Summary
Denne protokollen presenterer en automatisert, bildebasert høy gjennomstrømningsteknikk for å identifisere forbindelser som modulerer naturlig drepercellemediert brystkreftcelledreping i nærvær av et terapeutisk anti-HER-2-antistoff.
Abstract
Immunterapi med antigenspesifikke antistoffer eller immunsjekkpunkthemmere har revolusjonert behandlingen av brystkreft. Brystkreftceller som uttrykker den epidermale vekstfaktorreseptoren HER2 kan målrettes av anti-HER-2 antistoffet trastuzumab. Antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) er en viktig mekanisme involvert i antitumorvirkningen av HER-2. Trastuzumab bundet til kreftceller kan gjenkjennes av Fc-reseptorene i ADCC-effektorceller (f.eks. naturlige dreperceller, makrofager og granulocytter), og utløser den cytotoksiske aktiviteten til disse immuncellene som fører til kreftcelledød. Vi satte oss fore å utvikle en bildebasert analyse for kvantifisering av ADCC for å identifisere nye ADCC-modulatorforbindelser ved screening med høyt innhold. I analysen blir HER2 overuttrykkende JIMT-1 brystkreftceller dyrket sammen med NK-92-celler i nærvær av trastuzumab, og målcelledød kvantifiseres ved automatisert mikroskopi og kvantitativ bildeanalyse. Målceller skiller seg fra effektorceller basert på deres EGFP-fluorescens. Vi viser hvordan sammensatte biblioteker kan testes i analysen for å identifisere ADCC-modulatormedikamenter. For dette formålet ble en sammensatt bibliotekstestplate satt opp ved hjelp av tilfeldig utvalgte finkjemikalier fra laboratoriehyllen. Tre mikrotubuli destabiliserende forbindelser (kolkisin, vinkristin, podofyllotoksin) som forventes å forstyrre NK-cellemigrasjon og degranulering ble også inkludert i testbiblioteket. Testskjermen identifiserte alle tre positive kontrollforbindelsene som treff som viste metodens egnethet til å identifisere ADCC-modifiserende legemidler i et kjemisk bibliotek. Med denne analysen kan sammensatte biblioteksskjermer utføres for å identifisere ADCC-forsterkende forbindelser som kan brukes som adjuvante terapeutiske midler til behandling av pasienter som får immunterapi mot kreft. I tillegg kan metoden også brukes til å identifisere eventuelle uønskede ADCC-hemmende bivirkninger av terapeutiske legemidler tatt av kreftpasienter for forskjellige indikasjoner.
Introduction
Immunterapi med antistoffer mot kreft, immunsjekkpunkthemmere eller kimære antigenreseptoruttrykkende T-celler (CAR-T) representerer en kraftig tilnærming til kreftbehandling 1,2,3. Trastuzumab er et humanisert monoklonalt anti-HER-2 (humant epidermalt vekstfaktorreseptor 2) antistoff som brukes til behandling av HER-2 positiv tidlig stadium eller metastatisk brystkreft, samt HER-2 positiv metastatisk gastrisk kreft 4,5,6. Det virker primært ved å hemme den proliferasjonsstimulerende effekten av den epidermale vekstfaktor4. Det har imidlertid blitt rapportert at trastuzumab effektivt utløser kreftcelledød selv om kreftcellene har mistet responsen på HER-2-stimulering7. Denne paradoksale effekten av antistoffet skyldes antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC)7. ADCC kan medieres av naturlige dreperceller (NK), granulocytter og makrofager kollektivt kjent som effektorcellene til ADCC 8,9. Hvis et antistoff, slik som trastuzumab, binder seg til tumorceller, bruker disse effektorcellene sine Fc-reseptorer til å binde den konstante (Fc) regionen av antistoffet. Antistoffet bygger bro mellom tumorcellene og Fc-reseptorbærende effektorceller, og utløser frigjøringen av deres cytotoksiske mediatorer10. Naturlige dreperceller frigjør den cytotoksiske lasten av granulatene som inneholder perforin for å generere porer i målcellemembranen og granzyme (utløser signalveier for celledød) inn i immunsynapsen, noe som fører til apoptose av kreftcellene (se figur 1).
Figur 1: Effektor- og målcelleinteraksjoner i ADCC. Celleoverflaten Fcγ-reseptoren til effektoren NK-cellen gjenkjenner Fc-regionen av anti-HER2-trastuzumabantistoffet spesifikt for HER2-molekylet uttrykt på overflaten av tumorcellen. Dermed etableres den såkalte immunologiske synapsen mellom de to cellene, og induserer den rettede eksocytosen av cytotoksiske granulater i effektorcellen. De frigjorte perforin- og granzymemolekylene resulterer til slutt i apoptose av målcellen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Flere analyser har tidligere blitt utviklet for å kvantifisere cytotoksisitet, inkludert ADCC. Gullstandarden er frigjøringsmetoden for radioaktivt krom, der målcellene er merket med radioaktiv 51Cr-isotop, og ADCC kvantifiseres ved å måle radioaktivitet fra supernatanten til lyserte målceller11. På grunn av de åpenbare problemene på grunn av den strengt regulerte håndteringen, lagringen og avhending av radioaktive legemidler og avfall, har denne metoden blitt stadig mer upopulær blant bioforskere. I tillegg er det heller ikke egnet til applikasjoner med høy gjennomstrømning. Måling av aktiviteten til enzymer (f.eks. Laktat-dehydrogenase) frigjort fra de drepte målcellene kan gi et ikke-radioaktivt alternativ til 51Cr-analysen12. Disse analysene klarer imidlertid ikke å skille mellom mål- og effektorcelledød. ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) viste seg å være egnet for kvantifisering av ADCC13, men ECIS-utstyret er ikke tilgjengelig i de fleste laboratorier, og teknikken er ikke kompatibel med applikasjoner med høy gjennomstrømning/screening. Fluorescerende merkede celler representerer et populært alternativ i mange cellebiologiske analyser og brukes ofte i flowcytometri eller plateleserbaserte applikasjoner14,15,16. Imidlertid inneholder disse analysene ofte vasketrinn eller er på annen måte uforenlige med applikasjoner med høy gjennomstrømning (f.eks. flowcytometribaserte teknikker). Noen populære cytotoksisitetsanalyser, som i teorien skal være egnet for ADCC-kvantifisering, klarer ikke å bestemme ADCC-effektiviteten på en påliteligmåte 13. Nylig, med spredning av fluorescerende konfokalmikroskopi, blir bildebaserte analyser med høyt innhold stadig mer populære innen ulike områder av biovitenskap17. På den ene siden er cellebildeutstyr nå ganske allestedsnærværende, mens på den annen side kan nesten uendelige morfologiske parametere samles fra de oppkjøpte bildene. Derfor satte vi oss fore å utvikle en screeningkompatibel ADCC-analyse med høyt innhold og demonstrere dens egnethet for sammensatt bibliotekscreening.
Her presenterer vi en bildebasert ADCC-analyse og demonstrerer hvordan denne analysen kan brukes til High-Content Screening (HCS) for å identifisere ADCC-modulerende forbindelser. Modellen er basert på JIMT-1 brystkarsinom målceller, CD16.176V.NK-92 effektorceller og det humaniserte monoklonale anti-HER2 antistoffet trastuzumab. Med denne metoden er det mulig å identifisere medikamenter som kan forsterke den tumordrepende virkningen av NK-celler eller å få innsikt i mekanismen bak NK-cellemediert ADCC ved å identifisere små molekyler som forstyrrer ADCC. Vi foreslår at livsforskere som tar sikte på å kvantifisere cellemediert cytotoksisitet med spesiell hensyn til ADCC, kan ha nytte av å bruke denne analysen enten for oppdagelsesvitenskap eller medisinutvikling. Denne analysen kan være et alternativ hvis et laboratorium har tilgang til og noe erfaring med fluorescerende avbildning og kvantitativ bildeanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: De viktigste trinnene i analysearbeidsflyten er presentert i figur 2.
Figur 2: Arbeidsflyt på ADCC-skjermen. JIMT-1-EGFP målceller sådd i 96 brønn HCS-plater behandles med legemidler fra det sammensatte biblioteket. I sin tur tilsettes ufargede NK-celler (effektor) og trastuzumab, og platen avbildes ved 0 tidspunkt og etter 3 timers inkubasjon. ADCC-evalueringen er basert på endringen i antall levedyktige (overflateadherente) målceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Belegg på HCS-platen
- Belegg 96 brønn høyinnhold screening (HSC) plater med 50 μL / brønn JIMT-1 medium (DMEM / F-12 medium supplert med 20% føtal bovint serum (FBS), 0,3 U / ml insulin (100 IE / ml, Humulin R og 1% penicillin-streptomycin).
- Plasser platen i en CO2 -inkubator i 1 time.
MERK: Belegg er avgjørende for å feste JIMT-1-celler til glassoverflaten på platen.
2. Såing av JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) celler
MERK: EGFP-uttrykkende JIMT-1-celler ble generert i vårt tidligere arbeid18, og cellene ble dyrket i T25 vevskulturflasker i JIMT-1-medier (se sammensetning i trinn 1.1).
- Vask cellene med 2 ml steril PBS.
- Tilsett 1 ml trypsin-EDTA til kolben og sett kolben tilbake i en CO2 -inkubator i 10 minutter.
- Etter inkubasjonen, trykk på kolben for å sjekke om JIMT-1-celler er løsrevet.
- Stopp fordøyelsen med 2 ml JIMT-1 media og samle cellesuspensjonen i en 15 ml tube.
- Telle cellene med 0,4% trypan blå (80 μL av fargestoffet + 20 μL av cellesuspensjonen) i et Bürker kammer og juster cellenummeret til 133 000 celler / ml.
- Aspirer beleggmediet fra 96 brønnplaten (trinn 1.2).
- Pipette 75 μL av cellesuspensjonen til hver brønn på HCS-platene (se materialtabell).
- La cellene feste seg under en inkubasjon over natten ved 37 °C i en CO2 -inkubator.
3. Forbehandling av JIMT-1 EGFP-celler med det sammensatte biblioteket
- Aspirer mediet fra JIMT-1-cellene og tilsett 50 μL/brønn ferskt JIMT-1 medium til brønnene. Overfør platen til screeninglaboratoriet med høy gjennomstrømning.
MERK: Bruk av en væskehåndteringsrobot gjør tillegg av sammensatte biblioteker mer effektive og reproduserbare. - Overfør testforbindelsene fra den sammensatte bibliotekplaten til analyseplaten med et pinverktøy kalibrert til et 25 nL volum. Utfør dette fire ganger. Fire overføringsrunder gir et sluttvolum på 100 nL (og en 20 μM endelig konsentrasjon).
- Mellom hvert trinn vasker du stiftverktøyet, først med 50% DMSO og deretter med 70% etanol.
- Inkuber platene i 1 time i en CO2 -inkubator ved 37 ° C.
4. Starte ADCC-analysen ved å legge til effektorcellene
MERK: CD16.176V.NK92-celler (heretter kalt NK92-celler) ble dyrket i α-MEM supplert med 20 % FBS, 1 % MEM-NEAA, 1 % Na-pyruvat, 1 % glutamin, 1 % penicillin-streptomycin og 100 IE/ml IL-2.
- Telle NK92-celler med trypanblå (80 μL av fargestoffet + 20 μL av cellesuspensjonen). Juster celletallet til 400 000 celler/ml.
- Sentrifuge 4 ml av cellesuspensjonen ved 150 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Klargjør ADCC-mediet ved å tilsette 20 μg/ml anti-HER2-antistoff (trastuzumab) til JIMT-1-mediet.
- Hør NK-cellepelleten på nytt i 5 ml ADCC-medium.
- Pipett 20 000 NK-celler i 50 μl ADCC-medium til JIMT-1-målcellene. Det endelige volumet er 100 μL, og den endelige trastuzumabkonsentrasjonen er 10 μg/ml.
- Plasser analyseplaten i analyseutstyret med høyt innhold med et innebygd inkubatorsett ved 37 °C.
5. Bildebehandling
MERK: Platene skal avbildes på to tidspunkter, først umiddelbart etter tilsetning av effektorcellene til målcellene og for det andre ved 3 timer etter tilsetning av NK-celler. For avbildning kan analysatoren med høyt innhold og dens programvare eller egnede alternativer brukes (se Materialfortegnelse).
- Velg Platetype (96-brønns cellebærer ultra) fra listen over plater.
- Velg totoppet autofokus hvis analysen utføres i plater.
- Bruk 10x objektiv i ikke-konfokal modus.
- Velg Binning 2 for å doble signal-til-støy-forholdet.
- Ta lysfeltbilder ved 650-760 nm og fluorescerende bilder av EGFP-transducerte JIMT-1-celler ved 488 nm (eksitasjon) og 500-550 nm (emisjon) bølgelengder.
- Velg antall felt og antall tidspunkter for avbildningen.
6. Bildeanalyse
MERK: For å analysere ADCC-effektiviteten telles de levedyktige JIMT-1-cellene. Målceller drept av ADCC løsner fra overflaten og beveger seg bort fra mikroskopets fokalplan. Derfor tilsvarer forskjellen mellom antall levedyktige celler i begynnelsen og på slutten av ADCC-reaksjonen målceller eliminert av ADCC. For å vise hvordan du bygger opp evalueringssekvensen, vises en ADCC-kontrollbrønn i videoen.
- Bruk Find cells-modulen til å oppdage områder på bildet som tilsvarer celler.
MERK: Hver celle oppdages som et område på bildet med høyere fluorescensintensitet enn omgivelsene. - Velg celler ved hjelp av den innebygde M-algoritmen med minst 80 μm i diameter.
- Sett følsomheten for oppdeling, som pakker ut et stort objekt i mindre objekter, til 0,5.
- Sett den vanlige terskelen (det laveste nivået av bildepunktintensitet) til 0.
- Ekskluder deteksjon av bakgrunnsområde med høy EGFP-fluorescensintensitet i to trinn.
- Bruk først funksjonen Beregn egenskaper for intensitet til å bestemme EGFP-fluorescensintensiteten i det tidligere valgte celleområdet .
- Angi minimums- og maksimumsintensitetsterskelen ved hjelp av alternativet Velg populasjon .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere hvordan analysen fungerer i det virkelige liv, opprettet vi et testbibliotek med 16 forbindelser valgt tilfeldig fra laboratoriehyllene (figur 3). I tillegg ble DMSO også inkludert som negativ kontroll, og tre mikrotubulipolymerisasjonshemmerforbindelser (kolkisin, vinkristin og podofyllotoksin) som positive kontroller. Sistnevnte ble forventet å hemme ADCC ved å forstyrre NK-cellemigrasjon til kreftcellene og NK-celledegranulering. Alle testforbindelser og DMSO ble plassert på testbibliotekplaten i kvadruplikater, og DMSO ble også lagt til første og siste kolonne på platen (figur 3).
Figur 3: Det sammensatte biblioteket som ble brukt til å teste HCS ADCC-analysen. (A) Platekartet over det sammensatte biblioteket vises. Hver forbindelse er til stede på bibliotekplaten i kvadruplikater. DMSO ble lagt til som en negativ kontroll i første og siste kolonne på platen. Brønner som inneholder DMSO og de tre mikrotubulimonteringshemmerne (kolkisin, vinkristin og podofyllotoksin) er uthevet i farge. (B) Navn, plateposisjoner og forkortede navn på testforbindelser presenteres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved hjelp av vårt testbibliotek kjørte vi analysen og evaluerte resultatene som beskrevet i protokollen. Siden JIMT-1-celler uttrykker EGFP, kan de lett skilles fra effektorcellene som ikke er fluorescerende. Analysen er basert på å oppdage endringen i antall overflateadherente (levedyktige) målceller. Under våre analysebetingelser forårsaket NK-celler ca. 50 % JIMT-1-celledød (+NK-gruppen), mens ingen av testforbindelsene forårsaket toksisitet i fravær av NK-celler (-NK-gruppen) (figur 4). Analysebetingelsene var tidligere optimalisert for å oppnå dette middels cytotoksisitetsnivået18, forutsatt at dette ville tillate identifisering av både ADCC-aktivator- og inhibitorforbindelser. De positive kontrollmikrotubulihemmerne viste seg som "treff" i alle firedoble posisjoner som forventet, noe som indikerer analysens høye pålitelighet (figur 4).
Figur 4: Testing av et sammensatt bibliotek i ADCC-modellen. (A) Bilder av ADCC-reaksjoner ble tatt 3 timer etter ko-inkubasjon av NK-celler og JIMT-1-celler i nærvær av DMSO med 10x-målet til HCS-avbildningen. (Skalastangen er 200 μm.) En del av bildet er forstørret, og viser de ufargede effektor-NK-cellene og de EGFP-transducerte JIMT-1-målcellene. (Forstørrelsen av det opprinnelige bildet er 4x, skalalinjen er 50 μm.) (B) ADCC-analysen ble utført med EGFP-transdusert JIMT-1 brystkarsinomcellelinje og CD16.176 V.NK-92 cellelinje. Det anvendte forholdet mellom effektor og mål (E:T) var 2:1. I tilfelle av -NK-gruppen ble JIMT-1 EGFP-cellene inkubert uten NK-celler og anti-HER2-antistoff, mens i +NK-gruppen (ADCC) ble 10 μg / ml trastuzumab lagt til JIMT-1- og NK-cellekulturer. Antallet levedyktige JIMT-1-EGFP-celler ble detektert ved bruk av analyseutstyr med høyt innhold umiddelbart etter tilsetning av NK-celler og etter 3 timers inkubasjon. Målcellenes levedyktighet i +NK-gruppen var 50% av den i -NK-gruppen. Den røde stiplede linjen viser terskelverdien, som representerer prøver med ≥70% levedyktighet sammenlignet med gjennomsnittet av DMSO-kontroll (n = 20) drap. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADCC-reaksjonen har blitt beskrevet relativt lenge siden. Sentrale molekylære hendelser i prosessen er også beskrevet19. Metoder for måling av ADCC spenner fra gullstandarden radioaktiv kromfrigjøringsanalyse, cytoplasmatiske enzymfrigjøringsanalyser til flere fluorescensbaserte flowcytometri eller mikroplateanalyser20. En vanlig begrensning av disse analysene er imidlertid at de ikke er mottagelige for applikasjoner med høy gjennomstrømning. Tidligere utviklet vi en bildebasert HCS-analyse egnet for screening av sammensatte biblioteker for ADCC-modifiserende legemidler18. Den tidligere utviklede analysen hadde imidlertid en stor ulempe, dvs. det krevde et vasketrinn fordi målcellene måtte forhåndsfarges med kalcein-acetoksymetylester, og overflødig fargestoff måtte fjernes før tilsetning av NK-cellene og trastuzumab . Den nåværende metoden representerer en avansert versjon av analysen ved at bruken av EGFP-transducerte JIMT-1-celler tillater enkel differensiering mellom effektor- og målceller uten et farge- og vasketrinn. Videre må man også være klar over funksjonen i analysen vår at den ikke kan skille mellom døde og døende celler (ennå ikke helt løsrevet). Videre er det mulig at testforbindelsene kan øke celleadhesjonen, og som et resultat kan celleavfall forbli i fokalplanet og resultere i et falskt positivt resultat. I tillegg kan fluorescerende egenskaper av testforbindelser forårsake forstyrrelser. Derfor, selv om skjermer vanligvis kjøres én gang, anbefales det sterkt å validere treff i andre typer analyser også. Ytterligere begrensninger i analysen vår inkluderer indirekte identifisering av celledød, dvs. metoden er basert på kvantifisering av endringen i antall levedyktige celler i stedet for døde celler. Det er imidlertid viktig å merke seg at en tidligere studie fant at ECIS-basert deteksjon av levedyktige celler var bedre enn noen av metodene som direkte måler celledød13. Derfor representerer denne funksjonen i metoden vår ikke nødvendigvis en ulempe. Det som virkelig kan begrense anvendelsen av denne analysen, er imidlertid at den krever minst en grunnleggende kunnskap i avansert bildeanalyse, en ferdighet som blir stadig mer vanlig i dag.
Selv om det så langt har blitt testet et lite bibliotek (mindre enn 1000 forbindelser) med den opprinnelige versjonen av analysen18. Vi har ennå ikke identifisert et ADCC-boostermedikament. Årsaken til dette kan være at ADCC-aktivatorer kan være sjeldne, og mye større biblioteker må screenes for å identifisere en. Teoretisk er det også mulig at når ADCC-reaksjonen starter, fortsetter den uten store begrensende trinn, slik at prosessen vil være vanskelig å forbedre ytterligere av et farmacon. En mulig vei rundt dette problemet kan være å undertrykke ADCC-aktivitet (f.eks. med kortikosteroider) og kjøre skjermen på jakt etter forbindelser som gjenoppretter full ADCC-aktivitet. Vi mener likevel at identifisering av ADCC-hemmende effekt av kjente legemidler også kan være viktig for å bevisstgjøre klinikere som forskriver disse legemidlene til pasienter med ulike indikasjoner.
Når det gjelder de tekniske detaljene i analysen, anbefaler vi å sette opp analysen parallelt med en alternativ cytotoksisitetstest. I vår hånd viste ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) seg å være det mest pålitelige systemet for kvantifisering av ADCC-effektivitet13. I starten av prosjektet ble ECIS brukt til å justere kritiske parametere (tid, effektor til målcelleforhold, trastuzumabkonsentrasjon) og deretter overført analysen til HCS-plattformen18. Vi anbefaler at du gjør det samme og finjusterer disse parametrene, da de kan endres fra laboratorium til laboratorium. Når du setter opp analysen, er det viktig å være spesielt oppmerksom på noen av de kritiske trinnene i prosedyren. Standardisering av dyrkningsbetingelser (splittingsfrekvens, cellefôring, pletteringskonsistens) for både NK-celler og målceller kan øke reproduserbarheten av ADCC-effektiviteten. Videre må suspendering av NK-cellekulturer utføres med forsiktighet, da disse cellene har en tendens til å være følsomme for mekanisk stress (Guti et al. upublisert observasjon). Når det gjelder det sammensatte biblioteket, er det viktig å sørge for at alle brønner inneholder like store mengder testforbindelser hvis pinneverktøy brukes til overføring av forbindelser fra bibliotekplaten til analyseplaten. Dette kan forhindre at varierende mengder sammensatte løsninger fester seg til utsiden av pinnene. Videre bør treffforbindelser identifisert i en skjerm valideres fortrinnsvis i en pålitelig analyse basert på et annet prinsipp. For dette anbefaler vi den ECIS-baserte metode11 (se ovenfor i innledningen).
Avslutningsvis satte vi opp et JIMT-1 EGFP-basert in vitro ADCC-analysesystem egnet for testing av sammensatte biblioteker med automatisert bildeanalyse. Metoden var egnet for identifisering av farmasøyter med kjent ADCC-modifiserende effekt. Metoden er potensielt egnet for bestemmelse av kreftcelledød forårsaket av trastuzumab-legemiddelkonjugater (f.eks. nyutviklet trastuzumab-emtansin21) der toksisitetsmekanismen er mer kompleks og bare delvis forårsaket av ADCC og delvis av tubulinhemmeren mertansin. I fremtiden planlegger vi å ta i bruk teknologien for å kvantifisere ADCC i 3D-sfæroider, som representerer en mer nøyaktig refleksjon av tumoroppførsel enn 2D-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere rapporterer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
LV mottok finansiering fra National Research, Development and Innovation Office grants GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE og OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 celler ble hentet fra Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, på vegne av Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), er beskyttet av patenter over hele verden, og ble lisensiert av Nantkwest, lnc. Forfatterne takker György Vereb og Árpád Szöőr for deres hjelp med bruken av NK-92-cellelinjen og for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
