Summary
Detta protokoll presenterar en automatiserad, bildbaserad teknik med hög genomströmning för att identifiera föreningar som modulerar dödande av naturliga mördarcellmedierade bröstcancerceller i närvaro av en terapeutisk anti-HER-2-antikropp.
Abstract
Immunterapi med antigenspecifika antikroppar eller immuncheckpointhämmare har revolutionerat behandlingen av bröstcancer. Bröstcancerceller som uttrycker den epidermala tillväxtfaktorreceptorn HER2 kan riktas mot anti-HER-2-antikroppen trastuzumab. Antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) är en viktig mekanism som är inblandad i antitumörverkan av HER-2. Trastuzumab bundet till cancerceller kan kännas igen av Fc-receptorerna i ADCC-effektorceller (t.ex. naturliga mördarceller (NK), makrofager och granulocyter), vilket utlöser den cytotoxiska aktiviteten hos dessa immunceller som leder till cancercelldöd. Vi bestämde oss för att utveckla en bildbaserad analys för kvantifiering av ADCC för att identifiera nya ADCC-modulatorföreningar genom screening med högt innehåll. I analysen samodlas HER2-överuttryckande JIMT-1-bröstcancerceller med NK-92-celler i närvaro av trastuzumab, och målcelldöd kvantifieras genom automatiserad mikroskopi och kvantitativ bildanalys. Målceller skiljer sig från effektorceller baserat på deras EGFP-fluorescens. Vi visar hur föreningsbibliotek kan testas i analysen för att identifiera ADCC-modulatorläkemedel. För detta ändamål sattes en sammansatt bibliotekstestplatta upp med slumpmässigt utvalda finkemikalier från laboratoriehyllan. Tre mikrotubulidestabiliserande föreningar (kolkicin, vinkristin, podofyllotoxin) som förväntas störa NK-cellmigration och degranulering inkluderades också i testbiblioteket. Testskärmen identifierade alla tre positiva kontrollföreningar som träffar som bevisar metodens lämplighet för att identifiera ADCC-modifierande läkemedel i ett kemiskt bibliotek. Med denna analys kan föreningsbiblioteksskärmar utföras för att identifiera ADCC-förbättrande föreningar som kan användas som adjuvansterapeutiska medel för behandling av patienter som får immunterapier mot cancer. Dessutom kan metoden också användas för att identifiera eventuella oönskade ADCC-hämmande biverkningar av terapeutiska läkemedel som tas av cancerpatienter för olika indikationer.
Introduction
Immunterapi med antikroppar mot cancer, immunkontrollpunktshämmare eller chimära antigenreceptoruttryckande T (CAR-T) -celler representerar ett kraftfullt tillvägagångssätt för cancerbehandling 1,2,3. Trastuzumab är en humaniserad monoklonal anti-HER-2 (human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2) antikropp som används för behandling av HER-2-positiv tidig stadium eller metastaserande bröstcancer, liksom HER-2-positiv metastaserad magcancer 4,5,6. Det verkar främst genom att hämma den proliferationsstimulerande effekten av epidermal tillväxtfaktor4. Det har dock rapporterats att trastuzumab effektivt utlöser cancercellsdöd även om cancercellerna har förlorat sin respons på HER-2-stimulering7. Denna paradoxala effekt av antikroppen beror på antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet (ADCC)7. ADCC kan förmedlas av naturliga mördarceller (NK), granulocyter och makrofager som tillsammans kallas effektorcellerna i ADCC 8,9. Om en antikropp, såsom trastuzumab, binder till tumörceller, använder dessa effektorceller sina Fc-receptorer för att binda antikroppens konstanta (Fc) region. Antikroppen överbryggar tumörcellerna och Fc-receptorbärande effektorceller, vilket utlöser frisättningen av deras cytotoxiska mediatorer10. Naturliga mördarceller frigör den cytotoxiska lasten av sina granuler som innehåller perforin för att generera porer i målcellmembranet och granzym (utlöser celldödssignalvägar) i immunsynapsen vilket leder till apoptos av cancercellerna (se figur 1).
Figur 1: Effektor- och målcellinteraktioner i ADCC. Cellytan Fcγ-receptorn för effektorn NK-cellen känner igen Fc-regionen för anti-HER2-trastuzumab-antikroppen som är specifik för HER2-molekylen uttryckt på tumörcellens yta. Således etableras den så kallade immunologiska synapsen mellan de två cellerna, vilket inducerar den riktade exocytosen av cytotoxiska granuler av effektorcellen. De frisatta perforin- och granzymmolekylerna resulterar så småningom i apoptos av målcellen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Flera analyser har tidigare utvecklats för att kvantifiera cytotoxicitet, inklusive ADCC. Guldstandarden är den radioaktiva kromfrisättningsmetoden, där målcellerna märks med radioaktiv 51Cr-isotop, och ADCC kvantifieras genom att mäta radioaktivitet från supernatanten i lyserade målceller11. På grund av de uppenbara problemen på grund av strikt reglerad hantering, lagring och bortskaffande av radioaktiva farmakokoner och avfall har denna metod blivit alltmer icke-populär bland livsforskare. Dessutom är det inte heller mottagligt för applikationer med hög genomströmning. Mätning av aktiviteten hos enzymer (t.ex. laktat-dehydrogenas) som frigörs från de dödade målcellerna kan ge ett icke-radioaktivt alternativ till 51Cr-analysen12. Dessa analyser misslyckas dock med att skilja mellan mål- och effektorcelldöd. ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) visade sig vara lämplig för kvantifiering av ADCC13, men ECIS-utrustningen är inte tillgänglig i de flesta laboratorier och tekniken är inte kompatibel med applikationer / screening med hög genomströmning. Fluorescerande märkta celler representerar ett populärt alternativ i många cellbiologiska analyser och används ofta i flödescytometri eller plattläsarbaserade applikationer14,15,16. Dessa analyser innehåller emellertid ofta tvättsteg eller är på annat sätt inkompatibla med applikationer med hög genomströmning (t.ex. flödescytometribaserade tekniker). Vissa populära cytotoxicitetsanalyser, som i teorin bör vara lämpliga för ADCC-kvantifiering, misslyckas med att på ett tillförlitligt sätt bestämma ADCC-effektivitet13. Nyligen, med spridningen av fluorescerande konfokalmikroskopi, har bildbaserade analyser med högt innehåll blivit alltmer populära inom olika områden av biovetenskap17. Å ena sidan är cellavbildningsutrustning nu ganska allestädes närvarande, medan å andra sidan praktiskt taget oändliga morfologiska parametrar kan samlas in från de förvärvade bilderna. Därför bestämde vi oss för att utveckla en ADCC-analys med högt innehåll och visa dess lämplighet för sammansatt biblioteksscreening.
Här presenterar vi en bildbaserad ADCC-analys och demonstrerar hur denna analys kan användas för High-Content Screening (HCS) för att identifiera ADCC-modulerande föreningar. Modellen är baserad på JIMT-1 bröstkarcinommålceller, CD16.176V.NK-92 effektorceller och den humaniserade monoklonala anti-HER2-antikroppen trastuzumab. Med denna metod är det möjligt att identifiera läkemedel som kan förstärka NK-cellernas tumördödande verkan eller att få insikt i mekanismen hos NK-cellmedierad ADCC genom att identifiera små molekyler som stör ADCC. Vi föreslår att livsforskare som syftar till att kvantifiera cellmedierad cytotoxicitet med särskild hänsyn till ADCC kan dra nytta av att använda denna analys antingen för upptäcktsvetenskap eller läkemedelsutveckling. Denna analys kan vara ett alternativ om ett laboratorium har tillgång till och viss erfarenhet av fluorescerande avbildning och kvantitativ bildanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De viktigaste stegen i analysarbetsflödet presenteras i figur 2.
Bild 2: Arbetsflöde för ADCC-skärmen. JIMT-1-EGFP-målceller sådda i 96 brunns HCS-plattor behandlas med läkemedel från föreningsbiblioteket. I sin tur tillsätts ofärgade NK (effektor) celler och trastuzumab, och plattan avbildas vid 0 tidpunkt och efter 3 timmars inkubation. ADCC-utvärderingen baseras på förändringen i antalet livskraftiga (ytvidhäftande) målceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Beläggning av HCS-plattan
- Belägg de 96 brunnsplattorna med hög innehåll (HSC) med 50 μL / brunn JIMT-1-medium (DMEM / F-12-medium kompletterat med 20% fetalt bovint serum (FBS), 0,3 U / ml insulin (100 IE / ml, Humulin R och 1% penicillin-streptomycin).
- Placera plattan i en CO2-inkubator i 1 timme.
OBS: Beläggning är avgörande för att fästa JIMT-1-celler på plattans glasyta.
2. Sådd av JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) celler
OBS: EGFP-uttryckande JIMT-1-celler genererades i vårt tidigare arbete18, och cellerna odlades i T25-vävnadsodlingskolvar i JIMT-1-media (se sammansättning i steg 1.1).
- Tvätta cellerna med 2 ml steril PBS.
- Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA till kolven och sätt tillbaka kolven i en CO2-inkubator i 10 minuter.
- Efter inkubationen knackar du på kolven för att kontrollera om JIMT-1-cellerna lossnar.
- Stoppa uppslutningen med 2 ml JIMT-1-media och samla cellsuspensionen i ett 15 ml rör.
- Räkna cellerna med 0,4% trypanblå (80 μL av färgämnet + 20 μL av cellsuspensionen) i en Bürker-kammare och justera cellnumret till 133 000 celler / ml.
- Aspirera beläggningsmediet från 96-brunnsplattan (steg 1.2).
- Pipettera 75 μL av cellsuspensionen till varje brunn på HCS-plattorna (se Materialförteckning).
- Låt cellerna fästa under en inkubation över natten vid 37 °C i en CO2-inkubator .
3. Förbehandling av JIMT-1 EGFP-celler med föreningsbiblioteket
- Aspirera mediet från JIMT-1-cellerna och tillsätt 50 μL/väl färskt JIMT-1-medium till brunnarna. Överför plattan till screeninglaboratoriet med hög kapacitet.
OBS: Att använda en vätskehanteringsrobot gör tillsatsen av sammansatta bibliotek mer effektiv och reproducerbar. - Överför testföreningarna från föreningens biblioteksplatta till analysplattan med ett stiftverktyg kalibrerat till en volym på 25 nL. Utför detta fyra gånger. Fyra överföringsrundor ger en slutlig volym på 100 nL (och en slutkoncentration på 20 μM).
- Tvätta stiftverktyget mellan varje steg, först med 50% DMSO och sedan med 70% etanol.
- Inkubera plattorna i 1 timme i en CO2-inkubator vid 37 °C.
4. Starta ADCC-analysen genom att lägga till effektorcellerna
OBS: CD16.176V.NK92-celler (nedan kallade NK92-celler) odlades i α-MEM kompletterat med 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pyruvat, 1% glutamin, 1% penicillin-streptomycin och 100 IE / ml IL-2.
- Räkna NK92-celler med trypanblått (80 μL av färgämnet + 20 μL av cellsuspensionen). Justera cellnumret till 400 000 celler/ml.
- Centrifugera 4 ml av cellsuspensionen vid 150 x g i 3 min vid rumstemperatur.
- Bered ADCC-mediet genom att tillsätta 20 μg/ml anti-HER2-antikropp (trastuzumab) till JIMT-1-mediet.
- Resuspendera NK-cellpelleten i 5 ml ADCC-medium.
- Pipettera 20 000 NK-celler i 50 μL ADCC-medium till mål-JIMT-1-cellerna. Den slutliga volymen är 100 μl och den slutliga trastuzumabkoncentrationen är 10 μg/ml.
- Placera analysplattan i analysutrustningen med högt innehåll med en inbyggd inkubator inställd på 37 °C.
5. Bildbehandling
OBS: Plattorna ska avbildas vid två tidpunkter, först omedelbart efter tillsatsen av effektorcellerna till målcellerna och för det andra vid 3 timmar efter tillsatsen av NK-celler. För avbildning kan höginnehållsanalysatorn och dess programvara eller lämpliga alternativ användas (se materialtabell).
- Välj Platttyp (96-well cell carrier ultra) i listan över plattor.
- Välj autofokus med två toppar om analysen utförs i plattor.
- Använd 10x mål i icke-konfokalt läge.
- Välj Binning 2 för att fördubbla signal-brusförhållandet.
- Ta ljusfältsbilder vid 650-760 nm och fluorescerande bilder av EGFP-transducerade JIMT-1-celler vid 488 nm (excitation) och 500-550 nm (emission) våglängder.
- Välj antal fält och antal tidpunkter för avbildningen.
6. Bildanalys
OBS: För att analysera ADCC-effektiviteten räknas de livskraftiga JIMT-1-cellerna. Målceller som dödas av ADCC lossnar från ytan och rör sig bort från mikroskopets fokalplan. Därför motsvarar skillnaden mellan antalet viabla celler i början och i slutet av ADCC-reaktionen målceller eliminerade av ADCC. För att visa hur man bygger upp utvärderingssekvensen visas en ADCC-kontrollbrunn i videon.
- Använd modulen Sök efter celler för att identifiera områden i bilden som motsvarar celler.
OBS: Varje cell detekteras som ett område på bilden med en högre fluorescensintensitet än dess omgivning. - Välj celler med den inbyggda M-algoritmen med minst 80 μm i diameter.
- Ställ in Delningskänslighet, som paketerar ett stort objekt i mindre objekt, till 0,5.
- Ange tröskelvärdet för Common (den lägsta pixelintensitetsnivån) till 0.
- Uteslut detektering av bakgrundsområde med hög EGFP-fluorescensintensitet i två steg.
- Använd först funktionen Beräkna intensitetsegenskaper för att bestämma EGFP-fluorescensintensiteten i det tidigare valda cellområdet .
- Ställ in den lägsta och högsta intensitetströskeln med alternativet Välj population .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera hur analysen fungerar i verkligheten skapade vi ett testbibliotek med 16 föreningar som valts slumpmässigt från laboratoriehyllorna (figur 3). Dessutom inkluderades DMSO också som en negativ kontroll och tre mikrotubulipolymerisationshämmare (kolchicin, vinkristin och podofyllotoxin) som positiva kontroller. De senare förväntades hämma ADCC genom att störa NK-cellmigrationen till cancercellerna och NK-celldegranuleringen. Alla testföreningar och DMSO placerades på testbiblioteksplattan i fyrdubbla exemplar, och DMSO lades också till i plattans första och sista kolumner (figur 3).
Figur 3: Det sammansatta bibliotek som används för att testa HCS ADCC-analysen . (A) Plattkartan över det sammansatta biblioteket visas. Varje förening är närvarande på biblioteksplattan i fyrdubbla exemplar. DMSO lades till som en negativ kontroll till den första och sista kolumnen på plattan. Brunnar som innehåller DMSO och de tre mikrotubulimonteringshämmarna (kolchicin, vinkristin och podofyllotoxin) är markerade i färg. (B) Namn, plattpositioner och förkortade namn på testföreningar presenteras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Med hjälp av vårt testbibliotek körde vi analysen och utvärderade resultaten enligt beskrivningen i protokollet. Eftersom JIMT-1-celler uttrycker EGFP kan de lätt särskiljas från effektorcellerna som är icke-fluorescerande. Analysen är baserad på detektering av förändringen i antalet ytvidhäftande (livskraftiga) målceller. Under våra analysförhållanden orsakade NK-celler cirka 50% JIMT-1-celldöd (+ NK-gruppen), medan ingen av testföreningarna orsakade någon toxicitet i frånvaro av NK-celler (-NK-gruppen) (figur 4). Analysförhållandena optimerades tidigare för att uppnå denna medelhöga nivå av cytotoxicitet18, förutsatt att detta skulle möjliggöra identifiering av både ADCC-aktivator- och inhibitorföreningar. De positiva kontrollmikrotubulisammansättningshämmarna visade sig som "träffar" i alla fyrdubbla positioner som förväntat, vilket indikerar analysens höga tillförlitlighet (figur 4).
Bild 4: Testa ett sammansatt bibliotek i ADCC-modellen. (A) Bilder av ADCC-reaktioner togs 3 timmar efter saminkubation av NK-celler och JIMT-1-celler i närvaro av DMSO med HCS-kamerans 10x-mål. (Skalstapeln är 200 μm.) En del av bilden är förstorad och visar de ofärgade effektorn NK-celler och de EGFP-transducerade mål-JIMT-1-cellerna. (Förstoringen av originalbilden är 4x, skalstapeln är 50 μm.) (B) ADCC-analysen utfördes med EGFP-transducerad JIMT-1-bröstkarcinomcellinje och CD16.176 V.NK-92-cellinje. Det applicerade effektor-till-målförhållandet (E:T) var 2:1. I fallet med -NK-gruppen inkuberades JIMT-1 EGFP-cellerna utan NK-celler och anti-HER2-antikroppar, medan i +NK-gruppen (ADCC) 10 μg/ml tillfördes trastuzumab till JIMT-1- och NK-cellsamkulturerna. Antalet livskraftiga JIMT-1-EGFP-celler detekterades med hjälp av analysutrustning med högt innehåll omedelbart efter tillsats av NK-celler och efter 3 timmars inkubation. Målcellviabiliteten i +NK-gruppen var 50% av den i -NK-gruppen. Den röda streckade linjen visar tröskelvärdet, vilket representerar prover med ≥70% livskraft jämfört med genomsnittet av DMSO-kontroll (n = 20) dödande. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADCC-reaktionen har beskrivits för relativt länge sedan. Viktiga molekylära händelser i processen har också beskrivits19. Metoder för mätning av ADCC sträcker sig från guldstandarden radioaktivt kromfrisättningsanalys, cytoplasmatiska enzymfrisättningsanalyser till flera fluorescensbaserade flödescytometri- eller mikroplattanalyser20. En vanlig begränsning för dessa analyser är dock att de inte är mottagliga för applikationer med hög genomströmning. Tidigare utvecklade vi en bildbaserad HCS-analys lämplig för screening av föreningsbibliotek för ADCC-modifierande läkemedel18. Den tidigare utvecklade analysen hade emellertid en stor nackdel, dvs det krävde ett tvättsteg eftersom målcellerna måste förfärgas med kalcein-acetoximetylester och överskottsfärgämnet måste avlägsnas före tillsatsen av NK-cellerna och trastuzumab. Den nuvarande metoden representerar en avancerad version av analysen genom att användningen av EGFP-transducerade JIMT-1-celler möjliggör enkel differentiering mellan effektor- och målceller utan färgning och tvättsteg. Dessutom måste man också vara medveten om funktionen i vår analys att den inte kan skilja mellan döda och döende celler (ännu inte helt fristående). Dessutom är det möjligt att testföreningarna kan öka celladhesionen och som ett resultat kan cellskräp förbli i fokalplanet vilket resulterar i ett falskt positivt resultat. Dessutom kan testföreningarnas fluorescerande egenskaper orsaka störningar. Därför, även om skärmar vanligtvis körs en gång, rekommenderas det starkt att validera träffar i andra typer av analyser också. Ytterligare begränsningar av vår analys inkluderar indirekt identifiering av celldöd, dvs metoden är baserad på kvantifiering av förändringen i antalet livskraftiga celler istället för döda celler. Det är dock viktigt att notera här att en tidigare studie visade att ECIS-baserad detektion av livskraftiga celler var överlägsen några av de metoder som direkt mäter celldöd13. Därför representerar denna funktion i vår metod inte nödvändigtvis en nackdel. Vad som verkligen kan begränsa tillämpningen av denna analys är dock att det kräver åtminstone en grundläggande kunskap i avancerad bildanalys, en färdighet som blir allt vanligare idag.
Även om hittills har ett litet bibliotek (mindre än 1000 föreningar) testats med originalversionen av analysen18. Vi har ännu inte identifierat ett ADCC-boosterläkemedel. Anledningen till detta kan vara att ADCC-aktivatorer kan vara sällsynta, och mycket större bibliotek måste screenas för att identifiera en. Teoretiskt är det också möjligt att när ADCC-reaktionen startar, fortsätter den utan större begränsande steg så att processen skulle vara svår att förbättra ytterligare av en farmakokon. En möjlig väg runt detta problem kan vara att undertrycka ADCC-aktivitet (t.ex. med kortikosteroider) och köra skärmen och leta efter föreningar som återställer full ADCC-aktivitet. Vi anser dock att det också kan vara viktigt att identifiera ADCC-hämmande effekt av kända läkemedel för att öka medvetenheten hos kliniker som förskriver dessa läkemedel till patienter med olika indikationer.
När det gäller de tekniska detaljerna i analysen rekommenderar vi att analysen ställs in parallellt med ett alternativt cytotoxicitetstest. I vår hand visade sig ECIS (elektrisk cell-substratimpedansavkänning) vara det mest tillförlitliga systemet för kvantifiering av ADCC-effektivitet13. I början av projektet användes ECIS för att justera kritiska parametrar (tid, effektor till målcellförhållande, trastuzumabkoncentration) och överförde sedan analysen till HCS-plattformen18. Vi rekommenderar att du gör samma sak och finjusterar dessa parametrar, eftersom de kan ändras från labb till labb. Vid upprättandet av analysen är det viktigt att ägna särskild uppmärksamhet åt några av de kritiska stegen i proceduren. Standardisering av odlingsförhållanden (delningsfrekvens, cellmatning, pläteringskonsistens) för både NK-celler och målceller kan öka reproducerbarheten av ADCC-effektivitet. Dessutom måste suspendering av NK-cellkulturer utföras med försiktighet eftersom dessa celler tenderar att vara känsliga för mekanisk stress (Guti et al. opublicerad observation). När det gäller föreningsbiblioteket är det viktigt att se till att alla brunnar innehåller lika stora volymer testföreningar om stiftverktyg används för överföring av föreningar från biblioteksplattan till analysplattan. Detta kan förhindra att varierande mängder sammansatta lösningar fastnar på stiftens yttre sida. Dessutom bör träffföreningar som identifieras i en skärm valideras, helst i en tillförlitlig analys baserad på en annan princip. För detta rekommenderar vi ECIS-baserad metod11 (se inledningen ovan).
Sammanfattningsvis inrättade vi ett JIMT-1 EGFP-baserat in vitro ADCC-analyssystem som är lämpligt för att testa sammansatta bibliotek med automatiserad bildanalys. Metoden var lämplig för identifiering av farmakokoner med kända ADCC-modifierande effekter. Metoden är potentiellt lämplig för bestämning av cancercelldöd orsakad av trastuzumab-läkemedelskonjugat (t.ex. nyligen utvecklat trastuzumab-emtansin21) där toxicitetsmekanismen är mer komplex och endast delvis orsakas av ADCC och delvis av tubulinhämmaren mertansin. I framtiden planerar vi att anta tekniken för att kvantifiera ADCC i 3D-sfäroider, som representerar en mer exakt återspegling av tumörbeteende än 2D-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
LV fick finansiering från National Research, Development and Innovation Office-bidrag GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE och OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 celler erhölls från Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, på uppdrag av Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), skyddas av patent över hela världen och licensierades av Nantkwest, lnc. Författarna är tacksamma för György Vereb och Árpád Szöőr för deras hjälp med användningen av NK-92-cellinjen och för teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
