Summary
Этот протокол представляет собой автоматизированный высокопроизводительный метод на основе изображений для идентификации соединений, модулирующих естественное уничтожение клеток рака молочной железы, опосредованное естественными клетками-киллерами, в присутствии терапевтического антитела против HER-2.
Abstract
Иммунотерапия антиген-специфическими антителами или ингибиторами иммунных контрольных точек произвела революцию в терапии рака молочной железы. Клетки рака молочной железы, экспрессирующие рецептор эпидермального фактора роста HER2, могут быть нацелены на антитело против HER-2 трастузумаб. Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) является важным механизмом, участвующим в противоопухолевом действии HER-2. Трастузумаб, связанный с раковыми клетками, может быть распознан Fc-рецепторами эффекторных клеток ADCC (например, естественных клеток-киллеров (NK), макрофагов и гранулоцитов), запуская цитотоксическую активность этих иммунных клеток, приводящую к гибели раковых клеток. Мы решили разработать анализ на основе изображений для количественного определения ADCC для идентификации новых соединений модулятора ADCC с помощью скрининга с высоким содержанием. В анализе сверхэкспрессирующие клетки рака молочной железы HER2 JIMT-1 культивируются совместно с клетками NK-92 в присутствии трастузумаба, а гибель клеток-мишеней количественно определяется с помощью автоматической микроскопии и количественного анализа изображений. Клетки-мишени отличаются от эффекторных клеток на основе их флуоресценции EGFP. Мы показываем, как библиотеки соединений могут быть протестированы в анализе для идентификации препаратов-модуляторов ADCC. Для этой цели была установлена тестовая пластина для библиотеки соединений с использованием случайно выбранных тонких химикатов с лабораторной полки. В библиотеку тестов также были включены три дестабилизирующих соединения микротрубочек (колхицин, винкристин, подофиллотоксин), которые, как ожидается, будут препятствовать миграции и дегрануляции NK-клеток. Тестовый экран идентифицировал все три положительных контрольных соединения как попадания, доказывающие пригодность метода для идентификации ADCC-модифицирующих лекарств в химической библиотеке. С помощью этого анализа можно проводить скрининг библиотеки соединений для идентификации соединений, усиливающих ADCC, которые могут быть использованы в качестве адъювантных терапевтических агентов для лечения пациентов, получающих противоопухолевую иммунотерапию. Кроме того, метод также может быть использован для выявления любых нежелательных побочных эффектов, ингибирующих ADCC терапевтических препаратов, принимаемых онкологическими больными по различным показаниям.
Introduction
Иммунотерапия противоопухолевыми антителами, ингибиторами иммунных контрольных точек или Т-клетками, экспрессирующими химерные антигенные рецепторы (CAR-T), представляет собой мощный подход к лечению рака 1,2,3. Трастузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против HER-2 (рецептор 2 эпидермального фактора роста человека), используемое для лечения HER-2-положительного рака молочной железы на ранней стадии или метастатического рака молочной железы, а также HER-2-положительного метастатического рака желудка 4,5,6. Он в первую очередь действует путем ингибирования стимулирующего пролиферацию эффекта эпидермального фактора роста4. Однако сообщалось, что трастузумаб эффективно вызывает гибель раковых клеток, даже если раковые клетки утратили свою реакцию на стимуляцию HER-27. Этот парадоксальный эффект антитела обусловлен антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC)7. ADCC может быть опосредован естественными клетками-киллерами (NK), гранулоцитами и макрофагами, известными как эффекторные клетки ADCC 8,9. Если антитело, такое как трастузумаб, связывается с опухолевыми клетками, то эти эффекторные клетки используют свои Fc-рецепторы для связывания постоянной (Fc) области антитела. Антитело соединяет опухолевые клетки и эффекторные клетки, несущие Fc-рецептор, вызывая высвобождение их цитотоксических медиаторов10. Естественные клетки-киллеры высвобождают цитотоксический груз своих гранул, содержащих перфорин, для создания пор в клеточной мембране-мишени и гранзима (запускающего сигнальные пути гибели клеток) в иммунный синапс, что приводит к апоптозу раковых клеток (см. рис. 1).
Рисунок 1: Взаимодействие эффекторных и целевых клеток в ADCC. Рецептор Fcγ на клеточной поверхности эффекторной NK-клетки распознает Fc-область антитела к HER2 трастузумабу, специфичную для молекулы HER2, экспрессируемой на поверхности опухолевой клетки. Таким образом, между двумя клетками устанавливается так называемый иммунологический синапс, индуцирующий направленный экзоцитоз цитотоксических гранул эффекторной клетки. Высвобожденные молекулы перфорина и гранзима в конечном итоге приводят к апоптозу клетки-мишени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Ранее было разработано несколько анализов для количественной оценки цитотоксичности, включая ADCC. Золотым стандартом является метод высвобождения радиоактивного хрома, при котором клетки-мишени помечаются радиоактивным изотопом 51Cr, а ADCC количественно определяется путем измерения радиоактивности надосадочной жидкости лизированных клеток-мишеней11. Из-за очевидных проблем, связанных со строго регулируемым обращением, хранением и утилизацией радиоактивных фармаконов и отходов, этот метод становится все более непопулярным среди ученых-биологов. Кроме того, он также не поддается приложениям с высокой пропускной способностью. Измерение активности ферментов (например, лактатдегидрогеназы), высвобождаемых из убитых клеток-мишеней, может обеспечить нерадиоактивную альтернативу анализу 51Cr12. Эти анализы, однако, не могут различить гибель клеток-мишеней и эффекторных клеток. Электрическое измерение импеданса ячейки и подложки (ECIS) оказалось пригодным для количественной оценки ADCC13, но оборудование ECIS недоступно в большинстве лабораторий, и этот метод несовместим с высокопроизводительными приложениями / скринингом. Флуоресцентно меченные клетки представляют собой популярную альтернативу во многих анализах клеточной биологии и часто используются в проточной цитометрии или приложениях на основе считывателей планшетов14,15,16. Однако эти анализы часто содержат этапы промывки или иным образом несовместимы с высокопроизводительными приложениями (например, методами, основанными на проточной цитометрии). Некоторые популярные анализы цитотоксичности, которые теоретически должны подходить для количественного определения ADCC, не могут надежно определить эффективность ADCC13. В последнее время, с распространением флуоресцентной конфокальной микроскопии, анализы с высоким содержанием изображений становятся все более популярными в различных областях наук о жизни17. С одной стороны, оборудование для визуализации клеток в настоящее время довольно распространено, а с другой стороны, из полученных изображений можно собрать практически бесконечные морфологические параметры. Поэтому мы решили разработать анализ ADCC, совместимый с скринингом с высоким содержанием, и продемонстрировать его пригодность для скрининга составных библиотек.
Здесь мы представляем анализ ADCC на основе изображений и демонстрируем, как этот анализ можно использовать для скрининга с высоким содержанием (HCS) для идентификации соединений, модулирующих ADCC. Модель основана на клетках-мишенях карциномы молочной железы JIMT-1, эффекторных клетках CD16.176V.NK-92 и гуманизированном моноклональном антителе против HER2 трастузумабе. С помощью этого метода можно идентифицировать препараты, которые могут усиливать убивающее опухоль действие NK-клеток, или получить представление о механизме NK-клеточно-опосредованного ADCC путем идентификации малых молекул, интерферирующих ADCC. Мы предполагаем, что ученые-биологи, стремящиеся количественно оценить клеточно-опосредованную цитотоксичность с особым вниманием к ADCC, могут извлечь выгоду из использования этого анализа либо для науки, либо для разработки лекарств. Этот анализ может быть альтернативой, если лаборатория имеет доступ и некоторый опыт в флуоресцентной визуализации и количественном анализе изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые этапы рабочего процесса анализа представлены на рисунке 2.
Рисунок 2: Рабочий процесс экрана ADCC. Клетки-мишени JIMT-1-EGFP, посеянные в 96 луночных планшетов HCS, обрабатывают препаратами из библиотеки соединений. В свою очередь, добавляют неокрашенные NK-(эффекторные) клетки и трастузумаб, и планшет визуализируют в 0-й момент времени и через 3 ч инкубации. Оценка ADCC основана на изменении количества жизнеспособных (поверхностно прикрепленных) клеток-мишеней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
1. Покрытие пластины HCS
- Покройте 96 луночных скрининговых планшетов с высоким содержанием (HSC) средой JIMT-1 50 мкл / лунка (среда DMEM/F-12 с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,3 ЕД/мл инсулина (100 МЕ/мл, Humulin R и 1% пенициллин-стрептомицин).
- Поместите тарелку в инкубатор CO2 на 1 час.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие имеет решающее значение для крепления ячеек JIMT-1 к стеклянной поверхности пластины.
2. Посев клеток JIMT-1 с улучшенным зеленым флуоресцентным белком (EGFP)
ПРИМЕЧАНИЕ: EGFP-экспрессирующие клетки JIMT-1 были получены в нашей предыдущей работе18, и клетки культивировали в колбах для культивирования тканей T25 в среде JIMT-1 (см. композицию на шаге 1.1).
- Промойте клетки 2 мл стерильного PBS.
- Добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА в колбу и поместите колбу обратно в инкубатор CO2 на 10 минут.
- После инкубации коснитесь колбы, чтобы проверить, отсоединились ли клетки JIMT-1.
- Остановите пищеварение с помощью 2 мл среды JIMT-1 и соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
- Подсчитайте клетки с 0,4% трипанового синего (80 мкл красителя + 20 мкл клеточной суспензии) в камере Bürker и отрегулируйте количество клеток до 133 000 клеток / мл.
- Аспирируйте среду покрытия из 96-луночной пластины (шаг 1.2).
- Пипетка 75 мкл клеточной суспензии в каждую лунку планшетов HCS (см. Таблицу материалов).
- Дайте клеткам прикрепиться во время ночной инкубации при 37 ° C в инкубаторе CO2 .
3. Предварительная обработка клеток JIMT-1 EGFP с помощью библиотеки соединений
- Аспирируйте среду из ячеек JIMT-1 и добавьте в лунки 50 мкл / лунку свежей среды JIMT-1. Передайте пластину в высокопроизводительную лабораторию скрининга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование робота для работы с жидкостями делает добавление составных библиотек более эффективным и воспроизводимым. - Перенесите испытуемые соединения с библиотечной пластины на аналитическую пластину с помощью штифтового инструмента, откалиброванного до объема 25 нл. Выполните это четыре раза. Четыре раунда переноса дают конечный объем 100 нл (и конечную концентрацию 20 мкМ).
- Между каждым этапом промывайте штифтовый инструмент сначала 50% ДМСО, а затем 70% этанолом.
- Инкубируйте планшеты в течение 1 ч в инкубаторе CO2 при 37 °C.
4. Запуск анализа ADCC путем добавления эффекторных ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CD16.176V.NK92 (далее именуемые клетками NK92) культивировали в α-MEM с добавлением 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-пирувата, 1% глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 100 МЕ/мл IL-2.
- Подсчитайте клетки NK92 трипановым синим (80 мкл красителя + 20 мкл клеточной суспензии). Отрегулируйте количество клеток до 400 000 клеток / мл.
- Центрифугу 4 мл клеточной суспензии в дозе 150 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Подготовьте среду ADCC, добавив 20 мкг/мл антитела против HER2 (трастузумаб) в среду JIMT-1.
- Ресуспендируют гранулу NK-клеток в среде ADCC объемом 5 мл.
- Пипетка 20 000 NK-клеток в 50 мкл среды ADCC к целевым клеткам JIMT-1. Конечный объем составляет 100 мкл, а конечная концентрация трастузумаба составляет 10 мкг/мл.
- Поместите пробирную пластину в оборудование для анализа с высоким содержанием со встроенным инкубатором, настроенным на 37 °C.
5. Визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты следует визуализировать в два момента времени: во-первых, сразу после добавления эффекторных клеток к клеткам-мишеням, а во-вторых, через 3 часа после добавления NK-клеток. Для визуализации можно использовать анализатор высокого содержания и его программное обеспечение или подходящие альтернативы (см. Таблицу материалов).
- Выберите Тип пластины (96-луночный носитель ячейки Ultra) из списка планшетов.
- Выберите автофокус с двумя пиками, если анализ проводится в пластинах.
- Используйте 10-кратный объектив в неконфокальном режиме.
- Выберите Binning 2, чтобы удвоить соотношение сигнал/шум.
- Сделайте снимки светлого поля с длиной волны 650-760 нм и флуоресцентные изображения клеток JIMT-1, трансдуцированных с помощью EGFP, на длинах волн 488 нм (возбуждение) и 500-550 нм (излучение).
- Выберите количество полей и временных точек для изображения.
6. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа эффективности ADCC подсчитываются жизнеспособные клетки JIMT-1. Клетки-мишени, убитые ADCC, отделяются от поверхности и удаляются от фокальной плоскости микроскопа. Следовательно, разница между числом жизнеспособных клеток в начале и в конце реакции ADCC соответствует клеткам-мишеням, элиминированным ADCC. Чтобы показать, как построить последовательность оценки, на видео показана контрольная скважина ADCC.
- Используйте модуль «Поиск ячеек» для обнаружения областей на изображении, соответствующих ячейкам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая ячейка определяется как область на изображении с более высокой интенсивностью флуоресценции, чем ее окружение. - Выбирайте ячейки с помощью встроенного алгоритма M диаметром не менее 80 мкм.
- Установите для параметра Чувствительность расщепления, при которой большой объект разбивается на более мелкие, значение 0,5.
- Установите для параметра Общий порог (самый низкий уровень интенсивности пикселей) значение 0.
- Исключить обнаружение фоновой области с высокой интенсивностью флуоресценции EGFP можно в два этапа.
- Во-первых, используйте функцию « Вычислить свойства интенсивности », чтобы определить интенсивность флуоресценции EGFP в ранее выбранной области «Клетки ».
- Установите минимальный и максимальный порог интенсивности с помощью параметра «Выбрать население ».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать, как анализ работает в реальной жизни, мы создали тестовую библиотеку из 16 соединений, выбранных случайным образом с лабораторных полок (рис. 3). Кроме того, ДМСО также был включен в качестве отрицательного контроля и три соединения-ингибитора полимеризации микротрубочек (колхицин, винкристин и подофиллотоксин) в качестве положительного контроля. Ожидалось, что последние будут ингибировать ADCC, препятствуя миграции NK-клеток в раковые клетки и дегрануляции NK-клеток. Все испытуемые соединения и ДМСО помещали на тестовую библиотечную пластину в четырех экземплярах, а ДМСО также добавляли к первому и последнему столбцам планшета (рис. 3).
Рисунок 3: Составная библиотека, используемая для тестирования анализа HCS ADCC . (A) Показана карта пластин составной библиотеки. Каждое соединение присутствует на библиотечной пластине в четырех экземплярах. ДМСО был добавлен в качестве отрицательного контроля к первому и последнему столбцу пластины. Лунки, содержащие ДМСО и три ингибитора сборки микротрубочек (колхицин, винкристин и подофиллотоксин), выделены цветом. (B) Представлены наименования, положения табличек и сокращенные наименования испытуемых соединений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Используя нашу тестовую библиотеку, мы провели анализ и оценили результаты, как описано в протоколе. Поскольку клетки JIMT-1 экспрессируют EGFP, их можно легко отличить от эффекторных клеток, которые не являются флуоресцентными. Анализ основан на выявлении изменения количества поверхностных адгезивных (жизнеспособных) клеток-мишеней. В наших условиях анализа NK-клетки вызывали примерно 50% гибели клеток JIMT-1 (+ NK-группа), в то время как ни одно из тестируемых соединений не вызывало какой-либо токсичности в отсутствие NK-клеток (-NK-группа) (рис. 4). Условия анализа были ранее оптимизированы для достижения этого среднего уровня цитотоксичности18, предполагая, что это позволит идентифицировать как активатор ADCC, так и соединения-ингибиторы. Положительные контрольные ингибиторы сборки микротрубочек, как и ожидалось, показали «попадания» во все четверные положения, что указывает на высокую надежность анализа (рис. 4).
Рисунок 4: Тестирование составной библиотеки в модели ADCC. (A) Изображения реакций ADCC были получены через 3 часа после совместной инкубации NK-клеток и клеток JIMT-1 в присутствии DMSO с 10-кратным объективом тепловизора HCS. (Масштабная линейка составляет 200 мкм.) Одна часть изображения увеличена, показывая неокрашенные эффекторные NK-клетки и EGFP-трансдуцированные клетки-мишени JIMT-1. (Увеличение исходного изображения 4-кратное, масштабная линейка 50 мкм.) (B) Анализ ADCC проводили с EGFP-трансдуцированной клеточной линией JIMT-1 и клеточной линией CD16.176 V.NK-92. Приложенное отношение эффектора к цели (E: T) составляло 2: 1. В случае группы -NK клетки JIMT-1 EGFP инкубировали без NK-клеток и антител против HER2, в то время как в группе +NK (ADCC) трастузумаб 10 мкг/мл добавляли к кокультурам JIMT-1 и NK-клеток. Количество жизнеспособных клеток JIMT-1-EGFP определяли с помощью высокосодержательного аналитического оборудования сразу после добавления NK-клеток и через 3 ч инкубации. Жизнеспособность клеток-мишеней в группе +NK составила 50% от жизнеспособности в группе -NK. Красной пунктирной линией показано пороговое значение, которое представляет собой образцы с жизнеспособностью ≥70% по сравнению со средним значением убийства в контрольной группе ДМСО (n = 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Реакция ADCC была описана относительно давно. Также были описаны ключевые молекулярные события процесса19. Методы измерения ADCC варьируются от золотого стандарта анализа высвобождения радиоактивного хрома, анализов высвобождения цитоплазматических ферментов до нескольких проточных цитометрий на основе флуоресценции или микропланшетных анализов20. Однако общим ограничением этих анализов является то, что они не подходят для приложений с высокой пропускной способностью. Ранее мы разработали анализ HCS на основе изображений, подходящий для скрининга библиотек соединений для ADCC-модифицирующих препаратов18. Ранее разработанный анализ, однако, имел существенный недостаток, т.е. он требовал этапа промывки, потому что клетки-мишени должны были быть предварительно окрашены кальцеин-ацетоксиметилэстером, а избыток красителя должен был быть удален перед добавлением NK-клеток и трастузумаба. Текущий метод представляет собой усовершенствованную версию анализа в том смысле, что использование EGFP-трансдуцированных клеток JIMT-1 позволяет проводить прямую дифференциацию между эффекторными клетками и клетками-мишенями без этапа окрашивания и промывки. Кроме того, нужно также помнить об особенности нашего анализа, заключающейся в том, что он не может различать мертвые и умирающие клетки (еще не полностью отделенные). Кроме того, возможно, что исследуемые соединения могут увеличивать клеточную адгезию, и в результате клеточный мусор может оставаться в фокальной плоскости, что приводит к ложноположительному результату. Кроме того, флуоресцентные свойства тестируемых соединений могут вызывать помехи. Поэтому, несмотря на то, что экраны обычно запускаются один раз, настоятельно рекомендуется проверять попадания и в других типах анализов. Дополнительные ограничения нашего анализа включают косвенную идентификацию гибели клеток, т.е. метод основан на количественной оценке изменения количества жизнеспособных клеток вместо мертвых. Тем не менее, здесь важно отметить, что предыдущее исследование показало, что обнаружение жизнеспособных клеток на основе ECIS превосходит некоторые методы, непосредственно измеряющие гибель клеток13. Поэтому эта особенность нашего метода не обязательно представляет собой недостаток. Что действительно может ограничить применение этого анализа, так это то, что он требует, по крайней мере, базовых знаний в области расширенного анализа изображений, навыка, который сегодня становится все более распространенным.
Хотя до сих пор небольшая библиотека (менее 1000 соединений) была протестирована с оригинальной версией анализа18. Мы еще не идентифицировали бустерный препарат ADCC. Причина этого может заключаться в том, что активаторы ADCC могут быть редкими, и для их идентификации необходимо проверять гораздо более крупные библиотеки. Теоретически также возможно, что после того, как реакция ADCC начинается, она протекает без серьезных ограничивающих этапов, так что процесс будет трудно улучшить с помощью фармакона. Одним из возможных способов решения этой проблемы может быть подавление активности ADCC (например, с помощью кортикостероидов) и запуск экрана в поисках соединений, восстанавливающих полную активность ADCC. Тем не менее, мы считаем, что выявление ингибирующего действия ADCC известных медицинских препаратов также может быть важным для повышения осведомленности клиницистов, назначающих эти препараты пациентам с различными показаниями.
Что касается технических деталей анализа, мы рекомендуем настраивать анализ параллельно с альтернативным тестом на цитотоксичность. В наших руках ECIS (измерение импеданса электрического элемента-подложки) оказалось наиболее надежной системой для количественной оценки эффективности ADCC13. В начале проекта ECIS использовался для корректировки критических параметров (время, отношение эффектора к целевой клетке, концентрация трастузумаба), а затем перенос анализа на платформуHCS 18. Мы рекомендуем сделать то же самое и точно настроить эти параметры, так как они могут меняться от лаборатории к лаборатории. При настройке анализа важно обратить особое внимание на некоторые важные этапы процедуры. Стандартизация условий культивирования (частота расщепления, питание клеток, консистенция покрытия) как для NK-клеток, так и для клеток-мишеней может повысить воспроизводимость эффективности ADCC. Кроме того, суспендирование культур NK-клеток должно выполняться с осторожностью, поскольку эти клетки, как правило, чувствительны к механическому стрессу (Guti et al., неопубликованное наблюдение). Что касается библиотеки соединений, важно убедиться, что все лунки содержат равные объемы исследуемых соединений, если для переноса соединений с библиотечной пластины на пробирную пластину используются штифтовые инструменты. Это может предотвратить прилипание различных количеств составных растворов к внешней стороне штифтов. Кроме того, пораженные соединения, идентифицированные в скрининге, должны быть проверены, предпочтительно, в надежном анализе, основанном на другом принципе. Для этого мы рекомендуем метод11 на основе ECIS (см. выше во введении).
В заключение мы создали систему анализа ADCC in vitro на основе JIMT-1 EGFP, подходящую для тестирования библиотек соединений с автоматическим анализом изображений. Метод был пригоден для идентификации фармаконов с известными модифицирующими эффектами ADCC. Способ потенциально пригоден для определения гибели раковых клеток, вызванной конъюгатами лекарственного средства трастузумаба (например, недавно разработанным трастузумаб-эмтанзин21), где механизм токсичности является более сложным и лишь частично вызван ADCC и частично ингибитором тубулина мертанзином. В будущем мы планируем внедрить технологию количественной оценки ADCC в 3D-сфероидах, которые представляют собой более точное отражение поведения опухоли, чем 2D-модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
LV получила финансирование от грантов Национального управления исследований, разработок и инноваций GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS», GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE и OTKA K132193, K147482. Клетки CD16.176V.NK-92 были получены от доктора Керри С. Кэмпбелла (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, от имени Brink Biologics, lnc. Сан-Диего, Калифорния), защищены патентами по всему миру и были лицензированы Nantkwest, lnc. Авторы благодарят Дьёрдя Вереба и Арпада Сёёра за помощь в использовании клеточной линии NK-92 и за технические консультации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
