Summary
כאן אנו מתארים מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מוצלח של מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT) תוך שימוש בתרבית תאי HeLa דו-ממדית וורטפורפין כפוטוסנסיטייזר.
Abstract
מאמר זה מתאר מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT), בשם PhotoACT. ההתקן נבנה באמצעות מערך של דיודות פולטות אור (LED) קונבנציונליות הניתנות לתכנות, מודול תצוגת גביש נוזלי (LCD) וחיישן אור המחובר ללוח מיקרו-בקרים מסחרי. המבנה מבוסס התיבה של אב הטיפוס נעשה עם סיבית בצפיפות בינונית (MDFs). התא הפנימי יכול להקצות בו זמנית ארבעה מיקרו-לוחות מרובי תרביות תאים.
כהוכחת היתכנות, חקרנו את ההשפעה הציטוטוקסית של הפוטוסנסיטייזר (PS) verteporfin כנגד קו תאי HeLa בתרבית דו-ממדית (2D). תאי HeLa טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של verteporfin במשך 24 שעות. המדיום העל-טבעי המכיל את התרופה הושלך, התאים הדבקים נשטפו בתמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS), ונוסף מדיום ללא תרופות. במחקר זה נבדקה ההשפעה של ורטפורפין על תאים ללא חשיפה לאור או לאחר חשיפה של שעה אחת לאור באמצעות ערכי אדום-ירוק-כחול (RGB) של 255, 255 ו-255 (פלואנס ממוצע של 49.1 ± 0.6 J/cm2). לאחר 24 שעות, כדאיות התא הוערכה על ידי בדיקת 3-(4,5-דימתיל-2-תיאזוליל)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT).
תוצאות הניסוי הראו כי חשיפה של תאים שטופלו עם verteporfin לאור מהמכשיר מגבירה את ההשפעה הציטוטוקסית של התרופה באמצעות מנגנון המתווך על ידי מיני חמצן תגובתי (ROS). בנוסף, השימוש באב הטיפוס המתואר בעבודה זו אומת על ידי השוואת התוצאות עם מכשיר PDT מסחרי. לפיכך, אב טיפוס זה של טיפול פוטודינמי מבוסס LED מייצג אלטרנטיבה טובה למחקרים חוץ גופיים של PDT.
Introduction
בין המחלות הקטלניות ביותר שאינן ניתנות לתקשורת, סרטן מהווה גורם מוביל בעולם למוות בטרם עת. הוא היווה כמעט 10 מיליון מקרי מוות בשנת 2020, המייצגים בערך אחד מכל שישה מקרי מוות ברחבי העולם1. בנוסף, תופעת העמידות למולטי-דרוג (MDR) מהווה איום עצום על בריאות הציבור, שכן פרוטוקולים כימותרפיים מאושרים אינם מצליחים להגיע לשלבי הפוגה עבור מצב קליני זה2. תאים סרטניים יכולים לפתח עמידות לכימותרפיה באמצעות מספר מנגנונים; עם זאת, ביטוי יתר של כמה מובילי קלטות מחייבות ATP (ABC) - משאבות efflux תלויות ATP - נחשב הגורם העיקרי להתפתחות MDR בתוך מיקרו-סביבה של גידול3. בנוסף ל- MDR, סיבוכי סרטן אחרים, כגון הישנות וגרורות, מחזקים את הדרישה הדחופה לפתח ולשפר גישות טיפוליות כדי להתגבר על אתגר אונקולוגי זה.
הניצול המרפא של האור היה נהוג במשך מאותשנים, וטיפול פוטודינמי (PDT) מייצג גישה טיפולית מאושרת קלינית לגידולים מוצקים. PDT משלב מתן של פוטו-סנסיטייזר (PS) ואחריו קרינת אור כדי ליצור מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להפעיל ציטוטוקסיות סלקטיבית בתאי הגידול. גישה טיפולית זו עדיפה על השיטות הקונבנציונליות, הכוללות ניתוח, הקרנות וכימותרפיה5; זוהי טכניקה זעיר פולשנית המציגה ציטוטוקסיות נמוכה יותר ברקמות חיבור6. יישום האור והצטברות PS ישירות בגידול או במיקרו-סביבה שלו מבטיחים מיקוד מדויק, וכתוצאה מכך, תופעות לוואי מערכתיות קלות ובלתי רצויות7 ואפשרות לטיפול חוזר באותו אתר. יתר על כן, העלות נמוכה מזו של גישות אחרות. בשל התכונות המבטיחות שלה, PDT יכול להיחשב אופציה מתאימה עבור שניהם יחיד, במיוחד במקרה של גידולים שאינם ניתנים לניתוח, או טיפול בסרטן אדג'ובנטי7, ומייצג חלופה ל- MDR הקשורה לכימותרפיה 8,9.
הדו"ח הראשון שהראה שיעור תגובה אובייקטיבי גבוה באמצעות PDT תואר בשנת 1975 במודל10 של עכבר וחולדה. מאז, נערכו מחקרים באמצעות PDT עם תוצאות חיוביות7 הן in vivo והן in vitro עם קווי תאים סרטניים אנושיים בתרבית תאים דו-ממדית11,12. בהתחשב בתחולה הרחבה של PS שאושר קלינית, ללא קשר למסלולי ההצטברות הספציפיים שלהם ולטווחי אורכי הגל של פסגות הבליעה, התהליך הכללי הוא כדלקמן: (i) ספיגת PS, (ii) שיא של ריכוז PS בגידול או במיקרו-סביבה שלו, (iii) יישום אור, (iv) אינטראקציה PS-light, (v) העברת אנרגיה במצב התרגשות PS למצע רקמה או למולקולות חמצן הסובבות אותם, (vi) ייצור ROS הכולל חמצן סינגלט או אניון סופראוקסיד, (vii) מוות של תאי גידול באמצעות, למעשה, נמק או אפופטוזיס (מוות ישיר), אוטופגיה (מנגנון ציטופרוטקטיבי), איסכמיה של רקמות (נזק לכלי הדם), אפנון חיסוני, או חפיפה של מנגנונים אלה7. בשלב סופי זה, ההפעלה של מסלול מוות תאי מסוים תלויה בגורמים רבים, כגון מאפייני התא, תכנון ניסוי, והכי חשוב, לוקליזציה תוך-תאית של PS ונזק ממוקד הקשור ל-PDT13.
Verteporfin הוא דור שני של PS, שאושר על ידי סוכנויות רגולטוריות לשימוש קליני בנורווגיה ובסין לטיפול בניוון מקולרי הקשור לגיל7. לאחר מתן המינון, דווח כי פרודרוג זה מצטבר באופן חלקי במיטוכונדריה14 וגורם לזרחון חלבון תאי טירוזין ולפיצול DNA, מה שמוביל לאפופטוזיס של תאי הגידול15,16. לאחר דגירה של 24 שעות להפנמת ורטפורפין, מומלץ פרוטוקול PDT המשתמש במערך אורך גל של 690 ננומטר כדי להשיג רמות יעילות של העברת קרינה אלקטרומגנטית למולקולות סמוכות 7,17.
לגבי מקור האור עבור PDT, מערכות הלייזר הדיודה הקלאסיות הן בדרך כלל יקרות, מסובכות מבחינה טכנית, גדולות מדי, ולכן18,19 שאינן ניתנות להעברה. כתוצאה מפרופיל אורך הגל היחיד שלו, שניתן לצפות בו גם בציוד PDT מבוסס LED, הדרישה ליחידות עצמאיות עבור כל יישום פוטו-סנסיטייזר הופכת את השימוש במערכות לייזר דיודה למורכב עוד יותר ובלתי ישים מבחינה כלכלית20,21. לכן, השימוש במכונות LED נחשב לחלופה המבטיחה ביותר לפתרון לא רק עלויות22 ובעיות תחזוקה, אלא גם לספק תפוקת הספק גבוהה ופחות מזיקה 23 ויכולת תאורה רחבה יותר 24,25,26,27.
למרות התרומה הפוטנציאלית שציוד מבוסס LED יכול להציע לניסויי PDT28, לרוב האפשרויות המסחריות עדיין יש חסרונות כגון היעדר ניידות, עלות גבוהה ופרויקטי בנייה מורכבים ותפעול29. המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להציע כלי פשוט ואמין עבור מבחני PDT במבחנה . מאמר זה מתאר את PhotoACT, התקן PDT מבוסס LED שנבנה בתוך החברה, שהוא זול, ידידותי למשתמש ונייד. כהוכחת היתכנות, מכשיר זה הוכח כמגביר את הציטוטוקסיות של ורטפורפין במודל תרבית תאים דו-ממדית, ולכן יכול לשמש ככלי מחקר בניסויי PDT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. בניית מכשירים
- ראה לוחות סיבית בעובי 3 מ"מ בצפיפות בינונית (MDF) כדי לקבל חלקים עם הממדים המוצגים באיור 1A.
הערה: השתמש בקובץ הווקטורי (קובץ משלים 1) לחיתוך בקרה נומרית ממוחשבת (CNC). - בנה שתי תיבות במידות הבאות (אורך x רוחב x גובה): 330 מ"מ x 235 מ"מ x 225 מ"מ עבור התיבות הגדולות יותר, ו- 300 מ"מ x 220 מ"מ x 150 מ' עבור התיבות הקטנות יותר (איור 1B).
- קדח את גב הקופסה הגדולה יותר כדי להתקין מחבר לשקע חבית. קדחו את החלק העליון של הקופסה הגדולה ואת החלק העליון והתחתון של הקופסה הקטנה יותר כדי לספק מעבר לכבלי חשמל (איור 1C).
- צבעו את כל המשטחים הפנימיים בדיו שחור כדי לקדם שכיחות אור הומוגנית (איור 1D).
- חברו, במקביל, שלוש קלטות LED עם 10 נוריות LED כל אחת במשטח הפנימי העליון של התיבה הקטנה יותר (איור 1E).
- התקינו חיישן בהירות במרכז המשטח הפנימי התחתון של הקופסה הקטנה יותר (איור 1F).
- הדפס את מבנה יחידת הבקרה (איור 1G) באמצעות קובץ ההדפסה התלת-ממדית (קובץ משלים 2).
- התקן את כל הרכיבים (לחצן הפעלה, פוטנציומטרים, לוח מגע של זמן/התחלה, נוריות LED, חיישן בהירות, LCD, זמזם וספק כוח) ביציאות של לוח בקרה ESP32 המותקן בתא המטען של יחידת הבקרה (איור 2).
- העלה את קוד התכנות (קובץ משלים 3, קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5) והפעל בדיקה כדי לבדוק שכל החיבורים פועלים (איור 1H).
- הרכיבו את הקופסאות ותיקנו אותן יחד כדי למנוע רווחים, וכתוצאה מכך הפרעות אור חיצוניות ואובדן אור שנפלט. חברו את יחידת הבקרה המותקנת לאזור הקדוח בחלק העליון של אב הטיפוס (איור 1I).
- תקן דלת כניסה מאותו חומר ומידות 330 מ"מ x 225 מ"מ (אורך x רוחב) על הקופסה הגדולה יותר עם שני צירים קטנים. כמו כן, חברו קלטות סקוטש הצידה לקופסה הגדולה יותר כדי לחזק את סגירת אב הטיפוס (איור 1J). התקן ידית כדי לתפעל את דלת הכניסה של הציוד.
- חברו ארבע רפידות גומי לרגליים בתחתית אב הטיפוס כדי להבטיח יציבות רבה יותר במהלך הפעולות (איור 1K).
2. קווי תאים: טיפוח, זריעה וטיפול
- כימיקלים
- ממיסים את הפורפירין בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להשיג ריכוז של 100 mM.
התראה: יש לתמרן את DMSO בזהירות (טיפול עם שימוש בציוד מגן אישי ובאזור מאוורר). טפל בזהירות הן במלאי והן בפתרונות מדוללים כדי למנוע חשיפה מוגזמת לאור.
- ממיסים את הפורפירין בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להשיג ריכוז של 100 mM.
- שורות תאים
- טפחו את קו תאי ה-HeLa במדיום דל הגלוקוז (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% גנטמיצין.
- שמור את צלוחיות התרבית באינקובטור תרבית תאים 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס.
- נהל ובדוק את התאים עד שהם מגיעים למפגש של 80%-90%.
- תהליך הזריעה
- הסר את מדיום התרבות מהבקבוקון.
- לשטוף את מונולאייר התא עם PBS.
- נתק את תרבית התאים המפגשים עם טריפסין-EDTA (0.5%) 1x למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להפסיק את הפעולה של טריפסין על ידי החייאת התאים עם מדיום תרבית בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו 1% gentamicin.
- סופרים את התאים שעברו החייאה בעזרת המוציטומטר וזורעים אותם לצלחת של 96 בארות ב-2.0 × 104 תאים /באר.
- מכינים שתי צלחות לתנאי חושך ובהיר.
- לדגור את הצלחות במשך 24 שעות עבור חיבור התא.
- תהליך הטיפול
- הסר את המדיום משני לוחות 96 הבאר.
- לטפל בתאים עם 100 μL של ריכוזים הולכים וגדלים של verteporfin (0.045 עד 24 μM, דילול סדרתי).
- לדגור על התאים עם טיפול תרופתי במשך 24 שעות כדי לאפשר הפנמה של verteporfin.
- לאחר 24 שעות, יש להשליך את המדיום המכיל את התרופה, לשטוף את המונולייר של התאים עם PBS (100 μL), ולהוסיף מדיום ללא תרופות (100 μL).
- כסו מיקרו-פלטה אחת ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני חשיפה לאור ודגרה עליה למשך 24 שעות. לוח זה יספק נתוני בקרה עבור תוצאות PDT (מצב כהה). המיקרו-פלטה השנייה תשמש בתנאי החשיפה לאור במכשיר.
3. הפעלת המכשיר
- חבר את התקן ה-PDT לשקע החשמל והפעל אותו על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה .
- הכנס את המיקרו-פלטה השנייה (מצב אור) למכשיר PDT וסגור את הציוד על ידי הידוק דלת הכניסה עם קלטות הסקוץ'.
- השתמש בפוטנציומטרים כדי להתאים את תצורת ה- RGB (ניסוי RGB 255, 255, 255 כאן) ולהגדיר את צבע פליטת האור.
הערה: לכל שילוב RGB יש ספקטרום פליטה מסוים, אותו יש להתאים לניסויים עם פוטו-סנסיטייזרים שונים, וכתוצאה מכך, עקומות ספיגה שונות. - לחץ על לוח המגע (+)/(- ) כדי להתאים את תצורת הזמן (ניסוי של 60 דקות כאן) ולהגדיר את משך הבדיקה .
הערה: תצורת הזמן, בשיתוף עם ערך ההקרנה, תקבע את השטף של התהליך - מינון האור המיושם בבדיקה. - בדוק את פרטי ההגדרה בתצוגה.
- לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל את הבדיקה. ודא כי זמזם של צפצוף אחד נשמע בתחילת הבדיקה.
- במהלך הניסוי, התבונן במידע בזמן אמת על הצג, כגון הקרנה וזמן שנותר.
- אל תפתח את דלת הכניסה ואל תשנה תצורה כלשהי במהלך בדיקת PDT.
- בסוף הבדיקה, המתן לזמזם של ארבעה צפצופים ולמערכת האלקטרונית שתכבה את כל נוריות ה- LED. שימו לב להודעה מוגמרת ולכמות האנרגיה הסופית שהושקעה במהלך הניסוי בתצוגה.
הערה: הערך הסופי של השטף מחושב באמצעות משוואה (1):
(1)
כאשר F שווה ל-J/cm 2 ו-I שווה ל-mW/cm 2 או mJ/s·cm 2. ערך ההקרנה לוקח בחשבון את העוצמה של נורות ה- LED (מקור פולט) והאזור המוקרן באופן אחיד של התא הכהה (660 ס"מ 2) (משוואה [2]):
(2)
ערך ההקרנה התיאורטית מוצג בתצוגת ההתקן לאורך כל בדיקת PDT. בסוף הפעולה, השתמש במשוואה (3) כדי לחשב את הפלואנס:
פלואנס (F) = הקרנה (I, ערך קבוע) × זמן פעולה (ים) (3)
(1)
(2)4. בדיקת כדאיות התא
- לאחר בדיקת PDT, כסו את המיקרו-פלטה שנחשפה לאור ודגרו במשך 24 שעות.
- לאחר תקופת הדגירה, הסר את מדיום התרבית משתי הצלחות, שטף את המונולייר של התאים עם PBS (100 μL), והוסף תמיסת MTT (0.5 מ"ג / מ"ל, 100 μL). דגירה של שני הלוחות - תנאים כהים ובהירים - במשך 4 שעות כדי לאפשר היווצרות גביש פורמאזן.
- הסר את תמיסת ה-MTT בזהירות והמיס את הגבישים הסגולים בתמיסת DMSO/אתנול (1:1).
- לאחר פירוק מלא של הגבישים, בצע את מדידת הספיגה באמצעות קורא microplate ב 595 ננומטר.
הערה: ניתן להשתמש במכשיר בניסויים חשובים אחרים כגון מוות תאי בתיווך ROS המופעל על ידי פוטוסנסיטייזרים לאחר חשיפה לאור על ידי ציטומטריה של זרימה30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכשיר ה-PDT הסופי, שנקרא PhotoACT, כלל תא כהה להקצאת עד ארבעה מיקרו-לוחות מרובי משתתפים, כאשר המשטח הפנימי העליון שלו מצויד בקבוצה של 30 נורות LED מפוזרות המתוכנתות לפלוט ספקטרום שונה של אור נראה (איור 3 וקובץ משלים 6). המכשיר נבנה באמצעות שתי תיבות משויכות: קופסה פנימית שתוכננה כתא כהה עבור מבחני PDT, וקופסה חיצונית לכיסוי התא הפנימי ולהחזקת יחידת הבקרה (איור 1B). הקופסה הפנימית נצבעה בשחור (איור 1D) והורכבה מדגם קלטת של LED RGB WS2812 (או WS281B) עם 30 נוריות LED ואורך של מטר אחד (שנחתך מאוחר יותר לשלושה חלקים) ו-9 וואט, המכיל מעבד מובנה. מנגנון זה איפשר ניצול מבוקר יותר, וכתוצאה מכך, פליטת צבע מדויקת יותר. 30 נוריות ה-LED חולקו באופן שווה על פני כל המשטח הפנימי העליון של תא ה-PDT על-ידי שלוש קלטות מקבילות עם 10 נוריות LED כל אחת (איור 1E). נקבעה שכיחות אור הומוגנית בשל הרפלקטיביות הנמוכה של המשטחים הפנימיים השחורים וההתפלגות האחידה של תצורת ה-LED. חיישן בהירות TSL2561 שולב גם במרכז התחתון של התיבה הפנימית כדי לציין את שכיחות האור ולשמש ככלי בקרת איכות, המבטיח אחידות הקרנה בתוך התא החשוך (טבלה משלימה S1) וניטור העוצמה של מערכת ה-LED, שידוע שיש לה מספר מסוים של שעות של חיים שימושיים (איור 1F ). הקופסה החיצונית היא מבנה המכסה את הקופסה הפנימית, המורכבת משישה חלקי MDF, צבועים באפור וחתוכים בלייזר להתאמה מושלמת (איורים 1A,B). יחידת הבקרה תוכננה באמצעות תוכנה מקוונת 31, תלת מימד מודפס עם חומצה פולילקטית כחלק אחד באמצעות מדפסת3D, וצבוע אפור. הוא מכיל את כל רכיבי האלקטרוניקה, כולל תצוגה, פוטנציומטרים, כפתורים וזמזם (איור 1I ואיור 2).
כדי לאפשר התאמות עצמאיות של שכיחות האור, לוח הבקר ESP32 נבחר לשלב את יחידת הבקרה (איור 2). תצורה זו אמורה לאפשר ממשק USB לתכנות, Bluetooth, Wi-Fi, מעבד ליבה כפולה, יציאות רבות ויכולת לתקשר עם מעגל משולב (I2C), ממשק היקפי טורי (SPI) וממשקים אחרים. להפעלת המערכת נכתבה תוכנה בשפת C באמצעות סביבת פיתוח משולבת (IDE). מבנה הקוד32 מבוסס על FreeRTOS, מערכת תפעולית חופשית בזמן אמת הנתמכת על ידי לוח בקר ESP32. הלוגיקה המופנה מאפשרת תכנות יישומים עצמאיים, אשר יכול להיות מעובד על ידי ESP32 בגישות echeloned או מקבילות, מה שהופך את הפרויקט ואת תהליכי התחזוקה, השיפור והעדכון שלו הרבה יותר תכליתי ומאובטח.
הממשק בין המכונה למפעיל הוא ידידותי למשתמש ומורכב מתצוגת גביש נוזלי (LCD), פוטנציומטרים, כפתורים וזמזם (איור 3 וקובץ משלים 6). ה- LCD הקטן, 16 מ"מ x 2 מ"מ (עמודים לעומת קווים) היה בקר HD44780 מובנה עם פרוטוקול תקשורת I2C, אשר מקנה את קלות ההתקנה ואת צדדיות השידור, בהתאמה. ההגדרה הראשונית כוללת RGB והתאמות זמן על ידי המפעיל. ניתן לכוונן את גודל האור ואת תצורת הצבע באמצעות הפוטנציומטרים, המשנים את העוצמה (0 עד 255) של שלושת רכיבי הצבע הבסיסיים - RGB. התאמות אלה יכולות לגרום למספר קומפוזיציות צבע שטופלו בטבלת צבעי RGBהבינלאומית 33. לכל הרכב RGB יש אורך גל מסוים, אשר חייב להיות מותאם על פי PS המשמש בניסוי PDT; עקומת הספיגה של PS ואורך הגל של ההקרנה חייבים להיות חופפים כדי שהפוטואקטיבציה תתרחש באופן משביע רצון (איור משלים S1). לאורך התהליך, ניתן לגשת למצב הפעולה עם הזמן שנותר ולמידע על שכיחות האור ב- LCD.
בסוף הזמן המתוכנת, מערכת האלקטרוניקה כיבתה את כל נוריות ה-LED, פלטה אזהרה קולית והראתה בתצוגה את כמות האנרגיה הכוללת לכל שטח (J/cm²), אשר חושבה על ידי הכפלת הערך הקבוע של קרינה בזמן הפעולה בשניות. דגם דיגיטלי זה הציג טווח רחב של רמות גילוי (מגבלות בין 0.1 ל-40,000+ לוקס), ממשק I2C וזרם חשמלי בעוצמה נמוכה (0.5 mA ו-15 μA במצב פעולה והמתנה, בהתאמה).
כהוכחת היתכנות, המכשיר שימש להגברת ההשפעה הציטוטוקסית של ורטפורפין בתרבית תאי HeLa דו-ממדית לאחר חשיפה לאור של שעה אחת (49.1 ± 0.6 J/cm2). כפי שניתן לראות באיור 4A, ערך GI50 היה 3.1 μM עבור מצב האור ו-13.8 μM עבור המצב הכהה. לפיכך, ההסטה של פי 4.4 המשווה בין התנאים אימתה את השימוש בוורטיפורף כ-PS ואת תחולת PhotoACT למבחני PDT. כדי לאמת את השימוש באב הטיפוס המתואר בעבודה זו, נעשה שימוש במכשיר PDT מסחרי באותם תנאי ניסוי, כולל PS, תאים ופלואנס, והתוצאות הושוו. כפי שניתן לראות באיור 4B, שני המכשירים ביצעו פוטו-פורפין באותה מידה, ובכך שיפרו את האפקט הציטוטוקסי. תוצאות אלה אישרו את תחולתו של התקן זה בהתקן PDT שנבנה בבית (איור 4A,B). לבסוף, מוות תאי בתיווך ROS שנגרם על-ידי verteporfin לאחר חשיפה לאור אושר על-ידי ציטומטריה של זרימה באמצעות בדיקת DCFDA (איור 4C,D).
איור 1: הוראות בנייה והרכבה של PhotoACT. המחשה מפורטת של בנייה, קידוח, צביעה, הרכבה ואבזור רכיבים לתוך המכשיר. החלונית מציגה מדריך שלב אחר שלב לבניית ההתקן. קיצור: LED = דיודה פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: בניית יחידת הבקרה והוראות התקנה אלקטרוניות. שרטוט תצוגה זום של יחידת בקרה שהתפוצצה וסכימה מפורטת של חיבורים אלקטרוניים ביציאות לוח בקר ESP32 עם חיבורים ורכיבים המשמשים באב הטיפוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ייצוג PhotoACT. שרטוט הרכבה של עיצוב המוצר הסופי עם שטר חומרים, סימון בלונים ותצוגה מפורטת של נוריות הפנים העליונות. הדמות מאפשרת לזהות חלקים ורכיבים של אב הטיפוס. קיצורים: MDF = סיבית בצפיפות בינונית; LED = דיודה פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: פוטוטוקסיות במבחנה של יצירת ורטפורפין ו-ROS. (A,B) בדיקת כדאיות התא שבוצעה בשיטת MTT: הבדיקות נערכו כדי להעריך את הפרופיל הציטוטוקסי של הפוטוסנסיטייזר verteporfin בריכוזים שונים. תאי HeLa טופלו במשך 24 שעות עם ריכוזים שונים של verteporfin (0.045-24 μM), חשופים לאור (PhotoACT (A) או ציוד PDT מסחרי (B)) או תנאים כהים, ולאחר מכן נתון לבדיקת MTT. שני התנאים הראו ירידה בחיוניות התא בריכוזים גבוהים יותר של verteporfin, אך החשיפה לאור - שהתקבלה מבדיקות PDT - שיפרה את הפרופיל הציטוטוקסי של ה-PS, מה שמרמז על כך ש-PDT משפר את הציטוטוקסיות של verteporfin. עקומות הכדאיות הותאמו באמצעות תוכנת GraphPad Prism 6. (ג,ד) תאי HeLa טופלו במשך 24 שעות עם ריכוזים נמוכים וגבוהים של ורטפורפין (0.187 μM ו-6 μM) ולאחר מכן נחשפו לאור (PhotoACT) או לתנאים כהים. רמות ROS תוך-תאיות נמדדו לאחר הקרנה על ידי ציטומטריה של זרימה באמצעות בדיקת DCFDA (דגירה במשך 30 דקות ב-1 מיקרומטר). תזוזה ימינה בין ההיסטוגרמות רמזה על עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר בגלל הצטברות תוך-תאית גבוהה יותר של DCF, ולכן, רמות ROS גבוהות יותר. התוצאות לא הראו הבדל רלוונטי ברמות ה-ROS במצב הכהה (C), אך הראו עלייה במינון התגובה ברמות ה-ROS לאחר פוטואקטיבציה של ורטפורפין (D). קיצורים: ROS = מיני חמצן תגובתי; DCF = 2',7'-dichlorofluorescein; DCFDA = 2',7'-דיכלורוהידרופלואורסצין דיאצטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תרשים זרימת ההחלטות של המכשיר: הגדרה ראשונית ופתרון בעיות תפעול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים S1: חפיפה בין עקומת הספיגה של verteporfin לבין ספקטרום פליטת ה-LED של המכשיר. ספקטרום ספיגה של ורטפורפין עם שיאי הספיגה הספציפיים שלו (x,y') וספקטרום פליטת LED של RGB 255, 255, 255-צבע לבן (3,700K-5,000K CCT) המשמש לפוטו-אקטיביזם של הפוטוסנסיטייזר (x,y'"). החפיפה בין פסגות הספיגה השונות של ורטפורפין לבין האור הלבן המקרין מאששת את הפוטואקטיבציה של הפוטוסנסיטייזר, שאושרה גם על ידי התוצאות הביולוגיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S1: בדיקות אחידות קרינה. בהירות מיידית (לומן) נמדדת על-ידי חיישן הבהירות בנקודות שונות של האזור המוקרן. התוצאות המוצגות אינן מראות וריאציה אקספרסיבית, המעידה על הקרנה אחידה של המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: קובץ וקטורי לחיתוך. קובץ ציור (DWG) לחיתוך לוח MDF. הקובץ חייב לשמש לחיתוך בקרה נומרית (CNC) במחשב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: קובץ הדפסה תלת-ממדית של פקד היחידה. קובץ סטריאוליתוגרפיה (STL) להדפסת תלת-ממד של יחידת הבקרה של ההתקן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: קוד תכנות C. קוד תכנות שפותח בשפת C להגדרת יחידת הבקרה של הציוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 4: קוד תכנות INO. קוד תכנות שפותח בשפת INO להגדרת יחידת הבקרה של הציוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 5: הוראות הידור. Markdown (MD) "קרא אותי" קובץ עם הוראות נוספות לאיסוף קוד תכנות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 6: מודל העיצוב של המכשיר. תצוגה מקדימה של התקן עבור קובץ המודל התלת-ממדי של חילופי נתוני מוצר (STEP) לתצוגה חזותית כללית של אב הטיפוס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מכשיר PhotoACT הסופי היה נוח לבנייה עם רכיבים זמינים מסחרית בעלות נמוכה בעלות כוללת של פחות מ-$50. יתרונות נוספים כוללים דרישות תחזוקה נמוכות, יכולת להקרין סוגים רבים של לוחות תרבית, שימוש בו זמנית של עד ארבע יחידות לכל בדיקה, משקל נמוך (2 ק"ג)/גודל (44 ס"מ3) המאפשר ניידות, הקרנה מדויקת וניתנת לשחזור (נתונים שאינם מוצגים), וממשק התקנה ידידותי למשתמש ופשוט שאינו דורש חיבור למחשבים או למכונות אחרות.
שלבים קריטיים מסוימים של פרוטוקולי הבנייה והתפעול הולידו הזדמנויות לשיפור במהלך תפיסת הפרויקט. מכיוון שתא PDT דורש פליטת אור הומוגנית ומדידת אנרגיה עקבית, התיבות הפנימיות והחיצוניות נאטמו כדי למנוע הפרעות אור חיצוניות ואובדן אור שנפלט. קלטות סקוטש נוספות תוקנו לצדדים בדלת הקדמית כדי לחזק את סגירת התא ולהבטיח ניסויים ללא הפרעה. נורית LED מייצגת הותקנה ביחידת הבקרה כדי לאשר את תצורת ה-RGB הנדרשת, המציינת את הצבע והעוצמה של האור הנפלט במהלך הבדיקה. לבסוף, קוד התכנות עבר מספר שדרוגים כדי לחדד מדידות צפיפות מיידיות וכמויות סופיות של הערכות אנרגיה, תוך שמירה על יכולת שכפול ועקביות מתמטית. כמה פרטים עיקריים אחרים הדורשים תשומת לב נוספת כוללים: (i) התפלגות הומוגנית של נורות LED ומיקום מרכזי של חיישן הבהירות כדי להשיג תוצאות מייצגות ומאוזנות, (ii) התקנה של כל הרכיבים על פי הדיאגרמה האלקטרונית (איור 2) וקוד התכנות (קובץ משלים 3, קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5 ) כדי להבטיח פעולה נכונה, וכן (iii) את ההגדרה (שמירה על אותה תצורת RGB וזמן) לפני הפעלת ניסוי כדי להבטיח שכפולים עקביים עם תוצאות אמינות. למרות שמערכת RGB מספקת מספר קומפוזיציות של צבעים גלויים עם אורכי גל ספציפיים, ניסויים באור שאינו נראה ידרשו שדרוגי פרוטוקול ספציפיים. תרשים זרימה של החלטה מוצג באיור 5 כדי לספק גישה שיטתית לפתרון בעיות כדי לאתר ולתקן בעיות או שגיאות במהלך הפעולה.
PhotoACT, שתוכנן לעמוד בדרישות של ניסויים במבחנה עם תוצאות מאומתות המתקבלות עם הפעלה טיפולית של ורטפורפין כדי לגרום לציטוטוקסיות בתאי HeLa דו-ממדיים (איור 4), יכול להיות מומלץ לאוניברסיטאות, בתי ספר, תעשיות ומרכזי מחקר אחרים. מכשיר זה אמור להרחיב את היתרונות של PDT למחקר מדעי הבוחן את מנגנון הפעולה של פוטו-סנסיטייזרים ואת היישומים הקליניים שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לארתור אנריקה גומז דה אוליביירה ולוקאס ג'וליאן קרוז גומז על שעזרו בתהליך הצילומים. פרויקט זה נתמך על ידי מועצת המחקר הברזילאית (CNPq, מספרי מענקים 400953/2016-1-404286/2021-6) ו- Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). מחקר זה מומן בחלקו גם על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A.
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R.
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
