-baserede biologiske assays, der kræver et stort antal prøver, som vist i figuren med et 2-dimensionelt differentiel gelelektroforesebilledeeksempel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fremstillingsproces af siliciumskiveformen med tyk fotoresist og skyttegrave med højt billedformat. (A, B) Den samlede fremstillingsproces begyndte med at forberede siliciumskiven til fotoresistbelægning. (C-G) En tyk fotoresistbelægning blev ensartet påført siliciumskiven. (H,I) Fotoresisten blev mønstret med UV-eksponering gennem fotomasken. (J-L) Uhærdet fotoresist blev fjernet fra siliciumskiven. (M-P) PDMS-delen blev fremstillet gennem blød litografi. (Q,R) Enheden blev forseglet til glasrutschebanen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Funktionen af den mikrofluidiske enhed . (A) Først blev embryoner pipetteret ind i hovedembryonindløbet. (B) For det andet blev der påført undertryk på gasindløbet, og den mikrofluidiske anordning blev vippet nedad for at gøre det muligt for embryonerne at justere sig og blive indlæst i mikrokanalerne. (C) For det tredje blev negativt tryk fjernet for at immobilisere embryonerne. D) For det fjerde blev der anvendt et positivt tryk på gaskanalerne for at komprimere embryonerne. (E) Endelig blev embryonerne opsamlet fra den mikrofluidiske anordning ved at skifte tilbage til undertryk og vippe den mikrofluidiske anordning opad. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksperimentel måling af embryokompressionsniveau . (A) Repræsentative embryoner inde i den mikrofluidiske enhed under forskellige gastrykniveauer. Mens embryonerne ikke oplever signifikant kompression under vakuum eller i neurale tryktilstande, komprimeres de, når der påføres positivt tryk. (B) Mængden af uniaxial trykstamme, der påføres embryonerne ved forskellige gastrykniveauer (fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kompression af hjerneorganoider i en mikrofluidisk enhed designet og fremstillet efter samme strategi. (A) Kompressionen af hjernens organoider i stigende niveauer, efterhånden som gastrykket øges. (B) Bredden af hjerneorganoiderne inde i mikrokanalerne ved forskellige trykniveauer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Øverste visning af fotomasken, der blev brugt i den fotolitografiske fremstilling af siliciumskiveformen. Der er fem identiske mikrofluidiske enhedsgeometrier placeret inden for området med 4 i diameter. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Set fra oven af den mikrofluidiske enhed, der anvendes i denne undersøgelse, med de relevante dimensioner. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artiklen beskriver udviklingen af en mikrofluidisk enhed til automatisk at justere, immobilisere og præcist anvende mekanisk stimulering på hundredvis af hele Drosophila-embryoner . Integrationen af det mikrofluidiske system med en tynd glasdæksel tillod billeddannelse af embryoner med højopløsnings konfokal mikroskopi under stimuleringen. Den mikrofluidiske enhed muliggjorde også indsamling af embryonerne lige efter stimuleringen til løb nedstrøms biologiske assays. Designovervejelserne, fremstillingsmetoden og karakteriseringen af denne enhed blev beskrevet detaljeret. Siliciumskiveformfremstillingsprotokollen tillod den ensartede tykke belægning af fotoresisten med skyttegrave med højt billedformat.
For at denne fremstillingsmetode skal lykkes, er det vigtigt at sænke temperaturen på bagetrinnene og minimere siliciumskivens opvarmnings- og afkølingshastigheder, efter at den er belagt med fotoresist. Hvis dette ikke gøres ordentligt, kan fotoresistbelægningen let delaminere og ændre formgeometrien. Når siliciumskiveformen er fremstillet med succes, kan den kopieres til mere holdbare materialer for at forhindre beskadigelse af den originale form under på hinanden følgende PDMS-replikastøbningstrin, som også indeholder opvarmnings- og kølecyklusser21. Fremstillingen af PDMS mikrofluidisk enhed gennem replikastøbning er afhængig af den vellykkede afskalning af sidevægsstrukturer med højt billedformat fra formen. For at dette fabrikationstrin skal være pålideligt, er det afgørende at belægge overfladen af siliciumskiven korrekt med et silaniseringsmiddel for at lette skrælningen. Belægningen skal også fornyes efter fremstilling af ca. 20 PDMS-enheder for at kompensere for delvis fjernelse af silanlaget under hvert skrælningstrin. Ellers kan sidevæggene sidde fast inde i fotoresistmønsteret, hvilket gør formen ubrugelig. Da kompressionsniveauet på prøverne er en funktion af sidevæggenes mekaniske egenskaber, er det vigtigt at holde PDMS-replikastøbningsprocesparametrene konsistente. Hærdningsmiddelforholdet, temperaturen og varigheden skal overvåges nøje under fremstillingen. Da denne enhedsstrategi desuden er til påføring af mekanisk stimulering samtidigt på et stort antal flercellede organismer, kan deres aggregering inde i mikrokanalerne føre til tilstopning. Selvom dette problem ikke blev oplevet med de organismer, der blev brugt heri, hvis dette sker, er der potentielle løsninger fra litteraturen til at overvinde dette problem, såsom at bruge bæreropløsninger under introduktionen af prøverne22.
Selvom Drosophila-embryoner blev brugt som en hel flercellet organisme i dette arbejde, kan design- og fabrikationsstrategien, der præsenteres her, anvendes til mekanisk stimulering af andre multicellulære systemer ved at ændre enhedens dimensioner i overensstemmelse hermed (figur 2). Dette kan opnås ved at udvide den centrale mikrokanalbredde og højde for at matche de flercellede systemer. Gennem denne tilgang kan prøver komme ind i mikrokanalerne og komprimeres på samme måde ved at afbøje de deformerbare sidevægge med positivt pneumatisk tryk. For at demonstrere denne tilgang blev lignende enheder fremstillet til Drosophila ægkamre såvel som hjerneorganoider. Disse systemer muliggjorde den præcise mekaniske kompression af disse biologiske systemer svarende til Drosophila-embryoeksperimenterne (figur 6). Da denne tilgang muliggør genopfyldning af medierne omkring de immobiliserede prøver, kan den også være meget nyttig til kemiske stimuleringseksperimenter, der kræver hurtig medieudveksling uden at forstyrre prøverne. Samlet set kombinerer denne alsidige tilgang præcisionen og automatiseringsfunktionerne med høj kapacitet i mikrofluidiske systemer, samtidig med at den muliggør nye mekanobiologistudier på forskellige multicellulære systemer såsom små vævsprøver, organoider, embryoner og oocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interesser i de produkter, der er beskrevet i dette manuskript, og har intet andet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (CMMI-1946456), Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) og National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D.
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H.
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
