Summary
Qui, descriviamo un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire con successo saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT) utilizzando colture cellulari HeLa bidimensionali e verteporfina come fotosensibilizzante.
Abstract
Questo documento descrive un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT), chiamato PhotoACT. Il dispositivo è stato costruito utilizzando una serie di diodi emettitori di luce programmabili convenzionali (LED), un modulo display a cristalli liquidi (LCD) e un sensore di luce collegato a una scheda microcontroller commerciale. La struttura scatolare del prototipo è stata realizzata con pannelli di fibra a media densità (MDF). Il compartimento interno può allocare contemporaneamente quattro micropiastre multipozzetto per colture cellulari.
Come prova di concetto, abbiamo studiato l'effetto citotossico della verteporfina fotosensibilizzatrice (PS) contro la linea cellulare HeLa in coltura bidimensionale (2D). Le cellule HeLa sono state trattate con concentrazioni crescenti di verteporfina per 24 ore. Il mezzo di supernatante contenente farmaco è stato scartato, le cellule aderenti sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ed è stato aggiunto terreno privo di farmaci. In questo studio, l'effetto della verteporfina sulle cellule è stato esaminato senza esposizione alla luce o dopo l'esposizione per 1 ora alla luce utilizzando valori rosso-verde-blu (RGB) di 255, 255 e 255 (fluenza media di 49,1 ± 0,6 J / cm2). Dopo 24 ore, la vitalità cellulare è stata valutata mediante il test 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT).
I risultati sperimentali hanno mostrato che l'esposizione delle cellule trattate con verteporfina alla luce del dispositivo aumenta l'effetto citotossico del farmaco attraverso un meccanismo mediato da specie reattive dell'ossigeno (ROS). Inoltre, l'uso del prototipo descritto in questo lavoro è stato convalidato confrontando i risultati con un dispositivo PDT commerciale. Pertanto, questo prototipo di terapia fotodinamica basata su LED rappresenta una buona alternativa per gli studi in vitro di PDT.
Introduction
Tra le malattie non trasmissibili più letali, il cancro rappresenta una delle principali cause globali di morte prematura. Ha rappresentato quasi 10 milioni di morti nel 2020, rappresentando circa un decesso su sei in tutto il mondo1. Inoltre, il fenomeno della resistenza multifarmaco (MDR) rappresenta una tremenda minaccia per la salute pubblica, poiché i protocolli chemioterapici approvati non riescono a raggiungere le fasi di remissione per questa condizione clinica2. Le cellule tumorali possono sviluppare resistenza alla chemioterapia attraverso diversi meccanismi; tuttavia, la sovraespressione di alcuni trasportatori di cassette leganti ATP (ABC) - pompe di efflusso ATP-dipendenti - è considerata la causa principale dello sviluppo di MDR all'interno di un microambiente tumorale3. Oltre all'MDR, altre complicanze del cancro, come la recidiva e le metastasi, rafforzano l'urgente richiesta di sviluppare e migliorare gli approcci terapeutici per superare questa sfida oncologica.
L'utilizzo curativo della luce è stato praticato per secoli4 e la terapia fotodinamica (PDT) rappresenta un approccio terapeutico clinicamente approvato per i tumori solidi. La PDT combina la somministrazione di un fotosensibilizzatore (PS) seguita da irradiazione luminosa per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS) per esercitare citotossicità selettiva nelle cellule tumorali. Questo approccio terapeutico è superiore ai metodi convenzionali, tra cui chirurgia, radioterapia e chemioterapia5; È una tecnica minimamente invasiva che mostra una minore citotossicità nei tessuti connettivi6. L'applicazione della luce e l'accumulo di PS direttamente nel tumore o nel suo microambiente assicurano un targeting preciso e, di conseguenza, effetti collaterali sistemici minori e indesiderati7 e la possibilità di ripetere il trattamento nella stessa sede. Inoltre, il costo è inferiore a quello di altri approcci. Per le sue caratteristiche promettenti, la PDT può essere considerata un'opzione appropriata sia per il trattamento del cancro singolo, soprattutto nel caso di tumori inoperabili, sia per il trattamento adiuvante del cancro7, e rappresenta un'alternativa per MDR correlato alla chemioterapia 8,9.
Il primo rapporto che mostrava un alto tasso di risposta obiettiva usando PDT è stato descritto nel 1975 in un modello di topo e ratto10. Da allora, sono stati condotti studi utilizzando PDT con esiti positivi7 sia in vivo che in vitro con linee cellulari tumorali umane in coltura cellulare 2D11,12. Considerando l'ampia applicabilità della PS clinicamente approvata, indipendentemente dalle loro specifiche vie di accumulo e dagli intervalli di lunghezze d'onda dei picchi di assorbimento, il processo generale è il seguente: (i) assorbimento di PS, (ii) picco della concentrazione di PS nel tumore o nel suo microambiente, (iii) applicazione della luce, (iv) interazione PS-luce, (v) trasferimento di energia allo stato eccitato di PS al substrato tissutale o alle molecole di ossigeno circostanti, (vi) produzione di ROS che coinvolge ossigeno singoletto o anione superossido, (vii) morte delle cellule tumorali attraverso, essenzialmente, necrosi o apoptosi (morte diretta), autofagia (meccanismo citoprotettivo), ischemia tissutale (danno vascolare), modulazione immunitaria o una sovrapposizione di questi meccanismi7. In questa fase finale, l'attivazione di una specifica via di morte cellulare dipende da molti fattori, come le caratteristiche cellulari, il disegno sperimentale e, soprattutto, la localizzazione intracellulare della PS e il danno mirato correlato alla PDT13.
La verteporfina è una PS di seconda generazione, approvata dalle agenzie regolatorie per uso clinico in Norvegia e Cina per il trattamento della degenerazione maculare legata all'età7. Dopo la somministrazione della dose, è stato riportato che questo profarmaco si accumula parzialmente nei mitocondri14 e induce la fosforilazione della tirosina proteica cellulare e la frammentazione del DNA, portando all'apoptosi delle cellule tumorali15,16. Dopo 24 ore di incubazione per l'internalizzazione delle verteporfine, si raccomanda un protocollo PDT che utilizza una configurazione di lunghezza d'onda di 690 nm per ottenere livelli efficaci di trasferimento di radiazione elettromagnetica alle molecole adiacenti 7,17.
Per quanto riguarda la sorgente luminosa per PDT, i classici sistemi laser a diodi sono solitamente costosi, tecnicamente complicati, sovradimensionati e quindi non portatili18,19. Come conseguenza del suo profilo a lunghezza d'onda singola, che può essere osservato anche nelle apparecchiature PDT basate su LED, la richiesta di unità indipendenti per ogni applicazione di fotosensibilizzatori rende l'utilizzo di sistemi laser a diodi ancora più complesso ed economicamente impraticabile20,21. Pertanto, l'utilizzo di macchinari a LED è considerato l'alternativa più promettente per risolvere non solo i costi22 e problemi di manutenzione, ma anche per fornire un'elevata potenza e meno dannosa 23 e una più ampia capacità di illuminazione 24,25,26,27.
Nonostante il potenziale contributo che le apparecchiature basate su LED possono offrire agli esperimenti PDT28, la maggior parte delle opzioni commerciali presenta ancora inconvenienti come la mancanza di portabilità, costi elevati e complessi progetti di costruzione e funzionamento29. L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di offrire uno strumento semplice e affidabile per i saggi PDT in vitro . Questo documento descrive PhotoACT, un dispositivo PDT basato su LED costruito internamente, che è economico, facile da usare e portatile. Come prova di concetto, questo dispositivo ha dimostrato di migliorare la citotossicità della verteporfina in un modello di coltura cellulare 2D e, pertanto, può essere utilizzato come strumento di ricerca negli esperimenti PDT.
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Protocol
NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Costruzione del dispositivo
- Segare pannelli di fibra a media densità (MDF) spessi 3 mm per ottenere pezzi con le dimensioni mostrate in Figura 1A.
NOTA: utilizzare il file vettoriale (file supplementare 1) per il taglio a controllo numerico computerizzato (CNC). - Costruire due scatole con le seguenti dimensioni (lunghezza x larghezza x altezza): 330 mm x 235 mm x 225 mm per le scatole più grandi e 300 mm x 220 mm x 150 m per le scatole più piccole (Figura 1B).
- Forare il retro della scatola più grande per installare un connettore jack barile. Forare la parte superiore della scatola più grande e la parte superiore e inferiore della scatola più piccola per fornire un passaggio per i cavi elettrici (Figura 1C).
- Dipingete tutte le superfici interne con inchiostro nero per favorire un'incidenza omogenea della luce (Figura 1D).
- Attaccare, in parallelo, tre nastri LED con 10 LED ciascuno sulla superficie interna superiore della scatola più piccola (Figura 1E).
- Installare un sensore di luminosità al centro della superficie interna inferiore della scatola più piccola (Figura 1F).
- Stampare la struttura dell'unità di controllo (Figura 1G) utilizzando il file di stampa 3D (file supplementare 2).
- Installare tutti i componenti (pulsante di accensione, potenziometri, touchpad tempo/avvio, LED, sensore di luminosità, LCD, cicalino e alimentatore) alle porte di una scheda di controllo ESP32 montata all'interno dell'unità di controllo (Figura 2).
- Caricare il codice di programmazione (file supplementare 3, file supplementare 4 e file supplementare 5) ed eseguire un test per verificare che tutte le connessioni funzionino (Figura 1H).
- Assemblare le scatole e fissarle insieme per evitare spazi vuoti, e di conseguenza interferenze luminose esterne e perdite di luce emesse. Collegare l'unità di controllo montata all'area forata nella parte superiore del prototipo (Figura 1I).
- Fissare una porta anteriore dello stesso materiale e dimensioni 330 mm x 225 mm (lunghezza x larghezza) sulla scatola più grande con due cerniere piccole. Inoltre, attaccare i nastri in velcro lateralmente alla scatola più grande per rinforzare la chiusura del prototipo (Figura 1J). Installare una maniglia per manipolare la porta anteriore dell'apparecchiatura.
- Fissare quattro piedini in gomma nella parte inferiore del prototipo per garantire una maggiore stabilità durante le operazioni (Figura 1K).
2. Linee cellulari: coltivazione, semina e trattamento
- Prodotti chimici
- Sciogliere la porfirina in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una concentrazione di 100 mM.
ATTENZIONE: il DMSO deve essere manipolato con attenzione (manipolazione con l'uso di dispositivi di protezione individuale e in un'area ventilata). Manipolare accuratamente sia le soluzioni grezze che quelle diluite per evitare un'eccessiva esposizione alla luce.
- Sciogliere la porfirina in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una concentrazione di 100 mM.
- Linee cellulari
- Coltivare la linea cellulare HeLa nel mezzo a basso contenuto di glucosio Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di gentamicina.
- Conservare i palloni di coltura in un incubatore per colture cellulari al 5% di CO2 a 37 °C.
- Gestire e ispezionare le celle fino a raggiungere l'80% -90% di confluenza.
- Processo di semina
- Rimuovere il terreno di coltura dal pallone.
- Lavare il monostrato cellulare con PBS.
- Staccare la coltura cellulare confluente con tripsina-EDTA (0,5%) 1x per 5 minuti a 37 °C. Interrompere l'azione della tripsina risospendendo le cellule con terreno di coltura integrato con siero bovino fetale al 10% e gentamicina all'1%.
- Contare le cellule risospese con un emocitometro e seminarle in una piastra a 96 pozzetti a 2,0 × 104 cellule / pozzetto.
- Preparare due piastre per condizioni di buio e luce.
- Incubare le piastre per 24 ore per l'attacco cellulare.
- Processo di trattamento
- Rimuovere il mezzo da entrambe le piastre a 96 pozzetti.
- Trattare le cellule con 100 μL di concentrazioni crescenti di verteporfina (da 0,045 a 24 μM, diluizione seriale).
- Incubare le cellule con un trattamento farmacologico per 24 ore per consentire l'internalizzazione delle verteporfine.
- Dopo 24 ore, scartare il mezzo contenente il farmaco, lavare il monostrato di cellule con PBS (100 μL) e aggiungere terreno senza farmaco (100 μL).
- Coprire una micropiastra con un foglio di alluminio per proteggerla dall'esposizione alla luce e incubarla per 24 ore. Questa piastra fornirà i dati di controllo per i risultati PDT (condizione di buio). L'altra micropiastra verrà utilizzata sulla condizione di esposizione alla luce nel dispositivo.
3. Funzionamento del dispositivo
- Collegare il dispositivo PDT alla presa elettrica e accenderlo premendo il pulsante di accensione .
- Posizionare l'altra micropiastra (condizione di luce) nel dispositivo PDT e chiudere l'apparecchiatura fissando la porta anteriore con i nastri in velcro.
- Utilizzare i potenziometri per regolare la configurazione RGB (un esperimento RGB 255, 255 , 255 qui) e impostare il colore dell'emissione luminosa.
NOTA: Ogni combinazione RGB ha uno spettro di emissione specifico, che deve essere regolato per esperimenti con diversi fotosensibilizzatori e, di conseguenza, diverse curve di assorbanza. - Premere il touchpad (+)/(- ) per regolare la configurazione temporale (un esperimento di 60 minuti qui) e impostare la durata del test.
NOTA: La configurazione temporale, in associazione con il valore di irraggiamento, determinerà la fluenza del processo, la dose luminosa applicata nel test. - Controllare le informazioni di configurazione sul display.
- Premere il pulsante Start per avviare il test. Assicurarsi che all'inizio del test si senta un segnale acustico un cicalino.
- Nel corso dell'esperimento, osservare le informazioni in tempo reale sul display, come l'irradianza e il tempo rimanente.
- Non aprire lo sportello anteriore né modificare alcuna configurazione durante il test PDT.
- Alla fine del test, attendere un cicalino a quattro bip e che il sistema elettronico spenga tutti i LED. Osservare un messaggio Finito e la quantità finale di energia spesa - fluenza - durante l'esperimento nel display.
NOTA: il valore finale della fluenza viene calcolato utilizzando l'equazione (1):
(1)
Dove F è uguale a J/cm 2 e I è uguale a mW/cm 2 o mJ/s·cm 2. Il valore di irraggiamento considera la potenza dei LED (sorgente emittente) e l'area uniformemente irradiata della camera oscura (660 cm 2) (equazione [2]):
(2)
Il valore teorico di irradianza viene visualizzato sul display del dispositivo durante l'intero test PDT. Alla fine dell'operazione, utilizzare l'equazione (3) per calcolare la fluenza:
Fluenza (F) = irradianza (I, valore costante) × tempo di funzionamento (s) (3)
(1)
(2)4. Saggio di vitalità cellulare
- Dopo il test PDT, coprire la micropiastra esposta alla luce e incubare per 24 ore.
- Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il terreno di coltura da entrambe le piastre, lavare il monostrato di cellule con PBS (100 μL) e aggiungere la soluzione MTT (0,5 mg / ml, 100 μL). Incubare entrambe le piastre - condizioni scure e chiare - per 4 ore per consentire la formazione di cristalli formazan.
- Rimuovere accuratamente la soluzione MTT e sciogliere i cristalli viola con una soluzione di DMSO/etanolo (1:1).
- Dopo completa dissoluzione dei cristalli, effettuare la misura dell'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre a 595 nm.
NOTA: Il dispositivo può essere utilizzato in altri importanti esperimenti come la morte cellulare ROS-mediata innescata da fotosensibilizzatori dopo esposizione alla luce mediante citometria a flusso30.
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Representative Results
Il dispositivo PDT finale, chiamato PhotoACT, includeva una camera oscura per allocare fino a quattro micropiastre multipozzetto, con la sua superficie interna superiore dotata di un set di 30 LED diffusi programmati per emettere spettri distinti di luce visibile (Figura 3 e File supplementare 6). Il dispositivo è stato costruito utilizzando due scatole associate: una scatola interna progettata come camera oscura per i saggi PDT e una scatola esterna per coprire la camera interna e contenere l'unità di controllo (Figura 1B). La scatola interna è stata verniciata di nero (Figura 1D) e composta da un modello a nastro di LED RGB WS2812 (o WS281B) con 30 LED e di 1 m di lunghezza (che è stato successivamente tagliato in tre pezzi) e 9 watt, che contiene un processore incorporato. Questo apparato ha permesso un utilizzo più controllato e, di conseguenza, un'emissione di colore più accurata. I 30 LED sono stati equamente distribuiti su tutta la superficie interna superiore della camera PDT da tre nastri paralleli con 10 LED ciascuno (Figura 1E). È stata stabilita un'incidenza di luce omogenea grazie alla bassa riflettività delle superfici interne nere e alla distribuzione uniforme della configurazione dei LED. Un sensore di luminosità TSL2561 è stato inoltre incorporato nella parte inferiore centrale della scatola interna per indicare l'incidenza della luce e fungere da strumento di controllo qualità, garantendo l'uniformità dell'irradiazione all'interno della camera oscura (Tabella supplementare S1) e monitorando la potenza del sistema LED, che è noto per avere un certo numero di ore di vita utile (Figura 1F ). La scatola esterna è una struttura che copre la scatola interna, composta da sei parti in MDF, verniciate di grigio e tagliate al laser per una perfetta vestibilità (Figure 1A,B). L'unità di controllo è stata progettata utilizzando il software online 31, stampata in 3D con acido polilattico come singola parte utilizzando una stampante3D e dipinta di grigio. Contiene tutti i componenti elettronici, tra cui un display, potenziometri, pulsanti e un cicalino (Figura 1I e Figura 2).
Per consentire regolazioni indipendenti dell'incidenza della luce, è stata selezionata la scheda di controllo ESP32 per integrare l'unità di controllo (Figura 2). Questa configurazione dovrebbe consentire un'interfaccia USB per la programmazione, bluetooth, Wi-Fi, processore dual core, numerose porte e la capacità di comunicare con un circuito interintegrato (I2C), un'interfaccia periferica seriale (SPI) e altre interfacce. Per far funzionare il sistema, un programma è stato scritto in linguaggio C attraverso un ambiente di sviluppo integrato (IDE). La struttura del codice32 è basata su FreeRTOS, un sistema operativo gratuito e in tempo reale supportato dalla scheda controller ESP32. La logica di riferimento consente una programmazione indipendente delle applicazioni, che può essere elaborata da ESP32 in approcci a scaglioni o paralleli, rendendo il progetto e i suoi processi di manutenzione, miglioramento e aggiornamento molto più versatili e sicuri.
L'interfaccia tra la macchina e l'operatore è intuitiva e consiste in un display a cristalli liquidi (LCD), potenziometri, pulsanti e un cicalino (Figura 3 e File supplementare 6). Il piccolo LCD da 16 mm x 2 mm (colonne o linee) aveva un controller HD44780 integrato con un protocollo di comunicazione I2C, che conferisce rispettivamente la facilità di installazione e la versatilità di trasmissione. La configurazione preliminare include RGB e regolazioni temporali da parte dell'operatore. La grandezza luminosa e la configurazione del colore possono essere regolate utilizzando i potenziometri, che modificano l'intensità (da 0 a 255) delle tre componenti di colore di base-RGB. Queste regolazioni possono portare a diverse composizioni di colore affrontate nella tabella dei colori RGB internazionali33. Ogni composizione RGB possiede una lunghezza d'onda specifica, che deve essere regolata in base al PS utilizzato nell'esperimento PDT; la curva di assorbanza del PS e la lunghezza d'onda dell'irradiazione devono essere sovrapposte affinché la fotoattivazione avvenga in modo soddisfacente (figura supplementare S1). Lungo il processo, sullo schermo LCD è possibile accedere allo stato di funzionamento con il tempo rimanente e alle informazioni sull'incidenza della luce.
Al termine del tempo programmato, il sistema elettronico ha spento tutti i LED, emesso un avviso acustico e mostrato sul display la quantità totale di energia per area (J/cm²), calcolata moltiplicando il valore costante di irraggiamento per il tempo di funzionamento in secondi. Questo modello digitale presentava un'ampia gamma di livelli di rilevamento (limiti compresi tra 0,1 e 40.000+ lux), un'interfaccia I2C e una bassa intensità di corrente elettrica (0,5 mA e 15 μA in funzionamento e stato di standby, rispettivamente).
Come prova di concetto, il dispositivo è stato utilizzato per migliorare l'effetto citotossico della verteporfina in coltura cellulare HeLa 2D dopo un'esposizione alla luce di 1 ora (49,1 ± 0,6 J / cm2). Come mostrato nella Figura 4A, il valore GI50 era di 3,1 μM per la condizione di luce e 13,8 μM per la condizione di oscurità. Pertanto, lo spostamento di 4,4 volte confrontando le condizioni ha convalidato l'uso della verteporfina come PS e l'applicabilità di PhotoACT ai saggi PDT. Per convalidare l'uso del prototipo descritto in questo lavoro, è stato utilizzato un dispositivo PDT commerciale nelle stesse condizioni sperimentali, tra cui un PS, celle e fluenza, e i risultati sono stati confrontati. Come mostrato nella Figura 4B, entrambi i dispositivi fotoattivano la verteporfina allo stesso modo, aumentando l'effetto citotossico. Questi risultati hanno confermato l'applicabilità di questo nei dispositivi PDT costruiti internamente (Figura 4A, B). Infine, la morte cellulare mediata da ROS innescata dalla verteporfina dopo l'esposizione alla luce è stata confermata dalla citometria a flusso utilizzando il saggio DCFDA (Figura 4C, D).
Figura 1: Istruzioni di costruzione e montaggio di PhotoACT. Illustrazione dettagliata della costruzione, foratura, verniciatura, montaggio e accessori dei componenti nel dispositivo. Il pannello mostra una guida passo-passo per costruire il dispositivo. Abbreviazione: LED = diodo a emissione luminosa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: La costruzione dell'unità di controllo e le istruzioni di installazione elettronica. Disegno della vista ingrandita dell'unità di controllo esplosa e schema dettagliato delle connessioni elettroniche alle porte della scheda controller ESP32 con connessioni e componenti utilizzati nel prototipo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: rappresentazione PhotoACT. Disegno di assemblaggio del design del prodotto finale con distinta base, palloncini di etichettatura e vista dettagliata dei LED interni superiori. La figura permette di identificare parti e componenti del prototipo. Abbreviazioni: MDF = fibra di legno a media densità; LED = diodo a emissione luminosa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Fototossicità in vitro della generazione di verteporfine e ROS. (A,B) Saggio di vitalità cellulare eseguito con il metodo MTT: i saggi sono stati condotti per valutare il profilo citotossico della verteporfina fotosensibilizzatrice a diverse concentrazioni. Le cellule HeLa sono state trattate per 24 ore con diverse concentrazioni di verteporfina (0,045-24 μM), esposte alla luce (PhotoACT (A) o apparecchiature PDT commerciali (B)) o al buio, e quindi sottoposte al test MTT. Entrambe le condizioni hanno mostrato una ridotta vitalità cellulare a concentrazioni più elevate di verteporfina, ma l'esposizione alla luce ottenuta dai saggi PDT ha migliorato il profilo citotossico del PS, il che implica che la PDT aumenta la citotossicità della verteporfina. Le curve di fattibilità sono state montate utilizzando il software GraphPad Prism 6. (C,D) Le cellule HeLa sono state trattate per 24 ore con basse e alte concentrazioni di verteporfina (0,187 μM e 6 μM) e quindi esposte alla luce (PhotoACT) o a condizioni di oscurità. I livelli intracellulari di ROS sono stati misurati dopo irradiazione mediante citometria a flusso utilizzando la sonda DCFDA (incubazione per 30 minuti a 1 μM). Uno spostamento a destra tra gli istogrammi implicava una maggiore intensità di fluorescenza a causa di un maggiore accumulo intracellulare di DCF e, quindi, maggiori livelli di ROS. I risultati non hanno mostrato alcuna differenza rilevante nei livelli di ROS nella condizione di oscurità (C), ma hanno mostrato un aumento dose-risposta dei livelli di ROS dopo la fotoattivazione della verteporfina (D). Abbreviazioni: ROS = specie reattive dell'ossigeno; DCF = 2',7'-diclorofluoresceina; DCFDA = 2',7'-dicloroidrofluoresceina diacetato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Diagramma di flusso decisionale del dispositivo: configurazione preliminare e risoluzione dei problemi operativi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Sovrapposizione tra la curva di assorbanza della verteporfina e lo spettro di emissione LED del dispositivo. Spettro di assorbimento della verteporfina con i suoi picchi specifici di assorbanza (x,y') e spettro di emissione LED di colore RGB 255, 255, 255-bianco (3,700K-5,000K CCT) utilizzato per fotoattivare il fotosensibilizzatore (x,y''). La sovrapposizione tra i diversi picchi di assorbanza della verteporfina e la luce bianca irradiante corrobora la fotoattivazione del fotosensibilizzatore, confermata anche dai risultati biologici. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S1: Prove di uniformità dell'irradiazione. Luminosità istantanea (lumen) misurata dal sensore di luminosità in diversi punti dell'area irradiata. I risultati presentati non mostrano variazioni espressive, che attestano l'irradiazione uniforme del dispositivo. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: file vettoriale per il taglio. File di disegno (DWG) per il taglio di pannelli MDF. Il file deve essere utilizzato per il taglio a controllo numerico computerizzato (CNC). Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: file di stampa 3D del controllo dell'unità. Stereolitografia (STL) per stampare in 3D l'unità di controllo del dispositivo. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: codice di programmazione C. Codice di programmazione sviluppato in linguaggio C per la configurazione della centralina dell'apparecchiatura. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: codice di programmazione INO. Codice di programmazione sviluppato in linguaggio INO per la configurazione della centralina dell'apparecchiatura. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 5: istruzioni per la compilazione. Markdown (MD) "LEGGIMI" con istruzioni aggiuntive per la compilazione del codice di programmazione. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 6: modello di progettazione del dispositivo. Anteprima del file di modello tridimensionale Standard for the Exchange of Product Data (STEP) per la visualizzazione generale del prototipo. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il dispositivo PhotoACT finale era comodo da costruire con componenti disponibili in commercio e a basso costo ad un costo totale inferiore a $ 50. Ulteriori vantaggi includono basse esigenze di manutenzione, la capacità di irradiare più tipi di piastre di coltura, l'uso simultaneo di un massimo di quattro unità per test, peso ridotto (2 kg)/dimensioni (44 cm3) che consente portabilità, irradiazione accurata e riproducibile (dati non mostrati) e un'interfaccia di configurazione semplice e intuitiva che non richiede la connessione a computer o altre macchine.
Alcune fasi critiche dei protocolli di costruzione e funzionamento hanno dato origine a opportunità di miglioramento durante la concezione del progetto. Poiché una camera PDT richiede un'emissione di luce omogenea e una misurazione costante dell'energia, le scatole interne ed esterne sono state sigillate per evitare sia interferenze luminose esterne che perdite di luce emesse. Ulteriori nastri in velcro sono stati fissati lateralmente sulla porta frontale per rafforzare la chiusura della camera e garantire esperimenti ininterrotti. Un LED rappresentativo è stato installato presso l'unità di controllo per certificare la configurazione RGB richiesta, indicando il colore e l'intensità della luce emessa durante il test. Infine, il codice di programmazione ha subito diversi aggiornamenti per perfezionare le misurazioni istantanee della densità e la quantità finale di valutazioni energetiche, avallando la riproducibilità e la coerenza matematica. Alcuni altri dettagli importanti che richiedono particolare attenzione includono: (i) distribuzione omogenea dei LED e posizionamento centrale del sensore di luminosità per ottenere risultati rappresentativi e bilanciati, (ii) installazione di tutti i componenti secondo lo schema elettronico (Figura 2) e il codice di programmazione (file supplementare 3, file supplementare 4 e file supplementare 5 ) per garantire il corretto funzionamento e (iii) la configurazione (mantenendo lo stesso RGB e la stessa configurazione temporale) prima di eseguire un esperimento per garantire repliche coerenti con risultati affidabili. Sebbene il sistema RGB fornisca più composizioni di colore visibile con lunghezze d'onda specifiche, gli esperimenti sulla luce non visibile richiederebbero aggiornamenti di protocollo specifici. Nella Figura 5 viene presentato un diagramma di flusso decisionale per fornire un approccio sistematico alla risoluzione dei problemi per individuare e correggere problemi o errori durante l'operazione.
Progettato per soddisfare le esigenze della sperimentazione in vitro con risultati convalidati ottenuti con l'attivazione terapeutica della verteporfina per indurre citotossicità nelle cellule HeLa 2D (Figura 4), PhotoACT può essere raccomandato per università, scuole, industrie e altri centri di ricerca. Questo dispositivo dovrebbe estendere i benefici della PDT alla ricerca scientifica che esplora il meccanismo d'azione dei fotosensibilizzatori e le loro applicazioni cliniche.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Arthur Henrique Gomes de Oliveira e Lucas Julian Cruz Gomes per l'aiuto nel processo di ripresa. Questo progetto è stato sostenuto dal Consiglio brasiliano delle ricerche (CNPq, numero di sovvenzione 400953/2016-1-404286/2021-6) e dalla Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Questo studio è stato anche finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
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