Summary
Ce protocole présente une technique automatisée à haut débit basée sur l’image pour identifier les composés modulant la destruction des cellules cancéreuses du sein médiée par les cellules tueuses naturelles en présence d’un anticorps thérapeutique anti-HER-2.
Abstract
L’immunothérapie avec des anticorps spécifiques de l’antigène ou des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire a révolutionné le traitement du cancer du sein. Les cellules cancéreuses du sein exprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique HER2 peuvent être ciblées par l’anticorps anti-HER-2 trastuzumab. La cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) est un mécanisme important impliqué dans l’action antitumorale de HER-2. Le trastuzumab lié aux cellules cancéreuses peut être reconnu par les récepteurs Fc des cellules effectrices ADCC (p. ex. cellules tueuses naturelles (NK), macrophages et granulocytes), déclenchant l’activité cytotoxique de ces cellules immunitaires conduisant à la mort des cellules cancéreuses. Nous avons entrepris de développer un test basé sur l’image pour la quantification de l’ADCC afin d’identifier de nouveaux composés modulateurs de l’ADCC par criblage à haute teneur. Dans le test, les cellules cancéreuses du sein JIMT-1 surexprimant HER2 sont co-cultivées avec des cellules NK-92 en présence de trastuzumab, et la mort cellulaire cible est quantifiée par microscopie automatisée et analyse quantitative d’images. Les cellules cibles sont distinguées des cellules effectrices en fonction de leur fluorescence EGFP. Nous montrons comment les banques de composés peuvent être testées dans le test pour identifier les médicaments modulateurs de l’ADCC. À cette fin, une plaque d’essai de bibliothèque de composés a été mise en place en utilisant des produits chimiques fins sélectionnés au hasard sur les étagères du laboratoire. Trois composés déstabilisants des microtubules (colchicine, vincristine, podophyllotoxine) susceptibles d’interférer avec la migration et la dégranulation des cellules NK ont également été inclus dans la bibliothèque de tests. Le criblage d’essai a identifié les trois composés témoins positifs comme des résultats prouvant la pertinence de la méthode pour identifier les médicaments modifiant l’ADCC dans une bibliothèque chimique. Avec ce test, des criblages de bibliothèques de composés peuvent être effectués pour identifier les composés améliorant l’ADCC qui pourraient être utilisés comme agents thérapeutiques adjuvants pour le traitement des patients recevant des immunothérapies anticancéreuses. En outre, la méthode peut également être utilisée pour identifier les effets secondaires indésirables inhibiteurs de l’ADCC des médicaments thérapeutiques pris par les patients cancéreux pour différentes indications.
Introduction
L’immunothérapie avec des anticorps anticancéreux, des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire ou des lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques (CAR-T) représente une approche puissante du traitement du cancer 1,2,3. Le trastuzumab est un anticorps monoclonal humanisé anti-HER-2 (récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain) utilisé pour traiter le cancer du sein à un stade précoce ou métastatique HER-2 positif, ainsi que le cancer gastrique métastatique HER-2 positif 4,5,6. Il agit principalement en inhibant l’effet stimulant la prolifération du facteur de croissance épidermique4. Il a été rapporté, cependant, que le trastuzumab déclenche efficacement la mort des cellules cancéreuses même si les cellules cancéreuses ont perdu leur réactivité à la stimulation HER-27. Cet effet paradoxal de l’anticorps est dû à la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC)7. L’ADCC peut être médiée par des cellules tueuses naturelles (NK), des granulocytes et des macrophages collectivement connus sous le nom de cellules effectrices de l’ADCC 8,9. Si un anticorps, tel que le trastuzumab, se lie aux cellules tumorales, ces cellules effectrices utilisent leurs récepteurs Fc pour se lier à la région constante (Fc) de l’anticorps. L’anticorps relie les cellules tumorales et les cellules effectrices porteuses du récepteur Fc, déclenchant la libération de leurs médiateurs cytotoxiques10. Les cellules tueuses naturelles libèrent la cargaison cytotoxique de leurs granules contenant de la perforine pour générer des pores dans la membrane cellulaire cible et du granzyme (déclenchant des voies de signalisation de la mort cellulaire) dans la synapse immunitaire conduisant à l’apoptose des cellules cancéreuses (voir Figure 1).
Figure 1 : Interactions entre l’effecteur et la cellule cible dans l’ADCC. Le récepteur Fcγ de surface cellulaire de la cellule NK effectrice reconnaît la région Fc de l’anticorps anti-HER2 trastuzumab spécifique de la molécule HER2 exprimée à la surface de la cellule tumorale. Ainsi, la synapse dite immunologique est établie entre les deux cellules, induisant l’exocytose dirigée des granules cytotoxiques de la cellule effectrice. Les molécules de perforine et de granzyme libérées finissent par entraîner l’apoptose de la cellule cible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Plusieurs tests ont déjà été développés pour quantifier la cytotoxicité, y compris l’ADCC. L’étalon-or est la méthode de libération de chrome radioactif, où les cellules cibles sont marquées avec un isotope radioactif 51Cr, et l’ADCC est quantifié en mesurant la radioactivité du surnageant des cellules cibles lysées11. En raison des problèmes évidents dus à la manipulation, au stockage et à l’élimination strictement réglementés des pharmacons et des déchets radioactifs, cette méthode est devenue de moins en moins populaire parmi les scientifiques de la vie. En outre, il ne se prête pas non plus aux applications à haut débit. La mesure de l’activité des enzymes (p. ex. lactate-déshydrogénase) libérées par les cellules cibles tuées peut fournir une alternative non radioactive au test 51Cr12. Ces essais, cependant, ne font pas la distinction entre les morts cellulaires cibles et effectrices. La détection d’impédance électrique de substrat cellulaire (ECIS) s’est avérée appropriée pour la quantification de l’ADCC13, mais l’équipement ECIS n’est pas disponible dans la plupart des laboratoires et la technique n’est pas compatible avec les applications / criblage à haut débit. Les cellules marquées par fluorescence représentent une alternative populaire dans de nombreux tests de biologie cellulaire et sont souvent utilisées dans la cytométrie en flux ou les applications basées sur des lecteurs de plaques14,15,16. Cependant, ces tests contiennent souvent des étapes de lavage ou sont autrement incompatibles avec les applications à haut débit (par exemple, les techniques basées sur la cytométrie en flux). Certains tests de cytotoxicité populaires, qui en théorie devraient convenir à la quantification de l’ADCC, ne parviennent pas à déterminer de manière fiable l’efficacité de l’ADCC13. Récemment, avec la diffusion de la microscopie confocale fluorescente, les tests à haute teneur basés sur l’image sont devenus de plus en plus populaires dans divers domaines des sciences de la vie17. D’une part, les équipements d’imagerie cellulaire sont maintenant assez omniprésents, tandis que, d’autre part, des paramètres morphologiques pratiquement infinis peuvent être recueillis à partir des images acquises. Par conséquent, nous avons entrepris de développer un test ADCC compatible avec le criblage à haute teneur et de démontrer son adéquation au criblage par bibliothèque de composés.
Ici, nous présentons un test ADCC basé sur l’image et démontrons comment ce test peut être utilisé pour le criblage à haute teneur (HCS) afin d’identifier les composés modulateurs ADCC. Le modèle est basé sur des cellules cibles du carcinome du sein JIMT-1, des cellules effectrices CD16.176V.NK-92 et l’anticorps monoclonal humanisé anti-HER2 trastuzumab. Avec cette méthode, il est possible d’identifier des médicaments qui peuvent améliorer l’action tumorale des cellules NK ou de mieux comprendre le mécanisme de l’ADCC médié par les cellules NK en identifiant de petites molécules interférant avec l’ADCC. Nous suggérons que les scientifiques de la vie visant à quantifier la cytotoxicité à médiation cellulaire en accordant une attention particulière à l’ADCC puissent bénéficier de l’utilisation de ce test soit pour la science de la découverte, soit pour le développement de médicaments. Ce test peut être une alternative si un laboratoire a accès à l’imagerie fluorescente et à l’analyse quantitative d’images et possède une certaine expérience en la matière.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE : Les étapes clés du flux de travail de l’essai sont présentées à la figure 2.
Figure 2 : Workflow de l’écran ADCC. Les cellules cibles JIMT-1-EGFP ensemencées dans des plaques HCS à 96 puits sont traitées avec des médicaments de la bibliothèque de composés. À leur tour, des cellules NK (effectrices) non colorées et du trastuzumab sont ajoutés, et la plaque est imagée à 0 point de temps et après 3 h d’incubation. L’évaluation de l’ADCC est basée sur l’évolution du nombre de cellules cibles viables (adhérentes à la surface). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Revêtement de la plaque HCS
- Enduire les 96 plaques de criblage à haute teneur (CSH) de 50 μL/puits de milieu JIMT-1 (milieu DMEM/F-12 complété par 20 % de sérum fœtal bovin (FBS), 0,3 U/mL d’insuline (100 UI/mL, Humulin R et 1 % de pénicilline-streptomycine).
- Placer la plaque dans un incubateur de CO2 pendant 1 h.
REMARQUE: Le revêtement est crucial pour fixer les cellules JIMT-1 à la surface en verre de la plaque.
2. Ensemencement des cellules JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)
REMARQUE: Des cellules JIMT-1 exprimant l’EGFP ont été générées dans nos travaux précédents18, et les cellules ont été cultivées dans des flacons de culture tissulaire T25 dans des milieux JIMT-1 (voir composition à l’étape 1.1).
- Lavez les cellules avec 2 mL de PBS stérile.
- Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA dans la fiole et remettre la fiole dans un incubateur de CO2 pendant 10 min.
- Après l’incubation, tapotez la fiole pour vérifier si les cellules JIMT-1 sont détachées.
- Arrêtez la digestion avec 2 mL de milieu JIMT-1 et recueillez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL.
- Compter les cellules contenant 0,4 % de bleu de trypan (80 μL du colorant + 20 μL de la suspension cellulaire) dans une chambre de Bürker et ajuster le nombre de cellules à 133 000 cellules/mL.
- Aspirer le milieu de revêtement de la plaque de 96 puits (étape 1.2).
- Pipeter 75 μL de la suspension cellulaire à chaque puits des plaques HCS (voir le tableau des matériaux).
- Laisser les cellules se fixer pendant une nuit d’incubation à 37 °C dans un incubateur de CO2 .
3. Prétraitement des cellules JIMT-1 EGFP avec la bibliothèque de composés
- Aspirer le milieu des cellules JIMT-1 et ajouter 50 μL/puits de milieu JIMT-1 frais dans les puits. Transférez la plaque au laboratoire de criblage à haut débit.
REMARQUE: L’utilisation d’un robot de manipulation de liquides rend l’ajout de bibliothèques de composés plus efficace et reproductible. - Transférer les composés d’essai de la plaque de la bibliothèque de composés sur la plaque d’essai à l’aide d’un outil à goupille étalonné à un volume de 25 nL. Effectuez cette opération quatre fois. Quatre cycles de transfert donnent un volume final de 100 nL (et une concentration finale de 20 μM).
- Entre chaque étape, lavez l’outil à broches, d’abord avec 50% de DMSO, puis avec 70% d’éthanol.
- Incuber les plaques pendant 1 h dans un incubateur de CO2 à 37 °C.
4. Démarrage du test ADCC en ajoutant les cellules effectrices
REMARQUE : Des cellules CD16.176V.NK92 (ci-après appelées cellules NK92) ont été cultivées dans du α-MEM complété par 20 % de FBS, 1 % de MEM-NEAA, 1 % de Na-pyruvate, 1 % de glutamine, 1 % de pénicilline-streptomycine et 100 UI/mL d’IL-2.
- Compter les cellules NK92 avec du bleu de trypan (80 μL du colorant + 20 μL de la suspension cellulaire). Ajustez le nombre de cellules à 400 000 cellules/mL.
- Centrifuger 4 mL de la suspension cellulaire à 150 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Préparer le milieu ADCC en ajoutant 20 μg/mL d’anticorps anti-HER2 (trastuzumab) au milieu JIMT-1.
- Remettez en suspension la pastille de cellule NK dans un milieu ADCC de 5 mL.
- Pipeter 20 000 cellules NK dans 50 μL de milieu ADCC vers les cellules JIMT-1 cibles. Le volume final est de 100 μL et la concentration finale de trastuzumab est de 10 μg/mL.
- Placez la plaque d’analyse dans l’équipement d’analyse à haute teneur à l’aide d’un incubateur intégré réglé à 37 °C.
5. Imagerie
REMARQUE: Les plaques doivent être imagées à deux points temporels, d’abord, immédiatement après l’ajout des cellules effectrices aux cellules cibles et ensuite, 3 heures après l’ajout de cellules NK. Pour l’imagerie, l’analyseur à haute teneur et son logiciel ou des alternatives appropriées peuvent être utilisés (voir Tableau des matériaux).
- Sélectionnez Type de plaque (96-well cell carrier ultra) dans la liste des plaques.
- Sélectionnez l’autofocus à deux pics si le test est effectué en plaques.
- Utilisez l’objectif 10x en mode non confocale.
- Sélectionnez Binning 2 pour doubler le rapport signal/bruit.
- Prenez des images en fond clair à 650-760 nm et des images fluorescentes des cellules JIMT-1 transduites par EGFP à des longueurs d’onde de 488 nm (excitation) et 500-550 nm (émission).
- Sélectionnez le nombre de champs et le nombre de points temporels pour la création d’images.
6. Analyse d’images
REMARQUE: Pour analyser l’efficacité ADCC, les cellules JIMT-1 viables sont comptées. Les cellules cibles tuées par l’ADCC se détachent de la surface et s’éloignent du plan focal du microscope. Par conséquent, la différence entre le nombre de cellules viables au début et à la fin de la réaction ADCC correspond aux cellules cibles éliminées par l’ADCC. Pour montrer comment construire la séquence d’évaluation, un puits ADCC de contrôle est montré dans la vidéo.
- Utilisez le module Rechercher des cellules pour détecter les régions de l’image qui correspondent aux cellules.
REMARQUE: Chaque cellule est détectée comme une région sur l’image avec une intensité de fluorescence supérieure à son environnement. - Sélectionnez des cellules à l’aide de l’algorithme M intégré d’un diamètre minimal de 80 μm.
- Définissez la sensibilité de fractionnement, qui répartit un objet volumineux en objets plus petits, sur 0,5.
- Définissez le seuil commun (le niveau d’intensité de pixels le plus bas) sur 0.
- Exclure la détection de la zone de fond avec une intensité de fluorescence EGFP élevée en deux étapes.
- Tout d’abord, utilisez la fonction Calculer les propriétés d’intensité pour déterminer l’intensité de fluorescence EGFP dans la région Cellules précédemment sélectionnée.
- Définissez les seuils d’intensité minimale et maximale à l’aide de l’option Sélectionner une population .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour démontrer comment le test fonctionne dans la vie réelle, nous avons créé une bibliothèque de tests de 16 composés sélectionnés au hasard dans les étagères du laboratoire (Figure 3). En outre, le DMSO a également été inclus comme témoin négatif, et trois composés inhibiteurs de polymérisation des microtubules (colchicine, vincristine et podophyllotoxine) comme témoins positifs. Ces derniers devaient inhiber l’ADCC en interférant avec la migration des cellules NK vers les cellules cancéreuses et la dégranulation des cellules NK. Tous les composés d’essai et le DMSO ont été placés sur la plaque de la bibliothèque d’essai en quadruplications, et le DMSO a également été ajouté aux première et dernière colonnes de la plaque (Figure 3).
Figure 3 : La bibliothèque de composés utilisée pour tester le test HCS ADCC. (A) La carte des plaques de la bibliothèque de composés est affichée. Chaque composé est présent sur la plaque de bibliothèque en quadruplications. Le DMSO a été ajouté comme témoin négatif à la première et à la dernière colonne de la plaque. Les puits contenant du DMSO et les trois inhibiteurs de l’assemblage des microtubules (colchicine, vincristine et podophyllotoxine) sont mis en évidence en couleur. (B) Les noms, les positions des plaques et les noms abrégés des composés d’essai sont présentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
À l’aide de notre bibliothèque de tests, nous avons exécuté le test et évalué les résultats comme décrit dans le protocole. Étant donné que les cellules JIMT-1 expriment l’EGFP, elles peuvent être facilement distinguées des cellules effectrices qui ne sont pas fluorescentes. Le test est basé sur la détection du changement dans le nombre de cellules cibles adhérentes (viables) en surface. Dans nos conditions d’essai, les cellules NK ont causé environ 50% de la mort cellulaire JIMT-1 (groupe +NK), alors qu’aucun des composés testés n’a provoqué de toxicité en l’absence de cellules NK (groupe -NK) (Figure 4). Les conditions d’essai ont été préalablement optimisées pour atteindre ce niveau moyen de cytotoxicité18, en supposant que cela permettrait d’identifier à la fois les composés activateurs et inhibiteurs de l’ADCC. Les inhibiteurs de l’assemblage des microtubules témoins positifs se sont manifestés comme des « résultats » dans toutes les positions quadrupliquées comme prévu, ce qui indique la grande fiabilité du test (figure 4).
Figure 4 : Test d’une bibliothèque de composés dans le modèle ADCC. (A) Des images des réactions ADCC ont été prises 3 h après la co-incubation des cellules NK et des cellules JIMT-1 en présence de DMSO avec l’objectif 10x de l’imageur HCS. (La barre d’échelle est de 200 μm.) Une partie de l’image est agrandie, montrant les cellules NK effectrices non colorées et les cellules JIMT-1 cibles transduites par EGFP. (Le grossissement de l’image originale est de 4x, la barre d’échelle est de 50 μm.) (B) Le test ADCC a été réalisé avec une lignée cellulaire de carcinome du sein JIMT-1 transduite par EGFP et une lignée cellulaire CD16.176 V.NK-92. Le rapport effecteur/cible appliqué (E:T) était de 2:1. Dans le cas du groupe -NK, les cellules EGFP JIMT-1 ont été incubées sans cellules NK et anticorps anti-HER2, tandis que dans le groupe +NK (ADCC), 10 μg/mL de trastuzumab ont été ajoutés aux co-cultures de cellules JIMT-1 et NK. Le nombre de cellules JIMT-1-EGFP viables a été détecté à l’aide d’un équipement d’analyse à haute teneur immédiatement après l’ajout de cellules NK et après 3 heures d’incubation. La viabilité de la cellule cible dans le groupe +NK était de 50% de celle du groupe -NK. La ligne pointillée rouge indique la valeur seuil, qui représente les échantillons ayant une viabilité de ≥70 % par rapport à la moyenne des témoins témoins DMSO tués (n = 20). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La réaction de l’ADCC a été décrite il y a relativement longtemps. Les événements moléculaires clés du processus ont également été décrits19. Les méthodes de mesure de l’ADCC vont du test de libération de chrome radioactif de référence, des tests de libération d’enzymes cytoplasmiques à plusieurs tests de cytométrie en flux ou de microplaques basés sur la fluorescence20. Cependant, une limitation commune de ces tests est qu’ils ne se prêtent pas aux applications à haut débit. Auparavant, nous avions développé un test HCS basé sur l’image adapté au criblage de banques de composés pour les médicaments modifiant l’ADCC18. Le test précédemment développé, cependant, présentait un inconvénient majeur, c’est-à-dire qu’il nécessitait une étape de lavage car les cellules cibles devaient être pré-colorées avec de la calcéine-acétoxyméthylesther, et l’excès de colorant devait être retiré avant l’ajout des cellules NK et du trastuzumab. La méthode actuelle représente une version avancée du test en ce sens que l’utilisation de cellules JIMT-1 transduites par EGFP permet une différenciation directe entre les cellules effectrices et cibles sans étape de coloration et de lavage. De plus, il faut également être conscient de la caractéristique de notre test qu’il ne peut pas distinguer les cellules mortes des cellules mourantes (pas encore complètement détachées). En outre, il est possible que les composés d’essai augmentent l’adhérence cellulaire et, par conséquent, que des débris cellulaires restent dans le plan focal, ce qui entraîne un résultat faussement positif. De plus, les propriétés fluorescentes des composés d’essai peuvent provoquer des interférences. Par conséquent, bien que les criblages ne soient généralement exécutés qu’une seule fois, il est fortement recommandé de valider les résultats dans d’autres types de tests. Les limites supplémentaires de notre test comprennent l’identification indirecte de la mort cellulaire, c’est-à-dire que la méthode est basée sur la quantification du changement du nombre de cellules viables au lieu de cellules mortes. Cependant, il est important de noter ici qu’une étude antérieure a révélé que la détection basée sur ECIS de cellules viables était supérieure à certaines des méthodes mesurant directement la mort cellulaire13. Par conséquent, cette caractéristique de notre méthode ne représente pas nécessairement un inconvénient. Ce qui peut vraiment limiter l’application de ce test, cependant, c’est qu’il nécessite au moins une connaissance de base en analyse d’image avancée, une compétence qui devient de plus en plus courante aujourd’hui.
Bien que jusqu’à présent, une petite bibliothèque (moins de 1000 composés) a été testée avec la version originale du test18. Nous n’avons pas encore identifié de médicament de rappel ADCC. La raison en est peut-être que les activateurs ADCC peuvent être rares et que des bibliothèques beaucoup plus grandes doivent être examinées pour en identifier une. Théoriquement, il est également possible qu’une fois que la réaction ADCC commence, elle se déroule sans étapes limitatives majeures, de sorte que le processus serait difficile à améliorer davantage par un pharmacon. Une façon possible de contourner ce problème pourrait être de supprimer l’activité ADCC (par exemple, avec des corticostéroïdes) et d’exécuter l’écran à la recherche de composés restaurant l’activité complète de l’ADCC. Néanmoins, nous pensons que l’identification de l’effet inhibiteur de l’ADCC des médicaments connus peut également être importante afin de sensibiliser les cliniciens prescrivant ces médicaments à des patients présentant diverses indications.
En ce qui concerne les détails techniques du test, nous recommandons de mettre en place le test en parallèle avec un test de cytotoxicité alternatif. Dans notre main, ECIS (Electric cell-substrate impedance sensing) s’est avéré être le système le plus fiable pour la quantification de l’efficacité ADCC13. Au début du projet, ECIS a été utilisé pour ajuster les paramètres critiques (temps, rapport effecteur/cellule cible, concentration de trastuzumab), puis transféré le test sur la plateforme HCS18. Nous vous recommandons de faire de même et d’affiner ces paramètres, car ils peuvent changer d’un laboratoire à l’autre. Lors de la mise en place du test, il est important de porter une attention particulière à certaines des étapes critiques de la procédure. La normalisation des conditions de culture (fréquence de fractionnement, alimentation cellulaire, consistance du placage) pour les cellules NK et les cellules cibles peut augmenter la reproductibilité de l’efficacité de l’ADCC. De plus, la suspension des cultures de cellules NK doit être effectuée avec précaution car ces cellules ont tendance à être sensibles au stress mécanique (observation non publiée de Guti et al.). En ce qui concerne la bibliothèque de composés, il est important de s’assurer que tous les puits contiennent des volumes égaux de composés d’essai si des outils à goupille sont utilisés pour le transfert des composés de la plaque de bibliothèque à la plaque d’essai. Cela peut empêcher des quantités variables de solutions composées de coller sur le côté extérieur des broches. En outre, les composés de succès identifiés dans un criblage doivent être validés de préférence dans un essai fiable basé sur un principe différent. Pour cela, nous recommandons la méthodeECIS 11 (voir ci-dessus dans l’introduction).
En conclusion, nous avons mis en place un système de dosage ADCC in vitro basé sur JIMT-1 EGFP adapté au test de bibliothèques de composés avec analyse automatisée d’images. La méthode convenait à l’identification de pharmacons ayant des effets modificateurs connus de l’ADCC. La méthode est potentiellement appropriée pour la détermination de la mort des cellules cancéreuses causée par les conjugués médicamenteux trastuzumab (p. ex. trastuzumab-emtansine21 récemment développé) lorsque le mécanisme de toxicité est plus complexe et n’est causé que partiellement par l’ADCC et partiellement par l’inhibiteur de la tubuline mertansine. À l’avenir, nous prévoyons d’adopter la technologie permettant de quantifier l’ADCC dans les sphéroïdes 3D, qui représentent un reflet plus précis du comportement tumoral que les modèles 2D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
LV a reçu un financement de l’Office national de la recherche, du développement et de l’innovation subventions GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS », GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE et OTKA K132193, K147482. Les cellules CD16.176V.NK-92 ont été obtenues du Dr Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, pour le compte de Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sont protégés par des brevets dans le monde entier et ont été concédés sous licence par Nantkwest, lnc. Les auteurs remercient György Vereb et Árpád Szöőr pour leur aide dans l’utilisation de la lignée cellulaire NK-92 et pour leurs conseils techniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
