Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fagmedierad genmanipulation av borrelia Spirokete Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

Bakteriofagens förmåga att flytta DNA mellan bakterieceller gör dem till effektiva verktyg för genetisk manipulation av deras bakterievärdar. Här presenteras en metod för att inducera, återhämta sig och använda φBB-1, en bakteriofag av Borrelia burgdorferi, för att transducera heterologt DNA mellan olika stammar av borrelia spiroket.

Abstract

Införandet av främmande DNA i spiroketen Borrelia burgdorferi har nästan uteslutande åstadkommits genom transformation med hjälp av elektroporation. Denna process har särskilt lägre effektivitet i borrelia spirokete i förhållande till andra, bättre karakteriserade gramnegativa bakterier. Graden av framgång för transformation är mycket beroende av att ha koncentrerade mängder av högkvalitativt DNA från specifika bakgrunder och är föremål för betydande stam-till-stam-variation. Alternativa medel för att införa främmande DNA (dvs. skyttelvektorer, fluorescerande reportrar och markörer för antibiotikaresistens) i B. burgdorferi kan vara ett viktigt tillskott till beväpningen av användbara verktyg för genetisk manipulation av borrelia spiroket. Bakteriofag har varit välkända som naturliga mekanismer för rörelse av DNA bland bakterier i en process som kallas transduktion. I denna studie har en metod utvecklats för att använda den allestädes närvarande borreliala fagen φBB-1 för att transducera DNA mellan B. burgdorferi-celler med både samma och olika genetiska bakgrunder. Det transducerade DNA:t innefattar både borreliellt DNA och heterologt DNA i form av små skyttelvektorer. Denna demonstration tyder på en potentiell användning av fagmedierad transduktion som ett komplement till elektroporering för genetisk manipulation av borrelia spiroket. Denna rapport beskriver metoder för induktion och rening av φBB-1 från B. burgdorferi, användningen av denna i transduktionsanalyser och urval och screening av potentiella transduktanter.

Introduction

Utvecklingen av verktyg för genmanipulation av spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tillfört ett omätbart värde till förståelsen av borrelians natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har ett ovanligt komplext genom som består av en liten linjär kromosom och både linjära och cirkulära plasmider 5,6. Spontan plasmidförlust, intragen omläggning (rörelse av gener från en plasmid till en annan inom samma organism) och horisontell genöverföring (HGT, DNA-rörelsen mellan två organismer) har gett upphov till en svindlande mängd genetisk heterogenitet bland B. burgdorferi (för ett exempel, se Schutzer et al.7). De resulterande genotyperna (eller "stammarna") är alla medlemmar av samma art men har genetiska skillnader som påverkar deras förmåga att överföra till och infektera olika däggdjursvärdar 8,9,10,11. I denna rapport kommer termen "stam" att användas för att hänvisa till B. burgdorferi med en särskild naturligt härledd genetisk bakgrund; Termen "klon" kommer att användas för att hänvisa till en stam som har modifierats genetiskt för ett visst ändamål eller som ett resultat av experimentell manipulation.

Den molekylära verktygslådan som är tillgänglig för användning i B. burgdorferi inkluderar valbara markörer, genreportrar, skyttelvektorer, transposonmutagenes, inducerbara promotorer och motvalbara markörer (för en recension, se Drektrah och Samuels12). En effektiv användning av dessa metoder kräver ett artificiellt införande av heterologt (främmande) DNA i en B. burgdorferi-stam av intresse. I B. burgdorferi uppnås införandet av heterologt DNA nästan uteslutande via elektroporering, en metod som använder en puls av elektricitet för att göra ett bakteriemembran övergående permeabelt för små bitar av DNA som införs i mediet1. Majoriteten av cellerna (uppskattas till ≥99,5%) dödas av pulsen, men de återstående cellerna har en hög frekvens för att behålla det heterologa DNA13. Även om det anses vara bland de mest effektiva metoderna för att införa DNA i bakterier, är frekvensen av elektroporering i B. burgdorferi mycket låg (allt från 1 transformant i 5 × 104 till 5 × 106 celler)13. Hindren för att uppnå högre omvandlingsfrekvenser verkar vara både tekniska och biologiska. Tekniska hinder för framgångsrik elektroporering av B. burgdorferi inkluderar både mängden DNA (>10 μg) som är nödvändig och kravet på att spiroketerna ska vara i exakt rätt tillväxtfas (mitten av log, mellan 2 × 10 7 celler ·ml−1 och 7 × 107 celler·ml−1) vid framställning av elektrokompetenta celler 12,13. Dessa tekniska hinder kan dock vara lättare att övervinna än de biologiska hindren.

Borreliaforskare inser att B. burgdorferi-kloner kan delas in i två breda kategorier med avseende på deras förmåga att manipuleras genetiskt13,14. Högpassage, laboratorieanpassade isolat omvandlas ofta lätt men har vanligtvis förlorat de plasmider som är väsentliga för smittsamhet, beter sig på ett fysiologiskt avvikande sätt och kan inte infektera en däggdjursvärd eller kvarstå inom en fästingvektor12,13. Även om dessa kloner har varit användbara för att dissekera spiroketens molekylärbiologi inom laboratoriet, är de av litet värde för att studera spiroketen inom det biologiska sammanhanget för den enzootiska cykeln. Infektiösa isolat med låg passage, å andra sidan, beter sig på ett fysiologiskt sätt som återspeglar ett infektiöst tillstånd och kan slutföra den infektiösa cykeln men är vanligtvis motsträviga mot införandet av heterologt DNA och är därför svåra att manipulera för studie12,13. Svårigheten att omvandla lågpassageisolat är relaterad till minst två olika faktorer: (i) lågpassageisolat som ofta tätt klumpar ihop sig, särskilt under de förhållanden med hög densitet som krävs för elektroporering, vilket blockerar många celler från antingen fullständig applicering av den elektriska laddningen eller tillgång till DNA i mediet13,15; och (ii) B. burgdorferi kodar för minst två olika plasmidburna restriktionsmodifieringssystem (R-M) som kan gå förlorade i högpassageisolat14,16. R-M-system har utvecklats för att tillåta bakterier att känna igen och eliminera främmande DNA17. Faktum är att flera studier i B. burgdorferi har visat att omvandlingseffektiviteten ökar när källan till DNA är B. burgdorferi snarare än Escherichia coli13,16. Tyvärr är det en dyr och tidskrävande möjlighet att förvärva den nödvändiga höga koncentrationen av DNA för elektroporering från B. burgdorferi. Ett annat potentiellt problem vid elektroporering och val av lågpassageisolat är att processen verkar gynna transformanter som har förlorat den kritiska virulensassocierade plasmiden, lp2514,18,19; således kan själva handlingen att genetiskt manipulera lågpassage B. burgdorferi-isolat via elektroporering välja för kloner som inte är lämpliga för biologiskt relevant analys inom den enzootiska cykeln20. Med tanke på dessa problem kan ett system där heterologt DNA kan elektrotransformeras till B. burgdorferi-kloner med hög passage och sedan överföras till lågpassage-infektiösa isolat med en annan metod än elektroporering vara ett välkommet tillskott till den växande samlingen av molekylära verktyg som är tillgängliga för användning i borreliaspiroketen.

Förutom transformation (upptaget av naket DNA) finns det två andra mekanismer genom vilka bakterier regelbundet tar upp heterologt DNA: konjugering, vilket är utbyte av DNA mellan bakterier i direkt fysisk kontakt med varandra och transduktion, vilket är utbytet av DNA medierat av en bakteriofag21. Faktum är att bakteriofagens förmåga att förmedla HGT har använts som ett experimentellt verktyg för att dissekera de molekylära processerna inom ett antal bakteriesystem22,23,24. B. burgdorferi är inte naturligt kompetent för upptag av naket DNA, och det finns få bevis för att B. burgdorferi kodar för den apparat som är nödvändig för att främja framgångsrik konjugering. Tidigare rapporter har dock beskrivit identifieringen och den preliminära karakteriseringen av φBB-1, en tempererad bakteriofag av B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 förpackar en familj av 30 kb plasmider som finns inom B. burgdorferi25; Medlemmarna i denna familj har betecknats CP32S. I överensstämmelse med en roll för φBB-1 i att delta i HGT bland B. burgdorferi-stammar, rapporterade Stevenson et al. en identisk cp32 som hittades i två stammar med annars olika cp32s, vilket tyder på en ny delning av denna cp32 mellan dessa två stammar, troligen via transduktion29. Det finns också tecken på signifikant rekombination via HGT bland cp32:orna i ett annars relativt stabilt genom30,31,32,33. Slutligen har förmågan hos φBB-1 att transducera både cp32s och heterologt skyttelvektor-DNA mellan celler av samma stam och mellan celler av två olika stammar visats tidigare27,28. Med tanke på dessa resultat har φBB-1 föreslagits som ett annat verktyg som ska utvecklas för dissektion av molekylärbiologin hos B. burgdorferi.

Målet med denna rapport är att beskriva en metod för att inducera och rena φBB-1 från B. burgdorferi, samt tillhandahålla ett protokoll för att utföra en transduktionsanalys mellan B. burgdorferi-kloner och välja och screena potentiella transduktanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment med rekombinant DNA och BSL-2-organismer granskades och godkändes av Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee.

1. Beredning av B. burgdorferi-kulturen för produktion av φBB-1

  1. Förbered Barbour-Stoenner-Kelly medium kompletterat med 6,6% värmeinaktiverat normalt kaninserum (BSK)15. För 1 liter 1x BSK, kombinera de komponenter som anges i tabell 1 i 900 ml vatten, justera pH-värdet till 7,6 med 1 N natriumhydroxid och blanda långsamt vid 4 °C i 2-4 timmar. När blandningen är klar, kontrollera och justera pH till 7,6 om det behövs och öka volymen till 1 liter med vatten. Sterilisera mediet genom att passera genom ett 0,22 μM-filter (se materialförteckning) och använd färskt eller förvara vid 4 °C i ≤2 månader.
  2. Tre till fem dagar innan transduktionsprotokollet påbörjas ympas 150 μl av lämpliga B. burgdorferi-kloner till 15 ml 1x BSK i tätt täckta sterila koniska centrifugrör (se materialförteckning). Komplettera mediet med lämplig koncentration av antibiotika eller en kombination av antibiotika för selektion och underhåll av heterologt DNA i B. burgdorferi-klonen /klonerna (tabell 2).
    OBS: B. burgdorferi är en organism på biosäkerhetsnivå 2. Ta alla lämpliga försiktighetsåtgärder när du arbetar med denna organism. Utför allt arbete med levande kulturer av B. burgdorferi i ett certifierat och korrekt desinficerat klass II biosäkerhetsskåp. Kassera korrekt allt material som kontaktar B. burgdorferi och organismerna själva baserat på CDC-riktlinjer34.
  3. Inkubera kulturerna vid 33 °C utan att skaka tills kulturerna når en densitet på ≥5 × 107 spiroketer·ml−1, vilket tar ungefär 3–5 dagar.

2. Bestäm densiteten hos B. burgdorferi-kulturen (modifierad från Samuels)15

  1. För densiteter som förväntas vara över 5 × 106 celler·ml−1, bestäm celldensiteten med hjälp av spektroskopi.
    1. Överför 1 ml odling till ett 1,7 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 8 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    2. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 och 1,8 mM KH2PO4). Överför hela cellsuspensionen till en semi-mikro UV-transparent kyvett.
    3. Bestäm den optiska densiteten hos det återsuspenderade provet vid en våglängd av 600 nm (A600). Nollställ spektrofotometern (se materialförteckningen) mot PBS.
    4. För att beräkna koncentrationen av spiroketer ·ml−1 i den ursprungliga kulturen, multiplicera den optiska densiteten vid A600 med 1,4 × 109.
  2. För densiteter som förväntas vara mellan 5 × 104 celler ·ml−1 och 5 × 106 celler·ml−1, bestäm celldensiteten med hjälp av en Petroff-Hausser-räknekammare (se materialtabell) för att direkt räkna antalet spiroketer. Denna metod kan också användas för högre densiteter efter lämplig utspädning.
    OBS: Visualiseringen av levande spiroketer kräver ett mikroskop modifierat med en mörkfältskondensor.
    1. Applicera 10 μl prov på räknekammaren och täck med lämpligt täckglas. För densiteter högre än 1 × 107, späd provet i PBS för att ge 50-100 spiroketer per fält.
    2. Räkna cellerna med ett mörkfältmikroskop med en förstoring på 200x-400x. Räkna hela fältet med 25 grupper med 16 små rutor i alla plan.
    3. Multiplicera antalet räknat med utspädningsfaktorn (om någon) och 5 × 104 för att ge celler · ml − 1 av den ursprungliga kulturen.

3. Induktion av B. burgdorferi φBB-1

OBS: Sterilisera alla glasvaror och plastvaror genom autoklavering; sterilisera alla lösningar genom autoklavering eller filtrering genom ett 0,22 μM-filter. Stegen nedan presenteras baserat på volymer på 15 ml, men metoden är skalbar till mindre eller större volymer beroende på experimentets individuella behov.

  1. För B. burgdorferi-kulturen från vilken kommer att produceras (givaren), använd koncentrationen beräknad med endera metoden i steg 2 för att bestämma volymen startkultur som behövs för att ge 4 ml 2 × 108 spiroketer ·ml−1. Detta ger en slutlig koncentration på 5 × 107 spiroketer·ml−1 på 15 ml under återhämtningssteget (steg 3.6 nedan).
  2. Centrifugera odlingsvolymen beräknad i steg 3.1 vid 6 000 x g i 10 minuter. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 4 ml färsk BSK. Överför provet till det minsta sterila röret som finns tillgängligt för att hålla provet med minimalt huvudutrymme.
  3. Tillsätt lämplig mängd inducerande medel till den rekommenderade koncentrationen (tabell 3) baserat på en odlingsvolym på 4 ml för att inducera fagproduktion. Täck röret tätt och blanda noggrant.
  4. Inkubera provet vid 33 °C i 2–4 timmar.
  5. Efter inkubation, överför provet till ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera provet vid 6 000 x g i 10 minuter. Dekantera supernatanten.
  6. Återsuspendera cellpelleten i 15 ml 1x BSK.
    OBS: Efter induktion av fagen finns det två olika sätt att fortsätta med transduktionsanalysen. Dessa metoder presenteras i figur 1 och i steg 4 och steg 6.

4. Transduktion under samodling efter det att givaren exponerats för det inducerande medlet (figur 1A)

OBS: Detta protokoll kan endast användas när den fagproducerande stammen (givaren) har resistens mot ett visst antibiotikum och stammen som ska transduceras (mottagare) har resistens mot ett annat antibiotikum.

  1. Förbered en B. burgdorferi-kultur som ska användas som mottagare i transduktionsanalyser, enligt beskrivningen för givarstammen i steg 1 ovan. Baserat på densiteten bestämd som i steg 2, beräkna den volym som behövs för att ge 15 ml 1 × 107 spiroketer · ml − 1.
  2. Centrifugera odlingsvolymen beräknad i steg 4.1 vid 6 000 x g i 10 minuter. Dekantera supernatanten.
  3. Återsuspendera pelleten i 1 ml kultur från steg 3.6 (återsuspenderad fagdonator). Lägg till den återsuspenderade mottagaren tillbaka i kulturen med givaren. Komplettera inte med antibiotika. Den totala volymen som innehåller båda kulturerna är 15 ml.
  4. Inkubera vid 33 °C i 72–96 timmar.
  5. Utför val av transduktanter genom fastfasplätering efter samodling enligt beskrivningen i steg 7.

5. Utfällning av polyetylenglykol (PEG) för att återvinna för användning vid transduktionsanalys

OBS: Detta protokoll kan användas i fall där den fagproducerande stammen (givaren) har resistens mot ett visst antibiotikum och stammen som ska transduceras (mottagare) antingen inte har någon antibiotikaresistens eller resistens mot ett annat antibiotikum.

  1. Komplettera kulturen från steg 3.6 med lämpligt antibiotikum vid den koncentration som anges i tabell 2. Inkubera provet vid 33 °C i 72–96 timmar.
  2. Förbered lösningar för PEG-nederbörd.
    1. Förbered 500 ml 5 M NaCl. Sterilisera genom autoklavering och låt svalna före användning. Förvaras i rumstemperatur.
    2. Bered 500 ml 40% PEG genom att lösa 200 g PEG8000 i 400 ml vatten; Värm försiktigt under omrörning tills lösningen är väl blandad. Ta upp volymen till 500 ml med vatten. För att helt lösa upp PEG8000 och sterilisera lösningen, autoklavera lösningen och svalna före användning. Förvaras i rumstemperatur.
    3. Bered 100 ml suspensionsmedium (SM; 100 mM NaCl, 10 mMMgSO4 och 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Sterilisera genom autoklavering. Förvaras vid 4 °C.
  3. För PEG-utfällning av från donatorn B. burgdorferi-klonen (från steg 3.6) centrifugerar proverna efter 72–96 timmars inkubation vid 8 000 x g i 20 minuter vid 4 °C.
  4. Dekantera supernatanten i ett rent 50 ml koniskt rör; Kassera cellpelleten. Tillsätt 5 M NaCl till en slutlig koncentration av 1 M. Blanda väl. Gunga försiktigt vid rumstemperatur i 1 h.
  5. Centrifugera proverna vid 8 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Dekantera supernatanten i ett rent 50 ml koniskt rör; pelleten kan vara liten eller frånvarande. Tillsätt 40% PEG8000-lösning till supernatanten till en slutlig koncentration på 10%. Blanda väl och lägg på is i mer än 1 h upp till över natten.
    OBS: Längre tider verkar inte korrelera med signifikant ökad fagåterhämtning.
  6. Centrifugera proverna vid 8 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och ta bort så mycket överskottsvätska som möjligt utan att förlora någon pellet, som innehåller fagpartiklarna.
  7. Återsuspendera pelleten i en minimal volym SM, använd SM för att tvätta ner flaskans sida och samla eventuella fagpartiklar. Det rekommenderade förhållandet är 400 μL SM per 10 ml original supernatant, men beroende på pelletens storlek kan mer eller mindre SM krävas för fullständig resuspension.
  8. Behandla det återvunna fagprovet med en lika stor volym kloroform baserat på volymen av resuspension. Blanda provet väl och centrifugera sedan vid 8 000 x g i 10 minuter. Ta bort det vattenhaltiga (översta) lagret till ett rent rör och undvik något av det tjocka gränssnittsskiktet.
    OBS: φBB-1 är en icke-omsluten bakteriofag och är inte mottaglig för kloroformbehandling25. Detta steg görs för att ytterligare störa alla membranbundna strukturer (dvs. celler eller blebs) och för att döda eventuella cellulära föroreningar. Kloroform är en flyktig organisk och får endast användas i en välventilerad dragskåp. Kassera material som innehåller kloroform som organiskt avfall.
  9. Bestäm volymen som återvunnits efter den första kloroformbehandlingen och behandla provet igen med en mängd kloroform som är lika med 10% av den volymen. Blanda väl och centrifugera vid 8 000 x g i 10 min. Ta bort det vattenhaltiga (översta) lagret, var noga med att undvika något av gränssnittet eller det organiska lagret. Överför det vattenhaltiga skiktet till ett rent rör.
  10. Använd fagen omedelbart (enligt beskrivningen i steg 6) eller förvara vid 4 °C.
    OBS: Frysning av φBB-1 fagprover rekommenderas inte. Även om stabiliteten hos φBB-1 vid 4 °C inte har undersökts noggrant, har prover som lagrats vid 4 °C i upp till 1 månad efter återvinning använts framgångsrikt i transduktionstester.

6. Transduktionsanalys efter PEG-utfällning av φBB-1 (figur 1B)

  1. Förbered B. burgdorferi-kulturer som ska användas som mottagare i transduktionsanalyser, enligt beskrivningen för givarstammen i steg 1 ovan. Baserat på densiteten bestämd som i steg 2, beräkna volymen av mottagarens kultur som behövs för att ge 15 ml 1 × 107 spiroketer · ml − 1.
  2. Centrifugera odlingsvolymen beräknad i steg 6.1 vid 6 000 x g i 10 minuter. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 14,5 ml färsk BSK.
  3. Lägg till ≤ 500 μL PEG-utfällt fagprov (från steg 5) till mottagarklonens kultur. Blanda väl och inkubera vid 33 °C i 72–96 timmar.
    OBS: Mängden fag som återvinns under PEG-nederbörd kan vara variabel, beroende på ett antal faktorer. Men från 15 ml kultur av inducerad B. burgdorferi-stam CA-11.2A innehåller 500 μL vanligtvis 50-1,000 livskraftig28. Fagåtervinning ≥500 μL påverkar B. burgdorferi-tillväxten negativt, sannolikt på grund av det ökade förhållandet mellan SM och BSK.
  4. Utför valet av transduktanter genom fastfasplätering efter blandning med PEG-utfälld enligt beskrivningen i steg 7.

7. Val av transduktanter

OBS: Fastfasplätering av potentiella transduktanter utförs med hjälp av en enskiktsmodifiering av protokollet som först beskrevs av Samuels15. B. burgdorferi-kolonier växer inom agar, så för val av transduktanter genom fastfasplätering måste proverna läggas till mediet medan plattorna hälls. En alternativ metod för val av transformanter med hjälp av en utspädningsmetod i 96-brunnsplattor har också beskrivits tidigare35. Denna teknik kan också vara effektiv för val av transduktanter men har ännu inte prövats för detta ändamål.

  1. Bestäm antalet plattor som behövs för att välja transduktanter baserat på antalet prover från transduktionsanalyserna och kontrollerna som ska pläteras.
    OBS: Vanligtvis hälls två plattor per prov, en motsvarande cirka 10% av odlingsvolymen och en som inkluderar resten av kulturen. Häll dessutom plattor som fungerar som negativa kontroller för att individuellt testa att fagpreparatet och / eller moderklonerna som används som givare och mottagaren inte växer i närvaro av det eller de antibiotika som används under urvalet. Förberedelse av pläteringsmaterial för minst två extra plattor rekommenderas också. Till exempel, om antalet prover och kontroller som ska pläteras är åtta, förbered tillräckligt med pläteringsblandning för 10 plattor.
  2. Förbered lösningar för plätering enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Varje platta kommer att vara 30 ml, bestående av 20 ml 1,5x BSK för plätering och 10 ml 2,1% agaros (2: 1-förhållande). Detta ger en platta med slutliga koncentrationer av 1x BSK och 0,7% agaros. Till exempel, för 10 plattor, bereda en total pläteringsblandning av 300 ml, bestående av 200 ml 1,5x BSK och 100 ml 2,1% agaros.
    1. Förbered 1 L av 1,5x BSK enligt beskrivningen för 1x BSK i steg 1.1 med hjälp av mängderna för varje komponent som anges för 1,5x BSK i tabell 1. Lagra enligt beskrivningen för 1x BSK.
    2. Förbered 2,1% agaros i vatten och autoklav. Använd agaroslösningen färsk eller förvara vid rumstemperatur. Om den förvaras vid rumstemperatur, mikrovågsugn med locket löst tills det är helt smält före plätering.
    3. Bestäm den eller de antibiotikavolymer som behövs för att uppnå lämplig koncentration (tabell 2) baserat på hela pläteringsblandningen.
      OBS: Om den totala volymen av den slutliga pläteringslösningen är 300 ml, blanda 200 ml 1,5x BSK och tillräckligt med antibiotikum för att säkerställa att hela 300 ml har rätt slutlig antibiotikakoncentration. Om både givaren och mottagaren i transduktionsanalysen har olika antibiotikaresistensgener bör pläteringsblandningen innehålla båda antibiotika. Om den PEG-utfällda fagen från donatorn (enligt beredningen i steg 5) kodar för en markör för antibiotikaresistens och mottagaren inte har någon, bör pläteringsblandningen endast innehålla ett antibiotikum.
  3. Baserat på antalet plattor som ska hällas, överför lämplig mängd 1,5x BSK och antibiotika till en steril flaska som är tillräckligt stor för att hålla hela pläteringsblandningen. Jämvikt i ett vattenbad vid 56 °C i ≥15 min.
  4. Jämvikt smält agaros från autoklaven eller mikrovågsugnen i ett 56 ° C vattenbad i ≥ 15 minuter.
  5. Efter jämvikt, tillsätt den bestämda mängden 2,1% agaros till flaskan med 1,5x BSK (med antibiotikum) och sätt tillbaka pläteringslösningen i vattenbadet vid 42 ° C i 10-15 min.
    OBS: Högre temperaturer kan skada eller döda spiroketerna36. Om du använder samma vattenbad som ovan, kyl vattenbadet till 42-45 °C innan du startar timern för jämvikten. Låt inte pläteringslösningen balansera vid 42 °C i mer än 20 minuter, annars börjar den stelna medan du häller upp plattorna.
  6. Under jämvikt, förbered B. burgdorferi-proverna som ska pläteras. Överför mängden som ska pläteras till ett sterilt 50 ml koniskt centrifugrör (se materialförteckning).
    1. Om plätering av en mängd som är mindre än 1,5 ml (<5 % av den slutliga 30 ml plattvolymen), överför provet till det nya röret och tillsätt pläteringsblandningen direkt till provet under plätering.
    2. För större volymer, överför önskad odlingsvolym till det nya röret och centrifugera sedan vid 6 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Dekantera alla utom 100-500 μL av supernatanten och använd resten för att återsuspendera pelleten helt före plätering.
    3. För kontrollplattor efter samodling, tillsätt ≥107 celler från givar- eller mottagarklonerna till sterila 50 ml koniska centrifugrör. Om volymen är över 1,5 ml, centrifugera och återsuspendera pelleten enligt steg 7.6.2. Om en transduktionsanalys utfördes med användning av den PEG-utfällda fagen, tillsätt förutom mottagarklonen 100-250 μL av fagprovet i ett sterilt 50 ml koniskt rör för plätering.
  7. Efter att pläteringslösningen har utjämnats vid 42–45 °C i 10–15 minuter, överför 30 ml av pläteringslösningen till ett rör med lämpligt prov. Dosera omedelbart pläteringsblandningen och provet i en märkt platta. Upprepa med en ny pipett för varje prov som ska pläteras.
  8. Låt plattorna stelna i 15-20 min och placera dem sedan i en 33 °C inkubator kompletterad med 5%CO2. Vänd inte plattorna i minst 48 timmar efter att ha hällts.
  9. Beroende på mottagarklonens bakgrund, kontrollera att kolonierna förekommer i agarosen på urvalsplattorna efter 10-21 dagars inkubation. Välj minst 5-10 kolonier som växer på plattan i närvaro av båda antibiotika med en steriliserad bomullspluggad 5,75 i borosilikatpipett (se materialtabell) och inokulera dem i 1,5 ml 1x BSK med lämpliga antibiotika.
  10. Odla de inokulerade kolonierna vid 33 °C som i steg 1.3 i 3-5 dagar eller tills de når en densitet på cirka 20-40 spiroketer per fält vid 200x förstoring med hjälp av darkfieldmikroskopi.
    OBS: När spiroketerna har screenats (se steg 8) kan de frysas för långvarig lagring vid −80 °C genom att en lika stor volym kultur blandas med en blandning av 60 % glycerol och 40 % 1 x BSK steriliseras genom filtrering genom ett 0,22 μm-filter.

8. Kontroll av potentiella transduktanter

OBS: Screena klonerna som växer på plattor i närvaro av två antibiotika för att verifiera att de representerar sanna transduktanter i den förväntade (mottagar) bakgrunden. Dessa metoder är baserade på förstärkning och potentiell sekvensering av specifika regioner genom polymeraskedjereaktionen. Detaljerade protokoll och metoder för att utföra PCR i B. burgdorferi beskrivs någon annanstans (för ett aktuellt exempel, se Seshu et al.37). Välj de primers som används för att screena transduktanterna baserat på de stammar som används. Några förslag på hur man kan gå tillväga för att screena transduktanterna beskrivs nedan.

  1. Förbered B. burgdorferi lysater för PCR-screening.
    OBS: Följande protokoll används för att producera tvättade B. burgdorferi-lysater från odlade celler som odlas som i steg 7.9 för omedelbar analys av DNA med PCR. Denna metod är utformad för att minimera interferensen av potentiella hämmare i BSK men rekommenderas inte för att producera högkvalitativt DNA för sekvensering eller lagring. För detta ändamål, använd ett protokoll eller kit för total genomextraktion (se materialförteckning). Det rekommenderas starkt att lysater från moderklonerna (både givar- och mottagarstammar) också förbereds samtidigt för att inkluderas i varje analys.
    1. Överför 500 μl av varje potentiellt transduktant som valts och odlats enligt steg 7.10 till ett rent mikrocentrifugrör.
    2. Centrifugera kulturerna i 10 minuter vid 8 000 x g vid rumstemperatur.
    3. Ta bort supernatanten och återsuspendera varje pellet i 500 μl TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrifugera i 5 min vid 8 000 x g vid rumstemperatur.
    4. Ta bort supernatanten och återsuspendera varje pellet i 50 μl vatten av PCR-kvalitet. Koka proverna i 10 min. Låt dem svalna en kort stund och centrifugera sedan vid 8 000 x g i 10 min vid rumstemperatur.
    5. För varje PCR, använd omedelbart 2 μl från toppen av det centrifugerade provet. Undvik att störa pelleten.
  2. Screena de potentiella transduktanterna för de specifika gener som kodar för antibiotikaresistens med PCR. Se tabell 4 för primers för screening av antibiotikaresistensmarkörer som vanligtvis används i transduktionsanalyser.
    OBS: Även om det är sällsynt enligt vår erfarenhet kan spontan mutation till aminoglykosidantibiotika som används för val av heterologt DNA i B. burgdorferi förekomma.
  3. Screena de potentiella transduktanterna också med en annan stam- eller klonmarkör för att bekräfta att bakgrunden är mottagarens. Inkludera både givarens och mottagarens överordnade kloner i dessa analyser. Screena för töjningsspecifika markörer med hjälp av sekvenser baserade på de stammar som används och individuella laboratorieprotokoll för att bestämma töjningsintegritet.
  4. Om du försöker omvandla till virulenta kloner för användning inom fästingvektorn eller däggdjursvärd eller för direkt jämförelse med en annan klon, bestäm hela plasmidinnehållet i transduktanterna och moderklonerna. Detta görs för att säkerställa samma plasmidinnehåll som den jämförande stammen eller närvaron av de genetiska element som är nödvändiga för förökning inom den enzootiska cykeln, vilket beskrivs på andra ställen 18,19,37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Användningen av bakteriofag för att flytta DNA mellan mer lätt transformerbara B. burgdorferi-stammar eller kloner som är motsträviga mot elektrotransformation representerar ett annat verktyg för fortsatt molekylär undersökning av determinanterna för borrelia. Den transduktionsanalys som beskrivs häri kan modifieras efter behov för att underlätta förflyttningen av DNA mellan alla kloner av intresse med användning av antingen ett eller två antibiotika för val av potentiella transduktanter. Transduktionen av både prophage-DNA och heterologa E. coli/B. burgdorferi-skyttelvektorer mellan en högpassagestam CA-11.2A-klon och både en högpassagestam B31-klon och en virulent klon med låg passage av stam 297 har tidigare visats28. Resultaten som presenteras nedan visar rörelsen av prophage-DNA mellan två högpassage, avirulenta kloner. Donatorklonen, c1673, är en B. burgdorferi-stam CA-11.2A-klon som kodar för en kanamycinresistensgen på prophage-DNA27,28. Mottagaren är en klon av B. burgdorferi stam B31, betecknad c1706, som kodar för en gentamicinresistensmarkör på kromosomen28. Transduktionsanalysen utfördes enligt figur 1B; den PEG-utfällda fagen som återvunnits från supernatanterna av c1673 som utsatts för 5% etanol blandades med c1706 enligt beskrivningen i steg 6 i protokollet.

Efter blandning av cirka 20% av fagen som återvunnits genom PEG-utfällning från supernatanterna av etanolexponerad c1673 (kodningsresistens mot kanamycin) med c1706 (kodningsresistens mot gentamicin) pläterades blandningen i närvaro av båda antibiotika; kolonibildande enheter (CFU) som kan växa i närvaro av både kanamycin och gentamicin är tecken på transduktionshändelser (figur 2)27,28. Antalet CFUs rapporteras som transduktionsfrekvensen per initial mottagarcell. I detta representativa experiment återfanns cirka 275 transduktanter efter inkubation av fagen med 1 × 107 mottagarceller, vilket gav en transduktionsfrekvens på 2,75 × 10-5 CFUs per mottagarcell.

Efter återhämtningen av de potentiella transduktanterna utfördes PCR-förstärkning av generna som kodar för kanamycin- och gentamicinresistens på 10 av klonerna, med två representativa prover som visas i figur 3. Genen för kanamycinresistens kunde förstärkas från donatorn (c1673) och de potentiella transduktanterna men inte mottagarna (c1706). På samma sätt kan gentamicinresistensgenen förstärkas från mottagaren (c1706) och de potentiella transduktanterna men inte givaren. Således kodar de återvunna klonerna specifikt både antibiotikaresistensgener och representerar transduktionshändelser, inte spontana mutanter.

För att visa att kanamycinresistenskassetten transducerades av φBB-1 från givaren till mottagaren bestämdes transduktanternas bakgrund med hjälp av stamspecifika markörer, som beskrivits tidigare28. Detta är särskilt viktigt om transduktanterna har genererats genom samodlingsmetoden för transduktion. Kortfattat användes tidigare publicerade primers28 för att förstärka specifika regioner av olika borreliella plasmider, vilket genererade en profil som kan användas för att identifiera klonens bakgrund (Figur 4). C1673-klonen i CA-11.2A-bakgrunden kodar för specifika amplikoner 4, 5 och 6, medan c1706, som har en B31-bakgrund med hög passage, inte gör det. På samma sätt saknar de två transduktanterna amplikonerna 4, 5 och 6; Således har dessa kloner C1706-bakgrunden och har förvärvat kanamycinresistensgenen från C1673.

Komponent 1x BSK (för odling) (1 L) 1,5x BSK (för plätering) (1 L)
Bovint serumalbumin (fraktion V) 35 g 52,5 g
10x CMRL-1066 (utan L-glutamin) 8 g 12 g
Neopepton 4 g 6 g
jästolat 1,6 g 2,4 g
HEPES 4,8 g 7,2 g
Glukos 4 g 6 g
Natriumcitrat 0,56 g 0,84 g
Natriumpyruvat 0,64 g 0,96 g
N-acetyl-glukosamin 0,32 g 0,48 g
Bikarbonat 1,76 g 2,64 g
Värmeinaktiverat normalt kaninserum (INRS) 66 ml 99 ml

Tabell 1: BSK för odling och urval av B. burgdorferi-kloner för transduktionsanalyser. Formuleringen och beredningen av 1x BSK för odling av B. burgdorferi och 1,5x BSK för fastfasvalet av B. burgdorferi-kloner som beskrivs här är baserade på Samuels15. Olika formuleringar av BSK (eller MKP)37,40,41 som stöder tillväxten av B. burgdorferi har ännu inte testats med hjälp av transduktionsanalysen.

Antibiotikum Lagerkoncentration Slutlig koncentration i kultur av Bb
Kanamycin 100 mg.mL-1 (i vatten) 200-400 μ g.mL-1
Gentamicin 50 mg.mL-1 (i vatten) 50 μ g.mL-1
Streptomycin 50 mg.mL-1 (i vatten) 50 μ g.mL-1
Erytromycin 2 mg.mL-1 (i EtOH) 0,06 μ g.mL-1

Tabell 2: Potentiella antibiotika och koncentrationer som ska användas för selektion och underhåll av heterologt DNA i B. burgdorferi. Denna lista är baserad på nuvarande antibiotikaresistenta markörer som vanligtvis används i Borrelia burgdorferi42,43,44,45. Kanamycin, gentamicin och streptomycin framställs i vatten, filtreras genom ett 0,22 μM-filter och förvaras vid −20 °C. Erytromycin framställs i 95% etanol och lagras vid −20 °C. Många laboratorier rapporterar framgångsrik användning av kanamycin för selektion i en koncentration av 200 μg·ml−1; Vid användning av både gentamicin och kanamycin för selektion i transduktionsanalyser används 400 μg·ml−1 kanamycin. AadA-genen ger resistens mot både streptomycin och spektinomycin44. För val av konstruktioner som innehåller aadA-genen i E. coli, 100 μg·ml−1 spektinomycin används. Observera att aminoglykosiderna (kanamycin, gentamicin och streptomycin) inte är kliniskt relevanta vid behandling av borrelia. Emellertid används erytromycin kliniskt i vissa situationer46. Även om naturlig resistens mot detta antibiotikum i B. burgdorferi har rapporterats47, har denna resistensmarkör hittills inte använts i de transduktionsanalyser som rapporterats här.

Inducerande medel Lagerkoncentration (lösningsmedel) Slutlig koncentration i provet
Etanol 100% (ingen) 5%
Mitomycin C 2 mg.mL-1 (vatten) 20 μ g.mL-1
1-metyl-3-nitroso-nitroguanidin (MNNG) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 μ g.mL-1

Tabell 3: Potentiella inducerande medel och koncentrationer som används för induktion av φBB-1 från B. burgdorferi. N-metyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), mitomycin C och etanol, liksom metanol och isopropanol, har alla visat sig inducera φBB-1 över konstitutiva nivåer i B. burgdorferi stam CA.11-2A25,26,28. MNNG är en misstänkt cancerframkallande och miljöfara; Använd med försiktighet, lös upp i ett brännbart lösningsmedel och förbränn för bortskaffande. Mitomycin C är misstänkt cancerframkallande och potentiell miljöfara. Använd med försiktighet under en kemisk dragskåp och kassera på rätt sätt. Medan publicerade data tyder på att MNNG är det mest effektiva medlet för att inducera φBB-126, gör farorna med att arbeta med denna kemikalie och svårigheterna att förvärva den dess användning komplicerad48, särskilt med studenter. Induktion med etanol är genomgående bättre än med metanol eller isopropanol28 och har oftast använts i transduktionsanalysen.

Gennamn eller genbeteckning Antibiotikaresistens Hänvisning Primer namn Primersekvens (5 ́ till 3 ́)
kanR från Tn903 kanamycin 42 kanR 382F CGGTTGCATTCGATTCCTGT
kanR 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
aacC1 Gentamicin 43 aacC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
aacC1 497R TCTTCCCGTATGCCCAACTT
aadA Streptomycin 44 aadA 273F TGTGCACACACGACATCATTC
aadA 594R TACTGCGCTGTACCAAATGC

Tabell 4: Primers som används för den preliminära analysen av transduktion av markörer för antibiotikaresistens. De primers som anges här är för detektion av antibiotikaresistensgener som vanligtvis används i transduktionsanalyser. Dessa primers används i PCR med följande betingelser som upprepas i 28 cykler: denaturering vid 92 °C i 15 s, primerglödgning vid 56 °C i 15 s och mål-DNA-förlängning vid 72 °C i 30 s.

Figure 1
Figur 1: Transduktionsanalys för övervakning av fagmedierad rörelse (transduktion) av DNA. Transduktionsanalysen kan utföras med antingen (A) samodlingsmetoden eller (B) som återvunnits från odlingssupernatant genom PEG-utfällning. För samodlingsmetoden (A) odlas en inducerad B. burgdorferi-klon (givaren) som kodar för en antibiotikaresistensgen på DNA som ska transduceras av φBB-1 (grön cirkel) med en icke-inducerad B. burgdorferi-klon (mottagaren), som kodar för en andra antibiotikaresistensgen på kromosomen eller annat stabilt genetiskt element (röd cirkel). Denna metod kräver användning av två olika markörer för antibiotikaresistens (i detta exempel gener som kodar för kanamycin och gentamicinresistens). För att använda den renade fagen i transduktionsanalysen (B) blandas fagpartiklar som återvinns genom PEG-utfällning av supernatanten från den inducerade givaren med mottagaren. Även om den visas här med två olika antibiotika, kan denna metod utföras med användning av endast en antibiotikaresistensmarkör kodad på φBB-1-prophage-DNA, som tidigare visats27. Efter inkubation väljs transduktanter genom fastfasplätering i närvaro av båda antibiotika; om metod B används med endast en antibiotikaresistensmarkör kodad på-DNA, görs selektion med endast det antibiotikumet under fastfasplätering. Transduktanterna kommer att innehålla både antibiotikaresistensmarkörer och ha mottagarens bakgrund. Denna siffra är omtryckt från Eggers et al.28 med tillstånd från Oxford University Press. I det modellerade experimentet representerar c1673 och c1650 två olika CA-11.2A-kloner; c1673 bär en φBB-1-prophage som kodar för kanamycinresistens, och c1650 kodar för en gentamicinresistensmarkör på en icke-fagplats28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kolonibildande enheter valda genom fastfasplätering efter transduktionsanalysen. Kolonier som växer i närvaro av båda antibiotika efter blandning av fagen från c1673 med c1706 representerar potentiella transduktanter. Inga kolonier får växa på kontrollplattor som innehåller de enskilda donator- och mottagarklonerna eller ett prov av fagförberedelser (visas inte). Det minsta antalet produktiva i det ursprungliga provet kan bestämmas genom att räkna antalet CFU och multiplicera med utspädningsfaktorn. I detta fall gav 20% av fagprovet PEG-utfällt från en 15 ml kultur av givaren cirka 275 kolonier. Således var den ursprungliga koncentrationen av produktiv som återhämtades genom PEG-nederbörd ≥1,3 × 103 virioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: PCR-förstärkning av generna som ger kanamycinresistens och gentamicinresistens från två potentiella transduktanter. PCR med användning av primers för kanamycin- och gentamicinresistensgenerna (tabell 4) utfördes för att screena lysaterna som genererades från två kolonier (transduktant 1 och transduktant 2). Dessa kolonier valdes ut på en platta innehållande både kanamycin och gentamicin efter blandning av c1673 (givare) och c1706 (mottagare). Amplikonerna löstes på en 1% agarosgel elektrofores i 60 min vid 120 V i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert och färgades med 0,5 μg · ml − 1 etidiumbromid. Siffrorna anger storleksmarkörer i kilobaspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Bekräfta transduktanternas bakgrund. Regioner med specifika genetiska element förstärktes från c1673, c1706 och de två transduktanterna, som beskrivits tidigare28, för att bekräfta att transduktanternas bakgrund var mottagarklonens, c1706. De valda regionerna baserades på sekvenserna av gener på specifika linjära eller cirkulära plasmider (lp respektive cp) inom stammen B. burgdorferi-typ , B316. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) och 8 = fla-gen (kromosom). Amplikonerna löstes på en 1% agarosgel elektroforeserad i 60 min vid 120 V i 1x TAE-buffert och färgad med 0,5 μg·ml−1 etidiumbromid. Siffrorna anger storleksmarkörer i kilobaspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Användningen av transduktion kan representera en metod för att övervinna åtminstone några av de biologiska och tekniska hinder som är förknippade med elektrotransformationen av B. burgdorferi 1,4,13,37. I många system kan bakteriofag flytta värd-DNA (icke-prophage) mellan bakterieceller genom antingen generaliserad eller specialiserad transduktion 22,23,24,49,50. Vid specialiserad transduktion är några värdgener alltid förpackade i fagkapsiden tillsammans med prophage-DNA49,50. Till exempel paketerar φBB-1 alltid de delar av cp32 som är bakteriella ursprung, eftersom de är oupplösligt kopplade på plasmiden till de delar av cp32 som är faggenomet. Vid generaliserad transduktion antas förpackningsmekanismen för bakteriofagen låsa fast vid homologa icke-fagsekvenser och "av misstag" paketera slumpmässigt värd-DNA istället för-DNA; dessa bitar av DNA kan sedan införas i en annan cell49,50. Lite är ännu känt om generaliserad transduktion av i B. burgdorferi; i bättre karakteriserade bakteriesystem kan dock så många som 1% av bakteriofagen som frigörs från en cell innehålla slumpmässiga bakteriegener istället för-DNA51. Hittills har inga kromosomala markörer observerats transduceras mellan olika B. burgdorferi-kloner, men den tidigare demonstrationen att både cp32s och små heterologa skyttelvektorer kan förpackas och transduceras av φBB-1 indikerar att denna kan delta i både specialiserad och generaliserad transduktion28. Därför föreslås ett användningsfall för transduktion i laboratoriet, där elektrotransformation som genererar en kromosomal mutation fortfarande görs i bakgrunden av intresse; Införandet av skyttelvektorer för komplementering i trans- eller uttrycksstudier med hjälp av reporterkonstruktioner i stammar som är motsträviga mot elektrotransformation kan dock göras via transduktion mellan en mer transformerbar högpassageklon och mindre transformerbara stammar. Om framtida studier visar förmågan hos φBB-1 att också paketera och flytta kromosomala loci, kan de metoder som beskrivs här också visa sig vara användbara för att flytta modifierat kromosomalt DNA mellan lättare transformerbara stammar och stammar som annars är svåra att elektrotransformera. De cp32-liknande plasmiderna är genomgripande bland alla B. burgdorferi-stammar och de allra flesta andra borreliasjukdomar spiroketer52,53; det finns också bevis för homologer i andra Borrelia-arter, inklusive B. mayonii, B. miyamotoi och de som orsakar återfallande feber54,55,56. Huruvida homologerna i andra Borrelia-arter också är prophage är ännu inte känt, men i så fall kan transduktion också vara ett verktyg för molekylär dissektion av dessa arter, av vilka några ännu inte har lyckats genetiskt manipuleras.

Två metoder för att transducera DNA har presenterats här: samodling av donator- och mottagarkloner tillsammans före selektion (figur 1A) eller PEG-utfällning av från givaren och blandning av endast den fagen med mottagaren (figur 1B). Antalet transduktionshändelser per mottagarcell är högre efter samodling än med PEG-utfälld28, men samodling kräver att både givaren och mottagaren bär på olika antibiotikaresistensmarkörer och att bakgrunden till eventuella transduktanter noggrant screenas. Eftersom φBB-1-prophage är allestädes närvarande bland Borrelia52,53, finns det en teoretisk chans att en antibiotikaresistensmarkör eller annat heterologt DNA kan flytta från mottagaren till givaren (snarare än från givaren till mottagaren, som avsett). Att använda PEG-utfälld i transduktionsanalysen eliminerar denna möjlighet, eftersom givaren inte finns i/mottagarmixen. Dessutom krävs PEG-utfällning av fagen om fagen och dess genomiska innehåll ska användas både för analys (dvs. strukturell analys, kvantifiering, identifiering av förpackat material etc.) och transduktion. Trots dessa fördelar har användning av PEG-utfälld sina potentiella nackdelar; förutom att inte ge så många transduktanter som vid samodling kan PEG-nederbörd vara tidskrävande, kan leda till betydande fagförlust och resultera i prover som har föroreningar som kan störa nedströmsapplikationer57,58.

Transduktion har hittills demonstrerats från tre B. burgdorferi-stammar: CA-11.2A, en B31-klon med hög passage och en lågpassage 297-klon28. Av dessa tre producerar B. burgdorferi-stammen CA-11.2A den högsta mängden efter induktion25,26,28; men även efter induktion är antalet som återhämtats från B. burgdorferi fortfarande storleksordningar lägre än fagen som återhämtats i bättre karakteriserade system, såsom kolifag λ25,28,59. Således är en fråga som kan uppstå vid användning av transduktion via antingen samkultur eller blandning av efter PEG-utfällning det lilla antalet bakteriofag som frigörs från B. burgdorferi, även när de utsätts för inducerande medel. Dessutom är batch-till-batch-variationen i fagproduktion betydande, även när alla förhållanden, mediekomponenter och metoder verkar vara konsekventa mellan experiment. Av denna anledning är det viktigt att bestämma att minst ett minimalt antal produceras från en given klon eller under ett givet tillstånd. Traditionella analyser för att bestämma antalet i ett prov kräver att man blandar en liten mängd prov som innehåller med en tillåten bakterievärd där bakteriofagen är lytisk; Antalet produktiva fagpartiklar i provet bestäms av antalet lytiska händelser som inträffar i den bakgrunden, vilket resulterar i bildandet av plack på en gräsmatta av bakterierna60,61. Antalet rapporteras som plackbildande enheter (PFU)61. Kvantifiering av antalet produktiva φBB-1 som frigörs efter induktion med hjälp av en plackanalys hindras av oförmågan att odla Borrelia burgdorferi i en tät gräsmatta och en nuvarande brist på förståelse för de mekanismer som styr omkopplaren mellan de lysogena och lytiska replikationscyklerna för φBB-1. Medan anekdotiska rapporter om lyserade kulturer av B. burgdorferi är många, har det hittills inte funnits några publicerade studier som korrelerar observationen av lysen av en hel kultur med produktionen av. Av erfarenhet verkar endast ett litet antal celler i en given kultur spontant producera, förmodligen genom lys, och denna produktion kan endast ökas blygsamt med exponering för de kända inducerande medlen25,28,62. Således är en plackanalys för närvarande inte möjlig för kvantifiering av φBB-1 från B. burgdorferi.

För att kvantifiera antalet produktiva som produceras efter induktionen av B. burgdorferi kan transduktionsanalysen som beskrivs i denna rapport utföras med användning av en tillåten B. burgdorferi-klon med ett annat antibiotikum än det som förpackas av bakteriofagen. Denna analys resulterar i kolonier som härrör från transduktion, där varje koloni representerar en bekräftad. Således kan det minsta antalet i ett prov rapporteras som CFU snarare än PFU. Detta antal är sannolikt (långt) lägre än det faktiska totala antalet som produceras på grund av ineffektivitet som är inneboende i återhämtningen av genom PEG-utfällning (om den används), fastsättning och injektion av DNA med och fastfasplätering av B. burgdorferi.

En potentiell metod för att bestämma den totala mängden prophage-DNA inom supernatanterna i B. burgdorferi-kulturer är kvantitativ PCR (qPCR), men qPCR-protokoll för cp32-DNA från B. burgdorferi är inte väl representerade i litteraturen, och qPCR är ännu inte en metod som används i stor utsträckning för detta ändamål. För att kvalitativt bestämma att det finns minst en måttlig nivå av-DNA i ett givet prov kan det totala DNA:t extraheras från de PEG-utfällda supernatanterna i B. burgdorferi-kulturerna efter DNas-behandling före extraktion; -DNA kommer att skyddas av en intakt fagkapsid25. Det återvunna DNA:t löses sedan upp i en agarosgel och visualiseras med en DNA-fläck; detta protokoll ger vanligtvis ett svagt 30 kb-band som representerar det linjära DNA som är förpackat i faghuvudet25. Baserat på fläckens känslighet och intensiteten hos det korrekt dimensionerade-DNA-bandet i förhållande till en markör kan det ungefärliga antalet totala som återhämtats bestämmas25,27. En stark positiv korrelation mellan nivåerna av totalt-DNA som återhämtats från supernatanten med antalet transduktanter som återhämtats efter transduktionsanalysen har visats tidigare28.

Valet av givar- och mottagarstammar är avgörande för framgången med användningen av transduktion som ett molekylärt verktyg. Vår förståelse av cp32s som en prophage av φBB-1 kompliceras både av cp32:ornas genomslagskraft i borreliaspiroketerna52,53 och av det faktum att en enskild B. burgdorferi-cell kan innehålla flera homologer av dessa plasmider. Alla cp32:or i en cell verkar vara förpackade i faghuvuden i de fagproducerande stammar som har undersökts27. Det är dock inte klart om alla B. burgdorferi-stammar som innehåller cp32s kan producera bakteriofag, och stammar bör testas för denna förmåga före användning. På samma sätt är ingenting känt om receptorerna som tillåter att en viss stam transduceras av φBB-1, även om prophageplasmidens allestädes närvarande i hela släktet tyder på en hög sannolikhet för att en viss stam kan transduceras. Som kan härledas från närvaron av flera cp32-plasmider i en enskild B. burgdorferi-cell, verkar det inte finnas någon fagimmunitet63 som ges av närvaron av en befintlig prophage; stammarna CA.11-2A, B31 och 297 har använts i transduktionsanalyser och båda producerar och kan transduceras av φBB-127,28. Medan tidigare rapporter indikerade att transduktion var möjlig till endast ett begränsat antal stammar med peg-utfälld27, kan det ha berott på tekniska svårigheter med den metoden, eftersom alla stammar som hittills testats har varit framgångsrikt transducerbara med hjälp av samodlingsmetoden28.

När man utformar ett experiment för att använda transduktionsanalysen bör de viktigaste övervägandena för valet av donatorstam vara den genetiska bakgrunden, dess förmåga att lätt omvandlas via elektroporering och dess förmåga att producera. Även om en uttömmande undersökning av högpassageklonerna för varje stam inte har gjorts, producerar stammen CA-11.2A konstitutivt på detekterbara nivåer även i frånvaro av induktion. På liknande sätt producerar högpassagekloner av B31, den första B. burgdorferi-stammen som är helt sekvenserad5 och en vanligt förekommande stam i molekylära studier, också konstitutivt detekterbara mängder φBB-1 och är i allmänhet mycket transformerbara 1,4,25,27,37,64 . Om undersökningar kräver andra stammar rekommenderas att högpassagekloner av den stammen först testas för deras transformerbarhet genom att införa en plasmid som innehåller en markör för antibiotikaresistens via elektroporering och sedan bedöms för deras förmåga att transduceras genom att utföra en transduktionsanalys med en tillåten mottagare, såsom CA-11.2A eller B31, som kodar för en annan antibiotikaresistensmarkör. På samma sätt, för att säkerställa att en mottagarstam eller klon är tillåten för transduktion, kan en fagproducerande stam, såsom CA-11.2A som bär en prophage som kodar för resistens mot ett antibiotikum, blandas med klonen av intresse för att säkerställa att transduktion sker.

Mycket återstår att förstå om molekylärbiologin för φBB-1 och dess roll i HGT inom B. burgdorferi, särskilt när den passerar den enzootiska cykeln. Förmågan hos φBB-1 att experimentellt transducera både och heterologt DNA inom laboratoriet ger emellertid en möjlighet att lägga till ett annat verktyg för molekylär dissektion av B. burgdorferi och dess roll i patogenesen av Lyme-sjukdomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författaren vill tacka Shawna Reed, D. Scott Samuels och Patrick Secor för deras användbara diskussion och Vareeon (Pam) Chonweerawong för deras tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av institutionen för biomedicinska vetenskaper och fakultetsforskningsbidrag till Christian H. Eggers från School of Health Sciences vid Quinnipiac University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 187 Borrelia burgdorferi bakteriofag horisontell genöverföring transduktion
Fagmedierad genmanipulation av borrelia Spirokete <em>Borrelia burgdorferi</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter