Summary
Denne protokol præsenterer en automatiseret, billedbaseret high-throughput teknik til at identificere forbindelser, der modulerer naturligt dræbercellemedieret brystkræftcelledrab i nærvær af et terapeutisk anti-HER-2-antistof.
Abstract
Immunterapi med antigenspecifikke antistoffer eller immuncheckpoint-hæmmere har revolutioneret behandlingen af brystkræft. Brystkræftceller, der udtrykker den epidermale vækstfaktorreceptor HER2, kan målrettes af anti-HER-2-antistoffet trastuzumab. Antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) er en vigtig mekanisme, der er impliceret i antitumorvirkningen af HER-2. Trastuzumab bundet til kræftceller kan genkendes af Fc-receptorerne i ADCC-effektorceller (f.eks. naturlige dræberceller (NK), makrofager og granulocytter), hvilket udløser disse immuncellers cytotoksiske aktivitet, der fører til kræftcelledød. Vi satte os for at udvikle et billedbaseret assay til kvantificering af ADCC for at identificere nye ADCC-modulatorforbindelser ved screening med højt indhold. I analysen dyrkes HER2-overekspression af JIMT-1 brystkræftceller sammen med NK-92-celler i nærvær af trastuzumab, og målcelledød kvantificeres ved automatiseret mikroskopi og kvantitativ billedanalyse. Målceller skelnes fra effektorceller baseret på deres EGFP-fluorescens. Vi viser, hvordan sammensatte biblioteker kan testes i analysen for at identificere ADCC-modulatorlægemidler. Til dette formål blev en sammensat bibliotekstestplade oprettet ved hjælp af tilfældigt udvalgte fine kemikalier fra laboratoriehylden. Tre mikrotubulusdestabiliserende forbindelser (colchicin, vincristin, podophyllotoxin), der forventes at interferere med NK-cellemigration og degranulering, blev også inkluderet i testbiblioteket. Testskærmen identificerede alle tre positive kontrolforbindelser som hits, der beviser metodens egnethed til at identificere ADCC-modificerende lægemidler i et kemisk bibliotek. Med dette assay kan sammensatte biblioteksskærme udføres for at identificere ADCC-forstærkende forbindelser, der kan anvendes som adjuverende terapeutiske midler til behandling af patienter, der modtager anticancerimmunterapier. Derudover kan metoden også bruges til at identificere eventuelle uønskede ADCC-hæmmende bivirkninger af terapeutiske lægemidler taget af kræftpatienter til forskellige indikationer.
Introduction
Immunterapi med anticancerantistoffer, immuncheckpointhæmmere eller kimære antigenreceptorekspressive T (CAR-T) celler repræsenterer en kraftfuld tilgang til kræftbehandling 1,2,3. Trastuzumab er et humaniseret monoklonalt anti-HER-2 (humant epidermal vækstfaktorreceptor 2) antistof, der anvendes til behandling af HER-2-positiv brystkræft i et tidligt stadium eller metastatisk brystkræft, samt HER-2-positiv metastatisk gastrisk cancer 4,5,6. Det virker primært ved at hæmme den proliferationsstimulerende virkning af den epidermale vækstfaktor4. Det er imidlertid blevet rapporteret, at trastuzumab effektivt udløser kræftcelledød, selvom kræftcellerne har mistet deres lydhørhed over for HER-2-stimulering7. Denne paradoksale virkning af antistoffet skyldes antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC)7. ADCC kan medieres af naturlige dræberceller (NK), granulocytter og makrofager, samlet kendt som effektorcellerne i ADCC 8,9. Hvis et antistof, såsom trastuzumab, binder til tumorceller, bruger disse effektorceller deres Fc-receptorer til at binde antistoffets konstante (Fc) region. Antistoffet bygger bro mellem tumorcellerne og de Fc-receptorbærende effektorceller, hvilket udløser frigivelsen af deres cytotoksiske mediatorer10. Naturlige dræberceller frigiver den cytotoksiske last af deres granulater indeholdende perforin for at generere porer i målcellemembranen og granzym (udløsende signalveje for celledød) i immunsynapsen, hvilket fører til apoptose af kræftcellerne (se figur 1).
Figur 1: Effektor- og målcelleinteraktioner i ADCC. Celleoverfladen Fcγ-receptoren i effektoren NK-cellen genkender Fc-regionen af anti-HER2-trastuzumab-antistoffet, der er specifikt for HER2-molekylet udtrykt på overfladen af tumorcellen. Således etableres den såkaldte immunologiske synaps mellem de to celler, hvilket inducerer den rettede exocytose af cytotoksiske granuler af effektorcellen. De frigivne perforin- og granzymmolekyler resulterer i sidste ende i apoptose af målcellen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Flere assays er tidligere blevet udviklet til kvantificering af cytotoksicitet, herunder ADCC. Guldstandarden er den radioaktive kromfrigivelsesmetode, hvor målcellerne mærkes med radioaktiv 51Cr isotop, og ADCC kvantificeres ved at måle radioaktivitet fra supernatanten af lyserede målceller11. På grund af de åbenlyse problemer på grund af den strengt regulerede håndtering, opbevaring og bortskaffelse af radioaktive farmakoner og affald er denne metode blevet mere og mere upopulær blandt bioforskere. Derudover er det heller ikke acceptabelt for applikationer med høj kapacitet. Måling af aktiviteten af enzymer (f.eks. lactat-dehydrogenase) frigivet fra de dræbte målceller kan tilvejebringe et ikke-radioaktivt alternativ til 51Cr-analysen12. Disse analyser skelner imidlertid ikke mellem mål- og effektorcelledødsfald. ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) viste sig at være egnet til kvantificering af ADCC13, men ECIS-udstyret er ikke tilgængeligt i de fleste laboratorier, og teknikken er ikke kompatibel med applikationer/screening med høj kapacitet. Fluorescerende mærkede celler repræsenterer et populært alternativ i mange cellebiologiske assays og bruges ofte i flowcytometri eller pladelæserbaserede applikationer14,15,16. Disse analyser indeholder imidlertid ofte vasketrin eller er på anden måde uforenelige med applikationer med høj kapacitet (f.eks. flowcytometribaserede teknikker). Nogle populære cytotoksicitetsanalyser, som i teorien burde være egnede til ADCC-kvantificering, bestemmer ikke pålideligt ADCC-effektivitet13. For nylig, med spredningen af fluorescerende konfokal mikroskopi, bliver billedbaserede assays med højt indhold stadig mere populære inden for forskellige områder af biovidenskab17. På den ene side er cellebilleddannelsesudstyr nu ret allestedsnærværende, mens der på den anden side kan indsamles næsten uendelige morfologiske parametre fra de erhvervede billeder. Derfor satte vi os for at udvikle et ADCC-assay med højt indhold og demonstrere dets egnethed til screening af sammensatte biblioteker.
Her præsenterer vi et billedbaseret ADCC-assay og demonstrerer, hvordan dette assay kan bruges til High-Content Screening (HCS) til at identificere ADCC-modulerende forbindelser. Modellen er baseret på JIMT-1 brystkarcinommålceller, CD16.176V.NK-92 effektorceller og det humaniserede monoklonale anti-HER2-antistof trastuzumab. Med denne metode er det muligt at identificere lægemidler, der kan forbedre NK-cellernes tumordræbende virkning eller at få indsigt i mekanismen bag NK-cellemedieret ADCC ved at identificere små molekyler, der interfererer med ADCC. Vi foreslår, at bioforskere, der sigter mod at kvantificere cellemedieret cytotoksicitet med særligt hensyn til ADCC, kan drage fordel af at bruge dette assay enten til opdagelsesvidenskab eller lægemiddeludvikling. Dette assay kan være et alternativ, hvis et laboratorium har adgang til og en vis erfaring med fluorescerende billeddannelse og kvantitativ billedanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: De vigtigste trin i analysearbejdsgangen er vist i figur 2.
Figur 2: Arbejdsforløb på ADCC-skærmen. JIMT-1-EGFP målceller podet i 96 brønd HCS-plader behandles med lægemidler fra det sammensatte bibliotek. Til gengæld tilsættes ufarvede NK (effektor) celler og trastuzumab, og pladen afbildes ved 0 tidspunkt og efter 3 timers inkubation. ADCC-evaluering er baseret på ændringen i antallet af levedygtige (overfladeklæbende) målceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Belægning af HCS-pladen
- Overtræk de 96 HSC-plader (well high-content screening) med 50 μL/brønd JIMT-1 medium (DMEM/F-12 medium suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS), 0,3 E/ml insulin (100 IE/ml, Humulin R, og 1% penicillin-streptomycin).
- Pladen anbringes i en CO2 -inkubator i 1 time.
BEMÆRK: Belægning er afgørende for fastgørelse af JIMT-1-celler til pladens glasoverflade.
2. Såning af JIMT-1 forbedrede grønne fluorescerende proteinceller (EGFP)
BEMÆRK: EGFP-ekspressive JIMT-1-celler blev genereret i vores tidligere arbejde18, og cellerne blev dyrket i T25-vævskulturkolber i JIMT-1-medier (se sammensætning i trin 1.1).
- Cellerne vaskes med 2 ml sterilt PBS.
- Der tilsættes 1 ml trypsin-EDTA til kolben og kolben sættes tilbage i en CO2 -inkubator i 10 minutter.
- Efter inkubationen skal du trykke på kolben for at kontrollere, om JIMT-1-celler er løsnet.
- Stop fordøjelsen med 2 ml JIMT-1 medier og saml cellesuspensionen i et 15 ml rør.
- Tæl cellerne med 0,4% trypanblå (80 μL farvestof + 20 μL cellesuspension) i et Bürker-kammer og juster cellenummeret til 133.000 celler / ml.
- Opsug belægningsmediet fra 96-brøndpladen (trin 1.2).
- Der pipetteres 75 μL af celleopslæmningen til hvert hul i HCS-pladerne (se materialetabellen).
- Lad cellerne binde sig under en inkubation natten over ved 37 °C i en CO2 -inkubator.
3. Forbehandling af JIMT-1 EGFP-celler med det sammensatte bibliotek
- Opsug mediet fra JIMT-1-cellerne og tilsæt 50 μL/frisk JIMT-1-medium til hullerne. Overfør pladen til screeningslaboratoriet med høj kapacitet.
BEMÆRK: Brug af en væskehåndteringsrobot gør tilføjelsen af sammensatte biblioteker mere effektiv og reproducerbar. - Testforbindelserne overføres fra den sammensatte biblioteksplade til analysepladen med et stiftværktøj, der er kalibreret til et volumen på 25 nul. Udfør dette fire gange. Fire overførselsrunder giver et slutvolumen på 100 nL (og en slutkoncentration på 20 μM).
- Mellem hvert trin skal du vaske stiftværktøjet, først med 50% DMSO og derefter med 70% ethanol.
- Pladerne inkuberes i 1 time i en CO2 -inkubator ved 37 °C.
4. Start ADCC-analysen ved at tilføje effektorcellerne
BEMÆRK: CD16.176V.NK92-celler (i det følgende benævnt NK92-celler) blev dyrket i α-MEM suppleret med 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pyruvat, 1% glutamin, 1% penicillin-streptomycin og 100 IE / ml IL-2.
- Tæl NK92-celler med trypanblåt (80 μL farvestof + 20 μL cellesuspension). Juster cellenummeret til 400.000 celler/ml.
- Der centrifugeres 4 ml cellesuspension ved 150 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- ADCC-substratet fremstilles ved at tilsætte 20 μg/ml anti-HER2-antistof (trastuzumab) til JIMT-1-mediet.
- NK-cellepelleten resuspenderes i 5 ml ADCC-medium.
- Pipette 20.000 NK-celler i 50 μL ADCC-medium til mål-JIMT-1-cellerne. Det endelige volumen er 100 μL, og den endelige trastuzumabkoncentration er 10 μg/ml.
- Analysepladen anbringes i analyseudstyret med højt indhold med en indbygget inkubator indstillet til 37 °C.
5. Billedbehandling
BEMÆRK: Pladerne skal afbildes på to tidspunkter, først umiddelbart efter tilsætning af effektorcellerne til målcellerne og for det andet 3 timer efter tilsætning af NK-celler. Til billeddannelse kan højindholdsanalysatoren og dens software eller egnede alternativer anvendes (se materialetabel).
- Vælg Pladetype (96-brønds cellebærer ultra) på listen over plader.
- Vælg autofokus med to spidser , hvis analysen udføres i plader.
- Brug 10x mål i ikke-konfokal tilstand.
- Vælg Binning 2 for at fordoble signal/støj-forholdet.
- Tag brightfield-billeder ved 650-760 nm og fluorescerende billeder af EGFP-transducerede JIMT-1-celler ved 488 nm (excitation) og 500-550 nm (emission) bølgelængder.
- Vælg antallet af felter og antallet af tidspunkter for billeddannelsen.
6. Billedanalyse
BEMÆRK: For at analysere ADCC-effektiviteten tælles de levedygtige JIMT-1-celler. Målceller dræbt af ADCC løsner sig fra overfladen og bevæger sig væk fra mikroskopets brændplan. Derfor svarer forskellen mellem antallet af levedygtige celler i begyndelsen og slutningen af ADCC-reaktionen til målceller elimineret af ADCC. For at vise, hvordan man opbygger evalueringssekvensen, vises en kontrol-ADCC-brønd i videoen.
- Brug modulet Find celler til at registrere områder på billedet, der svarer til celler .
BEMÆRK: Hver celle registreres som et område på billedet med en højere fluorescensintensitet end dens omgivelser. - Vælg celler ved hjælp af den indbyggede M-algoritme med en diameter på mindst 80 μm.
- Indstil Opdelingsfølsomhed, som uddeler et stort objekt i mindre objekter, til 0,5.
- Indstil den fælles tærskel (det laveste niveau af pixelintensitet) til 0.
- Udeluk detektion af baggrundsområde med høj EGFP-fluorescensintensitet i to trin.
- Brug først funktionen Beregn intensitetsegenskaber til at bestemme EGFP-fluorescensintensiteten i det tidligere valgte celleområde .
- Indstil minimums- og maksimumsintensitetstærsklen ved hjælp af indstillingen Vælg population .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere, hvordan analysen fungerer i det virkelige liv, oprettede vi et testbibliotek med 16 forbindelser udvalgt tilfældigt fra laboratoriehylderne (figur 3). Derudover blev DMSO også inkluderet som en negativ kontrol og tre mikrotubuluspolymerisationshæmmere (colchicin, vincristin og podophyllotoxin) som positive kontroller. Sidstnævnte forventedes at hæmme ADCC ved at forstyrre NK-cellemigration til kræftcellerne og NK-celledegranulering. Alle teststoffer og DMSO blev anbragt på testbibliotekspladen i fire eksemplarer, og DMSO blev også tilføjet til pladens første og sidste kolonne (figur 3).
Figur 3: Det sammensatte bibliotek, der anvendes til test af HCS ADCC-assayet. (A) Pladekortet over det sammensatte bibliotek vises. Hver forbindelse er til stede på bibliotekspladen i quadruplicater. DMSO blev tilføjet som en negativ kontrol til den første og sidste kolonne på pladen. Brønde indeholdende DMSO og de tre mikrotubulussamlingshæmmere (colchicin, vincristin og podophyllotoxin) fremhæves i farve. (B) Navne, pladepositioner og forkortede navne på teststoffer præsenteres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Ved hjælp af vores testbibliotek kørte vi analysen og evaluerede resultaterne som beskrevet i protokollen. Da JIMT-1-celler udtrykker EGFP, kan de let skelnes fra effektorcellerne, der er ikke-fluorescerende. Analysen er baseret på påvisning af ændringen i antallet af overfladevedhængende (levedygtige) målceller. Under vores analysebetingelser forårsagede NK-celler ca. 50% JIMT-1-celledød (+NK-gruppe), mens ingen af testforbindelserne forårsagede nogen toksicitet i fravær af NK-celler (-NK-gruppe) (figur 4). Analysebetingelserne blev tidligere optimeret til at opnå dette mediumniveau af cytotoksicitet18, idet det antages, at dette ville muliggøre identifikation af både ADCC-aktivator- og inhibitorforbindelser. De positive kontrolmikrotubulussamlingshæmmere viste sig som "hits" i alle firedobbelte positioner som forventet, hvilket indikerer analysens høje pålidelighed (figur 4).
Figur 4: Test af et sammensat bibliotek i ADCC-modellen. (A) Billeder af ADCC-reaktioner blev taget 3 timer efter co-inkubation af NK-celler og JIMT-1-celler i nærværelse af DMSO med 10x-målet for HCS-billeddanneren. (Skalabjælken er 200 μm.) En del af billedet er forstørret og viser de ubejdsede effektor-NK-celler og de EGFP-transducerede JIMT-1-målceller. (Forstørrelsen af det originale billede er 4x, skalabjælken er 50 μm.) (B) ADCC-analysen blev udført med EGFP-transduceret JIMT-1 brystkarcinomcellelinje og CD16.176 V.NK-92-cellelinje. Det anvendte effektor til målforhold (E:T) var 2:1. I tilfælde af -NK-gruppen blev JIMT-1 EGFP-cellerne inkuberet uden NK-celler og anti-HER2-antistof, mens der i +NK-gruppen (ADCC) blev tilsat 10 μg/ml trastuzumab til JIMT-1- og NK-cellesamkulturerne. Antallet af levedygtige JIMT-1-EGFP-celler blev påvist ved hjælp af analyseudstyr med højt indhold umiddelbart efter tilsætning af NK-celler og efter 3 timers inkubation. Målcellelevedygtigheden i +NK-gruppen var 50% af den i -NK-gruppen. Den røde stiplede linje viser tærskelværdien, som repræsenterer prøver med ≥70% levedygtighed sammenlignet med gennemsnittet af DMSO-kontroldrab (n = 20). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADCC-reaktionen er blevet beskrevet for relativt længe siden. Vigtige molekylære begivenheder i processen er også blevet beskrevet19. Metoder til måling af ADCC spænder fra guldstandarden radioaktiv kromfrigivelsesanalyse, cytoplasmatisk enzymfrigivelsesassays til flere fluorescensbaserede flowcytometri- eller mikropladeassays20. En almindelig begrænsning ved disse analyser er imidlertid, at de ikke er modtagelige for applikationer med høj kapacitet. Tidligere udviklede vi et billedbaseret HCS-assay, der var egnet til screening af sammensatte biblioteker for ADCC-modificerende lægemidler18. Det tidligere udviklede assay havde imidlertid en stor ulempe, dvs. det krævede et vasketrin, fordi målcellerne skulle farves med calcein-acetoxymethylesther, og det overskydende farvestof skulle fjernes før tilsætning af NK-cellerne og trastuzumab. Den nuværende metode repræsenterer en avanceret version af analysen, idet brugen af EGFP-transducerede JIMT-1-celler tillader ligetil differentiering mellem effektor- og målceller uden et farvnings- og vasketrin. Desuden skal man også være opmærksom på det træk ved vores analyse, at den ikke kan skelne mellem døde og døende celler (endnu ikke helt løsrevet). Desuden er det muligt, at testforbindelserne kan øge celleadhæsionen, og som følge heraf kan cellerester forblive i fokalplanet, hvilket resulterer i et falsk positivt resultat. Derudover kan testforbindelsernes fluorescerende egenskaber forårsage interferens. Derfor, selvom skærme typisk køres én gang, anbefales det stærkt at validere hits i andre typer assays også. Yderligere begrænsninger af vores analyse inkluderer indirekte identifikation af celledød, dvs. metoden er baseret på kvantificering af ændringen i antallet af levedygtige celler i stedet for døde celler. Det er dog vigtigt at bemærke her, at en tidligere undersøgelse viste, at ECIS-baseret påvisning af levedygtige celler var bedre end nogle af de metoder, der direkte måler celledød13. Derfor repræsenterer denne funktion af vores metode ikke nødvendigvis en ulempe. Hvad der virkelig kan begrænse anvendelsen af dette assay er imidlertid, at det kræver mindst en grundlæggende viden inden for avanceret billedanalyse, en færdighed, der bliver mere og mere almindelig i dag.
Selvom hidtil et lille bibliotek (mindre end 1000 forbindelser) er blevet testet med den originale version af analysen18. Vi har endnu ikke identificeret et ADCC booster lægemiddel. Årsagen til dette kan være, at ADCC-aktivatorer kan være sjældne, og meget større biblioteker skal screenes for at identificere en. Teoretisk set er det også muligt, at når ADCC-reaktionen starter, fortsætter den uden større begrænsende trin, så processen ville være vanskelig at forbedre yderligere med en farmakon. En mulig måde at omgå dette problem kan være at undertrykke ADCC-aktivitet (f.eks. med kortikosteroider) og køre skærmen på udkig efter forbindelser, der gendanner fuld ADCC-aktivitet. Ikke desto mindre mener vi, at identifikation af ADCC-hæmmende virkning af kendte lægemidler også kan være vigtig for at øge bevidstheden om klinikere, der ordinerer disse lægemidler til patienter med forskellige indikationer.
Hvad angår de tekniske detaljer i assayet, anbefaler vi, at analysen opstilles parallelt med en alternativ cytotoksicitetstest. I vores hånd viste ECIS (elektrisk celle-substratimpedans sensing) sig at være det mest pålidelige system til kvantificering af ADCC-effektivitet13. I starten af projektet blev ECIS brugt til at justere kritiske parametre (tid, effektor til målcelleforhold, trastuzumabkoncentration) og overførte derefter analysen til HCS-platformen18. Vi anbefaler at gøre det samme og finjustere disse parametre, da de kan ændre sig fra laboratorium til laboratorium. Ved opsætning af analysen er det vigtigt at være særlig opmærksom på nogle af de kritiske trin i proceduren. Standardisering af dyrkningsbetingelser (opdelingsfrekvens, cellefodring, pletteringskonsistens) for både NK-celler og målceller kan øge reproducerbarheden af ADCC-effektivitet. Desuden skal suspension af NK-cellekulturer udføres med forsigtighed, da disse celler har tendens til at være følsomme over for mekanisk stress (Guti et al. upubliceret observation). Hvad angår det sammensatte bibliotek, er det vigtigt at sikre, at alle brønde indeholder lige store mængder testforbindelser, hvis der anvendes stiftværktøjer til overførsel af forbindelser fra bibliotekspladen til analysepladen. Dette kan forhindre varierende mængder af sammensatte opløsninger i at klæbe til ydersiden af stifterne. Desuden bør hitforbindelser, der identificeres på en skærm, valideres, helst i et pålideligt assay baseret på et andet princip. Til dette anbefaler vi ECIS-baseret metode11 (se ovenfor i indledningen).
Afslutningsvis oprettede vi et JIMT-1 EGFP-baseret in vitro ADCC-assaysystem, der er egnet til test af sammensatte biblioteker med automatiseret billedanalyse. Metoden var egnet til identifikation af farmakoner med kendte ADCC-modificerende virkninger. Metoden er potentielt egnet til bestemmelse af kræftcelledød forårsaget af trastuzumab-lægemiddelkonjugater (f.eks. nyligt udviklet trastuzumab-emtansin21), hvor toksicitetsmekanismen er mere kompleks og kun delvist er forårsaget af ADCC og delvist af tubulinhæmmeren mertansin. I fremtiden planlægger vi at vedtage teknologien til at kvantificere ADCC i 3D-sfæroider, som repræsenterer en mere nøjagtig afspejling af tumoradfærd end 2D-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere rapporterer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
LV modtog støtte fra National Research, Development and Innovation Office bevillinger GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE og OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 celler blev opnået fra Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, på vegne af Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), er beskyttet af patenter over hele verden og blev licenseret af Nantkwest, lnc. Forfatterne er taknemmelige for György Vereb og Árpád Szöőr for deres hjælp med brugen af NK-92-cellelinjen og for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
