Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.
Abstract
אפיתל המעי מתחדש כל 5-7 ימים, ונשלט על ידי אוכלוסיית תאי הגזע של אפיתל המעי (IESC) הממוקמת בתחתית אזור הקריפטה. IESCs כוללים תאי גזע פעילים, המחדשים את עצמם ומתמיינים לסוגי תאי אפיתל שונים, ותאי גזע שקטים, המשמשים כתאי גזע עתודות במקרה של פציעה. התחדשות אפיתל המעי נשלטת על ידי יכולות ההתחדשות וההבחנה של IESCs פעילים אלה. בנוסף, איזון אוכלוסיית תאי הגזע בקריפטה ושמירה על נישת תאי הגזע חיוניים להתחדשות המעיים. תרבית אורגנואידית היא גישה חשובה ואטרקטיבית לחקר חלבונים, מולקולות איתות ורמזים סביבתיים המווסתים את ההישרדות והתפקוד של תאי גזע. דגם זה זול יותר, גוזל פחות זמן וניתן למניפולציה רבה יותר ממודלים של בעלי חיים. אורגנואידים גם מחקים את המיקרו-סביבה של הרקמה, ומספקים רלוונטיות in vivo . הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בידודן של קריפטות המעי הגס, הטמעת תאי קריפטה מבודדים אלה במערכת מטריצת ג'ל תלת-ממדית והפיכת תאי קריפטה ליצירת אורגנואידים של המעי הגס המסוגלים לארגון עצמי, התפשטות, התחדשות עצמית והתמיינות. מודל זה מאפשר לאדם לתמרן את הסביבה - לדפוק חלבונים ספציפיים כגון claudin-7, הפעלה/השבתה של מסלולי איתות וכו' - כדי לחקור כיצד השפעות אלה משפיעות על תפקודם של תאי גזע במעי הגס. באופן ספציפי, נבדק תפקידו של חלבון הצומת ההדוק קלודין-7 בתפקוד תאי גזע המעי הגס. Claudin-7 חיוני לשמירה על הומאוסטזיס במעיים ועל תפקוד המחסום ותקינותם. נוקאאוט של קלודין-7 בעכברים גורם לפנוטיפ דמוי מחלת מעי דלקתית המציג דלקת מעיים, היפרפלזיה אפיתליאלית, ירידה במשקל, כיבים ברירית, רפיון תאי אפיתל ואדנומות. בעבר דווח כי קלודין-7 נדרש לתפקודי תאי גזע אפיתל במעי הדק. בפרוטוקול זה, מערכת תרבית אורגנואידית המעי הגס הוקמה כדי לחקור את התפקיד של claudin-7 במעי הגס.
Introduction
תרבית אורגנואידית מעיים היא מערכת ex vivo תלת-ממדית (3D) שבה מבודדים תאי גזע משכבות המעיים של הרקמה הראשונית ומצופים למטריצת ג'ל 1,2. תאי גזע אלה מסוגלים להתחדשות עצמית, ארגון עצמי ותפקוד איברים2. אורגנואידים מחקים את המיקרו-סביבה של הרקמה ודומים יותר למודלים של in vivo מאשר למודלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תרביות תאים במבחנה, אם כי פחות ניתנים למניפולציה מאשר לתאים 3,4. מודל זה מבטל מכשולים שנתקלים בהם במודלים דו-ממדיים, כגון היעדר הידבקויות תקינות בין תאים לתאים, אינטראקציות בין תאים ואוכלוסיות הומוגניות, וגם מצמצם את המגבלות של מודלים של בעלי חיים, כולל עלויות גבוהות ותקופות זמן ארוכות5. אורגנואידים במעיים - המכונים גם קולונואידים עבור אלה שגדלו מתאי גזע שמקורם בקריפטה של המעי הגס - הם למעשה מיני-איברים המכילים אפיתל הכולל את כל סוגי התאים שיהיו נוכחים ב- vivo, כמו גם לומן. מודל זה מאפשר מניפולציה של המערכת כדי לחקור היבטים רבים של המעי, כגון נישה של תאי גזע, פיזיולוגיה של המעי, פתופיזיולוגיה ומורפוגנזה של המעיים 3,5,6. הוא גם מספק מודל נהדר לגילוי תרופות, חקר הפרעות מעיים אנושיות כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן המעי הגס, פיתוח טיפול מותאם אישית ספציפי למטופל, וחקר התחדשות רקמות 4,7,8,9. בנוסף, המערכת האורגנואידית יכולה לשמש גם לחקר תקשורת תאית, מטבוליזם של תרופות, כדאיות, התפשטות ותגובה לגירויים 7,8. בעוד שניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים כדי לבחון טיפולים פוטנציאליים עבור מצבים פתולוגיים במעיים, הם מוגבלים למדי, מכיוון שחקר תרופות מרובות בו-זמנית מהווה אתגר. ישנם משתנים מבלבלים יותר in vivo, והעלות והזמן הקשורים הם גבוהים וארוכים, בהתאמה. מאידך גיסא, מערכת התרבית האורגנואידית מאפשרת סינון של טיפולים רבים בבת אחת בפרק זמן קצר יותר וכן מאפשרת טיפול מותאם אישית באמצעות שימוש בתרבית אורגנואידיתשמקורה בחולה 4,8. היכולת של אורגנואידים במעי הגס לחקות ארגון רקמות, מיקרו-סביבה ופונקציונליות הופכת אותם גם למודל מצוין לחקר התחדשות ותיקון רקמות9. המעבדה שלנו הקימה מערכת תרבית אורגנואידית במעי הדק כדי לחקור את ההשפעה של קלודין-7 על תפקודי תאי גזע במעי הדק10. במחקר זה הוקמה מערכת תרבית אורגנואידית במעי הגס כדי לחקור את יכולתם, או חוסר יכולתם של תאי גזע, לחדש את עצמם, להתמיין ולהתרבות במודל של נוקאאוט קלודין-7 מותנה (cKO).
קלודין-7 הוא חלבון חשוב מאוד של צומת הדוק (TJ) המתבטא מאוד במעי וחיוני לשמירה על תפקוד ותקינות TJ11. עכברי cKO סובלים מפנוטיפ דמוי IBD, המציג דלקת קשה, כיבים, רפיון תאי אפיתל, אדנומות ורמות ציטוקינים מוגברות11,12. בעוד שמקובל לחשוב שקלודינים חיוניים לתפקוד מחסום אפיתל, מתפתחים תפקידים חדשים לקלאודינים; הם מעורבים בהתפשטות, הגירה, התקדמות סרטן ותפקוד תאי גזע 10,12,13,14,15,16,17. כיום לא ידוע כיצד קלודין-7 משפיע על נישה של תאי גזע ותפקוד של תאי גזע במעי הגס. מכיוון שהמעי מתחדש במהירות כל 5-7 ימים בערך, תחזוקה של נישת תאי הגזע ותפקוד תקין של תאי הגזע הפעילים חיוניים18. כאן הוקמה מערכת לבחינת ההשפעות הרגולטוריות הפוטנציאליות של קלודין-7 על נישת תאי הגזע של המעי הגס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים והנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מזרח קרוליינה (ECU) (IACUC) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ו-ECU לגבי טיפול ושימוש בחיות מעבדה. עכברי נוקאאוט מסוג claudin-7 שאינם ניתנים להשראה וספציפיים למעיים נוצרו על-ידי חציית C57BL6 claudin-7-flox עכברים מהונדסים עם עכברי Villin-CreERT219. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות בני 3 חודשים.
1. הכנת ריאגנט/ציוד
- לקרר את הריאגנטים/הציוד הבאים לפני תחילת הניסויים הקשורים אליהם: מלח חצוב פוספט (PBS) לשטיפת רקמת המעי הגס במהלך בידוד קריפטה; נדנדה/רוטטור (מקום במקרר 4 מעלות צלזיוס) לדגירה עם מדיית דיסוציאציה אפיתליאלית.
- מוציאים את מטריצת הג'ל (ראו טבלת חומרים) מ-20°C- ומפשירים על קרח לפני הציפוי.
- מצננים את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס לפני סיבוב הקריפטות לציפוי.
- מצננים 0.1% נתרן ציטראט (ראו טבלת חומרים) ושומרים על הקרח לפני זיהוי מוות של תאים באתרם .
- חממו את הריאגנטים הבאים לפני תחילת הניסויים הקשורים אליהם: צלחת תרבית של 96 בארות למשך 24 שעות לפני הציפוי; מדיית L-WRN (ראה טבלת חומרים) לפני הוספה לקריפטות מצופות ולפני כל שינוי מדיה.
- מחממים את אמבט המים ל-94°C לפני הכתמת.
2. בידוד קריפטת המעי הגס מורין
- הכן את המדיה הדרושה לפי השלבים הבאים.
הערה: נפחי המדיה מחושבים כאן עבור רקמת המעי הגס של שני עכברים.- הכן מדיית דיסוציאציה אפיתליאלית: 30 מ"ל של 1x PBS + 400 μL של 0.5 M EDTA + 50 μL של 10 mM Y-27632 דיהידרוכלוריד (ראה טבלת חומרים). יש לשמור על הקרח עד לשימוש.
- הכן מדיה דיסוציאציה קריפטה: 10 מ"ל של 1x PBS + 10 μL של 10 mM Y-27632 דיהידרוכלוריד. יש לשמור על הקרח עד לשימוש.
- תוסף L-WRN מדיה: 50 מ"ל של מדיה L-WRN + 47.5 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין + 500 μL של L-גלוטמין + 500 μL של פניצילין/סטרפטומיצין + 1,000 μL של תוסף B-27 (50x) + 500 μL של תוסף N2 (100x) + 50 μL של HEPES (1 M) פתרון חיץ (ראה טבלת חומרים).
- סנן את מדיית ה-L-WRN המלאה (הנוספת) ואת ה-aliquot לאחסון בטמפרטורה של -20°C למשך עד 3 חודשים.
הערה: המדיה המופשרה יציבה ב-4 °C למשך עד שבועיים.
- בצע את בידוד הקריפטה.
- להרדמה כללית, יש להוסיף 1 מ"ל של איזופלוראן לכותנה ולהניח אותה בתוך קלטת פלסטיק בתוך תא הרדמה של 0.09 רגל מעוקב (ראו טבלת חומרים). מניחים את העכבר בתא ההרדמה עד שהנשימה נעצרת (כ-3-5 דקות) ולאחר מכן מבצעים נקע צוואר הרחם20.
- בצע חתך של כ-2 אינץ' לאורך קו האמצע של העכבר, תוך הצמדת העור האחורי לחשיפת הבטן. לבודד את המעי הגס על ידי חיתוך ממש מתחת לצקום מהצד הפרוקסימלי ומעל פי הטבעת מהצד הדיסטלי21.
- באמצעות מלקחיים, להסיר את רקמת השומן מחובר המעי הגס. דוחפים בעדינות את הצואה החוצה תוך שימוש בקצה השטוח של המלקחיים וחותכים את הרקמה לאורך.
- שטפו את הרקמה 10-15 פעמים עם PBS קר 1x באמצעות מלקחיים כדי "לסובב" את הרקמה סביב PBS בין שטיפות.
- באמצעות מספריים נקיים וחדים, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות, בגודל של כ -3-5 מ"מ.
- חזור על התהליך עבור העכבר השני ושלב את חתיכות הרקמה בצינור 50 מ"ל המכיל מדיית דיסוציאציה אפיתל קרה (שלב 2.1.1).
- דגירה של חתיכות רקמת המעי הגס במדיית דיסוציאציה אפיתל למשך 90 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.
- אפשרו לשברי הרקמה לשקוע לתחתית הצינור, ולאחר מכן השליכו בזהירות את מדיית הדיסוציאציה האפיתליאלית מבלי לשבש את הרקמה. חזור על תהליך זה בעת שטיפת הרקמה 10-15 פעמים עם PBS קר 1x. יש להשליך כמה שיותר PBS במהלך הכביסה הסופית.
- הוסיפו מדיית דיסוציאציה של קריפטה (שלב 2.1.2) לצינור 50 מ"ל המכיל חתיכות רקמת המעי הגס ונענעו ברציפות במשך 5-10 דקות ביד.
הערה: המדיה חייבת להיות עכורה מהקריפטות המנותקות. - מתחת למכסה המנוע של תרביות התאים, סננו את הרקמה והמדיה באמצעות מסננת תאי ניילון בגודל 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) לתוך צינור טרי של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע את הכדור המכיל קריפטה.
הערה: בהתאם לציוד, ניתן להעביר את המדיה המתוחה לצינור של 15 מ"ל עבור צנטריפוגה. - השהה את הכדור ב~ 3-4 מ"ל של PBS קר 1x.
- פיפטה 10 μL של הקריפטות המבודדות בשורה על שקופית מיקרוסקופ. תחת המיקרוסקופ, ספרו את מספר הקריפטות המלאות והארוכות כדי להעריך את ריכוז הקריפטה לכל 10 μL.
- חשב את הנפח המתאים של קריפטות כדי להסתובב למטה כדי לצלוח 10 קריפטות/μL בלוח של 96 בארות.
3. ציפוי קריפטה
- צנטריפוגה נפח מתאים של קריפטות מבודדות בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב 200 x גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 1,000 μL מבלי לשבש את הקריפטות הגלולות.
- הוסף 100 μL של מטריצת ג'ל (מספיק לתשע בארות) לקריפטות הכדוריות ולפיפטה בזהירות כדי למנוע החדרת בועות אוויר.
הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת תיאור מפורט של אופן הערבוב של מטריצת הג'ל והקריפטות. בדרך כלל, 100 μL מספיק עבור תשע בארות. - אפשרו למטריצת הג'ל להתמצק חלקית (~1-2 דקות).
- צלחת 10 μL של מטריצת הג'ל מעורבבת עם הקריפטות בכל באר של צלחת תרבית 96 באר שחוממה מראש ליצירת צורת כיפה.
הערה: מניחים את הכיפה במרכז הבאר. היזהרו לא לאפשר למטריצת הג'ל להתפשט לצידי הבאר. עיין בסעיף הדיון לקבלת תיאור מפורט על התמצקות וציפוי. - אפשר למטריצת הג'ל להיות מוגדרת במלואה במשך 10-20 דקות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- הכן את פתרון העבודה הסופי של מדיית L-WRN.
- יש להוסיף 100 μL פניצילין/סטרפטומיצין לאליקוט של 10 מ"ל של מדיית L-WRN (ראה שלב 2.1.3) (יציב במשך שבועיים ב-4 מעלות צלזיוס).
- הוסף תוספים ל-900 μL של מצע L-WRN עם פניצילין/סטרפטומיצין: 0.9 μL של 1 מ"ג/מ"ל EGF + 0.9 μL של 10 mM Y-27632 דיהידרוכלוריד.
הערה: הכרכים מבוססים על תשע בארות. Y-27632 דיהידרוכלוריד מתווסף רק ביום 0 (בזמן הציפוי).
- הוסף 100 μL של מדיה לכל באר. היזהר לא לשבש את הכיפה.
- דגירה ב-37°C עם 5% CO2 למשך 24 שעות.
4. יצירת נוקאאוט קלודין-7 בתרבות
- אפשרו לקריפטות לגדול כרגיל בתרבית במשך 24 שעות לאחר הציפוי.
- בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, יש להוסיף 2.7 מיקרו-ליטר של 1 מילימול/ל' 4-הידרוקסיטמוקסיפן (4OH-טמוקסיפן) ל-900 מיקרו-ל' של מדיית L-WRN (ריכוז סופי של 3 מיקרומול/ל') + 0.9 מיקרו-ל' של 1 מ"ג/מ"ל EGF.
הערה: תמיסת המלאי של 4OH-Tamoxifen מוכנה על-ידי ערבוב אבקת 4OH-טמוקסיפן (ראו טבלת חומרים) עם 1x PBS לריכוז של 1 mmol/L. - הסר מדיה ישנה מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום.
- הוסף 100 μL של מדיה המכילה 4OH-טמוקסיפן לכל באר ותייג אותם כקלודין-7 cKO/4OH-TAM.
הערה: יש להוסיף DMSO לבארות הבקרה. יש להוסיף מדיה טרייה המכילה 4OH-טמוקסיפן כל יומיים. - דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עד לשינוי המדיה הבא (~2-3 ימים).
5. תחזוקת אורגנואיד המעי הגס
הערה: יש לשנות את המדיה כל 2-3 ימים. תרבות עד 12 יום.
- הכן פתרון עבודה סופי טרי של מדיית L-WRN: 900 μL של מדיית L-WRN + 0.9 μL של 1 מ"ג / מ"ל EGF.
- הסר מדיה ישנה מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום. הוסיפו מדיה טרייה לבארות.
הערה: היזהר לא לשבש את הכיפה. - דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עד לשינוי המדיה הבא.
הערה: ניתן לשמור ולהעביר תרבויות למשך הזמן הרצוי לניסוי. התרביות של המחקר הנוכחי נשמרו בדרך כלל בין 9-12 ימים, אך ייתכן שתרצה להמשיך הלאה, במשך 15 או 20 יום.
6. קציר והטבעה של אורגנואידים במעי הגס
- הסר מדיה ישנה מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום.
- לתקן את האורגנואידים עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
הערה: PFA הוא חומר רעיל. נקוט אמצעי זהירות בעת שימוש במגיב זה. - הסר 4% PFA מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום והוסף 30% סוכרוז במשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
- תייג תבנית פלסטיק ומלא אותה עד 90% בתרכובת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) (ראו טבלת חומרים).
- יש להוציא 30% סוכרוז מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום. הוסף 10 μL של 1x PBS לכל באר.
- בעזרת קצה פיפטה, מגרדים בעדינות את תחתית הבאר כדי לנתק את הכיפה המכילה אורגנואידים.
- בעזרת פיפטה, הסר את ה- PBS המכיל את האורגנואידים המנותקים וטען את הנוזל לתבנית המכילה OCT.
הערה: יש להימנע מהכנסת בועות לתרכובת ה-OCT. - המשך בתהליך זה עד שכל האורגנואידים יוסרו מכל הבארות.
- בבקבוק דיואר מפלדת אל-חלד, הוסיפו כדורי קרח יבש ו-2-מתילבוטאן (מספיק כדי לכסות את כדורי הקרח היבשים) (ראו טבלת חומרים).
- יש להחזיק בהתמדה את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד מעל 2-מתילבוטאן כדי להקפיא את ההבזק.
- אחסנו את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד בטמפרטורה של -80°C עד שיהיה מוכן למקטע (ניתן לאחסן אותו עד שנה).
7. אימונופלואורסצנציה
- חתכו את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד בעובי של 5 מיקרומטר באמצעות קריוסטאט (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
- עבור כל קטע, בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שאורגנואיד נלכד. בסיום החיתוך, אחסנו את השקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנות להכתמה (ניתן לאחסן עד 6 חודשים).
- מחממים את המגלשות במאגר נתרן ציטראט של 10 mM למשך 10 דקות בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס.
הערה: החיץ נוצר על ידי המסת נתרן ציטראט במים שעברו דה-יוניזציה. התאם את ה- pH ל- 6 עם חומצה הידרוכלורית. - תנו למגלשות להתקרר על הספסל למשך 20 דקות. יש לשטוף במים מזוקקים למשך 5 דקות.
- הרכיבו את השקופיות במדף צביעה (ראו טבלת חומרים) עם 0.2% Triton X-100 ודגירה עם גליצין של 100 mM למשך 15 דקות.
- יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחת. יש לחסום עם אלבומין בסרום בקר (BSA) למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- דגירה עם claudin-7 נוגדן ארנב ראשוני22 (מדולל ב 1% BSA) לילה ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 10 דקות כל אחת.
- דגירה עם נוגדן משני נגד ארנב Cy323 (מדולל ב-1% BSA) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 10 דקות כל אחת.
- הרכב את המגלשות עם מדיום הרכבה מתאים (ראה טבלת חומרים) עם DAPI והוסף מכסה תלוש.
8. זיהוי מוות תאי
- לתקן את האורגנואידים בתוך הבארות עם 4% paraformaldehyde במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף עם PBS אחד למשך 5 דקות.
- דגרו את צלחת התרבית על קרח עם 0.1% טריטון X-100 בחיץ נתרן ציטראט קר של 0.1% למשך 2 דקות. יש לשטוף פעמיים עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחד.
- הכן את תגובת TUNEL24,25 באמצעות TMR Red, ערכה לזיהוי מוות תאי באתרה(ראו טבלת חומרים). הוסף 50 μL של ריאגנטים לתגובת TUNEL לכל באר.
- דגירה באטמוספירה לחה במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחושך.
הערה: יש להשלים את כל השלבים הנותרים בחושך. - יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחת. דגירה עם 1:2,500 Hoechst (מדולל ב 1x PBS, ראה טבלת חומרים) במשך 3 דקות.
- יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחת. השתמש במסנן TRITC כדי להמחיש תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לבחון את ההשפעות הרגולטוריות של קלודין-7 על תאי גזע של המעי הגס, בודדו קריפטות של המעי הגס מרקמת המעי הגס כפי שתואר לעיל ומוצג באיור 1A. לאחר שהקריפטות בודדו מהרקמה הראשונית, הן צופו במטריצה תלת-ממדית בלוח של 96 בארות כדי לגדול במשך 11 ימים (איור 1). קריפטות בריאות רגילות יסגרו את הלומן ויהפכו לספרואידים עד היום השני, ובסופו של דבר יתחילו לנדוד וליצור את סוגי תאי האפיתל השונים בערך ביום 5 (איור 1B). קולונואידים הורשו לגדול עד ליום ה-11, שם הם נקטפו לניסויים נוספים (איור 1B). כדי נוקאאוט קלודין-7 בתרבית, הקריפטות הורשו לגדול כרגיל במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הקריפטות טופלו ב-3 מיקרומול/L 4OH-טמוקסיפן (TAM) ותורבתו במשך 10 ימים נוספים. מדיום התרבות המכיל 4OH-TAM טרי השתנה כל יומיים. DMSO שימש ככלי רכב בבארות בקרה. קריפטות חסרות קלודין-7 (claudin-7 KO) לא הצליחו ליצור ספרואידים תקינים והחלו למות במהירות לאחר יום אחד של טיפול 4OH-TAM (איור 1B).
איור 2A מדגיש את הצמיחה המוצלחת של קולונואידים מקריפטות רגילות המכילות קלודין-7 (בקרה) ככל שהם מתקדמים לאורך 9 ימי התרבית. הקריפטות האלה התחילו ליצור ספרואידים ביום השני, התחילו לנדוד ביום 5, והמשיכו לגדול ולצמוח עד שנקטפו ביום התשיעי (איור 2A). לעומת זאת, קריפטות חסרות קלודין-7 (claudin-7 KO) הידרדרו מהר מאוד (איור 2B). כ-2-3 ימים לאחר הטיפול ב-4OH-TAM, קריפטות claudin-7 KO לא יצרו ספרואידים בעלי מראה בריא והופיעו רק כגושים מעגליים של תאים (איור 2B). קריפטות שבודדו מעכברים מסוג בר טופלו ב-4OH-TAM כדי לאשר שאין השפעה רעילה כתוצאה מטיפול בטמוקסיפן; קריפטות אלה הצליחו לשרוד ולגדול כרגיל. כדי לבחון את מחיקת claudin-7 ואת מצב ההישרדות של קולונואידים מסוג claudin-7 KO, נעשה שימוש בשיטה חיסונית ובערכה לזיהוי מוות של תאים באתרה (איור 3). כתמים אימונופלואורסצנטיים עבור קלודין-7 בבקרה שנקטפה ואורגנואידים cKO אישרו נוקאאוט מוצלח של קלודין-7 בתרבית (איור 3A). קולונואידים של בקרה ביום 9 הפגינו מעט מאוד אות אפופטוטי (איור 3B); עם זאת, קולונואידים מסוג claudin-7 KO הציגו אפופטוזיס גבוה (איור 3B). ללא קלודין-7, תאי הגזע לא יכלו לשרוד, לחדש את עצמם או להתמיין ליצירת קולונואידים.
איור 1: ייצוג סכמטי המציג בידוד קריפטה וצמיחה של קולונואידים . (A) תיאור גרפי של תהליך בידוד הקריפטה, ציפוי במטריצה התלת-ממדית וצמיחה עד לקציר. (B) ציר הזמן של ניסויים וגידול קולונואידים בבקרה ובקריפטות נגזרות KO של קלודין-7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: קולונואידים חסרי קלודין-7 אינם מסוגלים לשרוד ולגדול . (A) תמונות מייצגות של אורגנואידים של בקרה/DMSO ביום 3 וביום 9. (B) תמונות מייצגות של אורגנואידים 4OH-TAM/cKO ביום 3 וביום 9, n = 10. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: קולונואידים עם מחסור בקלודין-7 עוברים במהירות אפופטוזיס. (A) הכתמת קלודין-7 ביום 9/DMSO וקלודין-7 cKO/4OH-TAM אורגנואידים, n = 3. פסי קשקשים = 250 מיקרומטר. (B) כתמים אפופטוטיים בבקרת יום 9 וקולונואידים claudin-7 cKO/4OH-TAM, n = 3. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרבית אורגנואידית היא מודל מצוין לחקר תפקוד תאי גזע, פיזיולוגיה של המעי, גילוי תרופות, מחלות מעיים אנושיות והתחדשות ותיקון רקמות 7,8,9,10,11,26. אמנם יש לו יתרונות רבים, אך הוא יכול להיות מאתגר לבסס. יש להקפיד על כל השלבים לאורך הפרוטוקול, אך הכי חשוב בשלב הציפוי. בעת ערבוב הקריפטות המבודדות עם מטריצת ג'ל, הקפידו על פיפטה יסודית למעלה ולמטה כדי לשבור את גלולת הקריפטה שנוצרה בעקבות צנטריפוגה ולפזר את הקריפטות באופן שווה לאורך המטריצה. במקביל, הימנעו מהכנסת בועות אוויר לתוך המטריצה בזמן הפיפטה. על מנת לעשות זאת, pipetting חייב להיעשות לאט, עם קצה פיפטה לכיוון החלק התחתון של צינור 1.5 מ"ל.
בנוסף, מטריצת הג'ל לא חייבת להיות מוצקה במלואה לאורך כל התהליך הזה. כדי למנוע התמצקות מוקדמת, מערבבים על ידי פיפטציה זהירה, ואז מניחים את הצינור על קרח, וחוזרים על תהליך זה. לאחר שהקריפטות המבודדות ומטריצת הג'ל מעורבבות מספיק, אפשרו למטריצת הג'ל להתמצק חלקית. תהליך זה עשוי להימשך 1-5 דקות, בהתאם לסוג / מותג של מטריצת ג'ל בשימוש. זה חייב להיות דומה לג'ל כי יזוז מעט אם הצינור הוא tipped, אבל לא צריך להיות נוזלי מדי כי זה יישפך החוצה אם הפוך. בשלב זה, ניתן להתחיל לצפות 10 μL למרכז של כל באר. מטריצת הג'ל חייבת ליצור כיפה תלת ממדית ולא צריכה לגעת בצידי הבאר. אם מטריצת הג'ל מתפשטת ופוגעת בקיר הבאר, היא אינה מוצקה מספיק; המתן עד שהוא יתמצק מספיק כדי ליצור כיפה, שכן הקריפטות לא ישרדו ויגדלו אם הכיפה לא תיווצר. לאחר השלמת הציפוי כראוי, ותוספת מספקת של הקריפטות, כפי שהוסבר לעיל, האורגנואידים צפויים לגדול ללא בעיה.
פרוטוקול זה מקים מערכת אורגנואידית של המעי הגס עם או בלי קלודין-7 כדי לבחון את השפעותיה על הישרדות תאי הגזע של המעי הגס. בעוד שתרבית אורגנואידית המעי הגס היא מערכת חדשנית ובעלת יתרון, למודל עדיין יש מגבלות. בהתאם לסוג המחקר, היעדר תאים חיסוניים ואת המיקרוביוטה באורגנואידים במעיים עשוי להיות יתרון או חיסרון26. עבור המחקר הנוכחי, כדאי לחקור את התפקיד הרגולטורי של claudin-7 על תפקודי תאי גזע ללא מרכיב החיסון. המסקנה הייתה כי השפעה מסוימת נובעת באופן ספציפי מקלודין-7, ולא ממשתנים פוטנציאליים אחרים כגון התגובה החיסונית שתהיה נוכחת במודלים של בעלי חיים in vivo. לעומת זאת, גורם זה עשוי להיות מגבלה עבור סוגים אחרים של מחקרים. ביסוס תרבית אורגנואידית של המעי הגס עשוי גם להיות יקר יותר ועתיר זמן רב יותר מאשר קווי תאים דו-ממדיים מסורתיים. עם זאת, הם יכולים לחקות את המיקרו-סביבה התאית של רקמות המספקות רלוונטיות in vivo, מייצגים הרבה יותר רקמות מאשר תרבית תאים דו-ממדית, והם עדיין פחות יקרים ממודלים של בעלי חיים 4,7. בהתחשב ביישום העצום של תרבית האורגנואידית במעיים ובפוטנציאל העצום שלה, מערכת זו עשויה להפוך למודל האידיאלי במחקרי מעבדה ברחבי העולם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי NIH DK103166.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
