Summary
Flercellede 3D-tumorsfæroider ble fremstilt med lungeadenokarsinomceller, fibroblaster og monocytter, etterfulgt av isolering av kreftassosierte fibroblaster (CAFer) fra disse sfæroidene. Isolerte CAFer ble sammenlignet med normale fibroblaster for å vurdere mitokondriell helse ved å studere mitokondrielt transmembranpotensial, reaktive oksygenarter og enzymatiske aktiviteter.
Abstract
Kreftassosierte fibroblaster (CAFs) er blant de mest tallrike stromale cellene som er tilstede i tumormikromiljøet, noe som letter tumorvekst og progresjon. Kompleksitet i tumormikromiljøet, inkludert tumorsekretome, lavgradig betennelse, hypoksi og redoks ubalanse, fremmer heterotypisk interaksjon og tillater transformasjon av inaktive bosatte fibroblaster å bli aktive CAFer. CAFer skilles metabolsk fra normale fibroblaster (NFs) da de er mer glykolytisk aktive, produserer høyere nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) og overuttrykker laktateksportør MCT-4, noe som fører til åpningen av mitokondriell permeabilitetsovergangspore (MPTP). Her er det beskrevet en metode for å analysere mitokondriell helse av aktiverte CAFer isolert fra de flercellede 3D-tumorsfæroidene som består av humane lungeadenokarsinomceller (A549), humane monocytter (THP-1) og humane lungefibroblastceller (MRC5). Tumorsfæroider ble oppløst med forskjellige tidsintervaller, og gjennom magnetisk aktivert cellesortering ble CAF-er isolert. Det mitokondrielle membranpotensialet til CAFs ble vurdert ved bruk av JC-1 fargestoff, ROS-produksjon ved 2',7'-diklordihydrofluoresceindicetat (DCFDA) farging og enzymaktivitet i de isolerte CAF-ene. Analyse av mitokondriell helse av isolerte CAFer gir en bedre forståelse av den omvendte Warburg-effekten og kan også brukes til å studere konsekvensene av CAF mitokondrielle endringer, for eksempel metabolske flukser og tilsvarende reguleringsmekanismer på lungekreft heterogenitet. Dermed taler denne studien for en forståelse av tumor-stroma-interaksjoner på mitokondriell helse. Det ville gi en plattform for å sjekke mitokondrie-spesifikke legemiddelkandidater for deres effektivitet mot CAFs som potensielle terapier i tumormikromiljøet, og dermed forhindre CAF-involvering i lungekreftprogresjon.
Introduction
Solide svulster består av heterogene cellepopulasjoner som styres av tumormikromiljøet (TME), men opprinnelsen til de fleste cellene er ennå ikke oppdaget. Hovedsakelig stromale og immunceller (fibroblaster, endotelceller, monocytter, makrofager, dendrittiske celler, B-celler, T-celler og deres undergrupper) reflekterer tumor heterogeniteten i lunge-, bryst-, nyre- og andre faste kreftformer 1,2,3. Å forstå opprinnelsen til hver subtype og deres transdifferensieringspotensial er av største behov for å utvikle avanserte terapier mot disse kreftformene. Analysen av denne mangfoldige cellepopulasjonen i humane biopsier presenterer seg med flere utfordringer på grunn av tumortype, sted, stadium, begrensning av prøvemengde og pasientspesifikke variabiliteter4. Dermed er det nødvendig med en eksperimentell modell, som ikke bare er pålitelig, men som også kan simulere in vivo tumortilstanden, og viser seg å være ideell for å studere tumor-stroma crosstalk og dens involvering i sykdomspatofysiologi.
Tredimensjonale (3D) flercellede tumorsfæroidkulturer (MCTS) er et fordelaktig in vitro-modellsystem av svulster på grunn av deres likhet med naturlige kolleger. MCTS kan bedre replikere aspekter av solide svulster enn 2D-cellekulturmodeller, inkludert deres romlige arkitektur, fysiologiske responser, frigjøring av løselige mediatorer, genuttrykksmønstre og stoffresistensmekanismer. Videre er en stor fordel med MCTS at den kan brukes til å studere tumor heterogenitet og tumormikromiljøet (TME). Hanging-drop-metoden er det mest brukte verktøyet for å utvikle og analysere MCTS5. I denne metoden suspenderes de forskjellige cellene med media i form av dråper, noe som gjør det mulig å vokse på en sammenhengende 3D-samlet måte og er enkel å få tilgang til for undersøkelse. Teknikken er grei; Det krever ikke mange celler og eliminerer kravet til et spesialisert substrat som agarose for sfæroidutvikling6. En ekstra fordel med denne metoden ligger i reproduserbarheten av teknikken. Videre har denne metoden også blitt brukt til å co-kultur blandede cellepopulasjoner, som endotelceller og tumorceller, for å simulere tidlig tumorangiogenese7.
I denne studien ble flercellede 3D lungesvulstsfæroider fremstilt med lungeadenokarsinomceller, fibroblaster og monocytter ved hjelp av hengende dråpemetoden som etterligner lungetumormikromiljøet. Deretter ble den kreftassosierte fibroblastpopulasjonen (CAF) isolert for å undersøke mitokondriell helse. Hovedideen bak utviklingen av disse sfæroidene er å isolere CAF-ene, da krysstalen mellom cellene i sfæroider kan forvandle fibroblastene til en myo-fibroblast-lignende aktivert CAF-tilstand. For det andre kan denne studien også skildre hvordan avvikende ROS-produksjon og mitokondriell dysfunksjon driver de normale fibroblaster mot den mer aggressive CAF-fenotypen. Det ble funnet at fibroblaster samlet i tumorsfæroider fikk myofibroblastiske egenskaper med økt ROS-aktivitet og induksjon av metabolsk genuttrykk. Denne protokollen fremhever viktigheten av tumormikromiljøet ved aktivering av CAF og kan være en utmerket modell for in vitro-generering og studier av CAF-fenotypiske egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Kultur humant lungeadenokarsinom cellelinje A549, og human monocytisk cellelinje THP-1 i RPMI1640-medier supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i et fuktet kammer med 5% CO2.
- Kultur MRC-5 humane lungefibroblastceller i DMEM-medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycinoppløsning ved 37 ° C i et fuktet kammer med 5% CO2.
2. Fremstilling av flercellede tumorsfæroider ved bruk av A549 lungeadenokarsinomcellelinje, MRC5 fibroblaster og THP-1 monocytter
MERK: De multicellulære tumorigene og ikke-tumorigene 3D-sfæroidene ble fremstilt ved hjelp av hengende dråpemetoden i en 90 mm cellekulturskål. En detaljert beskrivelse av disse sfæroidenes utvikling er gitt nedenfor. Alle cellekulturreagenser som komplett medium, PBS og 0,25% trypsin-EDTA-løsning bør forvarmes ved 37 ° C før bruk, med mindre annet er angitt.
- Fremstilling av cellesuspensjon
- Vokse A549 og MRC5 adherente celler (5 x 106 celler hver) i DMEM komplett vekstmedium (Dulbecco's modifisert eagle medium [DMEM] + 10% føtalt bovint serum [FBS] + 1% penicillin-streptomycin) i T25 kolber ved 37 ° C i et fuktet kammer med 5% CO2.
- For THP-1-celler vokser cellesuspensjonen (5 x 106 celler) i komplett vekstmedium (RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin) i T25-kolber. For bedre vekst, plasser T25-kolbene ved 37 °C i et fuktet kammer med 5 % CO2 i stående stilling.
- Etter 3 dager, ved 80% -85% sammenløp, vask A549- og MRC5-cellene med kalsium- og magnesiumfri PBS (fosfatbuffersaltvann) ved å tilsette 1 ml PBS (25-30 ° C) i hver kolbe i 1 minutt og aspirere den.
- Høst A549- og MRC5-cellene fra kolben ved å inkubere dem med 500 μL 0,25% trypsin-EDTA-løsning i 5 minutter ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2. Umiddelbart etter, legg til 4 ml komplett vekstmedium for å deaktivere trypsinet.
- Samle cellesuspensjonen fra T25-kolben i et 15 ml rør og pellet den ned ved 125 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspend cellene i 5 ml komplett vekstmedium.
- Etablering av multicellulære tumorsfæroider
MERK: Alle trinn i tumorsfæroiddannelsen skal utføres inne i biosikkerhetsskapet for å opprettholde sterile forhold. Det maksimale volumet av cellesuspensjonen er standardisert som en dråpe på 25 μL for å forberede en dråpe slik at den ikke faller ned mens du inverterer lokkene.- Tell A549-, MRC5- og THP-1-cellenumre ved hjelp av en celleteller. For hver sfæroiddråpe (25 μL) opprettholdes følgende celletall: 5 000 A549-celler, 4 000 MRC5-celler og 1 000 THP-1-celler, etter protokollen beskrevet av Arora et al.7. Beregn celletallene tilsvarende for et volum på 1 ml.
MERK: Sfæroider ble opprinnelig fremstilt med tre forskjellige celletall per sfæroid (dvs. 5000, 8000 og 10.000). Også forskjellige celleforhold mellom tumorceller / fibroblaster / monocytter (1: 1: 1, 2: 2: 1, 4: 2: 1, 5: 2: 1 og 5: 4: 1) ble kontrollert. Til slutt ble en vellykket 3D multicellulær sfæroiddannelse sett med et forhold på 5: 4: 1 og ble brukt til studien. Fibroblastkonsentrasjonen ble økt basert på andelen i tumormikromiljøet, noe som ytterligere forbedret stivheten til tumorsfæroidene. Den detaljerte prosedyren ble rapportert i en nylig publikasjon av Arora et al.7. - Klargjør cellesuspensjonen i forholdet 5 (A549, 2 x 10 5 celler/ml) til 4 (MRC5, 1,6 x 105 celler/ml) til 1 (THP-1, 5 x 104 celler/ml) og gjør opp volumet til 1 ml med fullstendig DMEM.
- Plasser en dråpe på 25 μL cellesuspensjonsblanding på dekselet til en 90 mm kulturskål (ca. 50 dråper/90 mm tallerken). Fyll bunnen av 90 mm kulturskålen med 10 ml sterilt vann.
- Snu lokket forsiktig over det vannfylte hydreringskammeret og legg parabolen i en cellekulturinkubator i 3 dager.
- Overvåk sfæroidene under mikroskopet ved 10x forstørrelse på dag 4. For å få bilder, slå på strømbryteren, plasser 60 mm parabolen nøye på scenen og velg forstørrelsen (10x). Juster linsene og undersøk cellene for å analysere celleaggregering og spredning. Trykk på Frys - og Lagre-knappene på mikroskopet for å ta bildet.
- Bytt vekstmedium på dag 4 ved forsiktig å aspirere 20 μL medium fra hver dråpe og erstatte det med et friskt komplett vekstmedium.
- Tell A549-, MRC5- og THP-1-cellenumre ved hjelp av en celleteller. For hver sfæroiddråpe (25 μL) opprettholdes følgende celletall: 5 000 A549-celler, 4 000 MRC5-celler og 1 000 THP-1-celler, etter protokollen beskrevet av Arora et al.7. Beregn celletallene tilsvarende for et volum på 1 ml.
3. Live-dead analyse av tumor sfæroider
- På dag 7 og 10 må du forsiktig snu 90 mm parabolen i biosikkerhetsskapet og bruke en 200 μL pipette til å samle sfæroider fra hver dråpe. Samle fem sfæroider hver i et 1,5 ml rør.
- Tilsett 500 μL 1x PBS til 1,5 ml røret som inneholder sfæroider og sentrifuge ved 125 x g i 5 minutter. Kast supernatanten forsiktig og resuspend sfæroidene i 200 μL 1x PBS. Ikke pipetter grundig for å unngå sfæroidoppløsning.
- Pipetter ut sfæroidene ved hjelp av en 200 μL pipette på en 60 mm tallerken for calcein-AM og propidiumjodidfarging.
- Sett 5 μL 1 μM calcein-AM-oppløsning og 5 μL 2 mg / ml propidiumjodidoppløsning på sfæroidene. Inkuber i 10 min. Etter ferdigstillelse av inkubasjonsperioden, vask sfæroidene forsiktig med 1x PBS to ganger.
- Plasser 60 mm parabolen som inneholder sfæroider under det fluorescerende inverterte mikroskopet, observer og ta bilder ved 10x forstørrelse ved å velge fluorescensalternativet i mikroskopprogramvaren og velge FITC (grønn fluorescenskanal; eksitasjon 490 nm, utslipp 515 nm) for calcein og Texas rød kanal (TXR; eksitasjon 535 nm, utslipp 617 nm).
- For å skaffe bildet, slå på Ctr Adv, som er bryter 1, etterfulgt av å slå på CPU. Vent til programvaresystemet starter opp. Når du starter opp, plasser 60 mm parabolen nøye på scenen og velg forstørrelsen (10x) og fluorescerende kanaler (FITC, TXR). Juster linsene og skann etter bildet.
- For å se bildet i systemet, velg alternativet Live og se bildet. Juster intensiteten av fluorescens for passende optimalisering. Lagre bildet ved å klikke på Lagre-knappen .
MERK: På dette stadiet vil sfæroider være synlige gjennom det blotte øye. Under lysmikroskopet vil sfæroider vises som runde, stive kuler ved 10x forstørrelse. Flere sfæroider kan samles samtidig ved hjelp av en 200 μL pipette.
4. Desintegrasjon og cellesuspensjon av tumorsfæroider
- Samle 200 tumorsfæroider hver på dag 7 og 10, ved hjelp av en 1 ml pipette i et 15 ml rør.
NOTAT: Før innsamling, kontroller nøye formen og formen til en enkelt sfæroid etter at du har overført den til et mikroskopisk lysbilde eller på en 30 mm tallerken og observer under mikroskopet. - Pellet sfæroidene ved sentrifugering ved 125 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten forsiktig uten å forstyrre tumorsfæroidene.
- Vask sfæroidene forsiktig med 200 μL PBS, sentrifuger ved 125 x g i 5 minutter, og kast forsiktig supernatanten.
- For sfæroidoppløsning, tilsett 400 μL 0,25% trypsin-EDTA-løsning og hold ved 37 ° C i 10 minutter. Utfør kraftig pipettering for fullstendig oppløsning av sfæroidene.
- Nøytraliser trypsin ved å tilsette 1 ml komplett DMEM vekstmedium. Sentrifuge ved 125 x g i 5 minutter og kast supernatanten forsiktig.
- Resuspend pelleten i 1 ml komplett DMEM-medium og telle totalt antall celler.
5. Kreftassosiert fibroblast (CAF) isolasjon gjennom mikroperler
- For isolering av CAFs fra tumorsfæroider, resuspend 1 x 107 celler i 80 μL kald magnetisk aktivert cellesortering (MACS) buffer (PBS ved pH 7,2 som inneholder 0,5% bovint serumalbumin [BSA] og 2 mM etylendiamintetraeddiksyre [EDTA]).
- Inkuber cellesuspensjonen (inneholdende 1 x 107 celler) med 20 μL antifibroblast mikroperler. Bland godt ved å banke forsiktig på røret og inkubere i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene med 1 ml kald MACS-buffer, sentrifuger ved 125 x g i 5 minutter, og aspirer supernatanten. Resuspend cellene i 500 μL MACS buffer.
- For magnetisk perlebasert celleseparasjon, klargjør MACS-kolonnen ved å skylle den med 3 ml MACS-buffer.
- Plasser cellesuspensjonen i kolonnen etterfulgt av samlingen av gjennomstrømning som inneholder den umerkede cellepopulasjonen.
- Vask kolonnen tre ganger med 3 ml MACS-buffer. Fjern kolonnen fra skilletegnet og legg den på oppsamlingsrøret.
- Samle de antifibroblast mikroperlemerkede cellene ved å legge til 5 ml MACS-buffer og skyve stempelet godt inn i kolonnen.
- Sentrifuge de merkede cellene ved 125 x g i 5 minutter. Fortsett med de isolerte fibroblastene for nedstrøms applikasjoner.
6. Flowcytometribasert analyse av ACTA2-ekspresjon i isolerte CAF-er
- Tell antall isolerte CAFer og bruk omtrent 6 x 104 celler. Vask cellene en gang med PBS, sentrifuger ved 125 x g i 5 minutter, og aspirer supernatanten.
- Tilsett 100 μL cellepermeabiliseringsbuffer (PBS + 0,5% BSA + 0,3% v / v Triton X-100) og inkuber cellene ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vortex cellene periodisk for å opprettholde en enkeltcellesuspensjon. Sentrifuge og resuspendere cellene i 100 μL cellepermeabiliseringsbuffer.
- Tilsett 2 μL APC-konjugert antihumant α-SMA-antistoff og inkuber ved 4 °C i 45 minutter. Etter inkubasjon, tilsett 1 ml permeabiliseringsbuffer og sentrifuge ved 125 x g i 5 minutter for å fjerne overflødig antistoff.
- Resuspend pelleten i 400 μL permeabiliseringsbuffer for flowcytometrisk analyse. Oppnå totalt 10 000 hendelser av hver prøve i et flowcytometer. Velg ACTA2-positive celler etter å ha skilt populasjonene av celler basert på deres fremover- og sidespredning, og velg singletpopulasjonen etterfulgt av å velge ACTA2-positive celler som vises som en enkelt topp på enkeltparameterhistogrammet.
7. JC-1-farging for å bestemme mitokondriell membranpotensial
- Tell antall isolerte CAFer og bruk ca. 6 x 104 celler for 5,5,6,6'-tetraklor-1,1',3,3' tetraetylbenzimi-dazoylkarbocyaninjodid (JC-1) farging ved hjelp av flowcytometri.
- Vask cellene grundig med PBS, sentrifuger ved 125 x g i 5 minutter, aspirer supernatanten og tilsett 100 μL cellefargingsbuffer.
- Tilsett JC-1 fargestoff ved en arbeidskonsentrasjon på 2 μM og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Ved avslutning av inkubasjonen, vask cellene med PBS, sentrifuge ved 125 x g i 5 minutter, og resuspend i et endelig volum på 400 μL.
- Oppnå totalt 20 000 hendelser av hver prøve i et flowcytometer. Kvantifiser mitokondriell membranpotensial ved å måle de rødforskjøvne JC-1-aggregatene på FL-2-kanalen og de grønnforskjøvne monomerene på FL-1-kanalen.
8. DCFDA-farging for å estimere cellulære reaktive oksygenarter (ROS) nivåer
- Bruk hele sfæroidene (50 tall) samt de isolerte CAF-ene (6 x 104 celler) fra sfæroidene for 2',7'-diklordihydrofluoresceindicetat (DCFDA) farging.
- Vask cellene grundig med PBS, sentrifuger ved 125 x g i 5 minutter, aspirer supernatanten og tilsett 100 μL cellefargingsbuffer.
- Tilsett DCFDA-fargestoff ved en arbeidskonsentrasjon på 1 μM og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Vask cellene to ganger med PBS, sentrifuger ved 125 x g i 5 minutter, og resuspender deretter i et endelig volum på 400 μL.
- Oppnå totalt 20 000 hendelser av hver prøve i et flowcytometer. Vurder ROS-nivåene ved å måle fluorescensen på dag 7 og dag 10 for sfæroidene samt de isolerte CAF-ene.
9. RT-qPCR-analyse av CAF-markører og glykolytiske gener
- Trekk ut RNA fra de sorterte CAF-ene ved hjelp av et enkeltcellelysesett som følger produsentens protokoll. Forbered cDNA fra 100 ng RNA ved hjelp av et cDNA-syntesesett i henhold til produsentens retningslinjer.
- Utfør RT-qPCR for å analysere de relative CAF-markørene (ACTA2 8 og COL1A29) og glykolytisk gen (GLUT1 10 og MCT4 11) uttrykk. Utfør smeltekurveanalyse etter den endelige forlengelsen for å sikre spesifisiteten til produktene. Normaliser dataene ved å bruke uttrykket av GAPDH som referansegenet. Primersekvensene som brukes til RT-qPCR er listet opp i tilleggstabell 1.
10. Ekstraksjon og kvantifisering av det cellulære proteinet fra CAFs
MERK: Utfør alle trinnene av proteinekstraksjon på is for å unngå proteinnedbrytning.
- Resuspendere ca. 4 x 106 CAF-celler i 100 μL iskald RIPA lysebuffer (inneholdende 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS og 0,5% natriumdeoksykolat med 5 mM Halt protease og fosfatasehemmercocktail, og 5 mM EDTA ved pH 7,4).
- Vortex strengt for riktig cellelyse. Sonikere cellesuspensjonen ved 20 Hz frekvens, 20% amplitude i 15 s og 3x puls.
- Etter sonikering, sentrifuger proteinekstraktet ved 13.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et forkjølt 1,5 ml rør. Utfør BCA-proteinanalysen for å kvantifisere protein.
11. Spektrofotometrisk analyse av enzymatiske aktiviteter i CAFer
MERK: Følgende enzymaktiviteter analyseres i tumorsfæroidavledede CAFer.
- Måling av succinatdehydrogenaseaktivitet
- For å evaluere aktiviteten til succinatdehydrogenase (SDH) i CAFer, lag SHE-buffer med 250 mM sukrose, 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES) og 1 mM etylenglykol-bis (β-aminoetyleter) -N, N, N′, N ′-tetraeddiksyre (EGTA) og juster pH til 7,3. Tilsett 0,4 mM fenazinmetosulfat (PMS), 0,2 mM 2,6-diklorindofenol (DCPIP), 50 mM MgCl2, 0,02 % Triton X-100 og 1 mM cyanid i SHE-bufferen og hold ved 37 °C.
- Ekstraher det cellulære proteinet fra CAF-ene som beskrevet i trinn 10 (2 x 106 celler). I hver brønn på en 96-brønns plate, inkuber 100 μL 0,1 mg cellulært protein med 100 μL SHE-reaksjonsblanding ved 37 ° C i 15 minutter.
- For å starte den enzymatiske aktiviteten, tilsett 10 mM succinat12. Beregn enzymaktiviteten i nM/min/ml ved å måle endringene i absorbans ved 600 nm.
- Omregningsfaktoren for DCIP er 0,0215 A/nM basert på molar utryddelseskoeffisient12. Beregn den relative aktiviteten til SDH ved å bruke den nevnte formelen:
Relativ aktivitet (nM/min/ml/enzym) =
X 
X V
Hvor ΔA/min = hastigheten av enzymatisk reaksjon (A initial- Afinal) / (tidendelig- A / mininitial), Ve = volum av prøve, og V = volum av reaksjonen.
- Estimering av cytokrom c-oksidaseaktivitet
- For å evaluere cytokrom c-oksidaseaktiviteten (COX) i CAFer, tilsett 0,2 mg/ml cellulært protein i en KME-reaksjonsbufferløsning som inneholder KME-buffer (125 mM KCl, 20 mM 3-(N-morpholino)propansulfonsyre [MOPS] og 1 mM EGTA, pH 7,4), 0,02 % Triton X-100 og 5 mM natriumaskorbat.
- Bland 50 μM hestehjerte cytokrom c med 5 mM natriumaskorbat i et separat rør og inkuber ved 37 °C i 5 minutter13. Etter inkubering, tilsett 20 μL redusert cytokrom c til 500 μL KME-reaksjonsbufferløsning som inneholder cellulært protein.
- Beregn enzymaktiviteten i enheter/μL ved å måle endringene i absorbans ved 550 nm. Absorpsjonen av cytokrom c ved 550 nm endres med oksidasjonstilstanden. Forskjellen i utryddelseskoeffisienter (mM) mellom redusert og oksidert cytokrom c er 21,84 ved 550 nm14. Beregn mengden enzymaktivitet i det cellulære lysatet som:
Enheter/μL =
Hvor ΔA/min = A/minsample-A/minblank og 21,84 = ΔԑmM mellom oksidert cytokrom c og redusert cytokrom c ved 550 nm
- Vurdering av laktatdehydrogenaseaktivitet
- Utfør en laktatdehydrogenase (LDH) analyse ved hjelp av et laktatdehydrogenasecelleanalysesett som følger produsentens instruksjoner.
- Tilsett LDH testreagens (10 μL) til 0,5 mg / ml cellulære proteiner og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C. Ved avslutning av inkubasjonen måler du absorbansen ved 45 nm hvert 1. minutt i 8 minutter.
- Forbered NADH-standardene for kolorimetrisk deteksjon ved bruk av 0 (blank), 2,5, 5, 7,5, 10 og 12,5 nM / brønn av NADH etterfulgt av tilsetning av LDH-testreagens til et endelig volum på 50 μL.
- Plott forskjellene i absorbans mellomT-initial ogT-endelig til NADH-standardkurven for å bestemme mengden NADH-generering. Vurder aktiviteten til LDH ved å bruke den nevnte formelen:
LDH-aktivitet =
X fortynningsfaktor i prøven
Hvor B = mengde (nmole) NADH generert mellom T initial og Tendelig, reaksjonstid = Tendelig - Tinitial (min), og Ve = prøvevolum (mL) lagt til brønn.
X 
X V
X fortynningsfaktor i prøvenSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser utvikling av flercellede tumorsfæroider ved bruk av tre ulike cellepopulasjoner-A549 (lungeadenokarsinom), MRC-5 (fibroblaster) og THP-1 (monocytter)-ved hengende dråpe-metoden observert dag 7 og dag 10 under mikroskopet. På dag 7 var sfæroidene kompakte og stive med en diameter på 260 ± 5,3 μm, og på dag 10 var sfæroidene 480 ± 7,5 μm i diameter (figur 1A øvre panel, figur 1B-D). Dag 7 og dag 10 sfæroider var tette aggregater og stort sett ensartede i størrelse og diameter som observert i hele batchanalysen. Kompakthets- og stivhetstoppen til 3D multicellulær sfæroid ble lagt merke til rundt dag 10 (figur 1A øvre panel, figur 1B-D). Cellens levedyktighet ble vurdert ved kalcein-AM/PI-farging. En reduksjon i propidiumjodidfluorescens (rød) og en økning i kalcein-AM-fluorescens (grønn) fra dag 7 til dag 10 ble observert, noe som indikerer celleproliferasjon i 3D-mikromiljøet (figur 1A, E). Sfæroidene ble også vurdert for hypoksiske egenskaper ved bruk av Image-iT Red hypoxia staining; det ble funnet en hypoksisk kjerne midt på dagen 10 sfæroider (figur 1F). Videre ble det observert en markert oppregulering av E-cadherin genuttrykk i dag 7 og dag 10 sfæroider sammenlignet med dag 4 (figur 1G), noe som tyder på cellekompaktitet og stivhet. Også en økning i MKi67 genuttrykk med økningen i dager med dannelse av tumorsfæroider (figur 1H) indikerer cellevekst og proliferasjon.
Kreftassosierte fibroblaster (CAF) ble isolert fra dag 10 tumorsfæroider ved bruk av antifibroblastmikroperler som beskrevet i diagrammatisk oversikt i figur 2A. Isolerte fibroblaster fra disse tumorsfæroidene er ca. 69 % ACTA2-positive (figur 2B). På mRNA-nivå viste isolerte fibroblaster nesten tredobbelt (figur 2C) og ti ganger (figur 2D) oppregulering i henholdsvis ACTA2 og COL1A2 (kollagen type 1 alfa 2 kjede) genuttrykk, sammenlignet med de normale MRC-5 fibroblaster, noe som tyder på rollen som mikromiljø-ledetråder i CAF-transformasjon / aktivering i disse tumorsfæroidene.
For å evaluere de cellulære reaktive oksygenartene (ROS) -nivåene i de aktiverte CAF-ene, ble ROS-nivåene i tumorsfæroidene først undersøkt ved å bruke 2',7'-diklorfluoresceindiacetat (DCFDA), som diffunderte inn i cellene og deacetylert av de cellulære esterasene etterfulgt av ROS-avhengig oksidasjon i det fluorescerende molekylet 2',7'-diklorfluorescein (DCF). En signifikant økning i ROS-nivåer i dag 10 tumorsfæroider ble observert sammenlignet med dag 7, noe som tyder på mulig involvering av ROS-generering på CAF-aktivering (figur 3A, B). En signifikant økning ble observert i cellulære ROS-nivåer i CAFs isolert fra dag 7 og dag 10 tumorsfæroider (figur 3C). Videre ble en endring av mitokondriell membranpotensial lagt merke til som indikert av JC-1-fargingen (figur 3D). Samlet antyder disse resultatene en endring i mitokondriell membranpotensial og oksidativt stress i de aktiverte CAF-ene isolert fra tumorsfæroider.
For å analysere om de økte ROS-nivåene og mitokondriell membrandepolarisering i CAF-ene er årsakssammenheng med oppregulering av visse glykolytiske mål for å produsere den omvendte Warburg-effekten på kreftceller i tumormikromiljøet, ble det relative genuttrykket til GLUT1 og MCT4 undersøkt. En induksjon av GLUT1 (figur 4A) og MCT4 (figur 4B) genuttrykk ble observert i CAFs sammenlignet med normale fibroblaster. Denne observasjonen er i tråd med tidligere studier på dette feltet som viste en økt overflod av GLUT1- og MCT4-nivåer i CAFs 11. GLUT1 er ansvarlig for å transportere glukose inn i cellene, mens MCT4 ekstruderer laktat fra cellene, og derfor virker denne trenden ganske logisk for CAF-biologi. Siden mitokondriell dysfunksjon er markant korrelert med endringen av forskjellige mitokondrielle enzymaktiviteter, ble de forskjellige mitokondrielle enzymaktivitetene i de isolerte CAF-ene analysert. Signifikant induksjon av laktatdehydrogenase (LDH) enzymaktivitet i CAFs sammenlignet med normale fibroblaster ble observert (figur 4C), noe som tyder på høy laktatproduksjon, høyt oksidativt mitokondrielt stress og omvendt Warburg-effekt i aktiverte CAFer. Deretter ble cytokrom c-oksidase (COX) enzymaktivitet undersøkt i CAFer, da forbedringen av cellulære ROS-nivåer er kjent for å øke COX-ekspresjon og aktivitet gjennom NF-kB-avhengig vei15. En induksjon av COX-aktivitet ble observert i CAFs sammenlignet med normale fibroblaster (figur 4D), noe som tyder på involvering av ROS-avhengig signalering i konvertering av CAFs fra normale fibroblaster. Mitokondriell succinatdehydrogenase (SDH) enzymaktivitet i CAFs ble også vurdert og fant sin bemerkelsesverdige induksjon sammenlignet med normale fibroblaster (figur 4E).
Figur 1: Utvikling av flercellede tumorsfæroider og levendedøde analyser. (A) Øvre panel: Mikroskopiske bilder av flercellede 3D-tumorsfæroider bestående av A549 (lungeadenokarsinomceller), MRC-5 (fibroblaster) og THP-1 (monocytter) dag 7 og dag 10. Midtre og nedre panel: Sammenslått bilde av calcein-AM og propidiumjodid (PI) farging (midtpanel) og propidiumjodidfarging (nedre panel) på dag 7 og dag 10 tumorsfæroider. (B) Fasekontrastbilder av dag 7 og dag 10 tumorsfæroider tatt ved 10x mål. (C,D) Representative bilder og kvantitativ analyse av dag 7 (d7) og dag 10 (d10) sfæroider som viser måling av sfæroiddiameter. (E) Kvantitativ analyse av calcein-AM-merkede celler på dag 7 og dag 10 tumorsfæroider. (F) Immunfluorescensfarging av Image-iTRed hypoksi farging i dag 10 sfæroide seksjoner (6 μm). DAPI ble brukt til kjernemotvirkning. (G,H) RT-qPCR-analyse av E cadherin (G) og MKi67 (celleproliferasjonsmarkør) (H) mRNA-nivåer i dag 7 og dag 10 av tumorsfæroider. Todimensjonal kultur av MRC-5 ble ansett som kontroll. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer (n = 3). Data representert som gjennomsnittlig ± standardavvik (S.D. **p < 0,01 for test (dag 7 sfæroid) versus kontroll (2D-kultur MRC-5) ved bruk av student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analyse av CAF-egenskaper i isolerte fibroblaster fra tumorsfæroider. (A) Diagrammatisk oversikt over protokollen for isolering av fibroblaster fra de flercellede tumorsfæroidene på dag 10 ved bruk av antifibroblastmikroperler ved hjelp av en magnetisk cellesorterer etterfulgt av RNA-isolasjon for flowcytometrisk og genuttrykksanalyse. (B) Flowcytometrisk analyse som viser en økning i ACTA2-proteinuttrykk i isolerte fibroblaster. (C,D) RT-qPCR-analyse av ACTA2 (C) og COL1A2 (D) mRNA-nivåer i de isolerte fibroblastene fra dag 10 tumorsfæroider. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer (n = 3). Data representert som gjennomsnitt ± S.D. **p < 0,01 for test (isolerte CAFer) versus kontroll (MRC-5) ved bruk av student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse av nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) og JC1-farging i isolerte CAFer. (A) Immunfluorescensbilder som viser reaktive oksygenarter (ROS) nivåer i dag 7 og dag 10 sfæroider ved DCFDA-farging. (B) Flowcytometrisk analyse som representerer antall DCFDA-positive celler. X-aksen presenterer DCFDA og Y-aksen presenterer celletall. (C) Overflod av DCFDA-positive CAF-er isolert fra dag 7 og dag 10 sfæroider ved flowcytometri. MRC-5-celler i 2D-kultur ble brukt som kontroll. (D) Flowcytometrisk analyse av JC-1-farging for analyse av mitokondriell membranpotensial i isolerte CAFer fra dag 7 og dag 10 tumorsfæroider. MRC-5-celler i 2D-kultur ble brukt som kontroll. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer (n = 3). Data representert som gjennomsnitt ± S.D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Måling av mitokondrielle enzymaktiviteter i isolerte CAFer. (A,B) RT-qPCR-analyse av GLUT1 (A) og MCT4 (B) mRNA-nivåer i isolerte CAF-er fra dag 7 og dag 10 tumorsfæroider sammenlignet med normale fibroblaster (MRC-5). (CE) Laktatdehydrogenase (LDH) enzymaktivitet (C), cytokrom c-oksidase (COX) enzymaktivitet (D) og succinatdehydrogenase (SDH) enzymaktivitet (E) ble målt i normale fibroblaster og isolerte CAF-er fra dag 10 tumorsfæroider. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer (n = 3). Data representert som gjennomsnitt ± S.D. **p < 0,01 signifikans for test (isolert CAF) versus kontroll (MRC-5) ved bruk av student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Liste over fremover (F) og revers (R) primere for RT-qPCR-analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien introduserer utviklingen av flercellede tumorsfæroider som består av tumorceller, stromalcellepopulasjon (dvs. fibroblaster) og immuncellepopulasjon (dvs. monocytter) ved hjelp av en modifisert hengende dråpemetode. Fibroblaster og monocytter/makrofager er blant de viktigste populasjonene som utgjør tumormikromiljøet (TME), og deres tilstedeværelse er ofte knyttet til dårlig pasientprognose16. Når de er tilstede i TME, forvandles fibroblaster, og viser en spesifikk kreftassosiert fibroblast (CAF) fenotype som svulstens mikromiljøsignaler17 påvirker dem. Myofibroblaster, inflammatoriske fibroblaster (iCAFs) og antigenpresenterende fibroblaster (apCAFer) finnes ofte i aktiverte fibroblaster18,19. Disse fenotypene er ofte knyttet til kreft aggressivitet og terapiresistens20. Myofibroblaster rapporteres som dårlige varsler i flere solide svulster, da en høyere andel av disse fibroblastene begrenser T-celleinfiltrasjon som fører til en immunsuppressiv TME21. Disse myofibroblastene viser karakteristiske trekk ved økt produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) og sekresjon av forskjellige mediatorer som elastiner, kollagener og fibronektin som fører til ekstracellulær matriksavsetning innenfor TME22.
Denne studien optimaliserte protokollen for utvikling av multicellulære 3D-tumorsfæroider ved bruk av A549 lungeadenokarsinomceller, MRC-5 lungefibroblaster og THP-1 monocytter med hensyn til celletall og forholdet 5: 4: 1 (tumorceller: fibroblaster: monocytter) som nøye simulerer tumorstroma av den naturlige mikromiljøtilstanden. Disse sfæroidenes utvikling og analyse fortsatte til dag 10 for å nå sin kompleksitet. Dermed er cellenummer og forhold kritiske trinn i denne protokollen for å studere tumor-stroma-interaksjon i sfæroidene som til slutt genererer flere funksjoner i TME, for eksempel økt produksjon av ROS-nivåer, mitokondriell dysfunksjon, høyere glykolyse og deltakelse i konvertering av normale fibroblaster til aktiverte CAFer.
En av de viktigste begrensningene i studiet av CAF-biologi ligger i den begrensede tilgjengeligheten av CAFer fra primære tumorbiopsiprøver. Hovedmålet er å lage biomimetiske 3D-tumorsfæroider med fibroblaster og deretter isolere de aktiverte CAF-ene fra tumorsfæroidene ved hjelp av magnetiske mikroperler mot fibroblaster ved hjelp av en magnetisk aktivert cellesorterer (MACS). Dette kan gi en kilde til å studere CAFs direkte. CAF-populasjonen ble bekreftet ved å analysere CAF-spesifikke markører som alfa-glatt muskelaktin (α-SMA) og COL1A2-uttrykk. Crosstalk av kreftceller med fibroblaster omdanner fibroblastfenotypen mot aktiverte CAFer som utviser en økt glykolytisk vei assosiert med massivt cellulært opptak av glukose og frigjøring av laktat og pyruvat, sluttproduktene av glykolyse. Dermed vil denne tilnærmingen gi nok CAF-celler til forskerne til å avsløre mange ubesvarte spørsmål. Her er celletall og forhold optimalisert for lunge 3D-tumor sfæroider. For å danne andre solide tumorsfæroider, må man kanskje justere antall og forhold for å få riktig 3D-struktur. Også denne tilnærmingen kan trenge noen modifikasjoner for å isolere og studere immuncellepopulasjonen, spesielt tumorassosierte makrofager i sfæroider.
Siden denne 3D lungetumor sfæroidmodellen rekapitulerer naturlige tumormikromiljøfunksjoner, kan denne modellen brukes til å studere mekanismene for CAF-aktivering fra normale fibroblaster, dets involvering i lungekreftprogresjon i 3D-tumormikromiljøet. For det andre viser denne studien også hvordan avvikende ROS-produksjon og mitokondriell dysfunksjon driver de normale fibroblaster mot den mer aggressive CAF-fenotypen. Det vil også kaste lys over krysstalen mellom CAF og kreftceller og deres involvering i metabolsk omprogrammering assosiert med omvendt Warburg-effekt. Dermed kan denne modellen bane vei for en mer uttømmende studie og design av effektive terapeutiske inngrep for å målrette CAFs for lungeadenokarsinombehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av SERB-Women Excellence Award Project, India (SB / WEA-02/2017) og SERB-Early Career Research Award Project, India (ECR / 2017 / 000892) til DP. Forfatterne, LA og SR anerkjenner IIT Ropar og MHRD for sine stipendiatstillinger. MK anerkjenner ICMR for sin stipendiatstilling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | - | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | - | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
References
- Kim, N., et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).
- Davidson, S., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth. Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).
- Zhang, Y., et al. Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).
- Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing patient specificity in the engineering of tumor models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Tissue Engineering. , Humana Press. 141-151 (2007).
- Dituri, F., et al. Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography. Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).
- Arora, L., et al. Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment. Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).
- Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers. International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).
- Zhang, Y., et al. HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).
- Bu, L., et al. Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).
- Whitaker-Menezes, D., et al. Evidence for a stromal-epithelial "lactate shuttle" in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts. Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).
- Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).
- Bregman, A. A. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , John Wiley & Sons Incorporated. (2002).
- Berry, E. A., Trumpower, B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).
- Avagliano, A., et al. Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts. BioMed Research International. , (2018).
- Lorusso, G., Rüegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).
- Sebastian, A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer. Cancers. 12 (5), 1307 (2020).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Ganguly, D., et al. Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment. Cancers. 12 (9), 2652 (2020).
- Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).
- Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling. Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).
