Summary
Este protocolo presenta una técnica automatizada de alto rendimiento basada en imágenes para identificar compuestos que modulan la destrucción de células de cáncer de mama mediada por células asesinas naturales en presencia de un anticuerpo terapéutico anti-HER-2.
Abstract
La inmunoterapia con anticuerpos antígenos específicos o inhibidores de puntos de control inmunitario ha revolucionado la terapia del cáncer de mama. Las células de cáncer de mama que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico HER2 pueden ser atacadas por el anticuerpo anti-HER-2 trastuzumab. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo importante implicado en la acción antitumoral de HER-2. El trastuzumab unido a las células cancerosas puede ser reconocido por los receptores Fc de las células efectoras ADCC (por ejemplo, células asesinas naturales [NK], macrófagos y granulocitos), lo que desencadena la actividad citotóxica de estas células inmunitarias que conduce a la muerte de las células cancerosas. Nos propusimos desarrollar un ensayo basado en imágenes para la cuantificación de ADCC para identificar nuevos compuestos moduladores de ADCC mediante cribado de alto contenido. En el ensayo, las células de cáncer de mama JIMT-1 que sobreexpresan HER2 se cultivan conjuntamente con células NK-92 en presencia de trastuzumab, y la muerte de las células diana se cuantifica mediante microscopía automatizada y análisis cuantitativo de imágenes. Las células diana se distinguen de las células efectoras en función de su fluorescencia EGFP. Mostramos cómo se pueden probar las bibliotecas de compuestos en el ensayo para identificar fármacos moduladores de ADCC. Para este propósito, se instaló una placa de prueba de biblioteca compuesta utilizando productos químicos finos seleccionados al azar del estante del laboratorio. También se incluyeron en la biblioteca de pruebas tres compuestos desestabilizadores de microtúbulos (colchicina, vincristina, podofilotoxina) que se esperaba que interfirieran con la migración y desgranulación de las células NK. La pantalla de prueba identificó los tres compuestos de control positivo como éxitos que demuestran la idoneidad del método para identificar fármacos modificadores de ADCC en una biblioteca química. Con este ensayo, se pueden realizar exámenes de biblioteca de compuestos para identificar compuestos que mejoran el ADCC que podrían usarse como agentes terapéuticos adyuvantes para el tratamiento de pacientes que reciben inmunoterapias contra el cáncer. Además, el método también se puede utilizar para identificar cualquier efecto secundario inhibidor de ADCC indeseable de los fármacos terapéuticos tomados por pacientes con cáncer para diferentes indicaciones.
Introduction
La inmunoterapia con anticuerpos contra el cáncer, inhibidores de puntos de control inmunitario o células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR-T) representa un enfoque poderoso para el tratamiento del cáncer 1,2,3. Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER-2 (receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano) utilizado para tratar el cáncer de mama en estadio temprano o metastásico HER-2 positivo, así como el cáncer gástrico metastásico HER-2 positivo 4,5,6. Actúa principalmente inhibiendo el efecto estimulante de la proliferación del factor de crecimiento epidérmico4. Sin embargo, se ha informado que trastuzumab desencadena eficientemente la muerte de las células cancerosas, incluso si las células cancerosas han perdido su capacidad de respuesta a la estimulación de HER-27. Este efecto paradójico del anticuerpo se debe a la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC)7. El ADCC puede ser mediado por células asesinas naturales (NK), granulocitos y macrófagos conocidos colectivamente como las células efectoras de ADCC 8,9. Si un anticuerpo, como trastuzumab, se une a las células tumorales, entonces estas células efectoras usan sus receptores Fc para unirse a la región constante (Fc) del anticuerpo. El anticuerpo une las células tumorales y las células efectoras portadoras del receptor Fc, desencadenando la liberación de sus mediadores citotóxicos10. Las células asesinas naturales liberan la carga citotóxica de sus gránulos que contienen perforina para generar poros en la membrana celular diana y granzima (desencadenando vías de señalización de muerte celular) en la sinapsis inmune que conduce a la apoptosis de las células cancerosas (ver Figura 1).
Figura 1: Interacciones entre células efectoras y diana en ADCC. El receptor Fcγ de la superficie celular de la célula NK efectora reconoce la región Fc del anticuerpo anti-HER2 trastuzumab específico para la molécula HER2 expresada en la superficie de la célula tumoral. Así, se establece la llamada sinapsis inmunológica entre las dos células, induciendo la exocitosis dirigida de gránulos citotóxicos de la célula efectora. Las moléculas de perforina y granzima liberadas eventualmente resultan en la apoptosis de la célula diana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se han desarrollado previamente varios ensayos para cuantificar la citotoxicidad, incluido el ADCC. El estándar de oro es el método de liberación de cromo radiactivo, donde las células diana se marcan con isótopo radiactivo 51Cr, y el ADCC se cuantifica midiendo la radiactividad del sobrenadante de las células diana lisadas11. Debido a los problemas obvios debido al manejo, almacenamiento y eliminación estrictamente regulados de farmacones y desechos radiactivos, este método se ha vuelto cada vez más impopular entre los científicos de la vida. Además, tampoco es susceptible de aplicaciones de alto rendimiento. La medición de la actividad de las enzimas (por ejemplo, lactato-deshidrogenasa) liberadas de las células diana muertas puede proporcionar una alternativa no radiactiva al ensayo 51Cr12. Estos ensayos, sin embargo, no distinguen entre muertes de células diana y efectoras. La detección de impedancia de sustrato celular eléctrico (ECIS) demostró ser adecuada para la cuantificación de ADCC13, pero el equipo ECIS no está disponible en la mayoría de los laboratorios y la técnica no es compatible con aplicaciones / cribado de alto rendimiento. Las células marcadas con fluorescencia representan una alternativa popular en muchos ensayos de biología celular y se utilizan a menudo en citometría de flujo o aplicaciones basadas en lectores de placas14,15,16. Sin embargo, estos ensayos a menudo contienen pasos de lavado o son incompatibles con aplicaciones de alto rendimiento (por ejemplo, técnicas basadas en citometría de flujo). Algunos ensayos populares de citotoxicidad, que en teoría deberían ser adecuados para la cuantificación del ADCC, no logran determinar de manera confiable la eficiencia del ADCC13. Recientemente, con la difusión de la microscopía confocal fluorescente, los ensayos basados en imágenes y de alto contenido se están volviendo cada vez más populares en diversas áreas de las ciencias de la vida17. Por un lado, los equipos de imágenes celulares son ahora bastante ubicuos, mientras que, por otro lado, se pueden recopilar parámetros morfológicos prácticamente infinitos a partir de las imágenes adquiridas. Por lo tanto, nos propusimos desarrollar un ensayo ADCC compatible con el cribado de alto contenido y demostrar su idoneidad para el cribado de bibliotecas compuestas.
Aquí, presentamos un ensayo ADCC basado en imágenes y demostramos cómo se puede usar este ensayo para la detección de alto contenido (HCS) para identificar compuestos moduladores de ADCC. El modelo se basa en células diana de carcinoma de mama JIMT-1, células efectoras CD16.176V.NK-92 y el anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER2 trastuzumab. Con este método, es posible identificar fármacos que pueden mejorar la acción destructora de tumores de las células NK o obtener información sobre el mecanismo del ADCC mediado por células NK mediante la identificación de moléculas pequeñas que interfieren con el ADCC. Sugerimos que los científicos de la vida que buscan cuantificar la citotoxicidad mediada por células con especial atención al ADCC pueden beneficiarse del uso de este ensayo, ya sea para la ciencia del descubrimiento o el desarrollo de fármacos. Este ensayo puede ser una alternativa si un laboratorio tiene acceso y cierta experiencia en imágenes fluorescentes y análisis cuantitativo de imágenes.
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Protocol
NOTA: Los pasos clave del flujo de trabajo del ensayo se presentan en la Figura 2.
Figura 2: Flujo de trabajo de la pantalla ADCC. Las células diana JIMT-1-EGFP sembradas en placas HCS de 96 pocillos se tratan con fármacos de la biblioteca de compuestos. A su vez, se agregan células NK (efectoras) no teñidas y trastuzumab, y se obtiene una imagen de la placa en un punto de tiempo 0 y después de 3 h de incubación. La evaluación ADCC se basa en el cambio en el número de células diana viables (adherentes a la superficie). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Recubrimiento de la placa HCS
- Cubra las placas de cribado de alto contenido (HSC) de 96 pocillos con medio JIMT-1 de 50 μL/pocillo (medio DMEM/F-12 suplementado con suero bovino fetal al 20% (FBS), insulina 0.3 U/ml (100 UI/ml, Humulin R y 1% de penicilina-estreptomicina).
- Coloque la placa en una incubadora deCO2 durante 1 h.
NOTA: El recubrimiento es crucial para unir las celdas JIMT-1 a la superficie de vidrio de la placa.
2. Siembra de células de proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) JIMT-1
NOTA: Las células JIMT-1 que expresan EGFP se generaron en nuestro trabajo anterior18, y las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos T25 en medios JIMT-1 (ver composición en el paso 1.1).
- Lave las celdas con 2 ml de PBS estéril.
- Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al matraz y volver a colocar el matraz en una incubadora deCO2 durante 10 min.
- Después de la incubación, golpee el matraz para comprobar si las células JIMT-1 están desprendidas.
- Detenga la digestión con 2 ml de medios JIMT-1 y recoja la suspensión celular en un tubo de 15 ml.
- Contar las células con azul de tripano al 0,4% (80 μL del colorante + 20 μL de la suspensión celular) en una cámara de Bürker y ajustar el número de células a 133.000 células/ml.
- Aspirar el medio de recubrimiento de la placa de 96 pocillos (paso 1.2).
- Pipetear 75 μL de la suspensión celular a cada pocillo de las placas HCS (ver Tabla de materiales).
- Dejar que las células se adhieran durante una incubación nocturna a 37 °C en una incubadora deCO2 .
3. Pretratamiento de células JIMT-1 EGFP con la biblioteca de compuestos
- Aspirar el medio de las células JIMT-1 y añadir 50 μL/pocillo de medio JIMT-1 fresco a los pocillos. Transfiera la placa al laboratorio de cribado de alto rendimiento.
NOTA: El uso de un robot de manejo de líquidos hace que la adición de bibliotecas de compuestos sea más eficiente y reproducible. - Transfiera los compuestos de prueba de la placa de biblioteca de compuestos a la placa de ensayo con una herramienta de pasador calibrada a un volumen de 25 nL. Realice esto cuatro veces. Cuatro rondas de transferencia dan un volumen final de 100 nL (y una concentración final de 20 μM).
- Entre cada paso, lave la herramienta del pasador, primero con 50% de DMSO y luego con 70% de etanol.
- Incubar las placas durante 1 h en una incubadora deCO2 a 37 °C.
4. Inicio del ensayo ADCC añadiendo las células efectoras
NOTA: Las células CD16.176V.NK92 (en adelante, células NK92) se cultivaron en α-MEM suplementadas con 20% de FBS, 1% de MEM-NEAA, 1% de Na-piruvato, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 100 UI/ml de IL-2.
- Contar células NK92 con azul de tripano (80 μL del colorante + 20 μL de la suspensión celular). Ajuste el número de células a 400.000 células/ml.
- Centrifugar 4 ml de la suspensión celular a 150 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Prepare el medio ADCC agregando 20 μg/ml de anticuerpo anti-HER2 (trastuzumab) al medio JIMT-1.
- Resuspender el pellet de células NK en medio ADCC de 5 ml.
- Pipetear 20.000 células NK en 50 μL de medio ADCC a las células JIMT-1 objetivo. El volumen final es de 100 μL, y la concentración final de trastuzumab es de 10 μg/ml.
- Coloque la placa de ensayo en el equipo de análisis de alto contenido con una incubadora incorporada a 37 °C.
5. Imágenes
NOTA: Las placas deben ser fotografiadas en dos puntos de tiempo, primero, inmediatamente después de la adición de las células efectoras a las células diana y segundo, a las 3 h después de la adición de células NK. Para la obtención de imágenes, se puede utilizar el analizador de alto contenido y su software o alternativas adecuadas (consulte la Tabla de materiales).
- Seleccione Tipo de placa (portador de celda ultra de 96 pocillos) de la lista de placas.
- Seleccione el enfoque automático Dos picos si el ensayo se realiza en placas.
- Utilice un objetivo 10x en modo no confocal.
- Seleccione Binning 2 para duplicar la relación señal/ruido.
- Tome imágenes de campo claro a 650-760 nm e imágenes fluorescentes de las células JIMT-1 transducidas por EGFP a longitudes de onda de 488 nm (excitación) y 500-550 nm (emisión).
- Seleccione el número de campos y el número de puntos de tiempo para la creación de imágenes.
6. Análisis de imágenes
NOTA: Para analizar la eficiencia de ADCC, se cuentan las células JIMT-1 viables. Las células diana eliminadas por ADCC se desprenden de la superficie y se alejan del plano focal del microscopio. Por lo tanto, la diferencia entre el número de células viables al principio y al final de la reacción ADCC corresponde a las células diana eliminadas por ADCC. Para mostrar cómo construir la secuencia de evaluación, se muestra un pozo ADCC de control en el video.
- Utilice el módulo Buscar celdas para detectar regiones en la imagen que corresponden a celdas.
NOTA: Cada celda se detecta como una región en la imagen con una intensidad de fluorescencia más alta que su entorno. - Seleccione celdas utilizando el algoritmo M incorporado con un mínimo de 80 μm de diámetro.
- Establezca Sensibilidad de división, que divide un objeto grande en objetos más pequeños, en 0,5.
- Establezca el umbral común (el nivel más bajo de intensidad de píxeles) en 0.
- Excluir la detección de área de fondo con alta intensidad de fluorescencia EGFP en dos pasos.
- En primer lugar, utilice la función Calcular propiedades de intensidad para determinar la intensidad de fluorescencia EGFP en la región de celdas seleccionada anteriormente.
- Establezca el umbral de intensidad mínima y máxima mediante la opción Seleccionar población .
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Representative Results
Para demostrar cómo funciona el ensayo en la vida real, creamos una biblioteca de pruebas de 16 compuestos seleccionados al azar de los estantes del laboratorio (Figura 3). Además, el DMSO también se incluyó como control negativo y tres compuestos inhibidores de la polimerización de microtúbulos (colchicina, vincristina y podofilotoxina) como controles positivos. Se esperaba que estos últimos inhibieran el ADCC al interferir con la migración de células NK a las células cancerosas y la desgranulación de células NK. Todos los compuestos de prueba y DMSO se colocaron en la placa de la biblioteca de prueba en cuadruplicados, y DMSO también se agregó a la primera y última columna de la placa (Figura 3).
Figura 3: La biblioteca de compuestos utilizada para probar el ensayo HCS ADCC . (A) Se muestra el mapa de placas de la biblioteca de compuestos. Cada compuesto está presente en la placa de biblioteca en cuadruplicados. DMSO se agregó como control negativo a la primera y última columna de la placa. Los pocillos que contienen DMSO y los tres inhibidores del ensamblaje de microtúbulos (colchicina, vincristina y podofilotoxina) se resaltan en color. (B) Se presentan los nombres, las posiciones de las placas y los nombres abreviados de los compuestos de prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Usando nuestra biblioteca de pruebas, ejecutamos el ensayo y evaluamos los resultados como se describe en el protocolo. Dado que las células JIMT-1 expresan EGFP, se pueden distinguir fácilmente de las células efectoras que no son fluorescentes. El ensayo se basa en la detección del cambio en el número de células diana adherentes a la superficie (viables). En nuestras condiciones de ensayo, las células NK causaron aproximadamente un 50% de muerte celular JIMT-1 (grupo +NK), mientras que ninguno de los compuestos de prueba causó toxicidad en ausencia de células NK (grupo -NK) (Figura 4). Las condiciones del ensayo fueron previamente optimizadas para alcanzar este nivel medio de citotoxicidad18, asumiendo que esto permitiría la identificación tanto del activador del ADCC como de los compuestos inhibidores. Los inhibidores del ensamblaje de microtúbulos de control positivo aparecieron como "hits" en todas las posiciones cuadruplicadas como se esperaba, lo que indica la alta confiabilidad del ensayo (Figura 4).
Figura 4: Prueba de una biblioteca de compuestos en el modelo ADCC . (A) Las imágenes de las reacciones ADCC se tomaron 3 h después de la co-incubación de células NK y células JIMT-1 en presencia de DMSO con el objetivo 10x del generador de imágenes HCS. (La barra de escala es de 200 μm.) Una parte de la imagen se magnifica, mostrando las células NK efectoras no teñidas y las células JIMT-1 objetivo transducidas por EGFP. (El aumento de la imagen original es 4x, la barra de escala es de 50 μm). (B) El ensayo ADCC se realizó con la línea celular de carcinoma de mama JIMT-1 transducida por EGFP y la línea celular CD16.176 V.NK-92. La relación efector/objetivo (E:T) aplicada fue de 2:1. En el caso del grupo -NK, las células JIMT-1 EGFP se incubaron sin células NK y anticuerpos anti-HER2, mientras que en el grupo +NK (ADCC) se añadieron 10 μg/ml de trastuzumab a los cocultivos de células JIMT-1 y NK. El número de células JIMT-1-EGFP viables se detectó utilizando equipos de análisis de alto contenido inmediatamente después de la adición de células NK y después de 3 h de incubación. La viabilidad de las células diana en el grupo +NK fue del 50% de la del grupo -NK. La línea discontinua roja muestra el valor umbral, que representa muestras con ≥70% de viabilidad en comparación con el promedio de asesinatos de control DMSO (n = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La reacción del ADCC se ha descrito hace relativamente mucho tiempo. También se han descrito eventos moleculares clave del proceso19. Los métodos para medir el ADCC van desde el ensayo de liberación de cromo radiactivo estándar de oro, los ensayos de liberación de enzimas citoplasmáticas hasta varios ensayos de citometría de flujo o microplacas basados en fluorescencia20. Sin embargo, una limitación común de estos ensayos es que no son susceptibles de aplicaciones de alto rendimiento. Anteriormente, desarrollamos un ensayo HCS basado en imágenes adecuado para la detección de bibliotecas de compuestos para fármacos modificadores de ADCC18. Sin embargo, el ensayo desarrollado anteriormente tenía un gran inconveniente, es decir, requería un paso de lavado porque las células diana tenían que teñirse previamente con calceína-acetoxymetilester, y el exceso de tinte tenía que eliminarse antes de la adición de las células NK y trastuzumab. El método actual representa una versión avanzada del ensayo en el sentido de que el uso de células JIMT-1 transducidas por EGFP permite una diferenciación directa entre células efectoras y diana sin un paso de tinción y lavado. Además, también hay que ser conscientes de la característica de nuestro ensayo de que no puede distinguir entre células muertas y moribundas (aún no completamente separadas). Además, es posible que los compuestos de ensayo aumenten la adhesión celular y, como resultado, los restos celulares permanezcan en el plano focal, lo que da lugar a un resultado falso positivo. Además, las propiedades fluorescentes de los compuestos de ensayo pueden causar interferencia. Por lo tanto, aunque las pantallas generalmente se ejecutan una vez, también se recomienda validar los resultados en otros tipos de ensayos. Las limitaciones adicionales de nuestro ensayo incluyen la identificación indirecta de la muerte celular , es decir, el método se basa en la cuantificación del cambio en el número de células viables en lugar de células muertas. Sin embargo, es importante señalar aquí que un estudio previo encontró que la detección basada en ECIS de células viables fue superior a algunos de los métodos que miden directamente la muerte celular13. Por lo tanto, esta característica de nuestro método no representa necesariamente un inconveniente. Sin embargo, lo que realmente puede limitar la aplicación de este ensayo es que requiere al menos un conocimiento básico en análisis avanzado de imágenes, una habilidad que se está volviendo cada vez más común hoy en día.
Aunque hasta ahora, una pequeña biblioteca (menos de 1000 compuestos) ha sido probada con la versión original del ensayo18. Todavía no hemos identificado un fármaco de refuerzo ADCC. La razón de esto podría ser que los activadores ADCC pueden ser raros, y las bibliotecas mucho más grandes necesitan ser examinadas para identificar uno. Teóricamente, también es posible que una vez que comienza la reacción ADCC, proceda sin pasos limitantes importantes, de modo que el proceso sea difícil de mejorar aún más con un farmaco. Una posible forma de evitar este problema podría ser suprimir la actividad de ADCC (por ejemplo, con corticosteroides) y ejecutar la pantalla en busca de compuestos que restauren la actividad completa de ADCC. Sin embargo, creemos que la identificación del efecto inhibidor del ADCC de los fármacos conocidos también puede ser importante para crear conciencia sobre los médicos que prescriben estos fármacos a pacientes con diversas indicaciones.
En cuanto a los detalles técnicos del ensayo, recomendamos configurar el ensayo en paralelo con una prueba de citotoxicidad alternativa. En nuestra mano, ECIS (electric cell-substrate impedance sensing) demostró ser el sistema más confiable para la cuantificación de la eficiencia del ADCC13. Al inicio del proyecto, ECIS se utilizó para ajustar parámetros críticos (tiempo, relación efector/célula objetivo, concentración de trastuzumab) y luego transfirió el ensayo a la plataforma HCS18. Recomendamos hacer lo mismo y ajustar estos parámetros, ya que pueden cambiar de un laboratorio a otro. Al configurar el ensayo, es importante prestar especial atención a algunos de los pasos críticos del procedimiento. La estandarización de las condiciones de cultivo (frecuencia de división, alimentación celular, consistencia del recubrimiento) tanto para las células NK como para las células diana puede aumentar la reproducibilidad de la eficiencia del ADCC. Además, la suspensión de cultivos de células NK debe realizarse con cuidado, ya que estas células tienden a ser sensibles al estrés mecánico (Guti et al. observación no publicada). En cuanto a la biblioteca de compuestos, es importante asegurarse de que todos los pocillos contengan volúmenes iguales de compuestos de prueba si se utilizan herramientas de pasador para la transferencia de compuestos de la placa de biblioteca a la placa de ensayo. Esto puede evitar que cantidades variables de soluciones compuestas se adhieran al lado exterior de los pines. Además, los compuestos acertados identificados en una pantalla deben validarse preferiblemente en un ensayo fiable basado en un principio diferente. Para ello, recomendamos el método11 basado en ECIS (véase más arriba en la Introducción).
En conclusión, establecimos un sistema de ensayo ADCC in vitro basado en JIMT-1 EGFP adecuado para probar bibliotecas de compuestos con análisis automatizado de imágenes. El método fue adecuado para la identificación de farmacones con efectos modificadores conocidos de ADCC. El método es potencialmente adecuado para la determinación de la muerte de células cancerosas causada por conjugados de trastuzumab (por ejemplo, trastuzumab-emtansina21 recientemente desarrollado) donde el mecanismo de toxicidad es más complejo y solo es causado parcialmente por ADCC y parcialmente por el inhibidor de tubulina mertansina. En el futuro, planeamos adoptar la tecnología para cuantificar ADCC en esferoides 3D, que representan un reflejo más preciso del comportamiento del tumor que los modelos 2D.
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Disclosures
Los autores no informan ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
LV recibió fondos de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación subvenciones GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE y OTKA K132193, K147482. Las células CD16.176V.NK-92 se obtuvieron del Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, en nombre de Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), están protegidos por patentes en todo el mundo, y fueron licenciados por Nantkwest, lnc. Los autores agradecen a György Vereb y Árpád Szöőr por su ayuda con el uso de la línea celular NK-92 y por el asesoramiento técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
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