Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile Rickettsia spp.'yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

Elektroporasyon, eksojen DNA'yı Rickettsia cinsine sokmak için hızlı, geniş çapta benimsenmiş bir yöntemdir. Bu protokol, Rickettsia cinsindeki zorunlu hücre içi bakterilerin dönüşümü için yararlı bir elektroporasyon yöntemi sağlar.

Abstract

Rickettsioses, enfekte eklembacaklı vektörlerin ısırığı yoluyla omurgalı konakçılara bulaşabilen Rickettsia cinsine ait çok çeşitli zorunlu hücre içi bakterilerden kaynaklanır. Bugüne kadar, ortaya çıkan veya yeniden ortaya çıkan epidemik riketsiozlar, tanı yöntemleri sınırlı olduğu ve standartlaştırılmadığı veya evrensel olarak erişilebilir olmadığı için tanıdaki zorluk nedeniyle halk sağlığı riski olmaya devam etmektedir. Belirti ve semptomların tanınmamasından kaynaklanan yanlış tanı, gecikmiş antibiyotik tedavisine ve kötü sağlık sonuçlarına neden olabilir. Rickettsia özelliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sonuçta hastalığın daha iyi kontrol ve önlenmesi ile klinik tanı, değerlendirme ve tedaviyi geliştirecektir.

Riketsiyal genlerin fonksiyonel çalışmaları, patogenezdeki rollerini anlamak için çok önemlidir. Bu yazıda, Rickettsia parkeri suşu Tate's Hell'in mekik vektörü pRAM18dSFA ile elektroporasyonu ve kene hücre kültüründe dönüştürülmüş R. parkeri'nin antibiyotiklerle (spektinomisin ve streptomisin) seçimi için bir prosedür açıklanmaktadır. Vektör hücre hatlarındaki transformasyonu kontrol etmek için yararlı bir teknik olan konfokal immünofloresan mikroskopi kullanılarak kene hücrelerinde transforme R. parkeri'nin lokalizasyonu için bir yöntem de tanımlanmıştır. Benzer yaklaşımlar diğer rickettsiae'lerin dönüşümü için de uygundur.

Introduction

Rickettsiozlar, Rickettsia cinsine (Rickettsiaceae familyası, Rickettsiales sırası) ait çok çeşitli zorunlu hücre içi bakterilerden kaynaklanır. Rickettsia cinsi, filogenetik özelliklere göre dört ana gruba ayrılır1,2: en şiddetli ve ölümcül kene kaynaklı rickettsiozlara neden olan rickettsiiae'leri içeren benekli ateş grubu (SFG) (örneğin, Rocky Mountain Benekli Ateşinin etken maddesi olan Rickettsia rickettsii), tifüs grubu (TG, örneğin, Rickettsia prowazekii, epidemik tifüsün ajanı), geçiş grubu (TRG, örneğin, pire kaynaklı benekli ateşin etken maddesi olan Rickettsia felis) ve atasal grup (AG, örneğin, Rickettsia bellii).

Bilinen en eski vektör kaynaklı hastalıklar arasında, riketsiyozlar esas olarak patojenlerin keneler, pireler, bitler ve akarlar dahil olmak üzere enfekte eklembacaklı vektörlerinin ısırıkları yoluyla bulaşmasını takiben edinilir 3,4. Etkili antibiyotiklerin keşfi tedavi sonuçlarını iyileştirse de, ortaya çıkan ve yeniden ortaya çıkan epidemik riketsiyozlar geleneksel önleme ve kontrol stratejilerine meydan okumaya devam etmektedir. Bu nedenle, riketsia / konakçı / vektör etkileşimlerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sonuçta bu eski hastalıkları önlemek ve iyileştirmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek için güçlü bir temel oluşturacaktır.

Doğada, bakterilerde yatay gen transferi (HGT) konjugasyon, transdüksiyon ve transformasyon yoluyla gerçekleşir5. İn vitro bakteriyel transformasyon bu HGT kavramlarını kullanır, ancak rickettsiiae'nin hücre içi doğası bazı zorluklar sunar. Rickettsiae'nin farklı türlerinde kısıtlı büyüme koşulları ve iyi anlaşılmamış konjugasyon ve transdüksiyon sistemleri, rickettsiae 6,7,8'de konjugasyon ve transdüksiyon yöntemlerinin uygulanmasını engellemiştir. Diğer zorunlu hücre içi bakteri cinsleriyle (örneğin, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma ve Ehrlichia) karşılaştırıldığında, Rickettsia cinsi, benzersiz yaşam tarzı özellikleri nedeniyle rickettsiiae'nin genetik modifikasyonuna özel zorluklar getiren hücre sitoplazmasındaki büyüme ve replikasyon stratejileri açısından farklılık gösterir9.

Rickettsiae'nin genetik modifikasyonunu denerken üstesinden gelinmesi gereken ilk engel, başarılı bir dönüşüm elde etmektir. Bu nedenle, yüksek dönüşüm verimliliğine sahip uygulanabilir bir yaklaşım tasarlamak, rickettsia için genetik araçlar geliştirmek için son derece değerli olacaktır. Burada, Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii ve Rickettsia buchneri10,11,12 dahil olmak üzere çeşitli rickettsia türlerine eksojen DNA'yı başarılı bir şekilde tanıtmak için kullanılan, yaygın olarak tanınan bir transformasyon yöntemi olan elektroporasyona odaklanıyoruz. ,13,14,15,16.

Bu yazıda, R. parkeri suşu Tate's Hell'in (katılım: GCA_000965145.1) mekik vektörü pRAM18dSFA ile elektroporasyonu için bir prosedür açıklanmaktadır Rickettsia amblyommatis suşu AaR/SC plazmid pRAM18'den türetilen mekik vektörü pRAM18dSFA ile spektinomisin ve streptomisin direnci13,15,20 sağlayan aadA, çok kırmızı bir floresan proteini olan mKATE'yi kodlamak üzere tasarlanmıştır. Transforme R. parkeri, kene hücre hatlarında antibiyotik seçimi altında uygulanabilir ve istikrarlı bir şekilde korunur. Ek olarak, konfokal mikroskopi yoluyla canlı kene hücrelerinde transforme R. parkeri'nin lokalizasyonunun, vektör hücre hatlarındaki dönüşüm oranlarının kalitesini değerlendirmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. R. parkeri'nin kene hücre kültüründen yayılması ve saflaştırılması

NOT: Tüm hücre kültürü prosedürleri sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

  1. Hazırlanıyor R. parkeri-enfekte kene hücreleri
    1. 25cm2 hücre kültürü şişelerinde ISE6 hücrelerini, 5 mL'lik L15C300 orta17'de 34 ° C'de büyütün,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 5 triptoz fosfat suyu (TPB) ve% 0.1 lipoprotein konsantresi (LPC) ile desteklenir.
      NOT: ISE6 (Ixodes scapularis embriyo kaynaklı hücre hattı), birçok laboratuvarda yaygın olarak kullanılan bir kene hücre hattıdır ve bu nedenle kene-patojen etkileşimlerini incelemek için gerekli bir modeldir17,18,19. ISE6 hücrelerinin büyüme hızı, memeli hücrelerininkinden daha yavaştır ve popülasyon ≥72 saatlik süreyi ikiye katlar. Örneğin, %100 akıcı kültürden 1:5 oranında alt yetiştirilen ISE6 hücrelerinin %100 akıcılığı yeniden kazanması 3-4 hafta sürecektir. Sağlıklı ISE6 hücreleri genellikle çok sayıda yapışkan filament ile yuvarlanır17.
    2. ISE6 hücrelerini ışık mikroskobu altında bir hemositometre ile sayın. ~ 106 hücre / mL konsantrasyonunda kullanın (% 100 birleşik).
      1. Şişedeki hücreleri ortamla nazikçe durulayın ve homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için pipetleme yaparak hücreleri dağıtın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak için hemositometre arasına 20 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve camı örtün.
    3. 25 cm2 hücre kültürü şişelerinde ISE6 hücre kültürlerine konakçı hücresiz vahşi tip R. parkeri 20 (ortalama sayı: 5 × 107-10 × 107) ekleyin. Enfekte R. parkeri hücre kültürlerini, L15C300 ortam, %10 FBS, %5 TPB, %0,1 LPC, %0,25 sodyum bikarbonat (NaHCO 3) ve 25 mM HEPES'ten oluşan 5 mL'lik tam ortamda, hücrelerin %90-%100'ü enfekte olana kadar34 °C'de inkübe edin.
      NOT: R. parkeri'nin ISE6 hücrelerindeki enfeksiyon oranı Giemsa boyama ile belirlenir ve inkübasyon süresinin %90-%100 enfeksiyona ulaşması ortalama 5 gün ile 7 gün arasında değişmektedir.
    4. Giemsa boyama ile enfeksiyon oranını belirleyin.
      1. Biyogüvenlik kabininde, enfekte olmuş hücre kültürlerini yeniden askıya alın ve süspansiyonun 50 μL'sini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      2. Süspansiyonu tam bir ortamla (1:5 seyreltme) seyreltin ve 5 dakika boyunca 113 × g'lık bir santrifüj kullanarak cam mikroskop slaytlarına 100 μL santrifüj yapın. R. parkeri'yi canlı tutmak için, santrifüjden çıkarılmak üzere tasarlanmış sızdırmaz rotorlu bir santrifüj kullanın. Bu, sızdırmaz rotorun kaputun içine ve dışına taşınmasını sağlar.
        NOT: R. parkeri santrifüjlemeden önce hala hayatta olduğundan, rickettsia öldürülene kadar numunenin tutulması gerekir. Bu nedenle, R. parkeri kültürünü kızak üzerine döndürmek için kullanılan santrifüj, santrifüjden çıkarılmak üzere tasarlanmış sızdırmaz bir rotora sahip olmalıdır. Rotor laminer akış başlığındayken, numuneleri huni-mikroskop slayt tertibatına yükleyin, rotoru yeniden kapatın ve sızdırmaz rotoru tekrar santrifüje yerleştirin. Ardından, santrifüjü açın ve örnekler mikroskop slaytlarına bırakılır. Çalışma bittikten sonra, sızdırmaz rotoru santrifüjden çıkarın ve laminer akış başlığına yerleştirin. Orada, rotor kapağını açın ve huni-mikroskop sürgü tertibatını kaputun içine boşaltın. Kuruduktan sonra, cam mikroskop slaytlarını tüm patojenleri öldüren mutlak metanole batırın. Huniler ve metal taşıyıcılar, R. parkeri'yi öldüren seyreltilmiş DMQ'ya batırılır.
      3. Slaytları hava ile kurutun ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca mutlak metanol içinde sabitleyin.
      4. Slaytları Giemsa boyası (Sørenson tamponunda% 4, pH 6.6) ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca sabitleyin ve 5 saniye boyunca suyla durulayın.
      5. Işık mikroskobu ile enfeksiyon yüzdesini (rickettsia / 100 hücre ile enfekte olmuş hücre sayısı) belirleyin.
        NOT: Şekil 1'de tipik Giemsa lekesi sonuçları gösterilmektedir.
  2. Hücresiz R. parkeri hazırlama
    NOT: Kültürdeki hücrelerin %90-%100'ü enfekte olduğunda, riketsiya ISE6 hücrelerinden izole edilmeli ve elektroporasyon yapılmalıdır.
    1. Yaklaşık 0,2 mL'lik bir hacme steril 2 mL mikrosantrifüj tüplerine steril 60-90 silikon karbür kum ekleyin.
    2. % 100 R. parkeri ile enfekte kültürlerden 2 mL orta çıkarın (adım 1.1.3) ve kalan 3 mL ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın.
    3. Bu süspansiyonun eşit kısımlarını adım 1.2.1'de hazırlanan tüplere aktarın.
    4. Her tüpü 30 s boyunca yüksek hızda vorteks yapın ve ardından tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Kumların yerçekimi ile saniyeler içinde yerleşmesine izin verin.
    5. Sınıf II biyogüvenlik kabininde, steril bir 5 mL Luer-lock şırıngasını piston uzatılmışken ve pistonun ucu 15 mL konik tüpler için polistiren bir tabana sabitlenmiş olarak hazır bulundurun.
    6. Uygun bir pipetleyiciye takılı steril, 1 mL bariyer pipet ucu kullanarak, vorteksli hücre lizatının süpernatantını tüpten çıkarın ve herhangi bir kuma emmemeye dikkat edin. Pipet ucunu şırınga göbeği açıklığına yerleştirin ve içeriği hafif bir basınçla şırıngaya çıkarın. Alternatif olarak, kauçuk ampulle çalıştırılan steril, bariyerli 2 mL Pasteur pipet kullanın.
    7. Şırınga göbeğinin üzerine sterilize edilmiş 2 μm gözenek boyutunda bir filtre takın ve R. parkeri kültürünü adım 1.2.6'dan steril 1,5 mL tüplere filtreleyin.
    8. R. parkeri'yi 5 dakika boyunca 4 ° C'de 13.600 × g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.
    9. Peleti 1,2 mL buz gibi soğuk 300 mM sakkarozda tekrar askıya alın ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 13.600 × g'de tekrar santrifüj yapın. Toplam iki sakkaroz yıkaması için yeniden süspansiyonu ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
    10. R. parkeri peletlerini, dönüşüm başına 50 μL buz gibi soğuk 300 mM sakkarozda soğutulmuş, steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. R. parkeri'nin 25 cm2'lik bir şişesi iki ila üç dönüşüm için yeterli rickettsiae sağladığından, 100-150 μL 300 mM soğuk sakkaroz ekleyin.
      NOT: İstenirse, rickettsiae sayısı bir Petroff-Hausser sayım odası kullanılarak hesaplanabilir. 5 × 107 -10 × 107 hücresiz R. parkeri'nin ilk aşılamasını kullanırken,% 90-100 enfeksiyona ulaşmak ortalama 5-7 gün sürecek ve yaklaşık 5 × 107-10 × 10hücresiz R. parkeri verecektir.
    11. Pelet, iyice dağılana kadar pipetle indirerek yavaşça askıya alın. Numuneyi soğutulmuş, steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde 50 μL porsiyonlara bölün.
      NOT: İstenirse, riketsiyal canlılık, floresan boya 21 ile boyama işleminden sonra akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.

2. R. parkeri'nin pRAM18dSFA plazmidi ile dönüşümü

  1. Buz üzerinde, 50 μL R. parkeri süspansiyonu içeren her tüpe 3 μg endotoksin içermeyen pRAM18dSFA plazmid DNA 13,15,20 ekleyin ve karışımı pipet ucu ile nazikçe ama iyice karıştırın.
    NOT: Plazmid DNA'sını hazırlarken, endotoksin içermeyen plazmid DNA23'ü elde etmek için endotoksin çıkarma adımı içeren bir saflaştırma kiti kullanın. 50 μL R. parkeri süspansiyonu başına 1 μg ile 3 μg arasında bir plazmid konsantrasyonu aralığının başarılı dönüşümlerle sonuçlandığını, plazmid miktarının ise 10 μg'ye çıkarılmasının transformasyonu engellediğini bulduk.
  2. Yukarıdaki DNA ve R. parkeri karışımını soğutulmuş, steril 0,1 cm boşluklu bir elektroporasyon küvetine aktarın (karışım eşit dağılana kadar küvete hafifçe dokunun) ve 10-30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.
  3. Ortamı, ISE6 hücrelerinin %100 kaynaşma kültüründen çıkarın ve hücre katmanlarını NaHCO 3 ve HEPES tamponu ile 1,5 mL taze ortamda yeniden askıya alın (yukarıda adım 1.1.3'te açıklanmıştır). Transformasyon başına bir şişe birleştirilmiş hücre kullanın.
  4. Yeniden askıya alınan hücreleri steril bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (ISE6 hücrelerinin25 cm2 şişesi başına bir tüp).
  5. R. parkeri/pRAM18dSFA karışımını bir elektroporatör kullanarak 1,8 KV, 200 ohm, 25 μF'de elektroporat yapın.
  6. Steril, uzatılmış ince uçlu bir transfer pipeti kullanarak, az miktarda ISE6 hücre süspansiyonunu (adım 2.4) küvete aktarın ve küveti yıkamak için sıvıyı yavaşça yukarı ve aşağı çekin. Karışımı, ISE6 hücre süspansiyonunun geri kalanını içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve transformasyon karışımını hücrelerle yavaşça karıştırın.
  7. Dönüştürülmüş numuneleri RT'de 2 dakika boyunca 700 × g'da santrifüj yapın ve ardından RT'de 1 dakika daha santrifüj hızını 13.600 × g'a yükseltin.
    NOT: İki santrifüjleme hızı, hücrelerle riketsiyal bağlanmayı ve hücrelere girişi teşvik eder: ISE6 hücrelerini aşağı çekmek için 700 × g kullanılırken, riketsiyaları aşağı çekmek için 13.600 × g kullanılır.
  8. Numuneleri RT veya 34 °C'de 15 dakika ila 1 saat bekletin.
  9. ISE6 hücrelerindeki transformantları (iki veya üç) bir pipetleyiciye takılı steril 2 mL bariyer pipet ucu ile yeniden askıya alın veNaHCO 3 ve HEPES tamponu ile 3,5 mL taze ortam içeren iki veya üçadet 25 cm2 hücre kültürü şişesine aktarın. Alternatif olarak, kauçuk ampulle çalıştırılan steril, bariyerli 2 mL Pasteur pipet kullanın.
  10. Karışımı eşit şekilde yaymak için şişeleri sallayın ve ardından 34 ° C'de inkübe edin.
  11. 16-24 saat sonra, adım 2.10'da her şişeye 10 μL spektinomisin (50 mg / mL) ve 10 μL streptomisin (50 mg / mL) ekleyin.

3. Dönüştürülmüş R. parkeri'nin gözlemlenmesi

NOT: 3-7 gün sonra adım 2.11'de hazırlanan şişeleri gözlemlemek için rodamin/TRITC filtreli bir epifloresan mikroskop kullanın. Plaklar kültürlerde (5-14 gün) belirginleştiğinde, pRAM18dSFA plazmidinde kodlanmış kırmızı floresan protein mKATE'yi ifade eden dönüştürülmüş R. parkeri görülebilir.

  1. Konfokal mikroskopi
    1. Hücre kültürlerini adım 2.11 şişelerinden yeniden askıya alın ve bu hücre kültürlerinin 100 μL'sini karanlıkta RT'de 10-30 dakika boyunca 5 μL Hoechst 33342 çözeltisi ile karıştırın.
      NOT: Hoechst 33342, canlı kene hücresi DNA'sına bağlanan ve mavi floresan yayan hücre geçirgen bir nükleer karşı boyadır.
    2. Karışımın 50 μL'sini cam mikroskop üzerine santrifüjleyin, 3 dakika boyunca 5 × g'da bir santrifüj kullanarak kaydırırlar.
    3. Slaytta biriken hücrelerin noktasına 3 μL 1x PBS ekleyin, bir kapak kayması ile örtün ve bir konfokal mikroskopla görüntüleyin (60x hedef). Floresan görüntüleme için aşağıdaki uyarma ve emisyon parametrelerini kullanın: 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) için, 350 nm'de uyarma, 470 nm'de emisyon; tetrametilrodamin (TRITC) için, 557 nm'de uyarım, 576 nm'de emisyon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Giemsa boyamasından sonra ışık mikroskobu altında ISE6 hücrelerinde R. parkeri'nin morfolojisi Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2'de, ISE6 hücrelerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden dönüştürülmüş R. parkeri , konfokal mikroskopi kullanılarak gösterilmiştir. ISE6 hücrelerinde (mavi, çekirdeğe karşılık gelir) transforme R. parkeri'nin (kırmızı) enfeksiyon oranında, inkübasyonun (A) 7. gününden (B) 10. gününe kadar önemli bir artış vardır.

Figure 1
Resim 1: ISE6 hücrelerinde Giemsa lekeli Rickettsia parkeri'yi gösteren slaytlar. ISE6 hücreleri, (A) düşük enfeksiyon ve (B)% 90-100 enfeksiyon oranlarında vahşi tip R. parkeri ile enfekte olur. ISE6 hücrelerinin çekirdekleri Giemsa ile koyu mora boyanır; R. parkeri koyu mor çubuklar olarak görünür. Kırmızı kutular hücre içi rickettsiae'yi gösterir ve kırmızı yıldızlar hücre dışı rickettsiae'yi gösterir. Tüm görüntüler 100x objektifli bir ışık mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: N = çekirdek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: ISE6 hücrelerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden dönüştürülmüş Rickettsia parkeri . pRAM18dSFA-transforme R. parkeri (kırmızı) ISE6 hücrelerinde (mavi), Hoechst 33342 ile boyanmış ve konfokal mikroskopi (A) 7 gün ve (B) transformasyondan 10 gün sonra tespit edilmiştir. Hoechst 33342 çekirdekleri boyar ve uyarılması ve emisyon dalga boyları DAPI'ye benzer. Birleştirilmiş sinyaller, DAPI ve TRITC filtre görüntülerinin bir birleşimidir. Tüm görüntüler 60x objektif bir konfokal mikroskopta çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TRITC = tetrametilrodamin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, mekik plazmidi pRAM18dSFA üzerinde kodlanmış eksojen DNA'yı elektroporasyon kullanarak rickettsiiae'ye sokmak için bir yöntem gösteriyoruz. Bu prosedürde, hücresiz rickettsiae, konakçı hücrelerden arındırıldı, riketsiyal mekik vektörü ile dönüştürüldü ve enfeksiyon için kene hücrelerine salındı. Ayrıca kene hücrelerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden R. parkeri'yi tespit etmek için konfokal bir immünofloresan prosedürü de tanımlanmıştır. Benzer yöntemler diğer Rickettsia türleri için de geçerlidir ve daha fazla değişiklikle plazmidi koruyabilen diğer zorunlu hücre içi bakterilere uyarlanabilir.

Bu protokolde başarılı bir dönüşüm üç bileşen gerektirir: eksojen DNA, Rickettsia spp. bakterileri ve uygun bir konakçı hücretipi 22. Belirli araştırma hedefine bağlı olarak, bu bileşenler değiştirilebilir. İlk olarak, eksojen DNA, spektinomisin ve streptomisin seçilebilir belirteçler içeren ve mKATE'yi (çok kırmızı bir floresan proteini) eksprese eden pRAM18dSFA plazmidi aracılığıyla tanıtıldı. Bu plazmid ayrıca Escherichia coli'de büyüme için ampisilin direnci sağlar. Önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, antibiyotik direnci belirteçlerini ve floresan proteinleri için genleri değiştirmek mümkündür13. İkincisi, ISE6 hücreleri, dönüştürülmüş hücre çizgilerini temsil etmek üzere seçildi, çünkü bu hücre hattı birçok laboratuvarda yaygın olarak kullanılıyor ve vektör-patojen etkileşimlerinin incelenmesi için gerekli bir modeldir17,18,19. Diğer kenetürleri 16 veya memeli hücreleri23,24 de dönüşüm için rickettsiae yetiştirmek için kullanılabilir. Son olarak, bu protokolde, uygun güvenlik önlemlerine sahip bir sınıf II biyogüvenlik kabini kullanılarak bir biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında manipüle edilebilen R. parkeri kullanılmıştır. Diğer daha patojenik Rickettsia spp. (örneğin, R. rickettsii; R. prowazekii) manipülasyon için BSL-3 ayarı gerektirir; bu nedenle, bu tür ajanlarla çalışırken daha katı bir biyogüvenlik standardı protokolü kullanılmalıdır.

Bu protokol rickettsiae dönüşümü için standart bir prosedür olarak kullanılabilse de, birkaç önemli teknik adım özel dikkat gerektirir. İlk olarak, başarılı bir saflaştırma adımı hücresiz rickettsiae sağkalımını ve bulaşıcılığını sağlamalıdır9; Bu nedenle, transformasyon prosedürünün en kritik yönü bulaşıcı, hücresiz rickettsiae'yi izole etmektir. Saflaştırılmış rickettsiae'deki herhangi bir artık tuz, arklanma ve dönüşüm başarısızlığına neden olacaktır. Bu nedenle, tüm tuzları çıkarmak için izole hücresiz rickettsiiae'nin sakkaroz ile yıkanması gerekir. Soğuk sakkaroz çözeltisi ayrıca hücre dışı durumda riketsiyal membran bütünlüğünü de korur.

Bir kültürdeki hücrelerin% 90-100'ü enfekte olduğunda, rickettsiae ISE6 hücrelerinden izole edilmeli ve rickettsiae hücre içi organizmalar olduğundan ve hücrelerin dışında iyi hayatta kalmadığından, gecikmeden ve kesintisiz olarak elektroporasyon yapılmalıdır. Riketsiyal kültürler 4 ° C'de saklanabilse de, bu tür malzemeler elektroporasyon için kullanılmamalıdır. 4 ° C'de depolanan bir kültür, taze bir ISE6 hücresi tabakasını aşılamak için kullanılabilir, bu da enfeksiyon% 90-100'e ulaştığında elektroporasyon için kullanılabilir.

İkincisi, voltaj, direnç, kapasitans ve zaman sabiti dahil olmak üzere elektroporasyon ayarları, farklı riketsiyal türlere özgüdür. Örneğin, elektroporasyon sırasında gereken alan kuvveti, riketsiyaların boyutuna ve eksojen DNA7'ye bağlıdır. Son olarak, konakçı hücrelerde çoklu pasajlar sırasında eksojen plazmidlerin kaybını önlemek için transforme riketsiyaların antibiyotik seleksiyonu altında tutulması önemlidir9. Kullanılan antibiyotik konsantrasyonu ve türü, daha önce tarif edildiği gibi dönüştürülen Rickettsia türlerine bağlıdır 13,15,16,23 ve seçilen antibiyotik belirtecinin klinik tedavilerde uygulanan bir antibiyotik olmaması önemlidir.

Bu protokolü takip etmek için, tüm artık dönüştürülmemiş rickettsiae'ler elimine edilene kadar hem spektinomisin hem de streptomisin seçim için kullanılmalıdır. Kombine olarak, iki antibiyotik hem hücre içi hem de hücre dışı riketsiyaları öldürür ve dirençli vahşi tip riketsiyaların ortaya çıkma olasılığını azaltır. Ek olarak, bu antibiyotiklerin her ikisini de kullanmak, iki farklı plazmidi seçmek için bunları ayrı ayrı kullanma yeteneği gibi aşağı akış deneylerini etkilemez, çünkü aadA geni hem spektinomisin hem de streptomisin'e direnç kazandırır. Bu protokolde kullanılan iki antibiyotik, riketsiyal hastalığın klinik tedavisinde kullanılan antibiyotiklere direnç kazandırmaz.

Bu çalışmada kullanılan ISE6 kene hücresi hattının benzersiz avantajları vardır. İlk olarak, ISE6 hücreleri, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki yedi insan patojeninin ana vektörü olan siyah bacaklı kene Ixodes scapularis Say'den (Acari: Ixodidae) izole edildi. İkincisi, ISE6 birçok laboratuvarda yaygın olarak kullanılan bir kene hücresi hattıdır ve elektroporasyonu takiben kene ile ilişkili birçok bakteriyi (Rickettsia, Anaplasma ve Ehrlichia) kurtarmak için başarıyla kullanılmıştır. Üçüncüsü, bazı patojenik rickettsiiae sadece kene hücrelerinde yayılabilir, ancak memeli hücrelerinde çoğaltılamaz17,18,19,24. Bununla birlikte, kene hücre hatları memeli hücrelerine kıyasla nispeten kırılgandır ve daha yoğun kültür gereksinimlerine sahiptir25,26,27,28. Ek olarak, ISE6 hücrelerinin büyüme hızı, aynı başlangıç yoğunluğunda tohumlansa bile, memeli hücre hatlarınınkinden önemli ölçüde daha yavaştır, ancak riketsiyal dönüştürücüler azalmış büyüme gösterdiğinde yavaş replikasyon avantajlı olabilir.

Bu protokol aynı zamanda kritik deneysel adımlarda canlı hücrelerde rickettsiiae'nin dönüşüm verimliliğini değerlendirmek için bir yöntem sağlar, bu da elektroporasyon ayarlarını optimize etmeye veya dönüştürücüleri geri kazanmak için çeşitli hücre hatlarının verimliliğini test etmeye yardımcı olur. Bununla birlikte, bu protokolün özellikle elde edilen dönüştürücülerin nicelleştirilmesi için sınırlamaları vardır. Başarılı bir dönüşümün göstergesi olarak dönüşüm verimliliği, gelecekteki bir çalışmada gösterilebilir. Rickettsiyal canlılık, elde edilen transformantları ölçmek için uygun bir boyama kiti ve akış sitometrisi21 kullanılarak değerlendirilebilir. Dönüşüm verimliliğini belirlemek için iki parametre kullanılacaktır: dönüşüm için kullanılan canlı rickettsiae sayısı ve mKATE'yi ifade eden dönüştürülmüş rickettsiae sayısı.

Ek olarak, floresan sinyalleri ile görüntü analizi, farklı plazmidlerin dönüşüm oranlarını karşılaştırmak için kullanılabilir. Riketsiyal plazmid bakımının altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamadığından, eksojen plazmidlerin tanıtılması için iyi karakterize edilmiş transformasyon sistemleri daha ileri araştırmalar için değerli araçlar olabilir. Ayrıca, hücrelerde veya dokularda floresan proteini eksprese eden rickettsiae'nin doğrudan görselleştirilmesi, riketsia / konakçı / vektör etkileşimleri hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir. Bu, rickettsiosları kontrol etmek ve önlemek için stratejiler tasarlamak için bilgi sağlayacaktır.

Veri kullanılabilirliği:
Bu çalışmanın sonuçlarının altında yatan tüm veriler kamuya açıktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan edilmez.

Acknowledgments

Timothy J. Kurtti ve Benjamin Cull'a anlayışlı tartışmaları ve önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH'den U.G.M.'ye (2R01AI049424) ve Minnesota Tarımsal Deney İstasyonu'ndan (MIN-17-078) U.G.M.'ye verilen bir hibe ile finansal olarak desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Tags

Biyoloji Sayı 188 Elektroporasyon Rickettsia immünofloresan
Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile <em>Rickettsia</em> spp.'yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y.,… More

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter