Summary
Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.
Abstract
Immunotherapie met antigeenspecifieke antilichamen of immuuncheckpointremmers heeft een revolutie teweeggebracht in de therapie van borstkanker. Borstkankercellen die de epidermale groeifactorreceptor HER2 tot expressie brengen, kunnen het doelwit zijn van het anti-HER-2-antilichaam trastuzumab. Antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) is een belangrijk mechanisme dat betrokken is bij de antitumorwerking van HER-2. Trastuzumab gebonden aan kankercellen kan worden herkend door de Fc-receptoren van ADCC-effectorcellen (bijv. Natural killer (NK) cellen, macrofagen en granulocyten), waardoor de cytotoxische activiteit van deze immuuncellen wordt geactiveerd die leidt tot kankerceldood. We wilden een op afbeeldingen gebaseerde test ontwikkelen voor de kwantificering van ADCC om nieuwe ADCC-modulatorverbindingen te identificeren door middel van screening met een hoog gehalte. In de test worden HER2-overexpressie van JIMT-1-borstkankercellen samen gekweekt met NK-92-cellen in aanwezigheid van trastuzumab en wordt de dood van doelcellen gekwantificeerd door geautomatiseerde microscopie en kwantitatieve beeldanalyse. Doelcellen worden onderscheiden van effectorcellen op basis van hun EGFP-fluorescentie. We laten zien hoe samengestelde bibliotheken kunnen worden getest in de test om ADCC-modulatorgeneesmiddelen te identificeren. Voor dit doel werd een samengestelde bibliotheektestplaat opgezet met behulp van willekeurig geselecteerde fijne chemicaliën van de laboratoriumplank. Drie microtubuli destabiliserende verbindingen (colchicine, vincristine, podofyllotoxine) waarvan verwacht wordt dat ze de NK-celmigratie en degranulatie verstoren, werden ook opgenomen in de testbibliotheek. Het testscherm identificeerde alle drie de positieve controleverbindingen als treffers die de geschiktheid van de methode bewijzen om ADCC-modificerende geneesmiddelen in een chemische bibliotheek te identificeren. Met deze test kunnen samengestelde bibliotheekschermen worden uitgevoerd om ADCC-verbeterende verbindingen te identificeren die kunnen worden gebruikt als adjuvante therapeutische middelen voor de behandeling van patiënten die immunotherapieën tegen kanker krijgen. Bovendien kan de methode ook worden gebruikt om ongewenste ADCC-remmende bijwerkingen van therapeutische geneesmiddelen die door kankerpatiënten voor verschillende indicaties worden ingenomen, te identificeren.
Introduction
Immunotherapie met antikankerantistoffen, immuuncheckpointremmers of chimere antigeenreceptor-expressie T (CAR-T) cellen vertegenwoordigt een krachtige benadering van kankerbehandeling 1,2,3. Trastuzumab is een gehumaniseerd monoklonaal anti-HER-2 (humane epidermale groeifactorreceptor 2) antilichaam dat wordt gebruikt voor de behandeling van HER-2-positieve vroege stadium of gemetastaseerde borstkanker, evenals HER-2-positieve gemetastaseerde maagkanker 4,5,6. Het werkt voornamelijk door het proliferatiestimulerende effect van de epidermale groeifactor4 te remmen. Er is echter gemeld dat trastuzumab efficiënt kankerceldood veroorzaakt, zelfs als de kankercellen hun reactievermogen op HER-2-stimulatie hebben verloren7. Dit paradoxale effect van het antilichaam is te wijten aan antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC)7. ADCC kan worden gemedieerd door natural killer (NK) cellen, granulocyten en macrofagen gezamenlijk bekend als de effectorcellen van ADCC 8,9. Als een antilichaam, zoals trastuzumab, zich bindt aan tumorcellen, dan gebruiken deze effectorcellen hun Fc-receptoren om het constante (Fc) gebied van het antilichaam te binden. Het antilichaam overbrugt de tumorcellen en de Fc-receptordragende effectorcellen, waardoor de afgifte van hun cytotoxische mediatorenwordt geactiveerd 10. Natural killer-cellen geven de cytotoxische lading van hun korrels die perforine bevatten vrij om poriën in het doelcelmembraan en granzyme te genereren (waardoor celdoodsignaleringsroutes worden geactiveerd) in de immuunsynaps die leiden tot apoptose van de kankercellen (zie figuur 1).
Figuur 1: Effector- en doelcelinteracties in ADCC. De Fcγ-receptor van het celoppervlak van de effector NK-cel herkent het Fc-gebied van het anti-HER2-trastuzumab-antilichaam dat specifiek is voor het HER2-molecuul dat tot expressie komt op het oppervlak van de tumorcel. Zo wordt de zogenaamde immunologische synaps tussen de twee cellen vastgesteld, waardoor de gerichte exocytose van cytotoxische korrels van de effectorcel wordt geïnduceerd. De vrijgekomen perforine- en granzymemoleculen resulteren uiteindelijk in apoptose van de doelcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er zijn eerder verschillende testen ontwikkeld om cytotoxiciteit te kwantificeren, waaronder ADCC. De gouden standaard is de radioactieve chroomafgiftemethode, waarbij de doelcellen worden gelabeld met radioactief 51Cr-isotoop en ADCC wordt gekwantificeerd door radioactiviteit te meten van het supernatant van gelyseerde doelcellen11. Vanwege de voor de hand liggende problemen als gevolg van de strikt gereguleerde behandeling, opslag en verwijdering van radioactieve farmacons en afvalstoffen, is deze methode steeds minder populair geworden onder levenswetenschappers. Bovendien is het ook niet vatbaar voor toepassingen met een hoge doorvoer. Het meten van de activiteit van enzymen (bijv. lactaat-dehydrogenase) die vrijkomen uit de gedode doelcellen kan een niet-radioactief alternatief bieden voor de 51Cr-test12. Deze testen maken echter geen onderscheid tussen doel- en effectorceldood. Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) bleek geschikt voor de kwantificering van ADCC13, maar de ECIS-apparatuur is niet beschikbaar in de meeste laboratoria en de techniek is niet compatibel met toepassingen met hoge doorvoer / screening. Fluorescerend gelabelde cellen vormen een populair alternatief in veel celbiologische assays en worden vaak gebruikt in flowcytometrie of op plaatlezers gebaseerde toepassingen14,15,16. Deze testen bevatten echter vaak wasstappen of zijn anderszins niet compatibel met toepassingen met een hoge doorvoer (bijv. Op flowcytometrie gebaseerde technieken). Sommige populaire cytotoxiciteitstests, die in theorie geschikt zouden moeten zijn voor ADCC-kwantificering, slagen er niet in om de ADCC-efficiëntie betrouwbaar te bepalen13. Onlangs, met de verspreiding van fluorescerende confocale microscopie, worden beeldgebaseerde, hoog-inhoudige assays steeds populairder in verschillende gebieden van de levenswetenschappen17. Aan de ene kant is celbeeldvormingsapparatuur nu vrij alomtegenwoordig, terwijl aan de andere kant vrijwel eindeloze morfologische parameters kunnen worden verzameld uit de verkregen beelden. Daarom zijn we begonnen met het ontwikkelen van een high-content screening compatibele ADCC-test en om de geschiktheid ervan voor samengestelde bibliotheekscreening aan te tonen.
Hier presenteren we een op afbeeldingen gebaseerde ADCC-test en laten we zien hoe deze test kan worden gebruikt voor High-Content Screening (HCS) om ADCC-modulerende verbindingen te identificeren. Het model is gebaseerd op JIMT-1 borstcarcinoom doelcellen, CD16.176V.NK-92 effectorcellen en het gehumaniseerde monoklonale anti-HER2 antilichaam trastuzumab. Met deze methode is het mogelijk om geneesmiddelen te identificeren die de tumordodende werking van NK-cellen kunnen verbeteren of om inzicht te krijgen in het mechanisme van NK-celgemedieerde ADCC door kleine moleculen te identificeren die interfereren met ADCC. We suggereren dat levenswetenschappers die celgemedieerde cytotoxiciteit willen kwantificeren met speciale aandacht voor ADCC, baat kunnen hebben bij het gebruik van deze test, hetzij voor de ontdekkingswetenschap of de ontwikkeling van geneesmiddelen. Deze test kan een alternatief zijn als een laboratorium toegang heeft tot en enige ervaring heeft met fluorescerende beeldvorming en kwantitatieve beeldanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De belangrijkste stappen van de testworkflow worden weergegeven in figuur 2.
Figuur 2: Workflow van het ADCC-scherm. JIMT-1-EGFP-doelcellen gezaaid in 96 put HCS-platen worden behandeld met geneesmiddelen van de samengestelde bibliotheek. Op hun beurt worden ongekleurde NK (effector) cellen en trastuzumab toegevoegd en wordt de plaat afgebeeld op 0 tijdstip en na 3 uur incubatie. ADCC-evaluatie is gebaseerd op de verandering in het aantal levensvatbare (oppervlakte-adherente) doelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Coating van de HCS-plaat
- Bedek de 96 well high-content screening (HSC) platen met 50 μL/well JIMT-1 medium (DMEM/F-12 medium aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS), 0,3 U/ml insuline (100 IE/ml, Humulin R en 1% penicilline-streptomycine).
- Plaats de plaat gedurende 1 uur in een CO 2-incubator.
OPMERKING: Coating is cruciaal voor het bevestigen van JIMT-1-cellen aan het glazen oppervlak van de plaat.
2. Zaaien van JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) cellen
OPMERKING: EGFP-tot expressie brengende JIMT-1-cellen werden gegenereerd in ons vorige werk18 en de cellen werden gekweekt in T25-weefselkweekkolven in JIMT-1-media (zie samenstelling in stap 1.1).
- Was de cellen met 2 ml steriele PBS.
- Voeg 1 ml trypsine-EDTA toe aan de kolf en plaats de kolf gedurende 10 minuten terug in een CO 2-incubator.
- Tik na de incubatie op de kolf om te controleren of JIMT-1-cellen zijn losgemaakt.
- Stop de spijsvertering met 2 ml JIMT-1 media en verzamel de celsuspensie in een buis van 15 ml.
- Tel de cellen met 0,4% trypanblauw (80 μL van de kleurstof + 20 μL van de celsuspensie) in een Bürker-kamer en pas het celnummer aan op 133.000 cellen/ml.
- Zuig het coatingmedium op van de 96-putplaat (stap 1.2).
- Pipetteer 75 μL van de celsuspensie aan elk putje van de HCS-platen (zie materiaaltabel).
- Laat cellen zich hechten tijdens een nachtelijke incubatie bij 37 °C in een CO 2-incubator.
3. Voorbehandeling van JIMT-1 EGFP-cellen met de samengestelde bibliotheek
- Zuig het medium uit de JIMT-1 cellen en voeg 50 μL/goed vers JIMT-1 medium toe aan de putjes. Breng de plaat over naar het screeningslaboratorium met hoge doorvoer.
OPMERKING: Het gebruik van een vloeistofbehandelingsrobot maakt de toevoeging van samengestelde bibliotheken efficiënter en reproduceerbaarder. - Breng de teststoffen over van de samengestelde bibliotheekplaat naar de testplaat met een pingereedschap dat is gekalibreerd op een volume van 25 nL. Voer dit vier keer uit. Vier overdrachtsrondes geven een eindvolume van 100 nL (en een eindconcentratie van 20 μM).
- Was tussen elke stap het pingereedschap, eerst met 50% DMSO en vervolgens met 70% ethanol.
- Incubeer de platen gedurende 1 uur in een CO 2-incubator bij 37 °C.
4. De ADCC-test starten door de effectorcellen toe te voegen
OPMERKING: CD16.176V.NK92-cellen (hierna NK92-cellen genoemd) werden gekweekt in α-MEM aangevuld met 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pyruvaat, 1% glutamine, 1% penicilline-streptomycine en 100 IE/ml IL-2.
- Tel NK92-cellen met trypanblauw (80 μL van de kleurstof + 20 μL van de celsuspensie). Pas het celnummer aan op 400.000 cellen/ml.
- Centrifugeer 4 ml van de celsuspensie bij 150 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid het ADCC-medium door 20 μg/ml anti-HER2-antilichaam (trastuzumab) toe te voegen aan het JIMT-1-medium.
- Resuspensie van de NK-celpellet in 5 ml ADCC-medium.
- Pipetteer 20.000 NK-cellen in 50 μL ADCC-medium naar de doel-JIMT-1-cellen. Het uiteindelijke volume is 100 μl en de uiteindelijke trastuzumabconcentratie is 10 μg / ml.
- Plaats de testplaat in de hoogwaardige analyseapparatuur met een ingebouwde incubator die is ingesteld op 37 °C.
5. Beeldvorming
OPMERKING: De platen moeten op twee tijdstippen worden afgebeeld, ten eerste onmiddellijk na de toevoeging van de effectorcellen aan de doelcellen en ten tweede op 3 uur na de toevoeging van NK-cellen. Voor beeldvorming kunnen de high-content analyzer en zijn software of geschikte alternatieven worden gebruikt (zie materiaaltabel).
- Selecteer Plaattype (96-well cell carrier ultra) in de lijst met platen.
- Selecteer de autofocus met twee pieken als de test in platen wordt uitgevoerd.
- Gebruik 10x objectief in niet-confocale modus.
- Selecteer Binning 2 om de signaal-ruisverhouding te verdubbelen.
- Maak brightfield-opnamen bij 650-760 nm en fluorescerende beelden van de EGFP-getransduceerde JIMT-1-cellen bij 488 nm (excitatie) en 500-550 nm (emissie) golflengten.
- Selecteer het aantal velden en het aantal tijdspunten voor de afbeelding.
6. Beeldanalyse
OPMERKING: Om de ADCC-efficiëntie te analyseren, worden de levensvatbare JIMT-1-cellen geteld. Doelcellen die door ADCC worden gedood, maken zich los van het oppervlak en bewegen zich weg van het brandpuntsvlak van de microscoop. Daarom komt het verschil tussen het aantal levensvatbare cellen aan het begin en aan het einde van de ADCC-reactie overeen met doelcellen die door ADCC worden geëlimineerd. Om te laten zien hoe de evaluatievolgorde moet worden opgebouwd, wordt in de video een controle-ADCC-put getoond.
- Gebruik de module Cellen zoeken om gebieden op de afbeelding te detecteren die overeenkomen met cellen.
OPMERKING: Elke cel wordt gedetecteerd als een gebied op de afbeelding met een hogere fluorescentie-intensiteit dan de omgeving. - Selecteer cellen met behulp van het ingebouwde M-algoritme met een diameter van minimaal 80 μm.
- Stel de gevoeligheid voor splitsen, waarmee een groot object wordt verpakt in kleinere objecten, in op 0,5.
- Stel de drempel voor algemeen gebruik (het laagste pixelintensiteitsniveau) in op 0.
- Sluit de detectie van achtergrondgebied met hoge EGFP-fluorescentie-intensiteit in twee stappen uit.
- Gebruik eerst de functie Intensiteitseigenschappen berekenen om de EGFP-fluorescentie-intensiteit in het eerder geselecteerde cellengebied te bepalen.
- Stel de minimum- en maximumintensiteitsdrempel in met de optie Populatie selecteren .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te laten zien hoe de test in het echte leven werkt, hebben we een testbibliotheek gemaakt van 16 willekeurig geselecteerde verbindingen uit de laboratoriumschappen (figuur 3). Daarnaast werd DMSO ook opgenomen als een negatieve controle, en drie microtubule polymerisatieremmers (colchicine, vincristine en podofyllotoxine) als positieve controles. Van deze laatste werd verwacht dat ze ADCC zouden remmen door te interfereren met NK-celmigratie naar de kankercellen en NK-celdegranulatie. Alle teststoffen en DMSO werden in quadrupticaten op de testbibliotheekplaat geplaatst en DMSO werd ook toegevoegd aan de eerste en laatste kolom van de plaat (figuur 3).
Figuur 3: De samengestelde bibliotheek die wordt gebruikt voor het testen van de HCS ADCC-test. (A) De plaatkaart van de samengestelde bibliotheek wordt weergegeven. Elke verbinding is aanwezig op de bibliotheekplaat in viervoud. DMSO werd als negatieve controle toegevoegd aan de eerste en laatste kolom van de plaat. Putjes met DMSO en de drie microtubuli-assemblageremmers (colchicine, vincristine en podofyllotoxine) zijn gemarkeerd in kleur. (B) Namen, plaatposities en verkorte namen van teststoffen worden vermeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Met behulp van onze testbibliotheek hebben we de test uitgevoerd en de resultaten geëvalueerd zoals beschreven in het protocol. Omdat JIMT-1-cellen EGFP tot expressie brengen, kunnen ze gemakkelijk worden onderscheiden van de effectorcellen die niet-fluorescerend zijn. De test is gebaseerd op het detecteren van de verandering in het aantal oppervlakte-adherente (levensvatbare) doelcellen. Onder onze testomstandigheden veroorzaakten NK-cellen ongeveer 50% JIMT-1-celdood (+NK-groep), terwijl geen van de teststoffen enige toxiciteit veroorzaakte in afwezigheid van NK-cellen (-NK-groep) (figuur 4). De testomstandigheden waren eerder geoptimaliseerd om dit gemiddelde niveau van cytotoxiciteit18 te bereiken, ervan uitgaande dat dit de identificatie van zowel ADCC-activator als remmerverbindingen mogelijk zou maken. De positieve controle microtubule assemblage remmers verschenen als "hits" in alle quadruplicate posities zoals verwacht, wat wijst op de hoge betrouwbaarheid van de assay (figuur 4).
Figuur 4: Het testen van een samengestelde bibliotheek in het ADCC-model. (A) Beelden van ADCC-reacties werden 3 uur na co-incubatie van NK-cellen en JIMT-1-cellen genomen in aanwezigheid van DMSO met het 10x-objectief van de HCS-imager. (De schaalbalk is 200 μm.) Een deel van de afbeelding is vergroot, met de niet-gekleurde effector NK-cellen en de EGFP-getransduceerde doel-JIMT-1-cellen. (De vergroting van de originele afbeelding is 4x, de schaalbalk is 50 μm.) (B) De ADCC-test werd uitgevoerd met EGFP-getransduceerde JIMT-1 borstcarcinoomcellijn en CD16.176 V.NK-92-cellijn. De verhouding tussen effect en doel (E:T) was 2:1. In het geval van de -NK-groep werden de JIMT-1 EGFP-cellen geïncubeerd zonder NK-cellen en anti-HER2-antilichaam, terwijl in de +NK-groep (ADCC) 10 μg/ml trastuzumab werd toegevoegd aan de JIMT-1- en NK-celcoculturen. Het aantal levensvatbare JIMT-1-EGFP-cellen werd gedetecteerd met behulp van analyseapparatuur met een hoog gehalte onmiddellijk na de toevoeging van NK-cellen en na 3 uur incubatie. De levensvatbaarheid van de doelcel in de +NK-groep was 50% van die in de -NK-groep. De rode stippellijn toont de drempelwaarde, die monsters vertegenwoordigt met ≥70% levensvatbaarheid in vergelijking met het gemiddelde van DMSO-controle (n = 20) doden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ADCC-reactie is relatief lang geleden beschreven. Belangrijke moleculaire gebeurtenissen van het proces zijn ook beschreven19. Methoden voor het meten van ADCC variëren van de gouden standaard radioactieve chroom release assay, cytoplasmatische enzym release assays tot verschillende fluorescentie-gebaseerde flowcytometrie of microplate assays20. Een veel voorkomende beperking van deze testen is echter dat ze niet vatbaar zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer. Eerder ontwikkelden we een beeldgebaseerde HCS-test die geschikt is voor het screenen van samengestelde bibliotheken op ADCC-modificerende geneesmiddelen18. De eerder ontwikkelde test had echter een groot nadeel, d.w.z. het vereiste een wasstap omdat de doelcellen vooraf moesten worden gekleurd met calceïne-acetoxymethylesther en de overtollige kleurstof moest worden verwijderd vóór de toevoeging van de NK-cellen en trastuzumab. De huidige methode vertegenwoordigt een geavanceerde versie van de test in die zin dat het gebruik van EGFP-getransduceerde JIMT-1-cellen een eenvoudige differentiatie tussen effector- en doelcellen mogelijk maakt zonder een kleurings- en wasstap. Bovendien moet men zich ook bewust zijn van het kenmerk van onze test dat het geen onderscheid kan maken tussen dode en stervende cellen (nog niet volledig losgekoppeld). Bovendien is het mogelijk dat de teststoffen de celadhesie verhogen, waardoor celresten in het brandpuntsvlak achterblijven, wat resulteert in een vals positief resultaat. Bovendien kunnen de fluorescerende eigenschappen van teststoffen interferentie veroorzaken. Daarom, hoewel schermen meestal één keer worden uitgevoerd, wordt het ten zeerste aanbevolen om hits ook in andere soorten testen te valideren. Bijkomende beperkingen van onze test omvatten de indirecte identificatie van celdood, d.w.z. de methode is gebaseerd op de kwantificering van de verandering in het aantal levensvatbare cellen in plaats van dode cellen. Het is echter belangrijk om hier op te merken dat een eerdere studie aantoonde dat ECIS-gebaseerde detectie van levensvatbare cellen superieur was aan sommige van de methoden die direct celdood meten13. Daarom vertegenwoordigt dit kenmerk van onze methode niet noodzakelijkerwijs een nadeel. Wat de toepassing van deze test echter echt kan beperken, is dat het op zijn minst een basiskennis vereist in geavanceerde beeldanalyse, een vaardigheid die tegenwoordig steeds vaker voorkomt.
Hoewel tot nu toe een kleine bibliotheek (minder dan 1000 verbindingen) is getest met de originele versie van de test18. We hebben nog geen ADCC-boostermedicijn geïdentificeerd. De reden hiervoor kan zijn dat ADCC-activatoren zeldzaam kunnen zijn en dat veel grotere bibliotheken moeten worden gescreend om er een te identificeren. Theoretisch is het ook mogelijk dat zodra de ADCC-reactie begint, deze verloopt zonder grote beperkende stappen, zodat het proces moeilijk verder te verbeteren zou zijn door een farmaceut. Een mogelijke manier om dit probleem te omzeilen zou kunnen zijn om ADCC-activiteit te onderdrukken (bijvoorbeeld met corticosteroïden) en het scherm uit te voeren op zoek naar verbindingen die de volledige ADCC-activiteit herstellen. Niettemin denken we dat het identificeren van ADCC-remmend effect van bekende geneesmiddelen ook belangrijk kan zijn om het bewustzijn te vergroten van clinici die deze geneesmiddelen voorschrijven aan patiënten met verschillende indicaties.
Wat de technische details van de test betreft, raden we aan om de test parallel te laten lopen met een alternatieve cytotoxiciteitstest. In onze hand bleek ECIS (electric cell-substrate impedance sensing) het meest betrouwbare systeem voor de kwantificering van ADCC-efficiëntie13. Aan het begin van het project werd ECIS gebruikt om kritische parameters (tijd, effector-doelcelverhouding, trastuzumabconcentratie) aan te passen en vervolgens de test over te brengen naar het HCS-platform18. We raden aan hetzelfde te doen en deze parameters te verfijnen, omdat ze van lab tot lab kunnen veranderen. Bij het opzetten van de test is het belangrijk om speciale aandacht te besteden aan enkele van de kritieke stappen van de procedure. Het standaardiseren van kweekcondities (splitsingsfrequentie, celvoeding, platingconsistentie) voor zowel NK-cellen als doelcellen kan de reproduceerbaarheid van ADCC-efficiëntie verhogen. Bovendien moet het suspenseren van NK-celculturen met zorg worden uitgevoerd, omdat deze cellen gevoelig zijn voor mechanische stress (Guti et al. ongepubliceerde observatie). Wat de samenstellingsbibliotheek betreft, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle putten gelijke volumes teststoffen bevatten als pingereedschappen worden gebruikt voor de overdracht van verbindingen van de bibliotheekplaat naar de testplaat. Dit kan voorkomen dat verschillende hoeveelheden samengestelde oplossingen aan de buitenkant van de pinnen blijven plakken. Bovendien moeten hitverbindingen die in een scherm worden geïdentificeerd, bij voorkeur worden gevalideerd in een betrouwbare test op basis van een ander principe. Hiervoor adviseren wij de op ECIS gebaseerde methode11 (zie hierboven in de Inleiding).
Tot slot hebben we een JIMT-1 EGFP-gebaseerd in vitro ADCC-testsysteem opgezet dat geschikt is voor het testen van samengestelde bibliotheken met geautomatiseerde beeldanalyse. De methode was geschikt voor de identificatie van farmacen met bekende ADCC-modificerende effecten. De methode is potentieel geschikt voor de bepaling van kankerceldood veroorzaakt door trastuzumab-geneesmiddelconjugaten (bijv. Recent ontwikkelde trastuzumab-emtansine21) waarbij het toxiciteitsmechanisme complexer is en slechts gedeeltelijk wordt veroorzaakt door ADCC en gedeeltelijk door de tubulijnremmer mertansine. In de toekomst zijn we van plan om de technologie te gebruiken om ADCC te kwantificeren in 3D-sferoïden, die een nauwkeurigere weerspiegeling van tumorgedrag vertegenwoordigen dan 2D-modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs melden geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
LV ontving financiering van de subsidies van het National Research, Development and Innovation Office GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE en OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 cellen werden verkregen van Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, namens Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), worden wereldwijd beschermd door patenten en werden in licentie gegeven door Nantkwest, lnc. De auteurs zijn György Vereb en Árpád Szöőr dankbaar voor hun hulp bij het gebruik van de NK-92 cellijn en voor technisch advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
