Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fagmediert genetisk manipulasjon av Lyme-sykdommen Spirochete Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

Bakteriofagens evne til å flytte DNA mellom bakterieceller gjør dem til effektive verktøy for genetisk manipulering av deres bakterielle verter. Presentert her er en metode for å indusere, gjenopprette og bruke φBB-1, en bakteriofag av Borrelia burgdorferi, for å transdusere heterologt DNA mellom forskjellige stammer av Lyme-sykdommen spirochete.

Abstract

Innføring av fremmed DNA i spiroketen Borrelia burgdorferi har nesten utelukkende blitt oppnådd ved transformasjon ved hjelp av elektroporering. Denne prosessen har betydelig lavere effektivitet i Lyme sykdom spirochete i forhold til andre, bedre karakteriserte Gram-negative bakterier. Suksessraten for transformasjon er svært avhengig av å ha konsentrerte mengder DNA av høy kvalitet fra spesifikke bakgrunner og er gjenstand for betydelig belastning-til-belastningsvariabilitet. Alternative midler for å introdusere utenlandsk DNA (dvs. skyttelvektorer, fluorescerende reportere og antibiotikaresistensmarkører) i B. burgdorferi kan være et viktig tillegg til armamentarium av nyttige verktøy for genetisk manipulering av Lyme-sykdommen spirochete. Bakteriofag har blitt anerkjent som naturlige mekanismer for bevegelse av DNA blant bakterier i en prosess som kalles transduksjon. I denne studien er det utviklet en metode for å bruke den allestedsnærværende borreliale fagen φBB-1 for å transdusere DNA mellom B. burgdorferi-celler med både samme og forskjellig genetisk bakgrunn. Det transduserte DNA inkluderer både borrelialt DNA og heterologt DNA i form av små skyttelvektorer. Denne demonstrasjonen antyder en potensiell bruk av fagmediert transduksjon som et supplement til elektroporering for genetisk manipulering av Lyme-sykdommen spirochete. Denne rapporten beskriver metoder for induksjon og rensing av φBB-1 fra B. burgdorferi, bruk av denne fagen i transduksjonsanalyser, og valg og screening av potensielle transduktanter.

Introduction

Utviklingen av verktøy for genetisk manipulering av spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tilført umåtelig verdi til forståelsen av Lyme-sykdommens natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har et uvanlig komplekst genom som består av et lite lineært kromosom og både lineære og sirkulære plasmider 5,6. Spontant plasmidtap, intragen omorganisering (bevegelse av gener fra ett plasmid til et annet i samme organisme) og horisontal genoverføring (HGT, bevegelse av DNA mellom to organismer) har gitt opphav til en svimlende mengde genetisk heterogenitet blant B. burgdorferi (for eksempel, se Schutzer et al.7). De resulterende genotypene (eller "stammer") er alle medlemmer av samme art, men har genetiske forskjeller som påvirker deres evne til å overføre til og infisere forskjellige pattedyrverter 8,9,10,11. I denne rapporten vil begrepet "stamme" bli brukt til å referere til B. burgdorferi med en bestemt naturlig avledet genetisk bakgrunn; Begrepet "klone" vil bli brukt til å referere til en stamme som er genetisk modifisert for et bestemt formål eller som følge av eksperimentell manipulasjon.

Den molekylære verktøykassen som er tilgjengelig for bruk i B. burgdorferi inkluderer valgbare markører, genreportere, skyttelvektorer, transposon mutagenese, induserbare promotorer og motvalgbare markører (for en gjennomgang, se Drektrah og Samuels12). Effektiv bruk av disse metodene krever kunstig innføring av heterologt (utenlandsk) DNA i en B. burgdorferi-stamme av interesse. I B. burgdorferi oppnås innføringen av heterologt DNA nesten utelukkende via elektroporering, en metode som benytter en puls av elektrisitet for å gjøre en bakteriemembran forbigående gjennomtrengelig for små biter av DNA introdusert i media1. Flertallet av cellene (estimert til å være ≥99,5%) blir drept av pulsen, men de resterende cellene har en høy frekvens for å beholde det heterologe DNA13. Selv om det anses å være blant de mest effektive metodene for å introdusere DNA i bakterier, er hyppigheten av elektroporering i B. burgdorferi svært lav (fra 1 transformant i 5 × 104 til 5 × 106 celler)13. Barrierene for å oppnå høyere transformasjonsfrekvenser ser ut til å være både tekniske og biologiske. Tekniske barrierer for vellykket elektroporering av B. burgdorferi inkluderer både mengden DNA (>10 μg) som er nødvendig og kravet om at spiroketene skal være i nøyaktig riktig vekstfase (midt i loggen, mellom 2 × 10 7 celler · ml − 1 og 7 × 107 celler · ml −1) ved fremstilling av elektrokompetente celler12,13. Disse tekniske barrierene kan imidlertid være lettere å overvinne enn de biologiske barrierene.

Lyme sykdom forskere erkjenner at B. burgdorferi kloner kan deles inn i to brede kategorier med hensyn til deres evne til å bli manipulert genetisk13,14. Høy passasje, laboratorietilpassede isolater blir ofte lett transformert, men har vanligvis mistet plasmidene som er essensielle for smittsomhet, oppfører seg på en fysiologisk avvikende måte, og er ikke i stand til å infisere en pattedyrvert eller vedvare i en kryssvektor12,13. Selv om disse klonene har vært nyttige for å dissekere molekylærbiologien til spiroketen i laboratoriet, er de av liten verdi for å studere spirocheten innenfor den biologiske konteksten av den enzootiske syklusen. Lavpassasje smittsomme isolater oppfører seg derimot på en fysiologisk måte som reflekterer en smittsom tilstand og kan fullføre den smittsomme syklusen, men er vanligvis gjenstridig mot innføringen av heterologt DNA og er derfor vanskelig å manipulere for studie12,13. Vanskeligheten med å transformere isolater med lav passasje er relatert til minst to forskjellige faktorer: (i) isolater med lav passasje klumper seg ofte tett sammen, spesielt under de høye tetthetsforholdene som kreves for elektroporering, og blokkerer dermed mange celler fra enten full påføring av den elektriske ladningen eller tilgang til DNA i media13,15; og (ii) B. burgdorferi koder for minst to forskjellige plasmidbårne restriksjonsmodifikasjonssystemer (R-M) som kan gå tapt i høypassasjeisolater14,16. R-M-systemer har utviklet seg slik at bakterier kan gjenkjenne og eliminere fremmed DNA17. Faktisk har flere studier i B. burgdorferi vist at transformasjonseffektiviteten øker når kilden til DNA er B. burgdorferi i stedet for Escherichia coli13,16. Dessverre er anskaffelse av den nødvendige høye konsentrasjonen av DNA for elektroporering fra B. burgdorferi et dyrt og tidkrevende prospekt. En annen potensiell bekymring ved elektroporating og valg av lavpassasjeisolater er at prosessen ser ut til å favorisere transformanter som har mistet det kritiske virulensassosierte plasmidet, lp2514,18,19; dermed kan selve handlingen med genetisk manipulering av lavpassasje B. burgdorferi-isolater via elektroporering velge for kloner som ikke er egnet for biologisk relevant analyse innenfor den enzootiske syklusen20. Gitt disse problemene, kan et system der heterologt DNA kan elektrotransformeres til høypassasje B. burgdorferi-kloner og deretter overføres til lavpassasje smittsomme isolater ved en annen metode enn elektroporering, være et velkomment tillegg til den voksende samlingen av molekylære verktøy tilgjengelig for bruk i Lyme-sykdommen spirochete.

I tillegg til transformasjon (opptak av nakent DNA), er det to andre mekanismer hvor bakterier regelmessig tar opp heterologt DNA: konjugering, som er utveksling av DNA mellom bakterier i direkte fysisk kontakt med hverandre, og transduksjon, som er utveksling av DNA mediert av en bakteriofag21. Faktisk har bakteriofagens evne til å formidle HGT blitt brukt som et eksperimentelt verktøy for å dissekere de molekylære prosessene i en rekke bakterielle systemer22,23,24. B. burgdorferi er ikke naturlig kompetent for opptak av nakent DNA, og det er lite bevis på at B. burgdorferi koder for apparatet som er nødvendig for å fremme vellykket konjugering. Tidligere rapporter har imidlertid beskrevet identifisering og foreløpig karakterisering av φBB-1, en temperert bakteriofag av B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 pakker en familie på 30 kb plasmider funnet i B. burgdorferi25; Medlemmene av denne familien har fått betegnelsen CP32s. I samsvar med en rolle for φBB-1 i å delta i HGT blant B. burgdorferi-stammer, rapporterte Stevenson og medarbeidere en identisk cp32 funnet i to stammer med ellers forskjellige cp32s, noe som tyder på en nylig deling av denne cp32 mellom disse to stammene, sannsynligvis via transduksjon29. Det er også tegn på signifikant rekombinasjon via HGT blant cp32s i et ellers relativt stabilt genom30,31,32,33. Endelig har evnen til φBB-1 til å transdusere både cp32s og heterolog shuttle vector DNA mellom celler av samme stamme og mellom celler av to forskjellige stammer blitt demonstrert tidligere27,28. Gitt disse funnene har φBB-1 blitt foreslått som et annet verktøy som skal utvikles for disseksjon av molekylærbiologien til B. burgdorferi.

Målet med denne rapporten er å detaljere en metode for å indusere og rense φBB-1 fra B. burgdorferi, samt gi en protokoll for å utføre en transduksjonsanalyse mellom B. burgdorferi-kloner og velge og screene potensielle transduktanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ved bruk av rekombinante DNA- og BSL-2-organismer ble gjennomgått og godkjent av Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee.

1. Forberedelse av B. burgdorferi-kultur for produksjon av φBB-1

  1. Forbered Barbour-Stoenner-Kelly medium supplert med 6,6% varmeinaktivert normalt kaninserum (BSK)15. For 1 liter 1x BSK kombineres komponentene oppført i tabell 1 i 900 ml vann, justerer pH til 7,6 ved bruk av 1 N natriumhydroksid og blandes sakte ved 4 °C i 2-4 timer. Etter at blandingen er fullført, kontroller og juster pH til 7,6 om nødvendig, og øk volumet til 1 L med vann. Steriliser mediet ved å passere gjennom et 0,22 μM filter (se materialtabell) og bruk fersk eller oppbevar ved 4 °C i ≤2 måneder.
  2. Tre til fem dager før transduksjonsprotokollen påbegynnes, inokulerer 150 μL av den aktuelle B. burgdorferi-klonen (e) til 15 ml 1x BSK i tett kappede sterile koniske sentrifugerør (se Materialtabell). Suppler mediet med riktig konsentrasjon av antibiotika eller kombinasjon av antibiotika for valg og vedlikehold av heterologt DNA i B. burgdorferi-klonen (e) (tabell 2).
    MERK: B. burgdorferi er en biosikkerhetsnivå 2 organisme. Ta alle nødvendige forholdsregler mens du arbeider med denne organismen. Utfør alt arbeid med levende kulturer av B. burgdorferi i et sertifisert og riktig desinfisert klasse II biosikkerhetsskap. Kast bort alt materiale som kontakter B. burgdorferi og organismene selv basert på CDC-retningslinjer34.
  3. Inkuber kulturene ved 33 °C uten å riste til kulturene når en tetthet på ≥5 × 107 spiroketter·mL−1, som tar ca. 3-5 dager.

2. Bestem tettheten til B. burgdorferi-kulturen (e) (modifisert fra Samuels)15

  1. For tettheter som forventes å være over 5 × 106 celler·mL−1, bestem celletettheten ved hjelp av spektroskopi.
    1. Overfør 1 ml dyrkning til et mikrosentrifugerør på 1,7 ml og sentrifuge ved 8 000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Kast supernatanten og resuspend cellepelleten i 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 og 1,8 mM KH2PO4). Overfør hele cellesuspensjonen til en semi-mikro UV gjennomsiktig kyvette.
    3. Bestem den optiske tettheten til den resuspenderte prøven ved en bølgelengde på 600 nm (A600). Null spektrofotometeret (se materialtabell) mot PBS.
    4. For å beregne konsentrasjonen av spiroketter·mL−1 i den opprinnelige kulturen, multipliser den optiske tettheten ved A600 med 1,4 × 109.
  2. For tettheter som forventes å være mellom 5 × 104 celler·mL−1 og 5 × 106 celler·mL−1, bestemmer du celletettheten ved hjelp av et Petroff-Hausser tellekammer (se Materialtabell) for å telle antall spiroketter direkte. Denne metoden kan også brukes til høyere tettheter etter passende fortynning.
    MERK: Visualiseringen av levende spiroketter krever et mikroskop modifisert med en darkfield-kondensator.
    1. Påfør 10 μL prøve på tellekammeret og dekk med passende dekselglass. For tettheter høyere enn 1 × 107, fortynn prøven i PBS for å gi 50-100 spiroketter per felt.
    2. Tell cellene ved hjelp av et mørkefeltmikroskop ved en forstørrelse på 200x-400x. Tell hele feltet på 25 grupper med 16 små firkanter i alle plan.
    3. Multipliser tallet som telles med fortynningsfaktoren (hvis noen) og 5 × 104 for å gi celler · ml-1 av opprinnelig kultur.

3. Induksjon av B. burgdorferi φBB-1

MERK: Steriliser alt glass og plastikk ved autoklavering; steriliser alle løsningene ved autoklavering eller filtrering gjennom et 0,22 μM filter. Trinnene nedenfor presenteres basert på volumer på 15 ml, men metoden er skalerbar til mindre eller større volumer avhengig av eksperimentets individuelle behov.

  1. For B. burgdorferi-kulturen som skal produseres fra (donoren), bruk konsentrasjonen beregnet ved en av metodene i trinn 2 for å bestemme volumet av startkultur som trengs for å gi 4 ml på 2 × 108 spiroketter · ml −1. Dette vil gi en endelig konsentrasjon på 5 × 107 spiroketter·mL−1 i 15 ml under restitusjonsfasen (trinn 3,6 nedenfor).
  2. Sentrifuge kulturvolumet beregnet i trinn 3.1 ved 6 000 x g i 10 minutter. Dekanter supernatanten og resuspender pelleten i 4 ml fersk BSK. Overfør prøven til det minste sterile røret som er tilgjengelig for å holde prøven med minimal hodeplass.
  3. Tilsett riktig mengde induserende middel til den anbefalte konsentrasjonen (tabell 3) basert på et kulturvolum på 4 ml for å indusere fagproduksjon. Dekk røret tett og bland godt.
  4. Inkuber prøven ved 33 °C i 2-4 timer.
  5. Etter inkubasjon, overfør prøven til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger prøven ved 6000 x g i 10 minutter. Decant supernatanten.
  6. Resuspend cellepelleten i 15 ml 1x BSK.
    MERK: Etter induksjon av fagen er det to forskjellige måter å fortsette med transduksjonsanalysen. Disse metodene er presentert i figur 1 og i trinn 4 og trinn 6.

4. Transduksjon under samkultur etter donorens eksponering for induserende middel (figur 1A)

MERK: Denne protokollen kan bare brukes når den fagproduserende stammen (donor) har resistens mot et bestemt antibiotika og stammen som skal overføres (mottaker) har resistens mot et annet antibiotika.

  1. Forbered en B. burgdorferi-kultur som skal brukes som mottaker i transduksjonsanalyser, som beskrevet for donorstammen i trinn 1 ovenfor. Basert på tettheten bestemt som i trinn 2, beregne volumet som trengs for å gi 15 ml av 1 × 107 spiroketter·mL−1.
  2. Sentrifuge kulturvolumet beregnet i trinn 4.1 ved 6 000 x g i 10 minutter. Decant supernatanten.
  3. Resuspendere pelleten i 1 ml kultur fra trinn 3.6 (resuspendert fagdonor). Legg mottakeren tilbake i kulturen sammen med donoren. Ikke supplere med antibiotika. Det totale volumet som inneholder begge kulturer er 15 ml.
  4. Inkuber ved 33 °C i 72-96 timer.
  5. Utfør valg av transduktanter ved fastfasebelegg etter samkultur som beskrevet i trinn 7.

5. Polyetylenglykol (PEG) utfelling for å gjenopprette til bruk i transduksjonsanalyse

MERK: Denne protokollen kan brukes i tilfeller der den fagproduserende stammen (donor) har resistens mot et bestemt antibiotika og stammen som skal overføres (mottaker) enten ikke har antibiotikaresistens eller resistens mot et annet antibiotika.

  1. Suppler kulturen fra trinn 3.6 med passende antibiotika ved konsentrasjonen angitt i tabell 2. Inkuber prøven ved 33 °C i 72-96 timer.
  2. Forbered løsninger for PEG-nedbør.
    1. Forbered 500 ml 5 m NaCl. Steriliser ved autoklavering og la avkjøles før bruk. Oppbevares ved romtemperatur.
    2. Forbered 500 ml 40% PEG ved å oppløse 200 g PEG8000 i 400 ml vann; Varm forsiktig under omrøring til løsningen er godt blandet. Ta volumet opp til 500 ml med vann. For å fullstendig oppløse PEG8000 og sterilisere oppløsningen, autoklav oppløsningen og avkjøles før bruk. Oppbevares ved romtemperatur.
    3. Forbered 100 ml suspensjonsmedium (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 og 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Steriliser ved autoklavering. Oppbevares ved 4 °C.
  3. For PEG-utfelling av fra donoren B. burgdorferi-klonen (fra trinn 3.6), etter 72-96 timers inkubasjon, sentrifugerer prøvene ved 8000 x g i 20 minutter ved 4 °C.
  4. Dekanter supernatanten til et rent 50 ml konisk rør; Kast cellepelleten. Tilsett 5 M NaCl til en endelig konsentrasjon på 1 M. Bland godt. Rock forsiktig ved romtemperatur i 1 time.
  5. Sentrifuge prøvene ved 8000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Dekanter supernatanten til et rent 50 ml konisk rør; Pelleten kan være liten eller fraværende. Tilsett 40% PEG8000-oppløsning til supernatanten til en endelig konsentrasjon på 10%. Bland godt og sett på is i mer enn 1 time frem til over natten.
    MERK: Lengre tider ser ikke ut til å korrelere med betydelig økt faggjenoppretting.
  6. Sentrifuge prøvene ved 8000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og fjern så mye overflødig væske som mulig uten å miste pellet, som inneholder fagpartiklene.
  7. Resuspend pelleten i et minimalt volum SM, ved hjelp av SM for å vaske ned siden av flasken og samle eventuelle fagpartikler. Det anbefalte forholdet er 400 μL SM per 10 ml original supernatant, men avhengig av pelletens størrelse kan det være nødvendig med mer eller mindre SM for fullstendig resuspendering.
  8. Behandle den gjenvunnede fagprøven med et likt volum kloroform basert på volumet av resuspendering. Bland prøven godt og sentrifuger deretter ved 8000 x g i 10 minutter. Fjern det vandige (øverste) laget til et rent rør, og unngå noe av det tykke grensesnittlaget.
    MERK: φBB-1 er en ikke-innhyllet bakteriofag og er ikke utsatt for kloroformbehandling25. Dette trinnet er gjort for å ytterligere forstyrre eventuelle membranbundne strukturer (dvs. celler eller flekker) og for å drepe potensielle cellulære forurensninger. Kloroform er en flyktig organisk og skal bare brukes i en godt ventilert avtrekkshette; Kast materiale som inneholder kloroform som organisk avfall.
  9. Bestem volumet som gjenvinnes etter den første kloroformbehandlingen og behandle prøven igjen med en mengde kloroform lik 10% av dette volumet. Bland godt og sentrifuger ved 8000 x g i 10 min. Fjern det vandige (øverste) laget, og vær forsiktig med å unngå noe av grensesnittet eller det organiske laget. Overfør det vandige laget til et rent rør.
  10. Bruk fagen umiddelbart (som beskrevet i trinn 6) eller oppbevar ved 4 °C.
    MERK: Frysing av φBB-1 fagprøver anbefales ikke. Selv om stabiliteten til φBB-1 ved 4 °C ikke er grundig undersøkt, har prøver lagret ved 4 °C i opptil 1 måned etter restitusjon blitt brukt med hell i transduksjonsanalyser.

6. Transduksjonsanalyse etter PEG-nedbør av φBB-1 (figur 1B)

  1. Forbered B. burgdorferi-kulturer som skal brukes som mottaker i transduksjonsanalyser, som beskrevet for donorstammen i trinn 1 ovenfor. Basert på tettheten bestemt som i trinn 2, beregne volumet av mottakerkultur som trengs for å gi 15 ml av 1 × 107 spiroketter · ml−1.
  2. Sentrifuge kulturvolumet beregnet i trinn 6,1 ved 6 000 x g i 10 minutter. Dekanter supernatanten og resuspend pelleten i 14,5 ml fersk BSK.
  3. Tilsett ≤500 μL PEG-utfelt fagprøve (fra trinn 5) til kulturen til mottakerklonen. Bland godt og inkuber ved 33 °C i 72-96 timer.
    MERK: Mengden fag gjenvunnet under PEG-nedbør kan variere, avhengig av en rekke faktorer. Men fra 15 ml kultur av indusert B. burgdorferi stamme CA-11.2A, inneholder 500 μL vanligvis 50-1000 levedyktig28. Volumer av fagutvinning ≥500 μL påvirker B. burgdorferi-veksten negativt, sannsynligvis på grunn av det økte forholdet mellom SM og BSK.
  4. Utfør valg av transduktanter ved fastfasebelegg etter blanding med PEG-utfelt som beskrevet i trinn 7.

7. Valg av transduktanter

MERK: Solid-fase plating av potensielle transduktanter utføres ved hjelp av en enkeltlags modifikasjon av protokollen først beskrevet av Samuels15. B. burgdorferi-kolonier vokser i agar, så for valg av transduktanter ved fastfasebelegg, må prøvene legges til mediet mens platene helles. En alternativ metode for valg av transformanter ved bruk av en fortynningsmetode i 96-brønnsplater er også beskrevet tidligere35. Denne teknikken kan også være effektiv for valg av transduktanter, men har ennå ikke blitt prøvd for dette formålet.

  1. Bestem antall plater som trengs for valg av transduktanter basert på antall prøver fra transduksjonsanalysene og kontrollene som skal belegges.
    MERK: Vanligvis helles to plater per prøve, en tilsvarer omtrent 10% av kulturvolumet og en som inkluderer resten av kulturen. I tillegg helles plater som fungerer som negative kontroller for å teste individuelt at fagpreparatet og / eller foreldreklonene som brukes som donor og mottaker, ikke vokser i nærvær av antibiotika (er) som brukes under valg. Det anbefales også å klargjøre pletteringsmateriale for minst to ekstra plater. For eksempel, hvis antall prøver og kontroller som skal belagt er åtte, må du forberede nok pletteringsblanding for 10 plater.
  2. Forbered løsninger for plating som beskrevet nedenfor.
    MERK: Hver plate vil være 30 ml, bestående av 20 ml 1,5x BSK for plating og 10 ml 2,1% agarose (2: 1-forhold). Dette vil gi en plate med endelige konsentrasjoner på 1x BSK og 0,7% agarose. For eksempel, for 10 plater, lag en total pletteringsblanding på 300 ml, bestående av 200 ml 1,5x BSK og 100 ml 2,1% agarose.
    1. Forbered 1 l på 1,5x BSK som beskrevet for 1x BSK i trinn 1.1 ved å bruke mengdene av hver komponent som er oppført for 1,5x BSK i tabell 1. Oppbevares som beskrevet for 1x BSK.
    2. Forbered 2,1% agarose i vann og autoklav. Bruk agaroseoppløsningen frisk eller oppbevar ved romtemperatur. Hvis den oppbevares ved romtemperatur, mikrobølgeovn med lokket på løst til det er helt smeltet før plating.
    3. Bestem volumet av antibiotika som trengs for å oppnå riktig konsentrasjon (tabell 2) basert på hele pletteringsblandingen.
      MERK: Hvis det totale volumet av den endelige pletteringsløsningen er 300 ml, bland 200 ml 1,5 ganger BSK og nok antibiotika for å sikre at hele 300 ml har riktig endelig antibiotikakonsentrasjon. Hvis både donor og mottaker i transduksjonsanalysen har forskjellige antibiotikaresistensgener, bør pletteringsblandingen inneholde begge antibiotika. Hvis PEG-utfelt fra donor (som fremstilt i trinn 5) koder for en antibiotikaresistensmarkør og mottakeren ikke har noen, skal pletteringsblandingen bare inneholde det ene antibiotikumet.
  3. Basert på antall plater som skal helles, overfør riktig mengde 1,5x BSK og antibiotika (er) til en steril flaske som er stor nok til å holde hele platingblandingen. Balanser i et vannbad ved 56 °C i ≥15 min.
  4. Balanser smeltet agarose fra autoklaven eller mikrobølgeovnen i et 56 °C vannbad i ≥15 min.
  5. Etter likevekt, tilsett den bestemte mengden 2,1% agarose til flasken med 1,5x BSK (med antibiotika) og sett pletteringsløsningen tilbake i vannbadet ved 42 ° C i 10-15 minutter.
    MERK: Høyere temperaturer kan skade eller drepe spiroketter36. Hvis du bruker samme vannbad som ovenfor, avkjøl vannbadet til 42-45 °C før du starter timeren for likevekten. Ikke la pletteringsløsningen balansere ved 42 °C i mer enn 20 minutter, ellers vil den begynne å stivne mens du heller platene.
  6. Under likevekt, forberede B. burgdorferi-prøvene som skal belagtes. Overfør mengden som skal belagt til et sterilt 50 ml konisk sentrifugerør (se tabell over materialer).
    1. Hvis plating en mengde mindre enn 1,5 ml (<5% av det endelige 30 ml platevolumet), overfør prøven til det nye røret og legg pletteringsblandingen direkte til prøven under plettering.
    2. For større volumer, overfør ønsket kulturvolum til det nye røret og sentrifuger deretter ved 6000 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Dekanter alle unntatt 100-500 μL av supernatanten og bruk resten til å resuspendere pelleten helt før plating.
    3. For kontrollplater som følger samkultur, tilsett ≥107 celler fra donor- eller mottakerklonene til sterile 50 ml koniske sentrifugerør. Hvis volumet er over 1,5 ml, sentrifuger og resuspender pelleten som i trinn 7.6.2. Hvis en transduksjonsanalyse ble utført ved bruk av PEG-utfelt, i tillegg til mottakerklonen, tilsett 100-250 μL av fagprøven i et sterilt 50 ml konisk rør for plating.
  7. Etter at pletteringsløsningen har balansert ved 42-45 ° C i 10-15 minutter, overfør 30 ml av pletteringsoppløsningen til et rør med riktig prøve; Dispenser umiddelbart pletteringsblandingen og prøv i en merket plate. Gjenta med en ny pipette for hver prøve som skal belagt.
  8. La platene stivne i 15-20 minutter og legg dem deretter i en 33 °C inkubator supplert med 5% CO2. Ikke snu platene i minst 48 timer etter helling.
  9. Avhengig av bakgrunnen til mottakerklonen, må du kontrollere at koloniene vises i agarose på utvalgsplatene etter 10-21 dagers inkubasjon. Velg minst 5-10 kolonier som vokser på platen i nærvær av begge antibiotika ved hjelp av en sterilisert bomullsplugget 5,75 i borosilikatpipette (se materialtabell) og inokuler dem til 1,5 ml 1x BSK med passende antibiotika (er).
  10. Dyrk de inokulerte koloniene ved 33 °C som i trinn 1,3 i 3-5 dager eller til de når en tetthet på ca. 20-40 spiroketter per felt ved 200x forstørrelse ved bruk av darkfield-mikroskopi.
    MERK: Når de er screenet (se trinn 8), kan spiroketene fryses for langtidsoppbevaring ved -80 ° C ved å blande et likt volum kultur med en blanding av 60% glyserol og 40% 1x BSK sterilisert ved filtrering gjennom et 0,22 μm filter.

8. Verifisering av potensielle transduktanter

MERK: Screen klonene som vokser på plater i nærvær av to antibiotika for å bekrefte at de representerer ekte transduktanter i den forventede (mottaker) bakgrunnen. Disse metodene er basert på forsterkning, og potensielt sekvensering, av spesifikke regioner ved polymerasekjedereaksjonen. Detaljerte protokoller og praksis for å utføre PCR i B. burgdorferi er beskrevet andre steder (for et nylig eksempel, se Seshu et al.37). Velg primerne som brukes til screening av transduktantene basert på stammene som brukes. Noen forslag til hvordan man kan tilnærme seg screening av transduktantene er beskrevet nedenfor.

  1. Forbered B. burgdorferi lysater for PCR screening.
    MERK: Følgende protokoll brukes til å produsere vasket B. burgdorferi-lysater fra dyrkede celler dyrket som i trinn 7.9 for umiddelbar analyse av DNA ved PCR. Denne metoden er designet for å minimere forstyrrelsen av potensielle hemmere i BSK, men anbefales ikke for å produsere DNA av høy kvalitet for sekvensering eller lagring. For dette formålet, bruk en protokoll eller et sett for total genomutvinning (se Tabell over materialer). Det anbefales sterkt at lysater fra foreldreklonene (både donor- og mottakerstammer) også utarbeides samtidig for å inkludere i hver analyse.
    1. Overfør 500 μL av hvert potensielt transduktivt middel valgt og dyrket som i trinn 7.10 til et rent mikrosentrifugerør.
    2. Sentrifuge kulturene i 10 minutter ved 8000 x g ved romtemperatur.
    3. Fjern supernatanten og resuspend hver pellet i 500 μL TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Sentrifuge i 5 minutter ved 8000 x g ved romtemperatur.
    4. Fjern supernatanten og resuspend hver pellet i 50 μL vann av PCR-kvalitet. Kok prøvene i 10 min. La dem avkjøles kort, og sentrifuger deretter ved 8000 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
    5. For hver PCR, bruk umiddelbart 2 μL fra toppen av sentrifugert prøve; Unngå å forstyrre pelleten.
  2. Screen de potensielle transduktantene for de spesifikke genene som koder for antibiotikaresistens ved hjelp av PCR. Se tabell 4 for primere for screening av antibiotikaresistensmarkører som vanligvis brukes i transduksjonsanalyser.
    MERK: Selv om det er sjeldent i vår erfaring, kan spontan mutasjon til aminoglykosidantibiotika som brukes til valg av heterologt DNA i B. burgdorferi forekomme.
  3. Screen de potensielle transduktantene også ved hjelp av en annen belastning eller klonemarkør for å bekrefte at bakgrunnen er mottakerens. Inkluder både donor- og mottakerforeldreklonene i disse analysene. Skjerm for belastningsspesifikke markører ved hjelp av sekvenser basert på stammene som brukes og individuelle laboratorieprotokoller for å bestemme belastningsintegritet.
  4. Hvis du prøver å transdusere til virulente kloner for bruk i kryssvektoren eller pattedyrverten eller for direkte sammenligning med en annen klone, må du bestemme det komplette plasmidinnholdet i transduktantene og foreldreklonene. Dette gjøres for å sikre det samme plasmidinnholdet som for den komparative stammen eller tilstedeværelsen av de genetiske elementene som er nødvendige for forplantning i den enzootiske syklusen, som beskrevet andre steder 18,19,37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruken av bakteriofag for å flytte DNA mellom lettere transformerbare B. burgdorferi-stammer eller kloner som er gjenstridige mot elektrotransformasjon, representerer et annet verktøy for fortsatt molekylær undersøkelse av determinanter for Lyme-sykdommen. Transduksjonsanalysen beskrevet her kan modifiseres etter behov for å lette bevegelsen av DNA mellom kloner av interesse ved bruk av enten ett eller to antibiotika for valg av potensielle transduktanter. Transduksjonen av både profag-DNA og heterologe E. coli/B. burgdorferi-skyttelvektorer mellom en CA-11.2A-klon med høy passasjestamme og både en høypassasjestamme B31-klon og en lavpassasjevirulent klone av stamme 297 har tidligere blitt demonstrert28. Resultatene presentert nedenfor viser bevegelsen av profag-DNA mellom to høypassasje, avirulent-kloner. Donorklonen, c1673, er en B. burgdorferi-stamme CA-11.2A-klone som koder for et kanamycinresistensgen på profag-DNA27,28. Mottakeren er en klone av B. burgdorferi stamme B31, betegnet c1706, som koder for en gentamicin-resistensmarkør på kromosom28. Transduksjonsanalysen ble utført som illustrert i figur 1B; PEG-utfelt gjenvunnet fra supernatanter av c1673 utsatt for 5% etanol ble blandet med c1706 som beskrevet i trinn 6 i protokollen.

Etter blanding av ca. 20% av fagen gjenvunnet ved PEG-utfelling fra supernatantene av etanoleksponert c1673 (kodingsresistens mot kanamycin) med c1706 (kodingsresistens mot gentamicin), ble blandingen belagt i nærvær av begge antibiotika; kolonidannende enheter (CFU) som er i stand til å vokse i nærvær av både kanamycin og gentamicin, indikerer transduksjonshendelser (figur 2) 27,28. Antall CFU rapporteres som transduksjonsfrekvensen per første mottakercelle. I dette representative eksperimentet ble ca. 275 transduktanter gjenfunnet etter inkubasjon av fagen med 1 × 107 mottakerceller, noe som ga en transduksjonsfrekvens på 2,75 × 10-5 CFU per mottakercelle.

Etter utvinningen av de potensielle transduktivene ble PCR-amplifisering av genene som koder for kanamycin og gentamicinresistens utført på 10 av klonene, med to representative prøver vist i figur 3. Kanamycinresistensgenet kunne forsterkes fra donoren (c1673) og de potensielle transduktantene, men ikke mottakerne (c1706). På samme måte kan gentamicinresistensgenet forsterkes fra mottaker (c1706) og de potensielle transduktantene, men ikke donoren. Dermed koder de gjenvunnede klonene spesifikt for både antibiotikaresistensgener og representerer transduksjonshendelser, ikke spontane mutanter.

For å demonstrere at kanamycinresistenskassetten ble transdusert av φBB-1 fra giver til mottaker, ble bakgrunnen til transduktantene bestemt ved hjelp av stammespesifikke markører, som beskrevet tidligere28. Dette er spesielt viktig hvis transduktantene er generert ved kokulturmetoden for transduksjon. Kort fortalt ble tidligere publiserte primere28 brukt til å forsterke spesifikke regioner av forskjellige borreliale plasmider, og genererte en profil som kan brukes til å identifisere bakgrunnen til klonen (figur 4). C1673-klonen i CA-11.2A-bakgrunnen koder for spesifikke amplikoner 4, 5 og 6, mens c1706, som har en B31-bakgrunn med høy passasje, ikke gjør det. På samme måte mangler de to transduktantene amplikonene 4, 5 og 6; Dermed har disse klonene C1706-bakgrunnen og har fått kanamycinresistensgenet fra C1673.

Komponent 1x BSK (for dyrking) (1 L) 1,5x BSK (for plating) (1 L)
Bovint serumalbumin (fraksjon V) 35 g 52,5 g
10x CMRL-1066 (uten L-glutamin) 8 g 12 g
Neopepton 4 g 6 g
gjærolat 1,6 g 2,4 g
HEPES 4,8 g 7,2 g
Glukose 4 g 6 g
Natriumsitrat 0,56 g 0,84 g
Natriumpyruvat 0,64 g 0,96 g
N-acetyl-glukosamin 0,32 g 0,48 g
Natron 1,76 g 2,64 g
Varmeinaktivert normalt kaninserum (INRS) 66 ml 99 ml

Tabell 1: BSK for dyrking og utvelgelse av B. burgdorferi-kloner for transduksjonsanalyser. Formuleringen og fremstillingen av 1x BSK for dyrking av B. burgdorferi og 1,5x BSK for fastfasevalg av B. burgdorferi-kloner beskrevet her er basert på Samuels15. Ulike formuleringer av BSK (eller MKP)37,40,41 som støtter veksten av B. burgdorferi har ennå ikke blitt testet ved hjelp av transduksjonsanalysen.

Antibiotikum Lager konsentrasjon Endelig konsentrasjon i kultur av Bb
Kanamycin 100 mg.mL-1 (i vann) 200-400 g.mL-1
Gentamicin 50 mg.mL-1 (i vann) 50 μ g.mL-1
Streptomycin 50 mg.mL-1 (i vann) 50 g.mL-1
Erythromycin 2 mg.mL-1 (i EtOH) 0,06 μ g.mL-1

Tabell 2: Potensielle antibiotika og konsentrasjoner som skal brukes til seleksjon og vedlikehold av heterologt DNA i B. burgdorferi. Denne listen er basert på nåværende antibiotikaresistente markører som vanligvis brukes i Borrelia burgdorferi42,43,44,45. Kanamycin, gentamicin og streptomycin fremstilles i vann, filtersteriliseres gjennom et 0,22 μM-filter og lagres ved -20 ° C. Erytromycin fremstilles i 95% etanol og lagres ved -20 ° C. Mange laboratorier rapporterer vellykket bruk av kanamycin for seleksjon i en konsentrasjon på 200 μg · ml −1; Ved bruk av både gentamicin og kanamycin til seleksjon i transduksjonsanalyser brukes 400 μg·mL−1 kanamycin. aadA-genet gir resistens mot både streptomycin og spektinomycin44. For valg av konstruksjoner som inneholder aadA-genet i E. coli, 100 μg·mL−1 spektinomycin brukes. Merk at aminoglykosider (kanamycin, gentamicin og streptomycin) ikke er klinisk relevante i behandlingen av Lyme sykdom; Imidlertid brukes erytromycin klinisk i visse situasjoner46. Selv om naturlig resistens mot dette antibiotikumet i B. burgdorferi er rapportert47, har denne resistensmarkøren hittil ikke blitt brukt i transduksjonsanalysene som er rapportert her.

Induserende agent Lagerkonsentrasjon (løsemiddel) Endelig konsentrasjon i prøven
Etanol 100% (ingen) 5%
Mitomycin C 2 mg.mL-1 (vann) 20 g.mL-1
1-metyl-3-nitroso-nitroguanidin (MNNG) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 g.mL-1

Tabell 3: Potensielle induserende midler og konsentrasjoner brukt til induksjon av φBB-1 fra B. burgdorferi. N-metyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), mitomycin C og etanol, samt metanol og isopropanol, har alle vist seg å indusere φBB-1 over konstitutive nivåer i B. burgdorferi-stamme CA.11-2A25,26,28. MNNG er en mistenkt kreftfremkallende og miljøfare; Skal brukes med forsiktighet, oppløses i et brennbart oppløsningsmiddel og forbrennes til destruksjon. Mitomycin C er et mistenkt kreftfremkallende og potensielt miljøfare; Bruk med forsiktighet under en kjemisk avtrekkshette og kast på riktig måte. Mens publiserte data tyder på at MNNG er det mest effektive middelet for å indusere φBB-126, gjør farene ved å jobbe med dette kjemikaliet og vanskeligheter med å skaffe det bruken komplisert48, spesielt med studenter. Induksjon med etanol er gjennomgående bedre enn med metanol eller isopropanol28 og har vært mest brukt i transduksjonsanalysen.

Gennavn eller betegnelse Antibiotikaresistens Referanse Primer navn Primersekvens (5 ́ til 3 ́)
kanR fra Tn903 Kanamycin 42 kanR 382F CGGTTGCATTCGATTCCTGT
kanR 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
aacC1 Gentamicin 43 AACC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
aacC1 497R TCTTCCCGTATGCCCAACTT
aadA Streptomycin 44 aadA 273F TGTGCACGACGACATCATTC
aadA 594R TACTGCGCTGTACCAAATGC

Tabell 4: Primere brukt til foreløpig analyse av transduksjon av antibiotikaresistensmarkører. Primere angitt her er for påvisning av antibiotikaresistensgener som vanligvis brukes i transduksjonsanalyser. Disse primerne brukes i PCR med følgende forhold gjentatt i 28 sykluser: denaturering ved 92 °C i 15 s, primerglødning ved 56 °C i 15 s og mål-DNA-forlengelse ved 72 °C i 30 s.

Figure 1
Figur 1: Transduksjonsanalyse for overvåking av fagmediert bevegelse (transduksjon) av DNA. Transduksjonsanalysen kan utføres ved bruk av enten (A) samkulturmetoden eller (B) gjenvunnet fra kultursupernatant ved PEG-nedbør. For samkulturmetoden (A) dyrkes en indusert B. burgdorferi-klon (donoren) som koder for et antibiotikaresistensgen på DNA som skal transduseres av φBB-1 (grønn sirkel) med en ikke-indusert B. burgdorferi-klon (mottakeren), som koder for et andre antibiotikaresistensgen på kromosomet eller et annet stabilt genetisk element (rød sirkel). Denne metoden krever bruk av to forskjellige antibiotikaresistensmarkører (i dette eksemplet gener som koder for kanamycin og gentamicinresistens). For å bruke den rensede fagen i transduksjonsanalysen (B), blandes fagpartikler gjenvunnet ved PEG-utfelling av supernatanten fra den induserte giveren med mottakeren. Mens det her vises ved bruk av to forskjellige antibiotika, kan denne metoden utføres ved bruk av bare en antibiotikaresistensmarkør kodet på φBB-1 prophage DNA, som tidligere demonstrert27. Etter inkubasjon velges transduktanter ved fastfasebelegg i nærvær av begge antibiotika; hvis metode B brukes med bare en antibiotikaresistensmarkør kodet på-DNA, blir seleksjon gjort ved bruk av bare det antibiotika under fastfasebelegg. Transduktantene vil inneholde både antibiotikaresistensmarkører og ha mottakerens bakgrunn. Dette tallet er gjengitt fra Eggers et al.28 med tillatelse fra Oxford University Press. I det modellerte eksperimentet representerer c1673 og c1650 to forskjellige CA-11.2A-kloner; c1673 bærer en φBB-1 prophage som koder for kanamycinresistens, og c1650 koder for en gentamicinresistensmarkør i et ikke-fagsted28. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kolonidannende enheter valgt ved fastfasebelegg etter transduksjonsanalysen. Kolonier som vokser i nærvær av begge antibiotika etter blanding av fagen fra c1673 med c1706 representerer potensielle transduktanter. Ingen kolonier skal vokse på kontrollplater som inneholder de enkelte donor- og mottakerklonene eller en prøve av fagprep (ikke vist). Minste antall produktive i den opprinnelige prøven kan bestemmes ved å telle antall CFU og multiplisere med fortynningsfaktoren. I dette tilfellet ga 20% av fagprøven PEG-utfelt fra en 15 ml kultur av giveren ca. 275 kolonier. Dermed var den opprinnelige konsentrasjonen av produktiv gjenvunnet ved PEG-nedbør ≥1,3 × 103 virioner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: PCR-amplifisering av genene som gir kanamycinresistens og gentamicinresistens fra to potensielle transduktanter. PCR med primere for kanamycin- og gentamicinresistensgenene (tab 4) ble utført for å screene lysatene generert fra to kolonier (transduktant 1 og transduktant 2). Disse koloniene ble valgt på en plate som inneholdt både kanamycin og gentamicin etter blanding av c1673 (donor) og c1706 (mottaker). Amplikonene ble løst på en 1 % agarosegel elektroforesert i 60 minutter ved 120 V i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE)-buffer og farget med 0,5 μg·mL−1 etidiumbromid. Tallene angir størrelsesmarkører i kilobasepar. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bekrefter bakgrunnen til transduktantene. Regioner av spesifikke genetiske elementer ble forsterket fra c1673, c1706, og de to transduktantene, som beskrevet tidligere28, for å bekrefte at bakgrunnen til transduktantene var mottakerklonen, c1706. De valgte regionene var basert på sekvenser av gener på spesifikke lineære eller sirkulære plasmider (henholdsvis lp eller cp) innenfor B. burgdorferi-typestammen , B316. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) og 8 = fla-gen (kromosom). Amplikonene ble løst på en 1 % agarosegelelektroforesert i 60 minutter ved 120 V i 1x TAE-buffer og farget med 0,5 μg·mL−1 ethidiumbromid. Tallene angir størrelsesmarkører i kilobasepar. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruken av transduksjon kan representere en metode for å overvinne minst noen av de biologiske og tekniske barrierer knyttet til elektrotransformasjonen av B. burgdorferi 1,4,13,37. I mange systemer kan bakteriofag flytte vert (ikke-prophage) DNA mellom bakterieceller ved enten generalisert eller spesialisert transduksjon 22,23,24,49,50. I spesialisert transduksjon pakkes alltid noen vertsgener i fagkapsidet sammen med prophage DNA49,50. For eksempel pakker φBB-1 alltid de delene av cp32 som er bakteriell opprinnelse, fordi de er uløselig knyttet til plasmidet til delene av cp32 som er faggenomet. I generalisert transduksjon antas emballasjemekanismen til bakteriofagen å låse seg til homologe ikke-fagsekvenser og "ved et uhell" pakke tilfeldig verts-DNA i stedet for-DNA; disse bitene av DNA er da i stand til å bli introdusert i en annen celle49,50. Lite er ennå kjent om generalisert transduksjon av i B. burgdorferi; I bedre karakteriserte bakteriesystemer kan imidlertid så mange som 1% av bakteriofagen frigjort fra en celle inneholde tilfeldige bakteriegener i stedet for-DNA51. Så langt er det ikke observert kromosomale markører mellom forskjellige B. burgdorferi-kloner, men den tidligere demonstrasjonen av at både cp32s og små heterologe skyttelvektorer kan pakkes og transduseres av φBB-1 indikerer at denne fagen kan delta i både spesialisert og generalisert transduksjon28. Derfor foreslås et brukstilfelle for transduksjon i laboratoriet, hvor elektrotransformasjon som genererer en kromosomal mutasjon, fortsatt gjøres i bakgrunnen av interesse; Innføringen av skyttelvektorer for komplementering i trans- eller for ekspresjonsstudier ved bruk av reporterkonstruksjoner i stammer som er gjenstridige mot elektrotransformasjon, kan imidlertid gjøres via transduksjon mellom en mer transformerbar høypassasjeklon og mindre transformerbare stammer. Hvis fremtidige studier viser evnen til φBB-1 til også å pakke og flytte kromosomale loci, kan metodene beskrevet her også vise seg å være nyttige for å flytte modifisert kromosomalt DNA mellom lettere transformerbare stammer og stammer som ellers er vanskelige å elektrotransformere. De cp32-lignende plasmidene er gjennomgripende blant alle B. burgdorferi-stammer og det store flertallet av de andre Lyme-sykdommene spirochetes52,53; det er også bevis for homologer i andre Borrelia-arter, inkludert B. mayonii, B. miyamotoi, og de som forårsaker tilbakefallende feber54,55,56. Hvorvidt homologene i andre Borrelia-arter også er prophage er ennå ikke kjent, men i så fall kan transduksjon også være et verktøy for molekylær disseksjon av disse artene, hvorav noen ennå ikke er vellykket genetisk manipulert.

To metoder for å transdusere DNA er presentert her: å dyrke donor- og mottakerklonene sammen før seleksjon (figur 1A) eller PEG-utfellende fra donoren og blande bare fagen med mottakeren (figur 1B). Antall transduksjonshendelser per mottakercelle er høyere etter kokultur enn ved bruk av PEG-utfelt28, men kokultur krever at både donor og mottaker bærer forskjellige antibiotikaresistensmarkører og at bakgrunnen til eventuelle transduktanter blir nøye screenet. Siden φBB-1-propagoen er allestedsnærværende blant Borrelia52,53, er det en teoretisk sjanse for at når man blander aktivt voksende kloner, kan en antibiotikaresistensmarkør eller annet heterologt DNA bevege seg fra mottakeren til donoren (i stedet for fra giveren til mottakeren, som tiltenkt). Bruk av PEG-utfelt i transduksjonsanalysen eliminerer denne muligheten, da donoren ikke er tilstede i/mottaker-blandingen. I tillegg er PEG-utfelling av fagen nødvendig hvis fagen og dens genomiske innhold skal brukes både til analyse (dvs. strukturell analyse, kvantifisering, identifisering av pakket materiale, etc.) og transduksjon. Til tross for disse fordelene har bruk av PEG-utfelt sine potensielle ulemper; i tillegg til å ikke gi så mange transduktanter som med samkultur, kan PEG-nedbør være tidkrevende, kan føre til betydelig fagtap, og resulterer i prøver som har forurensninger som kan forstyrre nedstrøms applikasjoner57,58.

Transduksjon har blitt påvist fra tre B. burgdorferi-stammer så langt: CA-11.2A, en høypassasje B31-klone og en lavpassasje 297-klone28. Av disse tre produserer B. burgdorferi-stammen CA-11.2A den høyeste mengden etter induksjon25,26,28; Men selv etter induksjon er antall gjenvunnet fra B. burgdorferi fortsatt størrelsesordener lavere enn fagen gjenvunnet i bedre karakteriserte systemer, som for eksempel kolifhage λ25,28,59. Således er et problem som kan oppstå ved bruk av transduksjon via enten samkultur eller blanding av etter PEG-utfelling, det lille antallet bakteriofag som frigjøres fra B. burgdorferi, selv når de utsettes for induserende midler. I tillegg er batch-til-batch-variasjon i fagproduksjon betydelig, selv når alle forhold, mediekomponenter og metoder ser ut til å være konsistente mellom eksperimenter. Av denne grunn er det viktig å bestemme at minst et minimum antall produseres fra en gitt klon eller under en gitt tilstand. Tradisjonelle analyser for å bestemme antall i en prøve krever blanding av en liten mengde prøve som inneholder med en permissiv bakteriell vert der bakteriofagen er lytisk; Antall produktive fagpartikler i prøven bestemmes av antall lytiske hendelser som oppstår i den bakgrunnen, noe som resulterer i dannelse av plakk på en plen av bakteriene60,61. Antall rapporteres som plakkdannende enheter (PFU)61. Kvantifisering av antall produktive φBB-1 utgitt etter induksjon ved hjelp av en plakkanalyse hindres av manglende evne til å dyrke Borrelia burgdorferi i en tett plen og en nåværende mangel på forståelse av mekanismene som styrer bryteren mellom lysogene og lytiske replikasjonssykluser av φBB-1. Faktisk, mens anekdotiske rapporter om lysede kulturer av B. burgdorferi er mange, har det hittil ikke vært publisert studier som korrelerer observasjonen av lysis av en hel kultur med produksjon av. Av erfaring synes bare et lite antall celler i en gitt kultur å spontant produsere, antagelig ved lysis, og denne produksjonen kan bare økes beskjedent med eksponering for de kjente induserende midlene25,28,62. Dermed er en plakettanalyse foreløpig ikke mulig for å kvantifisere φBB-1 fra B. burgdorferi.

For å kvantifisere antall produktive produsert etter induksjon av B. burgdorferi, kan transduksjonsanalysen som beskrevet i denne rapporten utføres ved hjelp av en permissiv B. burgdorferi-klon med et annet antibiotikum enn det som er pakket av bakteriofagen. Denne analysen resulterer i kolonier som skyldes transduksjon, med hver koloni som representerer en bekreftet. Dermed kan minimum antall i en prøve rapporteres som CFU i stedet for PFU. Dette tallet er sannsynligvis (langt) lavere enn det faktiske totale antall produsert på grunn av ineffektivitet som er forbundet med gjenvinning av ved PEG-utfelling (hvis brukt), vedlegg og injeksjon av DNA ved, og fastfasebelegg av B. burgdorferi.

En potensiell metode for å bestemme den totale mengden profag-DNA i supernatantene til B. burgdorferi-kulturer er kvantitativ PCR (qPCR), men qPCR-protokoller for cp32 DNA fra B. burgdorferi er ikke godt representert i litteraturen, og qPCR er ennå ikke en metodikk som er mye brukt til dette formålet. For kvalitativt å bestemme at det er minst et moderat nivå av-DNA i en gitt prøve, kan det totale DNA ekstraheres fra PEG-utfelte supernatanter av B. burgdorferi-kulturer etter DNase-behandling før ekstraksjon; -DNA vil bli beskyttet av et intakt fagkapsid25. Det gjenvunnede DNA blir deretter løst i en agarosegel og visualisert med en DNA-flekk; denne protokollen gir vanligvis et svakt 30 kb-bånd som representerer det lineære DNA pakket i faghodet25. Basert på følsomheten til flekken og intensiteten til det korrekt store-DNA-båndet i forhold til en markør, kan det omtrentlige antallet totale som gjenvinnes bestemmes25,27. En sterk positiv korrelasjon av nivåene av totalt-DNA gjenvunnet fra supernatanten med antall transduktanter gjenfunnet etter transduksjonsanalysen er tidligere påvist28.

Valget av donor- og mottakerstammer er avgjørende for suksessen med bruk av transduksjon som molekylært verktøy. Vår forståelse av cp32s som en profhage av φBB-1 er komplisert både av gjennomgripende av cp32s i Lyme sykdom spirochetes52,53 og av det faktum at en individuell B. burgdorferi celle kan inneholde flere homologer av disse plasmider. Alle cp32s i en celle ser ut til å være pakket i faghoder i fagproduserende stammer som er undersøkt27. Det er imidlertid ikke klart om alle B. burgdorferi-stammene som inneholder cp32s kan produsere bakteriofag, og stammer bør testes for denne evnen før bruk. På samme måte er ingenting kjent om reseptorene som tillater en bestemt stamme å bli transdusert av φBB-1, selv om ubiquity av prophage plasmid i hele slekten antyder en høy sannsynlighet for at en bestemt stamme kan transduseres. Som det kan utledes av tilstedeværelsen av flere cp32-plasmider i en individuell B. burgdorferi-celle, ser det ikke ut til å være noen fagimmunitet63 gitt ved tilstedeværelsen av en eksisterende profag; stammene CA.11-2A, B31 og 297 har blitt brukt i transduksjonsanalyser og begge produserer og kan transduseres av φBB-127,28. Mens tidligere rapporter indikerte at transduksjon var mulig til bare et begrenset antall stammer ved bruk av PEG-utfelt27, kan det ha vært på grunn av tekniske problemer med den metoden, da alle stammene som er testet til dags dato, har vært vellykket overførbare ved bruk av samkulturmetoden28.

Når man designer et eksperiment for å bruke transduksjonsanalysen, bør de viktigste hensynene for valg av donorstamme være den genetiske bakgrunnen, dens evne til lett å bli transformert via elektroporering, og dens evne til å produsere. Selv om det ikke er gjort en uttømmende undersøkelse av høypassasjeklonene til hver stamme, produserer stammen CA-11.2A konstitutivt på detekterbare nivåer selv i fravær av induksjon. På samme måte produserer høypassasjekloner av B31, den første B. burgdorferi-stammen som er fullstendig sekvensert5 og en vanlig brukt stamme i molekylære studier, også konstitutivt detekterbare mengder φBB-1 og er generelt svært transformerbare 1,4,25,27,37,64 . Hvis undersøkelser krever andre stammer, anbefales det at høypassasjekloner av den stammen først testes for deres transformerbarhet ved å introdusere et plasmid som inneholder en antibiotikaresistensmarkør via elektroporering og deretter vurderes for deres evne til å bli transdusert ved å utføre en transduksjonsanalyse med en permissiv mottaker, for eksempel CA-11.2A eller B31, som koder for en annen antibiotikaresistensmarkør. På samme måte, for å sikre at en mottakerstamme eller klon er tillatt for transduksjon, kan en fagproduserende stamme, for eksempel CA-11.2A som bærer en prophagekodingsresistens mot et antibiotika, blandes med klonen av interesse for å sikre at transduksjon oppstår.

Mye gjenstår å forstå om molekylærbiologien til φBB-1 og dens rolle i HGT innen B. burgdorferi, særlig når den passerer den enzootiske syklusen. Evnen til φBB-1 til eksperimentelt å transdusere både og heterologt DNA i laboratoriet, gir imidlertid en mulighet til å legge til et annet verktøy for molekylær disseksjon av B. burgdorferi og dens rolle i patogenesen av Lyme-sykdommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatteren ønsker å takke Shawna Reed, D. Scott Samuels og Patrick Secor for deres nyttige diskusjon og Vareeon (Pam) Chonweerawong for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for biomedisinsk vitenskap og fakultetets forskningsstipendier til Christian H. Eggers fra School of Health Sciences ved Quinnipiac University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 187 Borrelia burgdorferi bakteriofag horisontal genoverføring transduksjon
Fagmediert genetisk manipulasjon av Lyme-sykdommen Spirochete <em>Borrelia burgdorferi</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter