Summary
Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.
Abstract
Die Immuntherapie mit antigenspezifischen Antikörpern oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren hat die Therapie von Brustkrebs revolutioniert. Brustkrebszellen, die den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor HER2 exprimieren, können mit dem Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab angegriffen werden. Die Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ist ein wichtiger Mechanismus, der an der Antitumorwirkung von HER2 beteiligt ist. Trastuzumab, das an Krebszellen gebunden ist, kann von den Fc-Rezeptoren von ADCC-Effektorzellen (z. B. natürlichen Killerzellen, Makrophagen und Granulozyten) erkannt werden, wodurch die zytotoxische Aktivität dieser Immunzellen ausgelöst wird, die zum Tod von Krebszellen führt. Wir haben uns zum Ziel gesetzt, einen bildbasierten Assay für die Quantifizierung von ADCC zu entwickeln, um neuartige ADCC-Modulatorverbindungen durch High-Content-Screening zu identifizieren. In dem Assay werden HER2-überexprimierende JIMT-1-Brustkrebszellen mit NK-92-Zellen in Gegenwart von Trastuzumab kokultiviert, und der Zielzelltod wird durch automatisierte Mikroskopie und quantitative Bildanalyse quantifiziert. Zielzellen werden anhand ihrer EGFP-Fluoreszenz von Effektorzellen unterschieden. Wir zeigen, wie Substanzbibliotheken im Assay getestet werden können, um ADCC-Modulatoren zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde eine Compound-Library-Testplatte mit zufällig ausgewählten Feinchemikalien aus dem Laborregal aufgebaut. Drei Mikrotubuli-destabilisierende Verbindungen (Colchicin, Vincristin, Podophyllotoxin), von denen angenommen wird, dass sie die Migration und Degranulation von NK-Zellen stören, wurden ebenfalls in die Testbibliothek aufgenommen. Das Testscreening identifizierte alle drei Positivkontrollverbindungen als Treffer, was die Eignung der Methode zur Identifizierung von ADCC-modifizierenden Medikamenten in einer chemischen Bibliothek belegt. Mit diesem Assay können Substanzbibliotheks-Screenings durchgeführt werden, um ADCC-verstärkende Verbindungen zu identifizieren, die als adjuvante Therapeutika für die Behandlung von Patienten verwendet werden könnten, die Krebsimmuntherapien erhalten. Darüber hinaus können mit der Methode auch unerwünschte ADCC-hemmende Nebenwirkungen von Therapeutika identifiziert werden, die von Krebspatienten für verschiedene Indikationen eingenommen werden.
Introduction
Die Immuntherapie mit Antikrebsantikörpern, Immun-Checkpoint-Inhibitoren oder chimären Antigenrezeptor-exprimierenden T (CAR-T)-Zellen stellt einen wirksamen Ansatz zur Krebsbehandlung dar 1,2,3. Trastuzumab ist ein humanisierter monoklonaler Anti-HER2-Antikörper (humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2), der zur Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs im Frühstadium oder metastasierendem Brustkrebs sowie HER2-positivem metastasierendem Magenkrebs eingesetzt wird 4,5,6. Es wirkt in erster Linie, indem es die proliferationsstimulierende Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors4 hemmt. Es wurde jedoch berichtet, dass Trastuzumab den Tod von Krebszellen effizient auslöst, selbst wenn die Krebszellen nicht mehr auf die HER2-Stimulation ansprechen7. Diese paradoxe Wirkung des Antikörpers ist auf die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) zurückzuführen7. ADCC kann durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Granulozyten und Makrophagen vermittelt werden, die zusammen als Effektorzellen von ADCC 8,9 bekannt sind. Bindet ein Antikörper wie Trastuzumab an Tumorzellen, dann binden diese Effektorzellen über ihre Fc-Rezeptoren an die konstante (Fc) Region des Antikörpers. Der Antikörper überbrückt die Tumorzellen und die Fc-Rezeptor-tragenden Effektorzellen und löst die Freisetzung ihrer zytotoxischen Mediatorenaus 10. Natürliche Killerzellen setzen die zytotoxische Fracht ihrer perforinhaltigen Granula frei, um Poren in der Zielzellmembran und Granzym (das Signalwege für den Zelltod auslöst) in die Immunsynapse zu erzeugen, was zur Apoptose der Krebszellen führt (siehe Abbildung 1).
Abbildung 1: Effektor- und Zielzellinteraktionen im ADCC. Der Fcγ-Rezeptor der Effektor-NK-Zelle auf der Zelloberfläche erkennt die Fc-Region des Anti-HER2-Trastuzumab-Antikörpers, der spezifisch für das auf der Oberfläche der Tumorzelle exprimierte HER2-Molekül ist. So entsteht zwischen den beiden Zellen die sogenannte immunologische Synapse, die die gerichtete Exozytose zytotoxischer Granula der Effektorzelle induziert. Die freigesetzten Perforin- und Granzym-Moleküle führen schließlich zur Apoptose der Zielzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zur Quantifizierung der Zytotoxizität wurden bereits mehrere Assays entwickelt, darunter ADCC. Der Goldstandard ist die Methode zur Freisetzung von radioaktivem Chrom, bei der die Zielzellen mit radioaktivem 51Cr-Isotop markiert werden und ADCC durch Messung der Radioaktivität aus dem Überstand lysierter Zielzellenquantifiziert wird 11. Aufgrund der offensichtlichen Probleme, die sich aus der streng reglementierten Handhabung, Lagerung und Entsorgung von radioaktiven Pharmakonen und Abfällen ergeben, ist diese Methode unter Biowissenschaftlern zunehmend unbeliebt geworden. Darüber hinaus ist es auch nicht für Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet. Die Messung der Aktivität von Enzymen (z. B. Laktat-Dehydrogenase), die aus den abgetöteten Zielzellen freigesetzt werden, kann eine nicht-radioaktive Alternative zum 51-Cr-Assaydarstellen 12. Diese Assays unterscheiden jedoch nicht zwischen Ziel- und Effektorzelltod. Die elektrische Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS) erwies sich als geeignet für die Quantifizierung von ADCC13, aber die ECIS-Geräte sind in den meisten Labors nicht verfügbar, und die Technik ist nicht mit Hochdurchsatzanwendungen/Screening kompatibel. Fluoreszenzmarkierte Zellen stellen eine beliebte Alternative in vielen zellbiologischen Assays dar und werden häufig in der Durchflusszytometrie oder in Plate-Reader-basierten Anwendungen verwendet14,15,16. Diese Assays enthalten jedoch häufig Waschschritte oder sind anderweitig nicht mit Hochdurchsatzanwendungen (z. B. Durchflusszytometrie-basierte Techniken) kompatibel. Einige gängige Zytotoxizitätsassays, die theoretisch für die ADCC-Quantifizierung geeignet sein sollten, sind nicht in der Lage, die ADCC-Effizienz zuverlässig zu bestimmen13. In jüngster Zeit werden mit der Verbreitung der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie bildbasierte High-Content-Assays in verschiedenen Bereichen der Biowissenschaften immer beliebter17. Auf der einen Seite sind Zellbildgebungsgeräte mittlerweile ziemlich allgegenwärtig, auf der anderen Seite lassen sich aus den aufgenommenen Bildern praktisch unendlich viele morphologische Parameter ableiten. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, einen High-Content-Screening-kompatiblen ADCC-Assay zu entwickeln und seine Eignung für das Screening von Substanzbibliotheken zu demonstrieren.
Hier stellen wir einen bildbasierten ADCC-Assay vor und zeigen, wie dieser Assay für das High-Content-Screening (HCS) verwendet werden kann, um ADCC-modulierende Verbindungen zu identifizieren. Das Modell basiert auf JIMT-1 Mammakarzinom-Zielzellen, CD16.176V.NK-92 Effektorzellen und dem humanisierten monoklonalen Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab. Mit dieser Methode ist es möglich, Medikamente zu identifizieren, die die tumorabtötende Wirkung von NK-Zellen verstärken können, oder Einblicke in den Mechanismus der NZ-Zell-vermittelten ADCC zu gewinnen, indem kleine Moleküle identifiziert werden, die die ADCC stören. Wir schlagen vor, dass Biowissenschaftler, die die zellvermittelte Zytotoxizität unter besonderer Berücksichtigung von ADCC quantifizieren wollen, von der Verwendung dieses Assays entweder für die Entdeckungswissenschaft oder die Arzneimittelentwicklung profitieren könnten. Dieser Assay kann eine Alternative sein, wenn ein Labor Zugang zu und Erfahrung in der Fluoreszenzbildgebung und quantitativen Bildanalyse hat.
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Protocol
HINWEIS: Die wichtigsten Schritte des Assay-Workflows sind in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2: Workflow des ADCC-Bildschirms. JIMT-1-EGFP-Zielzellen, die in 96 Well-HCS-Platten ausgesät wurden, werden mit Medikamenten aus der Substanzbibliothek behandelt. Im Gegenzug werden ungefärbte NK-Zellen (Effektorzellen) und Trastuzumab hinzugefügt, und die Platte wird zum Zeitpunkt 0 und nach 3 Stunden Inkubation abgebildet. Die ADCC-Bewertung basiert auf der Veränderung der Anzahl der lebensfähigen (oberflächenadhärenten) Zielzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
1. Beschichtung der HCS-Platte
- Beschichten Sie die 96-Well-High-Content-Screening-Platten (HSC) mit 50 μl/well JIMT-1-Medium (DMEM/F-12-Medium, ergänzt mit 20 % fetalem Kälberserum (FBS), 0,3 U/ml Insulin (100 I.E./ml, Humulin R und 1 % Penicillin-Streptomycin).
- Stellen Sie die Platte für 1 h in einen CO2 - Inkubator.
Anmerkungen: Die Beschichtung ist entscheidend für die Befestigung von JIMT-1-Zellen an der Glasoberfläche der Platte.
2. Aussaat von JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) Zellen
ANMERKUNG: EGFP-exprimierende JIMT-1-Zellen wurden in unserer früheren Arbeit18 erzeugt, und die Zellen wurden in T25-Gewebekulturflaschen in JIMT-1-Medien kultiviert (siehe Zusammensetzung in Schritt 1.1).
- Waschen Sie die Zellen mit 2 ml sterilem PBS.
- Geben Sie 1 ml Trypsin-EDTA in den Kolben und stellen Sie den Kolben wieder für 10 Minuten in einen CO2 -Inkubator.
- Klopfen Sie nach der Inkubation auf den Kolben, um zu prüfen, ob sich JIMT-1-Zellen abgelöst haben.
- Stoppen Sie den Aufschluss mit 2 ml JIMT-1-Medien und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen.
- Zählen Sie die Zellen mit 0,4% Trypanblau (80 μL des Farbstoffs + 20 μL der Zellsuspension) in einer Bürker-Kammer und stellen Sie die Zellzahl auf 133.000 Zellen/ml ein.
- Saugen Sie das Beschichtungsmedium von der 96-Well-Platte ab (Schritt 1.2).
- Pipettieren Sie 75 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung der HCS-Platten (siehe Materialtabelle).
- Lassen Sie die Zellen während einer nächtlichen Inkubation bei 37 °C in einem CO2 - Inkubator anhaften.
3. Vorbehandlung von JIMT-1 EGFP-Zellen mit der Substanzbibliothek
- Aspirieren Sie das Medium aus den JIMT-1-Zellen und geben Sie 50 μl frisches JIMT-1-Medium in die Wells. Übergeben Sie die Platte an das Hochdurchsatz-Screening-Labor.
HINWEIS: Die Verwendung eines Liquid-Handling-Roboters macht das Hinzufügen von Compound-Bibliotheken effizienter und reproduzierbarer. - Übertragen Sie die Testverbindungen mit einem auf ein Volumen von 25 nL kalibrierten Stiftwerkzeug von der Platte der Substanzbibliothek auf die Assay-Platte. Führen Sie dies viermal durch. Vier Transferrunden ergeben ein Endvolumen von 100 nL (und eine Endkonzentration von 20 μM).
- Waschen Sie das Stiftwerkzeug zwischen jedem Schritt zuerst mit 50 % DMSO und dann mit 70 % Ethanol.
- Inkubieren Sie die Platten für 1 h in einem CO2 - Inkubator bei 37 °C.
4. Starten des ADCC-Assays durch Hinzufügen der Effektorzellen
ANMERKUNG: CD16.176V.NK92-Zellen (im Folgenden als NK92-Zellen bezeichnet) wurden in α-MEM kultiviert, das mit 20 % FBS, 1 % MEM-NEAA, 1 % Na-Pyruvat, 1 % Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 100 IU/ml IL-2 ergänzt wurde.
- Zählen Sie NK92-Zellen mit Trypanblau (80 μl des Farbstoffs + 20 μl der Zellsuspension). Stellen Sie die Zellzahl auf 400.000 Zellen/ml ein.
- Zentrifugieren Sie 4 ml der Zellsuspension bei 150 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie das ADCC-Medium vor, indem Sie dem JIMT-1-Medium 20 μg/ml Anti-HER2-Antikörper (Trastuzumab) hinzufügen.
- Resuspendieren Sie das NK-Zellpellet in 5 ml ADCC-Medium.
- Pipettieren Sie 20.000 NK-Zellen in 50 μl ADCC-Medium auf die JIMT-1-Zielzellen. Das Endvolumen beträgt 100 μl und die endgültige Trastuzumab-Konzentration 10 μg/ml.
- Setzen Sie die Testplatte in das High-Content-Analysegerät mit integriertem Inkubator ein, das auf 37 °C eingestellt ist.
5. Bildgebung
HINWEIS: Die Platten sollten zu zwei Zeitpunkten abgebildet werden, erstens unmittelbar nach der Zugabe der Effektorzellen zu den Zielzellen und zweitens 3 h nach der Zugabe von NK-Zellen. Für die Bildgebung können der High-Content-Analyzer und seine Software oder geeignete Alternativen verwendet werden (siehe Materialtabelle).
- Wählen Sie Plattentyp (96-Well-Zellträger ultra) aus der Liste der Platten aus.
- Wählen Sie den Zwei-Peak-Autofokus , wenn der Assay in Platten durchgeführt wird.
- Verwenden Sie ein 10-fach-Objektiv im nicht-konfokalen Modus.
- Wählen Sie Binning 2 , um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verdoppeln.
- Nehmen Sie Hellfeldbilder bei 650-760 nm und Fluoreszenzbilder der EGFP-transduzierten JIMT-1-Zellen bei 488 nm (Anregung) und 500-550 nm (Emission) Wellenlängen auf.
- Wählen Sie die Anzahl der Felder und die Anzahl der Zeitpunkte für das Imaging aus.
6. Bildanalyse
HINWEIS: Um die ADCC-Effizienz zu analysieren, werden die lebensfähigen JIMT-1-Zellen gezählt. Zielzellen, die durch ADCC abgetötet werden, lösen sich von der Oberfläche und bewegen sich von der Fokusebene des Mikroskops weg. Daher entspricht die Differenz zwischen der Anzahl der lebensfähigen Zellen zu Beginn und am Ende der ADCC-Reaktion den Zielzellen, die durch ADCC eliminiert werden. Um zu zeigen, wie die Auswertesequenz aufgebaut wird, wird im Video ein Kontroll-ADCC-Bohrloch gezeigt.
- Verwenden Sie das Modul Zellen suchen , um Bereiche im Bild zu erkennen, die Zellen entsprechen.
HINWEIS: Jede Zelle wird als ein Bereich auf dem Bild mit einer höheren Fluoreszenzintensität als ihre Umgebung erkannt. - Wählen Sie Zellen mit dem integrierten M-Algorithmus mit einem Durchmesser von mindestens 80 μm aus.
- Legen Sie die Aufteilungsempfindlichkeit, mit der ein großes Objekt in kleinere Objekte aufgeteilt wird, auf 0,5 fest.
- Legen Sie den allgemeinen Schwellenwert (die niedrigste Stufe der Pixelintensität) auf 0 fest.
- Schließen Sie die Detektion von Hintergrundflächen mit hoher EGFP-Fluoreszenzintensität in zwei Schritten aus.
- Verwenden Sie zunächst die Funktion Intensitätseigenschaften berechnen , um die EGFP-Fluoreszenzintensität im zuvor ausgewählten Zellbereich zu bestimmen.
- Legen Sie den minimalen und maximalen Intensitätsschwellenwert mit der Option Population auswählen fest.
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Representative Results
Um zu demonstrieren, wie der Assay in der Praxis funktioniert, haben wir eine Testbibliothek mit 16 Verbindungen erstellt, die nach dem Zufallsprinzip aus den Laborregalen ausgewählt wurden (Abbildung 3). Darüber hinaus wurde DMSO als Negativkontrolle und drei Mikrotubuli-Polymerisationshemmerverbindungen (Colchicin, Vincristin und Podophyllotoxin) als Positivkontrollen eingeschlossen. Letztere sollten ADCC hemmen, indem sie die Migration von NK-Zellen zu den Krebszellen und die Degranulation von NZ-Zellen stören. Alle Testverbindungen und DMSO wurden vierfach auf die Testbibliotheksplatte gelegt, und DMSO wurde auch in die erste und letzte Spalte der Platte eingefügt (Abbildung 3).
Abbildung 3: Die Substanzbibliothek, die zum Testen des HCS-ADCC-Assays verwendet wird . (A) Die Plattenkarte der Compound-Bibliothek ist dargestellt. Jede Verbindung ist auf der Bibliotheksplatte in vierfacher Form vorhanden. DMSO wurde als Negativkontrolle in die erste und letzte Spalte der Platte eingefügt. Wells, die DMSO und die drei Mikrotubuli-Assemblierungsinhibitoren (Colchicin, Vincristin und Podophyllotoxin) enthalten, werden farblich hervorgehoben. (B) Namen, Plattenpositionen und abgekürzte Namen von Prüfverbindungen werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Mit unserer Testbibliothek haben wir den Assay durchgeführt und die Ergebnisse wie im Protokoll beschrieben ausgewertet. Da JIMT-1-Zellen EGFP exprimieren, können sie leicht von den Effektorzellen unterschieden werden, die nicht fluoreszierend sind. Der Assay basiert auf dem Nachweis der Veränderung der Anzahl der oberflächenadhärenten (lebensfähigen) Zielzellen. Unter unseren Assay-Bedingungen verursachten NK-Zellen etwa 50 % des JIMT-1-Zelltods (+NK-Gruppe), während keine der Testverbindungen in Abwesenheit von NZ-Zellen (-NK-Gruppe) Toxizität verursachte (Abbildung 4). Die Assay-Bedingungen wurden zuvor optimiert, um dieses mittlere Maß an Zytotoxizität zu erreichen18, in der Annahme, dass dies die Identifizierung sowohl von ADCC-Aktivator- als auch von Inhibitorverbindungen ermöglichen würde. Die Positivkontroll-Mikrotubuli-Assemblierungsinhibitoren zeigten sich erwartungsgemäß als "Treffer" in allen vierfachen Positionen, was auf die hohe Zuverlässigkeit des Assays hinweist (Abbildung 4).
Abbildung 4: Testen einer Verbindungsbibliothek im ADCC-Modell . (A) Bilder von ADCC-Reaktionen wurden 3 h nach der Co-Inkubation von NK-Zellen und JIMT-1-Zellen in Gegenwart von DMSO mit dem 10x-Objektiv des HCS-Imagers aufgenommen. (Der Maßstabsbalken beträgt 200 μm.) Ein Teil des Bildes ist vergrößert und zeigt die ungefärbten Effektor-NK-Zellen und die EGFP-transduzierten JIMT-1-Zielzellen. (Die Vergrößerung des Originalbildes beträgt 4-fach, der Maßstabsbalken 50 μm.) (B) Der ADCC-Assay wurde mit EGFP-transduzierten JIMT-1 Mammakarzinomzelllinien und CD16.176 V.NK-92 Zelllinien durchgeführt. Das Verhältnis von Effektor zu Ziel (E:T) betrug 2:1. Im Falle der -NK-Gruppe wurden die JIMT-1 EGFP-Zellen ohne NK-Zellen und Anti-HER2-Antikörper inkubiert, während in der +NK-Gruppe (ADCC) 10 μg/ml Trastuzumab zu den JIMT-1- und NK-Zell-Cokulturen hinzugefügt wurden. Die Anzahl der lebensfähigen JIMT-1-EGFP-Zellen wurde mit Hilfe von High-Content-Analysegeräten unmittelbar nach der Zugabe von NK-Zellen und nach 3 h Inkubation bestimmt. Die Viabilität der Zielzellen in der +NK-Gruppe betrug 50% der in der -NK-Gruppe. Die rote gestrichelte Linie zeigt den Schwellenwert, der Proben mit einer Viabilität von ≥70 % im Vergleich zum Durchschnitt der DMSO-Kontrolltötung (n = 20) darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die ADCC-Reaktion wurde schon vor relativ langer Zeit beschrieben. Wichtige molekulare Ereignisse des Prozesses wurden ebenfalls beschrieben19. Die Methoden zur Messung der ADCC reichen vom Goldstandard für den Assay zur Freisetzung von radioaktivem Chrom über zytoplasmatische Enzymfreisetzungsassays bis hin zu verschiedenen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie- oder Mikrotiterplatten-Assays20. Eine häufige Einschränkung dieser Assays besteht jedoch darin, dass sie nicht für Hochdurchsatzanwendungen geeignet sind. Zuvor haben wir einen bildbasierten HCS-Assay entwickelt, der für das Screening von Substanzbibliotheken auf ADCC-modifizierende Medikamente geeignet ist18. Der zuvor entwickelte Assay hatte jedoch einen großen Nachteil, d.h. er erforderte einen Waschschritt, da die Zielzellen mit Calcein-Acetoxymethylesther vorgefärbt und der überschüssige Farbstoff vor der Zugabe der NK-Zellen und Trastuzumab entfernt werden musste. Die aktuelle Methode stellt eine Weiterentwicklung des Assays dar, da die Verwendung von EGFP-transduzierten JIMT-1-Zellen eine einfache Unterscheidung zwischen Effektor- und Zielzellen ohne Färbe- und Waschschritt ermöglicht. Darüber hinaus muss man sich auch der Besonderheit unseres Assays bewusst sein, dass er nicht zwischen toten und sterbenden Zellen (noch nicht vollständig abgelöst) unterscheiden kann. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Testverbindungen die Zelladhäsion erhöhen und infolgedessen Zelltrümmer in der Fokusebene verbleiben, was zu einem falsch positiven Ergebnis führt. Darüber hinaus können die Fluoreszenzeigenschaften von Testverbindungen zu Interferenzen führen. Obwohl Screens in der Regel einmal durchgeführt werden, wird daher dringend empfohlen, Treffer auch in anderen Arten von Assays zu validieren. Weitere Einschränkungen unseres Assays sind die indirekte Identifizierung des Zelltods, d.h. die Methode basiert auf der Quantifizierung der Veränderung der Anzahl lebensfähiger Zellen anstelle von toten Zellen. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass eine frühere Studie ergab, dass die ECIS-basierte Detektion lebensfähiger Zellen einigen der Methoden zur direkten Messung des Zelltods überlegen war13. Daher stellt diese Eigenschaft unserer Methode nicht unbedingt einen Nachteil dar. Was die Anwendung dieses Assays jedoch wirklich einschränken kann, ist, dass er zumindest Grundkenntnisse in der fortgeschrittenen Bildanalyse erfordert, eine Fähigkeit, die heute immer häufiger eingesetzt wird.
Bisher wurde jedoch eine kleine Bibliothek (weniger als 1000 Verbindungen) mit der ursprünglichen Version des Assays18 getestet. Wir haben noch kein ADCC-Booster-Medikament identifiziert. Der Grund dafür könnte sein, dass ADCC-Aktivatoren selten sind und viel größere Bibliotheken untersucht werden müssen, um einen zu identifizieren. Theoretisch ist es auch möglich, dass die einmal eingesetzte ADCC-Reaktion ohne größere einschränkende Schritte abläuft, so dass der Prozess durch ein Pharmakon nur schwer weiter verbessert werden kann. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu umgehen, könnte darin bestehen, die ADCC-Aktivität zu unterdrücken (z. B. mit Kortikosteroiden) und das Screening nach Verbindungen durchzuführen, die die volle ADCC-Aktivität wiederherstellen. Nichtsdestotrotz sind wir der Meinung, dass die Identifizierung der ADCC-hemmenden Wirkung bekannter Arzneimittel auch wichtig sein kann, um das Bewusstsein von Ärzten zu schärfen, die diese Medikamente Patienten mit verschiedenen Indikationen verschreiben.
Was die technischen Details des Tests betrifft, so empfehlen wir, den Test parallel zu einem alternativen Zytotoxizitätstest einzurichten. In unserer Hand erwies sich ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) als das zuverlässigste System zur Quantifizierung der ADCC-Effizienz13. Zu Beginn des Projekts wurde ECIS verwendet, um kritische Parameter (Zeit, Effektor-zu-Zielzell-Verhältnis, Trastuzumab-Konzentration) anzupassen und dann den Assay auf die HCS-Plattform18 zu übertragen. Wir empfehlen, dasselbe zu tun und diese Parameter fein abzustimmen, da sie sich von Labor zu Labor ändern können. Bei der Einrichtung des Assays ist es wichtig, einigen der kritischen Schritte des Verfahrens besondere Aufmerksamkeit zu schenken. Die Standardisierung der Kulturbedingungen (Spaltungshäufigkeit, Zellzufuhr, Konsistenz der Beschichtung) sowohl für NK-Zellen als auch für Zielzellen kann die Reproduzierbarkeit der ADCC-Effizienz erhöhen. Darüber hinaus muss die Suspendierung von NK-Zellkulturen mit Vorsicht durchgeführt werden, da diese Zellen dazu neigen, empfindlich auf mechanischen Stress zu reagieren (Guti et al. unveröffentlichte Beobachtung). Was die Substanzbibliothek betrifft, so ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle Wells gleiche Mengen an Testverbindungen enthalten, wenn Stiftwerkzeuge für den Transfer von Verbindungen von der Bibliotheksplatte auf die Assay-Platte verwendet werden. Dadurch kann verhindert werden, dass unterschiedliche Mengen an zusammengesetzten Lösungen an der Außenseite der Stifte haften bleiben. Darüber hinaus sollten Hit-Verbindungen, die in einem Screening identifiziert wurden, vorzugsweise in einem zuverlässigen Assay validiert werden, der auf einem anderen Prinzip basiert. Hierfür empfehlen wir die ECIS-basierte Methode11 (siehe oben in der Einleitung).
Zusammenfassend haben wir ein JIMT-1 EGFP-basiertes In-vitro-ADCC-Assay-System aufgebaut, das sich zum Testen von Substanzbibliotheken mit automatisierter Bildanalyse eignet. Die Methode eignete sich zur Identifizierung von Pharmaconen mit bekannter ADCC-modifizierender Wirkung. Die Methode eignet sich potenziell für die Bestimmung des Krebszelltods, der durch Trastuzumab-Wirkstoffkonjugate (z. B. kürzlich entwickeltes Trastuzumab-Emtansin21) verursacht wird, bei denen der Mechanismus der Toxizität komplexer ist und nur teilweise durch ADCC und teilweise durch den Tubulin-Inhibitor Mertansin verursacht wird. Für die Zukunft planen wir, die Technologie zur Quantifizierung von ADCC in 3D-Sphäroiden einzusetzen, die das Tumorverhalten genauer widerspiegeln als 2D-Modelle.
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Disclosures
Die Autoren berichten über keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
LV erhielt Mittel aus den Zuschüssen des Nationalen Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsamtes GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE und OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92-Zellen wurden von Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, im Auftrag von Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sind weltweit durch Patente geschützt und wurden von Nantkwest, lnc, lizenziert. Die Autoren danken György Vereb und Árpád Szöőr für ihre Hilfe bei der Verwendung der NK-92-Zelllinie und für die technische Beratung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
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