Summary
该协议提供了一种自动化的、基于图像的高通量技术，用于在存在治疗性抗 HER-2 抗体的情况下鉴定调节自然杀伤细胞介导的乳腺癌细胞杀伤的化合物。
Abstract
使用抗原特异性抗体或免疫检查点抑制剂的免疫疗法彻底改变了乳腺癌的治疗。表达表皮生长因子受体HER2的乳腺癌细胞可以被抗HER-2抗体曲妥珠单抗靶向。抗体依赖性细胞毒性（ADCC）是HER-2抗肿瘤作用的重要机制。与癌细胞结合的曲妥珠单抗可以被ADCC效应细胞（例如自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和粒细胞）的Fc受体识别，触发这些免疫细胞的细胞毒性活性，导致癌细胞死亡。我们着手开发一种用于定量ADCC的基于图像的检测方法，以通过高内涵筛选鉴定新型ADCC调节剂化合物。在该测定中，HER2过表达JIMT-1乳腺癌细胞在曲妥珠单抗存在下与NK-92细胞共培养，并通过自动显微镜和定量图像分析量化靶细胞死亡。根据其EGFP荧光将靶细胞与效应细胞区分开来。我们展示了如何在测定中测试化合物库以鉴定ADCC调节剂药物。为此，使用实验室货架上随机选择的精细化学品建立了一个化合物库测试板。测试库中还包括三种有望干扰NK细胞迁移和脱颗粒的微管不稳定化合物（秋水仙碱，长春新碱，鬼臼毒素）。测试筛选将所有三种阳性对照化合物鉴定为命中，证明该方法适用于鉴定化学库中的ADCC修饰药物。通过该测定，可以进行化合物库筛选以鉴定ADCC增强化合物，这些化合物可用作治疗接受抗癌免疫治疗的患者的辅助治疗剂。此外，该方法还可用于鉴定癌症患者针对不同适应症服用的治疗药物的任何不良ADCC抑制副作用。
Introduction
使用抗癌抗体、免疫检查点抑制剂或嵌合抗原受体表达 T （CAR-T） 细胞进行免疫治疗是癌症治疗的有力方法1，2，3。曲妥珠单抗是一种人源化单克隆抗HER-2（人表皮生长因子受体2）抗体，用于治疗HER-2阳性早期或转移性乳腺癌，以及HER-2阳性转移性胃癌4，5，6。它主要通过抑制表皮生长因子4的增殖刺激作用起作用。然而，据报道，曲妥珠单抗有效地触发癌细胞死亡，即使癌细胞已经失去了对 HER-2 刺激的反应性7。抗体的这种矛盾效应是由于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）7。ADCC 可由自然杀伤 （NK） 细胞、粒细胞和巨噬细胞介导，统称为 ADCC8，9 的效应细胞。如果抗体（如曲妥珠单抗）与肿瘤细胞结合，则这些效应细胞使用其Fc受体结合抗体的恒定（Fc）区域。抗体桥接肿瘤细胞和携带Fc受体的效应细胞，触发其细胞毒性介质的释放10。自然杀伤细胞释放其含有穿孔素的颗粒的细胞毒性货物，以在靶细胞膜和颗粒酶（触发细胞死亡信号通路）中产生孔隙进入免疫突触，导致癌细胞凋亡（见图1）。
图 1：ADCC 中的效应子和靶细胞相互作用。 效应NK细胞的细胞表面Fcγ受体识别抗HER2曲妥珠单抗抗体的Fc区域，特异性于肿瘤细胞表面表达的HER2分子。因此，在两个细胞之间建立所谓的免疫突触，诱导效应细胞的细胞毒性颗粒的定向胞吐作用。释放的穿孔素和颗粒酶分子最终导致靶细胞凋亡。 请点击此处查看此图的大图。
以前已经开发了几种用于量化细胞毒性的测定方法，包括ADCC。金标准是放射性铬释放法，其中靶细胞用放射性51Cr同位素标记，并通过测量裂解靶细胞上清液的放射性来量化ADCC11。由于放射性药物和废物的处理、储存和处置受到严格管制，存在明显问题，这种方法在生命科学家中越来越不受欢迎。此外，它也不适合高吞吐量应用程序。测量从杀死的靶细胞释放的酶（例如乳酸脱氢酶）的活性可以提供51Cr测定的非放射性替代方案12。然而，这些测定无法区分靶细胞和效应细胞死亡。电电池-衬底阻抗检测（ECIS）被证明适用于ADCC13的定量，但大多数实验室都没有ECIS设备，并且该技术与高通量应用/筛选不兼容。荧光标记的细胞是许多细胞生物学测定中流行的替代方案，通常用于流式细胞术或基于酶标仪的应用14，15，16。然而，这些测定通常包含洗涤步骤或与高通量应用（例如，基于流式细胞术的技术）不兼容。一些流行的细胞毒性测定，理论上应该适用于ADCC定量，但无法可靠地确定ADCC效率13。最近，随着荧光共聚焦显微镜的普及，基于图像的高内涵检测在生命科学的各个领域越来越受欢迎17。一方面，细胞成像设备现在相当普遍，而另一方面，可以从采集的图像中收集几乎无穷无尽的形态参数。因此，我们着手开发一种高内涵筛选兼容的ADCC检测方法，并证明其适用于化合物文库筛选。
在这里，我们提出了一种基于图像的ADCC测定，并演示了该测定如何用于高内涵筛选（HCS）以鉴定ADCC调节化合物。该模型基于JIMT-1乳腺癌靶细胞、CD16.176V.NK-92效应细胞和人源化单克隆抗HER2抗体曲妥珠单抗。使用这种方法，可以通过识别干扰ADCC的小分子来鉴定可以增强NK细胞肿瘤杀伤作用的药物或深入了解NK细胞介导的ADCC的机制。我们建议，旨在量化细胞介导的细胞毒性的生命科学家，特别是ADCC，可能会从将该测定用于发现科学或药物开发中受益。如果实验室能够获得荧光成像和定量图像分析方面的一些经验，则该测定可能是一种替代方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：检测工作流程的关键步骤如图 2所示。
图 2：ADCC 屏幕的工作流程。 接种到96孔HCS板中的JIMT-1-EGFP靶细胞用化合物库的药物处理。反过来，加入未染色的NK（效应）细胞和曲妥珠单抗，并在0时间点和孵育3小时后对板进行成像。ADCC评估基于活（表面贴壁）靶细胞数量的变化。 请点击此处查看此图的大图。
1. HCS板的涂层
- 用 50 μL/孔 JIMT-1 培养基（补充有 20% 胎牛血清 （FBS）、0.3 U/mL 胰岛素（100 IU/mL、Humulin R 和 1% 青霉素-链霉素）的 DMEM/F-12 培养基）涂覆 96 孔高内涵筛选 （HSC） 板。
- 将板放入CO2 培养箱中1小时。
注意：涂层对于将JIMT-1电池附着到板的玻璃表面上至关重要。
2. 接种JIMT-1增强型绿色荧光蛋白（EGFP）细胞
注意：表达EGFP的JIMT-1细胞在我们之前的工作18中产生，并将细胞培养在JIMT-1培养基中的T25组织培养瓶中培养（参见步骤1.1中的组合物）。
- 用 2 mL 无菌 PBS 洗涤细胞。
- 向烧瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA，并将烧瓶放回 CO2 培养箱中 10 分钟。
- 孵育后，点击烧瓶以检查JIMT-1细胞是否分离。
- 用 2 mL JIMT-1 培养基停止消化，并将细胞悬液收集到 15 mL 管中。
- 在 Bürker 腔室中用 0.4% 台盼蓝（80 μL 染料 + 20 μL 细胞悬液）计数细胞，并将细胞数调整为 133， 000 个细胞/mL。
- 从96孔板中吸出包衣介质（步骤1.2）。
- 将75μL细胞悬液移液到HCS板的每个孔中（参见 材料表）。
- 允许细胞在CO2 培养箱中于37°C孵育过夜期间附着。
3. 用化合物文库预处理JIMT-1 EGFP细胞
- 从 JIMT-1 细胞中吸出培养基，并向孔中加入 50 μL/孔新鲜的 JIMT-1 培养基。将板转移到高通量筛选实验室。
注意：使用液体处理机器人可以更高效、更可重复地添加化合物库。 - 使用校准为25 nL体积的销工具将测试化合物从化合物库板转移到测定板。执行此操作四次。四轮转印的最终体积为100 nL（最终浓度为20 μM）。
- 在每个步骤之间，首先用50%DMSO清洗销钉工具，然后用70%乙醇清洗。
- 将板在37°C的CO2 培养箱中孵育1小时。
4.通过添加效应细胞开始ADCC测定
注意：CD16.176V.NK92细胞（以下简称NK92细胞）在补充有20%FBS，1%MEM-NEAA，1%丙酮酸钠，1%谷氨酰胺，1%青霉素链霉素和100 IU / mL IL-2的α-MEM中培养。
- 用台盼蓝（80 μL 染料 + 20 μL 细胞悬液）计数 NK92 细胞。将细胞数调整为 400，000 个细胞/mL。
- 在室温下以150 x g 离心4mL细胞悬液3分钟。
- 通过在 JIMT-1 培养基中加入 20 μg/mL 抗 HER2 抗体（曲妥珠单抗）来制备 ADCC 培养基。
- 将NK细胞沉淀重悬于5 mL ADCC培养基中。
- 将 20，000 个 NK 细胞在 50 μL ADCC 培养基中移液至目标 JIMT-1 细胞中。最终体积为 100 μL，最终曲妥珠单抗浓度为 10 μg/mL。
- 将测定板放入具有设置为37°C的内置培养箱的高内涵分析设备中。
5. 成像
注意：板应在两个时间点成像，首先，在将效应细胞添加到目标细胞后立即成像，其次，在添加NK细胞后3小时。对于成像，可以使用高内涵分析仪及其软件或合适的替代品（见 材料表）。
- 从板列表中选择板类型（96孔细胞载体超）。
- 如果测定是在平板中进行的，请选择 双峰自动聚焦 。
- 在非共聚焦模式下使用10倍物镜。
- 选择合并 2 可将信噪比加倍。
- 在 650-760 nm 处拍摄明场图像，并在 488 nm（激发）和 500-550 nm（发射）波长下拍摄 EGFP 转导的 JIMT-1 细胞的荧光图像。
- 选择映像的字段数和时间点数。
6. 图像分析
注意：为了分析ADCC效率，对活的JIMT-1细胞进行计数。被ADCC杀死的靶细胞从表面分离并远离显微镜的焦平面。因此，ADCC反应开始和结束时活细胞数之间的差异对应于ADCC消除的靶细胞。为了展示如何建立评估序列，视频中展示了一个对照ADCC孔。
- 使用 “查找 单元格”模块检测图像上与单元格对应的区域。
注意：每个细胞被检测为图像上荧光强度高于其周围环境的区域。 - 使用内置 M 算法选择直径最小为80μm的细胞。
- 将 拆分敏感度（将大型对象划分为较小对象）设置为 0.5。
- 将 “公共阈值 ”（像素强度的最低级别）设置为 0。
- 分两步排除具有高EGFP荧光强度的背景区域的检测。
- 首先，使用“ 计算强度属性 ”功能确定先前选择的 “细胞 ”区域中的EGFP荧光强度。
- 使用 选择总体 选项设置最小和最大强度阈值。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了演示该测定在现实生活中的工作原理，我们创建了一个测试库，其中包含从实验室货架中随机选择的16种化合物（图3）。此外，DMSO也作为阴性对照，三种微管聚合抑制剂化合物（秋水仙碱，长春新碱和鬼臼毒素）作为阳性对照。后者有望通过干扰NK细胞向癌细胞的迁移和NK细胞脱颗粒来抑制ADCC。将所有测试化合物和DMSO一式四份放置在测试文库板上，并将DMSO也添加到板的第一列和最后一列中（图3）。
图 3：用于测试 HCS ADCC 测定的化合物库。 （A） 显示了化合物库的板图。每种化合物一式两份存在于文库板上。将DMSO作为阴性对照添加到板的第一列和最后一列。含有 DMSO 和三种微管组装抑制剂（秋水仙碱、长春新碱和鬼臼毒素）的孔以颜色突出显示。（B）提供供试化合物的名称、板位置和缩写名称。请点击此处查看此图的大图。
使用我们的测试库，我们运行了测定并评估了协议中所述的结果。由于JIMT-1细胞表达EGFP，因此可以很容易地将它们与非荧光效应细胞区分开来。该测定基于检测表面贴壁（活）靶细胞数量的变化。在我们的测定条件下，NK细胞引起约50%的JIMT-1细胞死亡（+NK组），而在没有NK细胞（-NK组）的情况下，没有测试化合物引起任何毒性（图4）。先前对测定条件进行了优化，以达到中等水平的细胞毒性18，假设这将允许鉴定ADCC激活剂和抑制剂化合物。阳性对照微管组装抑制剂如预期的那样在所有四份位置显示为“命中”，表明该测定的高可靠性（图4）。
图 4：在 ADCC 模型中测试化合物库 。 （A）在DMSO存在下，用HCS成像仪的10倍物镜共孵育NK细胞和JIMT-1细胞后3小时拍摄ADCC反应的图像。（比例尺为 200 μm。图像的一部分被放大，显示未染色的效应NK细胞和EGFP转导的靶标JIMT-1细胞。（原始图像的放大倍率为4倍，比例尺为50μm。（B）ADCC测定使用EGFP转导的JIMT-1乳腺癌细胞系和CD16.176 V.NK-92细胞系进行。施加的效应器与目标（E：T）的比例为2：1。在-NK组的情况下，将JIMT-1 EGFP细胞在没有NK细胞和抗HER2抗体的情况下孵育，而在+NK组（ADCC）中，将10μg/mL曲妥珠单抗添加到JIMT-1和NK细胞共培养物中。在加入NK细胞后和孵育3小时后立即使用高内涵分析设备检测活的JIMT-1-EGFP细胞的数量。+NK组的靶细胞活力是-NK组的50%。红色虚线显示阈值，表示与DMSO对照（n = 20）杀伤平均值相比，存活率为≥70%的样品。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADCC反应在很久以前就已经描述过了。该过程的关键分子事件也已描述19。测量ADCC的方法范围从金标准放射性铬释放测定，细胞质酶释放测定到几种基于荧光的流式细胞术或微孔板测定20。然而，这些测定的一个常见局限性是它们不适合高通量应用。此前，我们开发了一种基于图像的HCS测定法，适用于筛选ADCC修饰药物的化合物库18。然而，先前开发的测定有一个主要缺点， 即它需要一个洗涤步骤，因为靶细胞必须用钙黄绿素-乙酰氧基甲基酯预染色，并且在加入NK细胞和曲妥珠单抗之前必须去除多余的染料。目前的方法代表了该测定的高级版本，因为使用EGFP转导的JIMT-1细胞允许直接区分效应细胞和靶细胞，而无需染色和洗涤步骤。此外，还必须意识到我们测定的特征，即它无法区分死亡和垂死细胞（尚未完全分离）。此外，测试化合物可能会增加细胞粘附，并且，因此细胞碎片可能残留在焦平面中，从而导致假阳性结果。此外，测试化合物的荧光特性可能会引起干扰。因此，尽管筛选通常运行一次，但强烈建议在其他类型的分析中也验证命中率。我们测定的其他局限性包括间接鉴定细胞死亡， 即该方法基于活细胞数量变化的定量而不是死细胞。然而，这里需要注意的是，之前的一项研究发现，基于ECIS的活细胞检测优于一些直接测量细胞死亡的方法13。因此，我们方法的这个特性并不一定代表缺点。然而，真正可能限制这种测定的应用的是，它至少需要高级图像分析的基本知识，这种技能在今天变得越来越普遍。
尽管到目前为止，已经使用测定18的原始版本测试了一个小型库（少于1000种化合物）。我们尚未确定ADCC加强药物。其原因可能是ADCC激活剂可能很少见，需要筛选更大的库来识别一个。从理论上讲，一旦ADCC反应开始，它也有可能在没有主要限制步骤的情况下进行，因此该过程将难以通过药物进一步改进。解决此问题的一种可能方法是抑制ADCC活性（例如，使用皮质类固醇）并运行屏幕以查找恢复完全ADCC活性的化合物。尽管如此，我们认为识别已知药物的ADCC抑制作用也可能很重要，以提高临床医生向各种适应症患者开具这些药物的认识。
至于测定的技术细节，我们建议将测定与替代细胞毒性测试同时进行。在我们手中，ECIS（电池-基板阻抗检测）被证明是量化ADCC效率的最可靠系统13。在项目开始时，ECIS用于调整关键参数（时间，效应器与靶细胞的比例，曲妥珠单抗浓度），然后将测定转移到HCS平台18。我们建议执行相同的操作并微调这些参数，因为它们可能会因实验室而异。在设置测定时，重要的是要特别注意程序的一些关键步骤。标准化NK细胞和靶细胞的培养条件（分裂频率、细胞补料、接种一致性）可以提高ADCC效率的重现性。此外，必须小心地进行NK细胞培养，因为这些细胞往往对机械应力敏感（Guti等人未发表的观察）。对于化合物库，如果使用销工具将化合物从文库板转移到测定板，则确保所有孔都包含相同体积的测试化合物非常重要。这可以防止不同数量的化合物溶液粘附在引脚的外侧。此外，筛选中鉴定的命中化合物应优选在基于不同原理的可靠测定中得到验证。为此，我们建议使用基于 ECIS 的方法11 （请参阅上面的简介）。
总之，我们建立了一个基于JIMT-1 EGFP的 体外 ADCC检测系统，适用于通过自动图像分析测试化合物库。该方法适用于鉴定具有已知ADCC修饰作用的药物。该方法可能适用于测定由曲妥珠单抗药物偶联物（例如，最近开发的曲妥珠单抗-美坦辛21）引起的癌细胞死亡，其中毒性机制更为复杂，仅部分由ADCC引起，部分由微管蛋白抑制剂美坦辛引起。未来，我们计划采用该技术来量化3D球状体中的ADCC，这比2D模型更准确地反映了肿瘤行为。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
LV获得了国家研究，发展和创新办公室赠款GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS“，GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE和OTKA K132193，K147482的资助。CD16.176V.NK-92细胞来自Kerry S. Campbell博士（宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯中心，代表Brink Biologics，lnc。加利福尼亚州圣地亚哥），受全球专利保护，并由Nantkwest，lnc授权。作者感谢György Vereb和Árpád Szöőr在使用NK-92细胞系方面的帮助和技术建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
