Summary
פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.
Abstract
אימונותרפיה עם נוגדנים ספציפיים לאנטיגן או מעכבי בקרה חיסונית חוללה מהפכה בטיפול בסרטן השד. תאי סרטן השד המבטאים את קולטן גורם הגדילה האפידרמיס HER2 יכולים להיות ממוקדים על ידי נוגדן נגד HER-2 trastuzumab. ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) היא מנגנון חשוב המעורב בפעילות האנטי-סרטנית של HER-2. Trastuzumab הקשורים לתאים סרטניים יכול להיות מזוהה על ידי קולטני Fc של תאים משפיעים ADCC (למשל, תאי הרג טבעי (NK), מקרופאגים, גרנולוציטים), הפעלת הפעילות ציטוטוקסית של תאים חיסוניים אלה המוביל למוות תאים סרטניים. יצאנו לפתח בדיקה מבוססת תמונה לכימות ADCC כדי לזהות תרכובות אפנן ADCC חדשות על ידי סינון תוכן גבוה. בניסוי, תאי סרטן השד JIMT-1 בעלי ביטוי יתר של HER2 מתורבתים יחד עם תאי NK-92 בנוכחות טרסטוזומאב, ומוות תאי המטרה מכומת על ידי מיקרוסקופ אוטומטי וניתוח תמונה כמותי. תאי המטרה נבדלים מתאי אפקט בהתבסס על פלואורסצנטיות ה-EGFP שלהם. אנו מראים כיצד ניתן לבדוק ספריות מורכבות בבדיקה כדי לזהות תרופות אפנן ADCC. לשם כך הוצבה פלטת בדיקה של ספריית תרכובת באמצעות כימיקלים עדינים שנבחרו באופן אקראי ממדף המעבדה. שלוש תרכובות מערערות יציבות מיקרוטובולים (קולכיצין, וינקריסטין, פודופילוטוקסין) הצפויות להפריע לנדידת תאי NK ולפירוק תאי NK נכללו גם הן בספריית הבדיקה. מסך הבדיקה זיהה את כל שלוש תרכובות הבקרה החיוביות כפגיעות המוכיחות את התאמת השיטה לזיהוי תרופות משנות ADCC בספרייה כימית. באמצעות בדיקה זו, ניתן לבצע מסכי ספרייה מורכבים כדי לזהות תרכובות משפרות ADCC שיכולות לשמש כסוכני טיפול אדג'ובנטיים לטיפול בחולים המקבלים אימונותרפיה אנטי-סרטנית. בנוסף, השיטה יכולה לשמש גם לזיהוי תופעות לוואי בלתי רצויות מעכבות ADCC של תרופות טיפוליות הנלקחות על ידי חולי סרטן עבור אינדיקציות שונות.
Introduction
אימונותרפיה עם נוגדנים אנטי-סרטניים, מעכבי בקרה חיסונית, או תאי T (CAR-T) המבטאים קולטן אנטיגן כימרי מייצגת גישה רבת עוצמה לטיפול בסרטן 1,2,3. Trastuzumab הוא נוגדן חד שבטי אנושי anti-HER-2 (קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2) המשמש לטיפול בסרטן שד חיובי HER-2 בשלב מוקדם או גרורתי, כמו גם סרטן קיבה גרורתי חיובי HER-2 4,5,6. זה פועל בעיקר על ידי עיכוב ההשפעה מגרה התפשטות של גורם גדילה אפידרמיס4. עם זאת, דווח כי trastuzumab גורם ביעילות למוות של תאים סרטניים גם אם התאים הסרטניים איבדו את תגובתם לגירוי HER-27. השפעה פרדוקסלית זו של הנוגדן נובעת מציטוטוקסיות תלויית תאים (ADCC)7. ADCC יכול להיות מתווך על ידי תאי הרג טבעי (NK), גרנולוציטים ומקרופאגים הידועים ביחד כתאי ההשפעה של ADCC 8,9. אם נוגדן, כגון trastuzumab, נקשר לתאי הגידול, אז תאים משפיעים אלה משתמשים בקולטני Fc שלהם כדי לקשור את האזור הקבוע (Fc) של הנוגדן. הנוגדן מגשר בין תאי הגידול לבין תאי ההשפעה נושאי קולטן Fc, וגורם לשחרור המתווכים ציטוטוקסיים שלהם10. תאי הרג טבעיים משחררים את המטען ציטוטוקסי של הגרגירים שלהם המכילים פרפורין כדי ליצור נקבוביות בקרום תא המטרה וגראנזים (המפעיל מסלולי איתות מוות תאי) לתוך סינפסת החיסון, מה שמוביל לאפופטוזיס של התאים הסרטניים (ראו איור 1).
איור 1: אינטראקציות של אפקטור ותא יעד ב-ADCC. קולטן Fcγ משטח התא של תא ה- NK המשפיע מזהה את אזור Fc של נוגדן ה- trastuzumab נגד HER2 הספציפי למולקולת HER2 המבוטאת על פני השטח של התא הסרטני. לפיכך, מה שנקרא סינפסה אימונולוגית הוקמה בין שני התאים, גרימת exocytosis מכוונת של גרגירים ציטוטוקסיים של התא המשפיע. מולקולות הפרפורין והגרנזים המשתחררות גורמות בסופו של דבר לאפופטוזיס של תא המטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
מספר בדיקות פותחו בעבר כדי לכמת ציטוטוקסיות, כולל ADCC. תקן הזהב הוא שיטת שחרור כרום רדיואקטיבי, שבה תאי המטרה מסומנים באיזוטופ רדיואקטיבי 51Cr, ו-ADCC מכומת על ידי מדידת רדיואקטיביות מהסופרנאטנט של תאי המטרה11. בגלל הבעיות הברורות עקב טיפול, אחסון וסילוק מוסדרים בקפידה של תרופות רדיואקטיביות ופסולת, שיטה זו הפכה יותר ויותר לא פופולרית בקרב מדעני החיים. בנוסף, זה לא מקובל על יישומים תפוקה גבוהה גם. מדידת הפעילות של אנזימים (למשל, לקטט-דהידרוגנאז) המשתחררים מתאי המטרה המומתים יכולה לספק חלופה לא רדיואקטיבית לבדיקת 51Cr12. עם זאת, בדיקות אלה אינן מצליחות להבחין בין מוות של תאי מטרה למוות של תאי השפעה. חישת עכבה של מצע תא חשמלי (ECIS) הוכחה כמתאימה לכימות ADCC13, אך ציוד ECIS אינו זמין ברוב המעבדות, והטכניקה אינה תואמת ליישומים/סינון בעלי תפוקה גבוהה. תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי מייצגים חלופה פופולרית בבדיקות ביולוגיה רבות של התא ומשמשים לעתים קרובות ביישומים מבוססי ציטומטריית זרימה או קורא לוחות14,15,16. עם זאת, בדיקות אלה מכילות לעתים קרובות שלבי שטיפה או שאינן תואמות בדרך אחרת ליישומים בעלי תפוקה גבוהה (למשל, טכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה). כמה מבחני ציטוטוקסיות פופולריים, אשר בתיאוריה אמורים להתאים לכימות ADCC, אינם מצליחים לקבוע באופן מהימן יעילות ADCC13. לאחרונה, עם התפשטות המיקרוסקופ הקונפוקלי הפלואורסצנטי, מבדקים מבוססי תמונה, בעלי תוכן גבוה הופכים פופולריים יותר ויותר בתחומים שונים של מדעי החיים17. מצד אחד, ציוד הדמיה של תאים נמצא כיום בכל מקום, ומצד שני, ניתן לאסוף פרמטרים מורפולוגיים כמעט אינסופיים מהתמונות שנרכשו. לכן, יצאנו לפתח בדיקת ADCC תואמת סינון בתוכן גבוה ולהדגים את התאמתו לסינון ספריות מורכבות.
כאן, אנו מציגים בדיקת ADCC מבוססת תמונה ומדגימים כיצד ניתן להשתמש בבדיקה זו עבור סינון תוכן גבוה (HCS) לזיהוי תרכובות אפנון ADCC. המודל מבוסס על תאי מטרה של קרצינומה של השד JIMT-1, תאי השפעה CD16.176V.NK-92 ונוגדן חד שבטי אנושי נגד HER2 trastuzumab. בשיטה זו, ניתן לזהות תרופות שיכולות לשפר את פעולת הרג הגידול של תאי NK או לקבל תובנה לגבי המנגנון של ADCC בתיווך תאי NK על ידי זיהוי מולקולות קטנות המפריעות ל- ADCC. אנו מציעים כי מדעני חיים השואפים לכמת ציטוטוקסיות בתיווך תאים תוך התייחסות מיוחדת ל- ADCC עשויים להפיק תועלת משימוש בבדיקה זו למדע התגלית או לפיתוח תרופות. בדיקה זו עשויה להיות חלופה אם למעבדה יש גישה וניסיון כלשהו בהדמיה פלואורסצנטית וניתוח תמונה כמותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: השלבים העיקריים של זרימת העבודה של הבדיקה מוצגים באיור 2.
איור 2: זרימת עבודה של מסך ADCC. תאי מטרה JIMT-1-EGFP שנזרעו לתוך 96 צלחות HCS באר מטופלים בתרופות של ספריית התרכובת. בתורו, תאי NK (אפקטור) לא מוכתמים ו trastuzumab מתווספים, ואת הצלחת הוא imaged ב 0 נקודת זמן ולאחר 3 שעות של הדגירה. הערכת ADCC מבוססת על השינוי במספר תאי היעד בני קיימא (פני השטח הנצמדים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
1. ציפוי צלחת HCS
- יש לצפות את 96 לוחות ההקרנה בעלי התוכן הגבוה (HSC) במדיום JIMT-1 של 50 μL/באר (DMEM/F-12 בינוני בתוספת 20% נסיוב בקר עוברי (FBS), אינסולין 0.3 U/mL (100 IU/mL, Humulin R ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
- הכניסו את הצלחת לאינקובטור CO2 למשך שעה אחת.
הערה: ציפוי חיוני לחיבור תאי JIMT-1 למשטח הזכוכית של הצלחת.
2. זריעה של תאי חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר JIMT-1 (EGFP)
הערה: תאי JIMT-1 המבטאים EGFP נוצרו בעבודתנו הקודמת18, והתאים גודלו בתרבית צלוחיות תרבית רקמה T25 במדיה JIMT-1 (ראו הרכב בשלב 1.1).
- לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS סטרילי.
- הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוק והחזיר את הבקבוק לאינקובטור CO2 למשך 10 דקות.
- לאחר הדגירה, הקש על הבקבוק כדי לבדוק אם תאי JIMT-1 מנותקים.
- עצור את העיכול עם 2 מ"ל של מדיה JIMT-1 ולאסוף את תרחיף התא לתוך צינור 15 מ"ל.
- ספור את התאים עם 0.4% טריפאן כחול (80 μL של צבע + 20 μL של תרחיף התא) בתא Bürker ולהתאים את מספר התא ל 133, 000 תאים / מ"ל.
- שאפו את מצע הציפוי מצלחת הבאר 96 (שלב 1.2).
- פיפטה 75 μL של תרחיף התא לכל באר של לוחות HCS (ראה טבלת חומרים).
- אפשר לתאים להיצמד במהלך דגירה של לילה ב 37 ° C באינקובטור CO2 .
3. טיפול מקדים בתאי JIMT-1 EGFP עם ספריית התרכובות
- שאפו את התווך מתאי JIMT-1 והוסיפו 50 μL/באר תווך JIMT-1 טרי לבארות. מעבירים את הצלחת למעבדת סינון בתפוקה גבוהה.
הערה: שימוש ברובוט לטיפול בנוזלים הופך את התוספת של ספריות מורכבות ליעילה יותר וניתנת לשחזור. - העבר את תרכובות הבדיקה מלוח ספריית התרכובות ללוח הבדיקה באמצעות כלי סיכה המכויל לנפח של 25 nL. בצע זאת ארבע פעמים. ארבעה סבבי העברה נותנים נפח סופי של 100 nL (וריכוז סופי של 20 מיקרומטר).
- בין כל שלב, שטפו את כלי הסיכה, תחילה עם 50% DMSO ולאחר מכן עם 70% אתנול.
- לדגור את הצלחות במשך 1 שעה באינקובטור CO2 ב 37 ° C.
4. התחלת בדיקת ADCC על ידי הוספת תאי האפקט
הערה: תאי CD16.176V.NK92 (להלן תאי NK92) גודלו בתרבית ב-α-MEM בתוספת 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-פירובט, 1% גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-100 IU/mL IL-2.
- ספירת תאי NK92 עם כחול טריפאן (80 μL של הצבע + 20 μL של השעיית התא). התאם את מספר התא ל- 400,000 תאים/מ"ל.
- צנטריפוגה 4 מ"ל של תרחיף התא ב 150 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכינו את מדיום ADCC על ידי הוספת נוגדן אנטי-HER2 (trastuzumab) של 20 מיקרוגרם/מ"ל למדיום JIMT-1.
- להשעות מחדש את גלולת תא NK בתווך ADCC 5 מ"ל.
- פיפטה 20,000 תאי NK ב-50 מיקרוליטר של תווך ADCC לתאי היעד JIMT-1. הנפח הסופי הוא 100 μL, וריכוז trastuzumab הסופי הוא 10 מיקרוגרם / מ"ל.
- מקם את צלחת הבדיקה לתוך ציוד ניתוח תוכן גבוה עם אינקובטור מובנה להגדיר ב 37 ° C.
5. הדמיה
הערה: יש לצלם את הלוחות בשתי נקודות זמן, הראשונה, מיד לאחר הוספת תאי האפקט לתאי היעד והשנייה, 3 שעות לאחר הוספת תאי NK. להדמיה, ניתן להשתמש במנתח התוכן הגבוה ובתוכנה שלו או בחלופות מתאימות (ראה טבלת חומרים).
- בחר סוג צלחת (96-well cell carrier ultra) מרשימת הלוחות.
- בחר את שני המיקוד האוטומטי של שני שיאים אם הבדיקה מתבצעת בלוחות.
- השתמש במטרה 10x במצב לא קונפוקלי.
- בחר Binning 2 כדי להכפיל את יחס האות לרעש.
- צלם תמונות שדה בהיר ב- 650-760 ננומטר ותמונות פלואורסצנטיות של תאי JIMT-1 המומרים על ידי EGFP באורכי גל של 488 ננומטר (עירור) ו- 500-550 ננומטר (פליטה).
- בחר את מספר השדות ואת מספר נקודות הזמן עבור ההדמיה.
6. ניתוח תמונות
הערה: כדי לנתח את יעילות ADCC, תאי JIMT-1 בני קיימא נספרים. תאי מטרה שנהרגים על ידי ADCC מתנתקים מפני השטח ומתרחקים ממישור המוקד של המיקרוסקופ. לכן, ההבדל בין מספר התאים בני קיימא בתחילת ובסוף תגובת ADCC מתאים לתאי מטרה שסולקו על ידי ADCC. כדי להראות כיצד לבנות את רצף ההערכה, באר ADCC בקרה מוצגת בסרטון.
- השתמש במודול חיפוש תאים כדי לזהות אזורים בתמונה המתאימים לתאים.
הערה: כל תא מזוהה כאזור בתמונה בעל עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר מסביבתו. - בחר תאים באמצעות אלגוריתם M המובנה בקוטר מינימלי של 80 מיקרומטר.
- הגדר רגישות פיצול, המחלקת אובייקט גדול לאובייקטים קטנים יותר, ל- 0.5.
- קבעו את הסף 'משותף ' (הרמה הנמוכה ביותר של עוצמת פיקסלים) על 0.
- אל תכלול זיהוי של אזור רקע עם עוצמה פלואורסצנטית גבוהה של EGFP בשני שלבים.
- תחילה, השתמש בפונקציה Calculate Intensity Properties כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות של EGFP באזור התאים שנבחר קודם לכן.
- הגדר את סף העוצמה המינימלי והמרבי באמצעות האפשרות בחר אוכלוסייה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים כיצד הבדיקה פועלת בחיים האמיתיים, יצרנו ספריית בדיקות של 16 תרכובות שנבחרו באופן אקראי ממדפי המעבדה (איור 3). בנוסף, DMSO נכלל גם כבקרה שלילית, ושלוש תרכובות מעכבות פילמור מיקרוטובול (קולכיצין, וינכריסטין ופודופילוטוקסין) כבקרות חיוביות. אלה האחרונים היו צפויים לעכב ADCC על ידי הפרעה לנדידת תאי NK לתאים הסרטניים ופירוק תאי NK. כל תרכובות הבדיקה וה-DMSO הונחו על לוח ספריית הבדיקה ברביעיות, ו-DMSO נוסף גם לעמודה הראשונה והאחרונה של הלוח (איור 3).
איור 3: הספרייה המורכבת ששימשה לבדיקת בדיקת HCS ADCC . (A) מפת הלוחות של ספריית המתחם מוצגת. כל תרכובת נמצאת על לוח הספרייה ברביעיות. DMSO נוסף כבקרה שלילית לעמודה הראשונה והאחרונה של הצלחת. בארות המכילות DMSO ושלושת מעכבי הרכבת המיקרוטובולים (קולכיצין, וינקריסטין ופודופילוטוקסין) מודגשים בצבע. (B) מוצגים שמות, מיקומי לוחות ושמות מקוצרים של תרכובות בדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
באמצעות ספריית הבדיקות שלנו, הרצנו את הבדיקה והערכנו את התוצאות כמתואר בפרוטוקול. מאחר שתאי JIMT-1 מבטאים EGFP, ניתן להבחין ביניהם בקלות לבין תאי האפקט שאינם פלואורסצנטיים. הבדיקה מבוססת על זיהוי השינוי במספר תאי המטרה הנצמדים לפני השטח (בני קיימא). בתנאי הבדיקה שלנו, תאי NK גרמו לכ-50% מוות של תאי JIMT-1 (קבוצת +NK), בעוד שאף אחת מתרכובות הבדיקה לא גרמה לרעילות כלשהי בהיעדר תאי NK (קבוצת -NK) (איור 4). תנאי הבדיקה הותאמו בעבר להשגת רמה בינונית זו של ציטוטוקסיות18, בהנחה שהדבר יאפשר זיהוי הן של ADCC activator והן של תרכובות מעכבות. מעכבי הרכבת מיקרוטובול הבקרה החיובית הופיעו כ"מכה" בכל המיקומים המרובעים כצפוי, מה שמצביע על האמינות הגבוהה של הבדיקה (איור 4).
איור 4: בדיקת ספרייה מורכבת במודל ADCC. (A) תמונות של תגובות ADCC צולמו 3 שעות לאחר הדגירה המשותפת של תאי NK ותאי JIMT-1 בנוכחות DMSO עם המטרה פי 10 של מצלמת HCS. (סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר). חלק אחד של התמונה מוגדל, ומציג את תאי ה-NK הלא מוכתמים ואת תאי היעד JIMT-1 המומרים ב-EGFP. (ההגדלה של התמונה המקורית היא 4x, סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר). (B) בדיקת ADCC בוצעה עם קו תאי קרצינומה של השד JIMT-1 מותמר EGFP וקו תאים CD16.176 V.NK-92. יחס האפקט המופעל למטרה (E:T) היה 2:1. במקרה של קבוצת -NK, תאי JIMT-1 EGFP הודגרו ללא תאי NK ונוגדן נגד HER2, ואילו בקבוצת +NK (ADCC) 10 מיקרוגרם/מ"ל טרסטוזומאב נוסף לתרביות המשותפות של תאי JIMT-1 ו-NK. מספר תאי JIMT-1-EGFP ברי קיימא זוהה באמצעות ציוד ניתוח תוכן גבוה מיד לאחר הוספת תאי NK ולאחר 3 שעות של דגירה. יכולת הקיום של תאי המטרה בקבוצת +NK הייתה 50% מזו שבקבוצת -NK. הקו המקווקו האדום מציג את ערך הסף, המייצג דגימות עם כדאיות של ≥70% בהשוואה לממוצע ההרג של בקרת DMSO (n=20). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תגובת ADCC תוארה לפני זמן רב יחסית. אירועים מולקולריים מרכזיים של התהליך תוארו גם הם19. השיטות למדידת ADCC נעות בין בדיקת שחרור כרום רדיואקטיבי בתקן הזהב, מבחני שחרור אנזימים ציטופלזמיים למספר ציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנטיות או מבחני מיקרו-לוחות20. עם זאת, מגבלה נפוצה של בדיקות אלה היא שהן אינן ניתנות להתאמה ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. בעבר, פיתחנו בדיקת HCS מבוססת תמונה המתאימה לסינון ספריות מורכבות עבור תרופות משנות ADCC18. עם זאת, לבדיקה שפותחה בעבר היה חיסרון גדול, כלומר, היא דרשה שלב שטיפה מכיוון שהיה צורך להכתים מראש את תאי המטרה בקלצאין-אצטוקסימתילאסטר, והיה צורך להסיר את עודפי הצבע לפני הוספת תאי ה- NK והטרסטוזומאב. השיטה הנוכחית מייצגת גרסה מתקדמת של הבדיקה בכך שהשימוש בתאי JIMT-1 מותמרים EGFP מאפשר התמיינות פשוטה בין תאי האפקט לתאי המטרה ללא שלב צביעה ושטיפה. יתר על כן, יש להיות מודעים גם לתכונה של הבדיקה שלנו שהיא אינה יכולה להבחין בין תאים מתים וגוססים (שעדיין לא מנותקים לחלוטין). יתר על כן, ייתכן כי תרכובות הבדיקה עשויות להגביר את הידבקות התא, וכתוצאה מכך פסולת התא עלולה להישאר במישור המוקד וכתוצאה מכך תוצאה חיובית כוזבת. בנוסף, התכונות הפלואורסצנטיות של תרכובות הבדיקה עלולות לגרום להפרעה. לכן, למרות שמסכים מופעלים בדרך כלל פעם אחת, מומלץ מאוד לאמת להיטים גם בסוגים אחרים של מבחנים. מגבלות נוספות של הבדיקה שלנו כוללות זיהוי עקיף של מוות תאי, כלומר, השיטה מבוססת על כימות השינוי במספר התאים החיים במקום תאים מתים. עם זאת, חשוב לציין כאן כי מחקר קודם מצא כי זיהוי מבוסס ECIS של תאים קיימא היה עדיף על כמה שיטות מדידה ישירה של מוות תאים13. לכן, תכונה זו של השיטה שלנו אינה מייצגת בהכרח חיסרון. מה שבאמת עשוי להגביל את היישום של בדיקה זו, עם זאת, הוא שזה דורש לפחות ידע בסיסי בניתוח תמונה מתקדם, מיומנות שהופכת נפוצה יותר ויותר כיום.
למרות שעד כה, ספרייה קטנה (פחות מ -1000 תרכובות) נבדקה עם הגרסה המקורית של הבדיקה18. עדיין לא זיהינו תרופת דחף ADCC. הסיבה לכך עשויה להיות שמפעילי ADCC עשויים להיות נדירים, וספריות גדולות בהרבה צריכות לעבור סינון כדי לזהות אחד. תיאורטית, ייתכן גם שברגע שתגובת ADCC מתחילה, היא מתקדמת ללא צעדים מגבילים משמעותיים, כך שיהיה קשה לשפר את התהליך עוד יותר על ידי פרמקון. דרך אפשרית אחת לעקוף בעיה זו עשויה להיות לדכא את פעילות ADCC (למשל, עם סטרואידים) ולהריץ את המסך בחיפוש אחר תרכובות המחזירות פעילות ADCC מלאה. עם זאת, אנו חושבים כי זיהוי ההשפעה המעכבת ADCC של תרופות רפואיות ידועות עשוי להיות חשוב גם על מנת להעלות את המודעות של רופאים הרושמים תרופות אלה לחולים עם אינדיקציות שונות.
באשר לפרטים הטכניים של הבדיקה, אנו ממליצים להגדיר את הבדיקה במקביל לבדיקת ציטוטוקסיות חלופית. בידינו, ECIS (חישת עכבת תא חשמלי) הוכיחה את עצמה כמערכת האמינה ביותר לכימות יעילות ADCC13. בתחילת הפרויקט, ECIS שימש להתאמת פרמטרים קריטיים (זמן, משפיע ליחס תא מטרה, ריכוז trastuzumab) ולאחר מכן העביר את הבדיקה לפלטפורמת HCS18. אנו ממליצים לעשות את אותו הדבר ולכוונן את הפרמטרים הללו, מכיוון שהם עשויים להשתנות ממעבדה למעבדה. בעת הגדרת הבדיקה, חשוב להקדיש תשומת לב מיוחדת לחלק מהשלבים הקריטיים של ההליך. סטנדרטיזציה של תנאי התרבית (תדירות פיצול, הזנת תאים, עקביות ציפוי) הן עבור תאי NK והן עבור תאי היעד עשויה להגביר את יכולת השחזור של יעילות ADCC. יתר על כן, השעיית תרביות תאי NK חייבת להתבצע בזהירות מכיוון שתאים אלה נוטים להיות רגישים ללחץ מכני (Guti et al. תצפית שלא פורסמה). באשר לספריית התרכובות, חשוב לוודא שכל הבארות מכילות נפחים שווים של תרכובות בדיקה אם נעשה שימוש בכלי סיכה להעברת תרכובות מצלחת הספרייה לצלחת הבדיקה. זה עשוי למנוע מכמויות משתנות של תמיסות מורכבות להידבק לצד החיצוני של הפינים. יתר על כן, תרכובות פגיעה המזוהות במסך צריכות להיות מאומתות רצוי בבדיקה אמינה המבוססת על עיקרון אחר. לשם כך, אנו ממליצים על שיטה11 מבוססת ECIS (ראה לעיל במבוא).
לסיכום, הקמנו מערכת בדיקת ADCC במבחנה מבוססת JIMT-1 EGFP המתאימה לבדיקת ספריות מורכבות עם ניתוח תמונה אוטומטי. השיטה התאימה לזיהוי פרמקונים עם השפעות משנות ADCC ידועות. השיטה מתאימה באופן פוטנציאלי לקביעת מוות של תאים סרטניים הנגרם על ידי תרופות מצומדות trastuzumab (למשל, trastuzumab-emtansine21 שפותח לאחרונה) כאשר מנגנון הרעילות מורכב יותר ונגרם רק באופן חלקי על ידי ADCC ובחלקו על ידי מעכב טובולין מרטנזין. בעתיד, אנו מתכננים לאמץ את הטכנולוגיה לכימות ADCC בספרואידים תלת-ממדיים, המייצגים השתקפות מדויקת יותר של התנהגות הגידול מאשר מודלים דו-ממדיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מדווחים על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
LV קיבלה מימון ממענקי משרד המחקר, הפיתוח והחדשנות הלאומי GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE ו-OTKA K132193, K147482. תאי CD16.176V.NK-92 התקבלו מד"ר קרי ס. קמפבל (מרכז פוקס צ'ייס, Philapedlphia, PA, מטעם Brink Biologics, lnc. סן דייגו, קליפורניה), מוגנים על ידי פטנטים ברחבי העולם, וקיבלו רישיון על ידי Nantkwest, lnc. המחברים מודים לגיורגי ורב ולארפד שור על עזרתם בשימוש בקו התאים NK-92 ועל הייעוץ הטכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
