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Biology

फिजियोलॉजिकल या ट्यूमरल संदर्भों में निवासी कोशिकाओं के बीच गतिशीलता और बातचीत की जांच करने के लिए एक मानव अस्थि मज्जा 3 डी मॉडल

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64736
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 2Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3Université de Lyon, 4Centre Léon Bérard, 5Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences Mario Serio, Università degli Studi di Firenze

Summary

यहां, हम एक आसान-से-लागू, मानकीकृत, माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम का वर्णन करते हैं जो विवो संरचना में मानव अस्थि मज्जा की जटिलता को दर्शाता है, सामान्य और पैथोलॉजिकल घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का बारीक अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल प्रदान करता है।

Abstract

मेडुलरी आला एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र है जो निवासी कोशिकाओं के लिए होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। दरअसल, अस्थि मज्जा, जिसमें एक जटिल बाह्य मैट्रिक्स और विभिन्न सेल प्रकार शामिल हैं, जैसे कि मेसेनकाइमल स्टेम सेल, ओस्टियोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाएं, प्रत्यक्ष सेल-सेल इंटरैक्शन के साथ-साथ साइटोकिन उत्पादन के माध्यम से हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल विनियमन में गहराई से शामिल है। विवो संरचना में इसकी बारीकी से नकल करने और मानव अस्थि मज्जा की प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित करने वाले प्रयोगों का संचालन करने के लिए, बायोमैटेरियल्स के आधार पर कई 3 डी मॉडल बनाए गए हैं, जो मुख्य रूप से प्राथमिक स्ट्रोमल कोशिकाओं पर निर्भर हैं। यहां, एक प्रोटोकॉल को न्यूनतम और मानकीकृत प्रणाली प्राप्त करने के लिए वर्णित किया गया है जो स्थापित करना आसान है और अस्थि मज्जा जैसी संरचना की विशेषताएं प्रदान करता है, जो एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल आबादी को जोड़ता है, और विवो अस्थि मज्जा ऊतक में विविधता को दर्शाता है। यह 3 डी अस्थि मज्जा जैसी संरचना कैल्शियम फॉस्फेट-आधारित कणों और मानव सेल लाइनों का उपयोग करके इकट्ठी होती है, अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट का प्रतिनिधि- सिस्टम के भीतर विभिन्न प्राथमिक सेल आबादी को जोड़कर या प्रतिस्थापित करके जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता की निगरानी की अनुमति देता है। अंतिम 3 डी संरचनाओं को या तो निर्धारण, पैराफिन-एम्बेडिंग, और सिस्टम के भीतर सेल स्थानीयकरण के लिए हिस्टोलॉजिकल / इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला करने के बाद छवि विश्लेषण के लिए काटा जा सकता है, या आणविक या कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए प्रत्येक सेलुलर घटक को इकट्ठा करने के लिए अलग किया जा सकता है।

Introduction

अस्थि मज्जा (बीएम) अक्षीय और लंबी हड्डियों और त्रिकोणीय सपाट हड्डियों के केंद्रीय गुहाओं दोनों के भीतर पाया जाता है, और इसमें विभिन्न प्रकार के अलग-अलग सेलुलर और गैर-सेलुलर घटक होते हैं। संरचनात्मक स्तर पर, इसमें हेमटोपोइएटिक ऊतक द्वीप (जिसे "हेमटन" भी कहा जाता है) 1,2 और वसा कोशिकाएं होती हैं जो संवहनी साइनस से घिरी होती हैं जो ट्रिब्युलर हड्डी3 के भीतर फैली होती हैं। लंबी और सपाट हड्डियों में, हड्डी और अस्थि मज्जा को रक्त की आपूर्ति वाहिकाओंके एंडोस्टेल नेटवर्क के माध्यम से परस्पर जुड़ी होती है। इस ठोस सुरक्षात्मक नेटवर्क में छिपा हुआ, बीएम एक स्पंजी स्ट्रोमा में डूबी बहुत अपरिपक्व कोशिकाओं को होस्ट करता है और निवासी मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) और हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) 5 के भेदभाव के लिए स्थान का गठन करता है। दरअसल, ओस्टियोब्लास्ट के उत्पादन के माध्यम से हड्डी के ऊतकों के नवीकरण के अलावा, बीएम के मुख्य ज्ञात कार्यों में से एक हेमटोपोइजिस विकास6 में रहता है।

बीएम हेमटोपोइएटिक ऊतक में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार शामिल हैं, अर्थात् एचएससी, अग्रदूत, और लिम्फोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, एरिथ्रोसाइट्स, ग्रैन्यूलोसाइट्स, मोनोसाइट्स और थ्रोम्बोसाइट्स7 जैसे अधिक विभेदित रक्त कोशिकाएं। हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को बीएम स्पेस में यादृच्छिक रूप से व्यवस्थित नहीं किया जाता है, लेकिन हेमटोपोइएटिक niches के भीतर एक विशेष संगठन प्रदर्शित करता है, जिसमें विभिन्न मूल (ओस्टियोब्लास्ट, ओस्टियोक्लास्ट, एमएससी, एडिपोसाइट्स, साइनसॉइडल एंडोथेलियम और पेरिवास्कुलर स्ट्रोमल कोशिकाएं, प्रतिरक्षा कोशिकाएं, तंत्रिका कोशिकाएं और विशिष्ट परिपक्व हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं) के कई सेल प्रकार शामिल हैं, जो सामान्य हेमटोपोइजिस8 सुनिश्चित करने के लिए एक जटिल संरचना बनाते हैं। . हेमटोपोइएटिक आला के जैविक कार्यों में कई शारीरिक या गैर-शारीरिकतनावों के जवाब में विभिन्न तंत्रों (सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन, घुलनशील कारकों का उत्पादन, हाइपोक्सिया) के माध्यम से एचएससी अस्तित्व, आसंजन, क्वीसेंस, होमिंग और भेदभाव का विनियमन शामिल है। यद्यपि इन हेमटोपोइएटिक niches को शुरू में सजातीय संस्थाओं के रूप में माना जाता था, लेकिन एकल-कोशिका और इमेजिंग विश्लेषण जैसे तकनीकी विकास ने उत्तरोत्तर उनकी जटिलता, गतिशीलता और अनुकूली गुणों 9,10,11 का खुलासा किया है।

मानव शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए जानवरों के उपयोग को बदलने और कम करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता नए अवसरों और चुनौतियोंकी ओर ले जाती है। नए वर्णित इन विट्रो उपकरणों में, तीन-आयामी (3 डी) मॉडल जो शास्त्रीय दो-आयामी (2 डी) संस्कृतियों 13,14,15,16,17 की तुलना में विवो मानव बीएम की नकल करते हैं, प्रस्तावित किए गए हैं। इस प्रकार 3 डी मॉडलिंग सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का निरीक्षण करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रतीत होता है, जो विवो में होने वाले लोगों के करीब है। इन मॉडलों की एक किस्म का उपयोग करते हुए, कुछ टीमों ने एचएससी18,19 के अस्तित्व और प्रसार का प्रदर्शन किया है। कई 3 डी मॉडल उपलब्ध हैं, सबसे आम दृष्टिकोण पाड़-आधारित 3 डी बायोमैटेरियल्स जैसे हाइड्रोगेल, कोलाइड्स या कोलेजन का उपयोग है, जो एमएससी से जुड़े हैं, जो उनकी ओस्टियोब्लास्टिक वंश भेदभाव क्षमता 20,21,22 का लाभ उठाते हैं। फिर भी, उपयोगकर्ता के अनुकूल और मानकीकृततरीके से मानव कोशिकाओं पर अध्ययन के लिए सभी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए कोई वैश्विक सहमति नहीं मिली है, खासकर जब से ये वर्तमान 3 डी सिस्टम मुख्य रूप से प्राथमिक स्ट्रोमल कोशिकाओं पर भरोसा करते हैं, और इस प्रकार प्राथमिक नमूनों, ऊतक उपलब्धता और विषमता तक सीमित पहुंच से पीड़ित हैं।

इसके अतिरिक्त, एंडोथेलियल सेल कम्पार्टमेंट को पेश किया जाना चाहिए क्योंकि ये कोशिकाएं सेल-सेल इंटरैक्शन के एक प्रमुख घटक का प्रतिनिधित्व करती हैं और ल्यूकेमिया24 और मेटास्टेसिस25 दोनों में स्टेम सेल भाग्य और बीएम रोग के विकास में शामिल होती हैं। हमने पहले बताया था कि एक मानकीकृत मानव 3 डी अस्थि मज्जा मॉडल में पैथोलॉजिकल तत्वों के अतिरिक्त रोगी के नमूनों में देखी गई विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करता है जैसे कि बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) परिवर्तन26। मानव बीएम माइक्रोएन्वायरमेंट और निवासी कोशिकाओं के बीच गतिशीलता और बातचीत को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हम न्यूनतम, सुव्यवस्थित, बीएम जैसी संरचना बनाने के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल और मानकीकृत प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रणाली में तीन मानव अस्थि मज्जा कोशिका प्रकार-एंडोथेलियल कोशिकाएं और स्ट्रोमल कोशिकाएं शामिल हैं, जो माइक्रोएन्वायरमेंट और एचएससी का प्रतिनिधित्व करती हैं। एक मचान और ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव माध्यम के रूप में विशिष्ट मोतियों का उपयोग करके, प्राप्त 3 डी संरचना मानव मज्जा आला की नकल करेगी, जिससे मानव अस्थि मज्जा के एक आसान अध्ययन की अनुमति मिलेगी।

Protocol

नोट: अस्थि मज्जा जैसी रीढ़ की हड्डी संरचना तैयार करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एचएमईसी -1 एंडोथेलियल कोशिकाओं और बाइफैसिक कैल्शियम फॉस्फेट (बीसीपी) मोतियों पर एचएस 27 ए स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ मोतियों के संयोजन पर निर्भर करता है। बीसीपी मोती एक मचान के रूप में काम करेंगे, जो एक विशिष्ट माध्यम के साथ, 3 डी संरचनात्मक आकार की अनुमति देता है।

1. मोती की तैयारी और नसबंदी

  1. 1.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक इंसर्ट (छोटे, बेलनाकार, प्लास्टिक डिश जिसमें नीचे पॉली कार्बोनेट झिल्ली होती है) के लिए 35-40 मिलीग्राम बीसीपी मोती (एचए / β-टीसीपी 60/40; 45-75 μm) का वजन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। मोतियों का वजन करने के बाद, 1.5 एमएल ट्यूब के शीर्ष के माध्यम से एक साफ सुई के साथ एक छोटा छेद बोर करें ताकि ऑटोक्लेव चक्र (60 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस) के दौरान ढक्कन को खुला होने से बचाया जा सके, और ट्यूबों को एक बंद बाँझ बॉक्स में ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखा जा सके।

2.3D बाँझ हुड के तहत तैयारी डालें

  1. 6-वेल प्लेट के कुओं के भीतर बाँझ पॉली कार्बोनेट सेल कल्चर डालें। डालने में 1.5 एमएल ट्यूब से बाँझ बीसीपी मोती डालें। इंसर्ट के अंदर 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (PBS) के 350 μL टपकाकर मोतियों को सावधानीसे धोएं और फिर कुएं में 4.5 मिलीलीटर 1x PBS जोड़ें। पीबीएस को या तो वैक्यूम या 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके कुएं के एक कोने में टिप रखकर निकालें और छोड़ दें। धोने के चरण को दो बार दोहराएं।
  2. एक बार मोतियों को धोने के बाद, सिस्टम को अवरुद्ध करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक 1x PBS का उपयोग करें। ध्यान से ब्लॉकिंग समाधान के 350 μL को डालने और कुएं में 4.5 mL जोड़ें और पूरी प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर एक इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: चरण 2.1 और 2.2 सेल सीडिंग से पहले बीसीपी मोतियों से आयन रिलीज को कम करने में मदद करते हैं।

3. सेल लाइन कटाई और 3 डी रखरखाव

नोट: इस इनक्यूबेशन चरण के बाद, माइक्रोएन्वायरमेंटल कोशिकाओं को 3 डी संरचना रीढ़ बनाने के लिए जोड़ा जाता है। यह प्रणाली एचएमईसी -1 के उपयोग पर आधारित है, मानव माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं एसवी 40 से बड़े टी एंटीजन के साथ अमर हो जाती हैं, और एचएस 27 ए, मानव अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाएं मानव पेपिलोमावायरस के साथ अमर हो जाती हैं, एक ठोस बीएम जैसी संरचना बनाने की उनकी क्षमता और एंडोथेलियल कोशिकाओं को शामिल करने के साथ उनकी संगतता के कारण।

  1. सिस्टम में कोशिकाओं को जोड़ने से पहले, निम्नलिखित इनक्यूबेशन मीडिया तैयार करें:
    1. पूर्ण ओस्टियो विभेदन माध्यम (ओडीएम) के 50 एमएल के लिए, डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 45 एमएल + एफबीएस के 5 एमएल + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.5 एमएल + 10-4 मिलीग्राम / एल डेक्सामेथासोन के 8 × + बीटा-ग्लिसरोफोस्फेट के 2.16 ग्राम / एल + 44 मिलीग्राम / एल एस्कॉर्बिक एसिड मिलाएं।
    2. पूर्ण एचएमईसी -1 माध्यम के 50 एमएल के लिए, एमसीडीबी 131 + 5 एमएल एफबीएस + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.5 एमएल + ग्लूटामाइन विकल्प का 1% + हाइड्रोकार्टिसोन का 1 मिलीग्राम / एल + ईजीएफ का 10 μg / L मिलाएं।
  2. सिस्टम से ब्लॉकिंग समाधान निकालें। 15 एमएल ट्यूब में 1 × 106 एचएमईसी -1 कोशिकाओं (संवहनी डिब्बे का प्रतिनिधित्व करने वाले) और 2 × 106 एचएस 27 ए कोशिकाओं (मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल डिब्बे का प्रतिनिधित्व करते हुए) को मिलाएं और कमरे के तापमान पर 1,575 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और 175 μL ODM (HS27A ओस्टियोडिफरेंटेशन के लिए विशिष्ट माध्यम) के साथ HMEC-1 माध्यम (HMEC-1 सेल विकास के लिए विशिष्ट माध्यम) के 175 μL जोड़ें।
  3. इस निलंबन का 350 μL डालें जिसमें प्रत्येक सम्मिलित के अंदर 3 × 106 कुल कोशिकाएं होती हैं। फिर, प्लेट के कुओं में कोशिकाओं के बिना संयुक्त मीडिया के 4.5 एमएल (एचएमईसी -1 माध्यम का 2.25 एमएल + ओडीएम का 2.25 एमएल) डालें। धीरे-धीरे मिश्रण को 1 एमएल माइक्रोपिपेट के साथ कई बार एस्पिरेट करें और डालें ताकि इंसर्ट के भीतर कोशिकाओं और बीसीपी मोतियों को समरूप किया जा सके। सम्मिलित करने के निचले भाग में बसने के लिए पूरे मिश्रण को आवंटित करें।
    नोट: एक मृत मात्रा के साथ मिश्रण तैयारी की सिफारिश की जाती है यदि कई सम्मिलित किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, यदि चार सम्मिलित सुसंस्कृत हैं, तो हमेशा पांच सम्मिलित के लिए आवश्यक मात्रा तैयार करें।
  4. एक बार जब एंडोथेलियल और मेसेनकाइमल कोशिकाएं इंसर्ट के अंदर समरूप हो जाती हैं, तो 6-वेल प्लेट को इनक्यूबेटर के अंदर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 3 सप्ताह तक रखें। 1 एमएल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके डालने से माध्यम को सावधानीपूर्वक हटाकर और डालने के कोने को परेशान करने से बचने के लिए आंतरिक सम्मिलित दीवार पर टिप रखकर इंसर्ट और वेल 2x प्रति सप्ताह के अंदर माध्यम को बदलें।
    नोट: पुनर्प्राप्त सतह पर तैरने वाला को बाद में प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए किसी भी कदम पर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. सिस्टम में रुचि की कोशिकाओं को जोड़ना

नोट: एचएमईसी -1 और एचएस 27 ए संवर्धन के 3 सप्ताह के बाद, एचएस 27 ए कोशिकाओं के ओस्टियोडिफरेंटेशन ने सिस्टम के कठोरता को सक्षम किया। इस चरण में, इंसर्ट के भीतर रुचि की हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं को जोड़ें (अतिरिक्त कोशिकाओं की संख्या 1 से 104 × 106 तक भिन्न × सकती है)। अतिरिक्त कोशिकाएं टीएफ 1 कोशिकाएं थीं जो बीसीआर-एबीएल ऑन्कोजीन और प्राथमिक मोनोन्यूक्लिएटेड सीडी 34 + कोशिकाओं के साथ स्थानांतरित थीं जो या तो तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया रोगियों या स्वस्थ दाताओं से आती थीं।

  1. इस चरण में मध्यम संरचना को बदलें, क्योंकि ओडीएम यौगिक हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं के लिए विषाक्त है और सिस्टम कठोरता होने के बाद इसे जोड़ना जारी रखने की कोई आवश्यकता नहीं है। उदाहरण के लिए, हेमटोपोइएटिक रखरखाव का समर्थन करने के लिए, हेमटोपोइएटिक सेल लाइनों के लिए पूर्ण आरपीएमआई के साथ ओडीएम माध्यम को प्रतिस्थापित करें (आरपीएमआई एफबीएस के 10% और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 1% के साथ पूरक) या प्राथमिक हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के लिए आईएमडीएम। 3 डी माध्यम (दो बार) साप्ताहिक परिवर्तनों के लिए 50% पूर्ण एचएमईसी -1 माध्यम और 50% पूर्ण आरपीएमआई / आईएमडीएम माध्यम का एक बैच तैयार करें।
  2. इस संयोजन माध्यम में रुचि की हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और इसे सम्मिलित करें। यदि दवा उपचार प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है, तो उपचार से पहले रुचि की कोशिकाओं को जोड़ने के बाद 24 घंटे प्रतीक्षा करें, जिससे उन्हें हड्डी जैसी संरचना का पालन करने का समय मिले।
  3. आवश्यकताओं के अनुसार 3 डी सेल संस्कृति की अवधि को अनुकूलित करें। सप्ताह में दो बार माध्यम (50% एचएमईसी -1 पूर्ण माध्यम + 50% आरपीएमआई पूर्ण माध्यम) को ताज़ा करें।
    नोट: 3 डी सेल संस्कृति के दौरान, कुछ अनुयायी कोशिकाएं कुओं के तल में डालने के बाहर रिसाव कर सकती हैं, जिससे मध्यम खपत बढ़ सकती है। सम्मिलित करने से परे सेल फैलाव के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें और यदि आवश्यक हो तो बाँझ हुड के तहत एक नई 6-वेल प्लेट में सम्मिलित करें।

5.3D अस्थि मज्जा जैसे प्रयोगात्मक परिणाम

नोट: 3 डी संवर्धन के बाद, प्रयोग के उद्देश्यों के अनुसार कई परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।

  1. प्रोटीन विश्लेषण
    नोट: 3 डी प्रयोग के दौरान, अस्थि मज्जा जैसी संरचना में मौजूद कोशिकाओं द्वारा स्रावित प्रोटीन को आगे के विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है।
    1. जब संस्कृति माध्यम को सप्ताह में 2 गुना बदल दिया जाता है, तो सिस्टम के भीतर रुचि के प्रोटीन के उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इंसर्ट के अंदर से पुनर्प्राप्त सुपरनैटेंट स्टोर करें।
  2. 3 डी संरचना से कोशिकाओं को अलग करना (एक बाँझ हुड के तहत यदि कोशिकाओं को क्रमबद्ध करने की आवश्यकता होती है)
    नोट: 3 डी अस्थि मज्जा जैसी प्रणाली में सुसंस्कृत कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त, क्रमबद्ध और आगे विश्लेषण किया जा सकता है।
    1. प्रयोग के अंत में, 15 एमएल ट्यूब में, आरपीएमआई के 4.5 एमएल को 0.4 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज के साथ पूरक 0.5 एमएल एफबीएस के साथ मिलाएं, और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर घोल को गर्म करें।
    2. झिल्ली को ठीक से काटने के लिए एक बाँझ 6-वेल प्लेट कवर पर डालें (शीर्ष पर सफेद झिल्ली पक्ष)। किनारों से झिल्ली को काटने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें, इस प्रकार एक सफेद ठोस डिस्क को पुनः प्राप्त करें। चरण 5.2.1 में तैयार गर्म 15 एमएल ट्यूब के अंदर डिस्क रखें।
    3. ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक सक्रिय पहिया में रखें और पाचन (कोलेजनेज के संपर्क में) की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। विषम विश्लेषण से बचने के लिए सभी झिल्ली के लिए एक ही इनक्यूबेशन समय लागू करें।
    4. 10 मिनट के बाद, कमरे के तापमान पर 1,575 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और 5 एमएल गर्म 1x पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। नोट: इस चरण में, जैसा कि पॉली कार्बोनेट झिल्ली आम तौर पर सतह पर तैरने वाले अंश में तैरती है, इसे बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करके छोड़ दिया जा सकता है। यदि झिल्ली अभी भी गोली में शामिल है, तो इसे छोड़ दें और इसे अगले चरण के अंत में हटा दें।
    5. गोली को 300 μL गर्म ट्रिप्सिन में पुन: निलंबित करें, ट्यूब को 10 सेकंड के लिए भंवर करें, और इसे 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    6. गर्म शुद्ध एफबीएस के 1 एमएल जोड़कर एंजाइमेटिक पाचन को रोकें। 1 एमएल माइक्रोपिपेट के साथ, यांत्रिक रूप से एस्पिरेट करें और डिस्क को पूरी तरह से अलग करने के लिए माध्यम को वितरित करें।
      चेतावनी: आकांक्षा / वितरण कदम बहुत तेज होना चाहिए, अन्यथा मोती सिरे के अंदर तलछट होंगे।
    7. ट्यूब को 1,575 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। 10% एफबीएस के साथ पूरक 1x PBS के 3 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
    8. सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करने से पहले मोतियों को 5 सेकंड के लिए तलछट पर छोड़ दें और इसे संग्रह ट्यूब पर रखे गए 35 μm सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें। 1,575 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए पुनर्प्राप्त फिल्ट्रेट को सेंट्रीफ्यूज करें। व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने के लिए ट्रिपैन ब्लू के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: ट्रिपैन ब्लू इनक्यूबेशन के बाद पुनर्प्राप्त व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या ~ 1-2 × 105 कोशिकाएं प्रति पचने वाली प्रविष्टि है।
  3. पुनर्प्राप्त कोशिकाओं की फ्लो साइटोमेट्री लेबलिंग
    नोट: 3 डी अस्थि मज्जा जैसी संरचना से पुनर्प्राप्त कोशिकाओं को लेबल किया जा सकता है और आगे प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। 3 डी पृथक्करण के बाद विभिन्न डिब्बों का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के मिश्रण का उपयोग करें। यहां, सीडी 45 (रुचि के हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं पर दाग), सीडी 31 (संवहनी डिब्बे पर दाग), और सीडी 73 (ओस्टियोब्लास्टिक डिब्बे पर दाग) का उपयोग पीबीएस + 2% एफबीएस के 50 μL में 1 μL पर किया गया था। पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर सभी तैयार कोशिकाओं और एंटीबॉडी को प्रकाश से दूर रखें।
    1. एंटीबॉडी मिश्रण में छर्रों को फिर से निलंबित करें और प्रकाश से दूर बर्फ पर 30-40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. कोशिकाओं को धोने के लिए 1 एमएल पीबीएस + 2% एफबीएस जोड़ें और 1,575 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. पुनः प्राप्त गोली को 1x PBS + 10% FBS के 200 μL में पुन: निलंबित करें, जिसे 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI, पतला 1: 2,000) के साथ पूरक किया गया है।
    4. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके साइटोमीटर में ट्यूबों का विश्लेषण करें: एफएससी 297 पीएनवी; एसएससी 220 पीएनवी; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. एकल आबादी को गेट करने के लिए एफएससी-एच बनाम एफएससी-डब्ल्यू ग्राफ प्लॉट का उपयोग करें। एकल अंश में, व्यवहार्य कोशिकाओं की आबादी (DAPI-नकारात्मक) निर्धारित करने के लिए DAPI-A बनाम FSC-A ग्राफ प्लॉट का उपयोग करें। डीएपीआई-नकारात्मक आबादी के साथ पहले गेटेड होने के साथ, सीडी 45-पॉजिटिव आबादी निर्धारित करने के लिए एपीसी-ए बनाम एफएससी-ए ग्राफ प्लॉट का उपयोग करें।
  4. 3 डी अस्थि मज्जा जैसी संरचना का निर्धारण
    नोट: 3 डी बीएम जैसी संरचना का निर्धारण आम तौर पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए किया जाता है ताकि सीटू में कोशिकाओं की कल्पना की जा सके और आगे विशिष्ट धुंधलापन हो सके।
    1. बीएम जैसी संरचना को ठीक करने के लिए, पुरानी प्लेट से इंसर्ट (चरण 4.3) को 1x PBS से भरी एक नई 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। फिर, धीरे से 1x PBS के साथ सम्मिलित के अंदर माध्यम को बदलें।
      नोट: पीबीएस के साथ गठित संरचना को फ्लश न करें; तरल का दबाव 3 डी संरचना को खराब कर सकता है।
    2. एक बार जब डालने को धो लिया जाता है, तो इसे एक नई 6-वेल प्लेट के भीतर रखें और कुएं और इंसर्ट दोनों को ताजा खोले गए पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) 4% (1x PBS में पतला 16%) के साथ भरें।
    3. निर्धारण प्रक्रिया को प्रकाश से दूर कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए आगे बढ़ने दें।
    4. निर्धारण प्रक्रिया के अंत में, 1x PBS के साथ एक बार डालें और इसे प्रकाश से दूर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. ठोस डिस्क को पुनः प्राप्त करने के लिए चरण 5.2.2 में वर्णित प्रविष्टि के निचले भाग में झिल्ली को काटें।
    6. संरचना को डीकैल्सीफाई करने के लिए ईडीटीए (0.5 एम, पीएच 8) में 48 घंटे के लिए डिस्क 4x को इनक्यूबेट करें।
    7. संरचना को पैराफिन में एम्बेड करें और स्लाइस 4 μm मोटे खंडों को काटें।
    8. एक स्वचालित इम्यूनोस्टेनर का उपयोग करके, एंटी-सीडी 45, एंटी-सीडी 73 और केआई 67 एंटीबॉडी के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें। एंटी-खरगोश या माउस घोड़े की मूली पेरोक्सीडेज (एचआरपी) के साथ और क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के रूप में 3,3'-डायमिनोबेंजिडाइन के साथ धुंधलापन की कल्पना करें और गिल-हेमेटॉक्सिलिन के साथ काउंटरस्टेन करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक न्यूनतम, इन विट्रो, 3 डी, मानव बीएम जैसे माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करना संभव है, जिसमें से तीन अलग-अलग सेल डिब्बों से व्यवहार्य कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 1)। दरअसल, वांछित एक्सपोजर के बाद, 3 डी बीएम जैसी संरचनाओं को अलग किया जा सकता है और एमएससी, एंडोथेलियल कोशिकाओं और हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं का मूल्यांकन / अब तक, परिणाम बताते हैं कि व्यवहार्य कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने से पहले, 3 डी मॉडल के भीतर कम से कम 6 सप्ताह के लिए हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं को बनाए रखना संभव है (चित्रा 2 बी)। हालांकि, इस 3 डी मॉडल की सीमा का अनुमान लगाने के लिए भविष्य की जांच की आवश्यकता है। इसके अलावा, यदि आवश्यक हो, तो इस 3 डी बीएम जैसे मॉडल (चित्रा 2 सी) में प्राथमिक सामान्य अस्थि मज्जा (एनबीएम) एमएससी या तीव्र मायलोइड ल्यूकेमिया (एएमएल) एमएससी के साथ एचएस 27 ए सेल लाइन को प्रतिस्थापित करना संभव है या प्राथमिक एचएससी (चित्रा 2 डी) के साथ हेमटोपोइएटिक सेल लाइन को बदलना संभव है। इसके अलावा, सेल डिब्बों या रुचि के विशिष्ट मार्करों के स्थानीयकरण के बीच बातचीत का विश्लेषण करते समय, 3 डी बीएम जैसी संरचनाओं को पैराफिन एम्बेडिंग और इम्यूनोकेमिस्ट्री के साथ तय और आगे संसाधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सीडी 45 (हेमेटोलॉजिकल) या सीडी 73 (एमएससी) सामग्री का विश्लेषण इन 3 डी मॉडल (चित्रा 3) का उपयोग करके किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: मानव 3 डी बीएम जैसी प्रणाली के प्रारंभिक सेटअप का योजनाबद्ध आरेख। सह-संस्कृति के 3 सप्ताह के बाद, ठोस बीएम जैसे ऊतक को हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं (उदाहरण के रूप में) या अन्य सेल प्रकारों के साथ एकत्र या बीज दिया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, तो एक बार कोशिकाओं के पालन करने के बाद, उपचार जोड़ा जा सकता है और सप्ताह में दो बार मध्यम परिवर्तन किए जा सकते हैं। प्रयोग के अंत में, बीएम जैसी संरचनाओं को या तो स्थानीयकरण अध्ययन के लिए तय और आगे संसाधित किया जा सकता है या सेल सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए अलग किया जा सकता है। संक्षेप: बीसीपी = बिफैसिक कैल्शियम फॉस्फेट; बीएम = अस्थि मज्जा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: बीएम जैसे 3 डी मॉडल में संस्कृति के बाद विभिन्न डिब्बों से व्यवहार्य कोशिकाओं की वसूली। (ए) 9.84% व्यवहार्य कोशिकाओं (डीएपीआई-) के साथ एक अलग बीएम जैसी संरचना से सेल रिकवरी का विशिष्ट पैटर्न। ओस्टियोब्लास्ट कोशिकाओं (सीडी 45- आबादी के भीतर 88.6% सीडी 73+ कोशिकाएं), और एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीडी 45- आबादी के भीतर 22.1% सीडी 31+ कोशिकाएं) 3 डी पृथक्करण के बाद ठीक हो गए। (बी) 3 डी प्रणाली व्यवहार्य हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं (सीडी 45 +) को कल्चर के 6 सप्ताह बाद तक बनाए रखने की अनुमति देती है। (ग) एचएमईसी-1 (इस उदाहरण में कुसबिरा-ऑरेंज से रंगीन) के साथ एनबीएम या एएमएल से प्राथमिक एमएससी से बनी 3डी प्रणालियां एचएससी (3.88% सीडी45+ डीएपीआई-कोशिकाओं ) को सीटू (डी) में बनाए रख सकती हैं। संक्षेप: बीएम = अस्थि मज्जा; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; एमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम सेल; एनबीएम = सामान्य अस्थि मज्जा; एएमएल = तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया; एचएससी = हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल; एफएससी = आगे बिखराव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: बीएम जैसे 3 डी मॉडल के भीतर सेल इंटरैक्शन और प्रसार का विज़ुअलाइज़ेशन। एचएस 27 ए और एचएमईसी -1 के साथ 3 डी सह-संस्कृति के 3 सप्ताह के बाद सिस्टम एकत्र किए गए थे और 1 सप्ताह के बाद हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को जोड़ा गया था। आईएचसी द्वारा विशिष्ट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग (भूरे रंग में कल्पना की गई) को एक एंटी-खरगोश या माउस घोड़े की मूली पेरोक्सीडेज का उपयोग करके कल्पना की गई थी और क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के रूप में 3,3'-डायमिनोबेंजिडीन के साथ कल्पना की गई थी और गिल-हेमेटोक्सीलिन के साथ काउंटरस्टेन्ड किया गया था और सीडी 45 (बाएं पैनल) के साथ हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की उपस्थिति को दर्शाता है, सीडी 73 (मध्य पैनल) के साथ स्ट्रोमल कोशिकाओं, या केआई 67 (दाएं पैनल) के साथ सभी कोशिकाओं का प्रसार। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षेप: बीएम = अस्थि मज्जा; आईएचसी = इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

मानव शारीरिक और संबंधित रोग संबंधी मुद्दों पर अध्ययन द्वारा सामना की जाने वाली वर्तमान चुनौतियों में से एक मानव अंगों के जटिल कार्यों की सटीक नकल करने वाले मॉडल की कमी है। मानव बीएम 3 डी मॉडल के मामले में, कई मॉडल हाइड्रोगेल का उपयोग करते हैं और आंशिक रूप से बीएम को पुन: पेश करते हैं, उदाहरण के लिए, एक बेहतर ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव 27,28 सुनिश्चित करने में शास्त्रीय 2 डी संस्कृतियों की तुलना में 3 डी संस्कृति स्थितियों की शक्ति कोदर्शाते हैं। फिर भी, अच्छी प्रजनन क्षमता और उपयोग में आसानी के बावजूद, ये सिस्टम मानव बीएम 3 डी संरचना और वास्तुकला की नकल नहीं करते हैं, जो आगे के विश्लेषणों को काफी प्रभावित कर सकते हैं। तकनीकी प्रगति ने वैज्ञानिकों को कुछ एचएससी गुणों को बनाए रखने के लिए छिड़काव-आधारित बायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग करके देशी मानव ओस्टियोब्लास्टिक आला वातावरण को बेहतर ढंग से पुन: उत्पन्न करने में सक्षमबनाया है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के विकास ने एक प्रासंगिक अस्थि मज्जा जैसी संरचना को पुन: पेश करने के लिए नए दृष्टिकोणों को जन्म दिया है, लेकिन अब तक केवल अस्थि मज्जा की सीमित विशेषताओं को हासिल किया है, और इसलिएअनुप्रयोगों को 30,31,32,33 तक सीमित कर दिया है।

भौतिक विज्ञान में प्रगति ने प्राकृतिक या सिंथेटिक बायोमैटेरियल्स की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास में योगदान दिया है, जिसका उपयोग प्रासंगिक 3 डी हड्डी संस्कृति प्रणालियों को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, ऐसी प्रणालियों को कभी-कभी मानक जैविक प्रयोगशालाओं में विकसित करना मुश्किल होता है, जिसमें बायोफिज़िक्स में कोई इन-हाउस कौशल नहीं होता है। इसके अलावा, ज्यादातर मामलों में, ये प्रणालियां बीएम माइक्रोएन्वायरमेंट सहित मानव हड्डी की 3 डी संरचना की नकल करने की सीमित क्षमता प्राप्त करती हैं, और बड़ी मात्रा में साइटोकिन्स और विकास कारकों का उपयोग करती हैं, जिससे कृत्रिम रूप से समृद्ध संस्कृति माध्यम34 बनता है।

एडिपोसाइटिक भेदभाव के बजाय ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव को प्रेरित करने का विकल्प इस तथ्य पर आधारित था कि प्रीओस्टियोब्लास्ट्स और ओस्टियोब्लास्ट को एंडोस्टियल आला35 के हिस्से के रूप में वर्णित किया गया है। इसने अस्थि और अस्थि मज्जा दोनों के अनुरोधित घटकों के रूप में ओस्टियोब्लास्टिक कोशिकाओं की पहचान की। अस्थि मज्जा के सेलुलर घटकों में, एंडोथेलियल और स्ट्रोमल कोशिकाएं माइक्रोएन्वायरमेंट के एक बड़े हिस्से पर कब्जा कर लेती हैं। इसके अलावा, ये दो सेल प्रकार होमियोस्टेसिस और भेदभाव के विनियमन में शामिल बाह्य मैट्रिक्स और साइटोकिन्स के संरचनात्मक गैर-सेलुलर घटकों का उत्पादन करते हैं, जो यहां कैल्सीफाइड संरचना उत्पन्न करने के लिए अनुरोध किया गया है। इस प्रकार, यह एंडोथेलियल और स्ट्रोमल कोशिकाओं के उपयोग को सही ठहराता है, और प्रयोगशालाओं के बीच आसान पहुंच और प्रजनन क्षमता बढ़ाने की अनुमति देने के लिए सेल लाइनों की हमारी पसंद। एचएमईसी -1 लाइन की संस्कृति समय के साथ अधिक स्थिर होने के साथ, इस सेल लाइन को 3 डी सिस्टम के विकास के लिए बरकरार रखा गया था। स्ट्रोमल कोशिकाओं के लिए, हमने 2 डी संस्कृति में सामान्य अस्थि मज्जा से प्राप्त स्ट्रोमल सेल लाइनों की ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव क्षमता की तुलना की: एचएस 5 और एचएस 27 ए। हमने पाया कि एचएस 5 लाइन ने किसी भी सेल लाइन के साथ उत्पन्न 3 डी सिस्टम में एचएस 27 ए लाइन के रूप में अंतर नहीं किया। इस संबंध में, एचएस 5 लाइन द्वारा एचएस 27 ए कोशिकाओं को बदलने के प्रयासों के परिणामस्वरूप कम कठोर संरचना का उत्पादन हुआ है, यह सुझाव देते हुए कि एचएस 27 ए अधिक उपयुक्त हैं।

एचएस 27 ए और एचएमईसी -1 सेल लाइनों दोनों को अलग-अलग मीडिया संयोजनों में सुसंस्कृत किया गया था, जिसमें ओस्टियोब्लास्ट संरचनाओं के साथ एचएमईसी -1 की सबसे अच्छी कठोर संरचना और संरेखण प्राप्त होता है ताकि बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन मूल संरचना में सापेक्ष कठोरता लाए। डी 14 में भेदभाव की प्रगति के विश्लेषण से पता चला है कि भेदभाव डी 21 (बीएसपी, लेट ओस्टियोब्लास्टिक मार्कर का माप) पर अधिक उन्नत था, एचएमईसी -1: एचएस 27 ए के लिए 1: 2 अनुपात के साथ और बेहतर परिणाम के साथ जब 2 × 106 एचएस 27 ए पेश किए गए थे। एंडोथेलियल कोशिकाओं की होमियोस्टैसिस और भेदभाव (साइटोकिन्स की आपूर्ति के माध्यम से अन्य चीजों के बीच) को विनियमित करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका है। तथ्य यह है कि एचएमईसी -1 कोशिकाओं को इस प्रणाली में बनाए रखा जाता है, यह इंगित करता है कि वे कम से कम इस भूमिका को पूरा कर सकते हैं, और यह हमारे मॉडल की वैधता में योगदान देता है। एचएमईसी -1 एंडोथेलियल लाइन के लिए, इसे जल्दी पेश करना महत्वपूर्ण था ताकि इसे संरचना में ठीक से एकीकृत किया जा सके और इस उम्मीद के साथ कि ये कोशिकाएं संरचना के भीतर संरेखण या यहां तक कि ट्यूब भी बना सकती हैं। एचएस 27 ए और एचएमईसी -1 के सह-संस्कृति परीक्षण विभिन्न चरणों में उत्तरार्द्ध को पेश करके किए गए थे: डी 0, डी 7, डी 14; कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं देखा गया, न तो स्ट्रोमल कोशिकाओं के भेदभाव में और न ही एंडोथेलियल कोशिकाओं के रखरखाव या स्थिति में। इस प्रकार, इन कोशिकाओं को प्रक्रिया की शुरुआत में पेश किया गया था। हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को ऐसे समय में पेश किया गया था जब ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव सेल-सेल इंटरैक्शन के पक्ष में पर्याप्त उन्नत होगा। यह विकल्प इस तथ्य से भी वातानुकूलित था कि यह ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव एक माध्यम के उपयोग से वातानुकूलित है, जो हमारे परीक्षणों के अनुसार, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के रखरखाव का पूरी तरह से समर्थन नहीं करता है। हेमेटोलॉजिकल कोशिकाएं या तो सेल लाइनें या प्राथमिक बीएम सीडी 45 हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं हो सकती हैं।

इस 3 डी मॉडल से, हम प्रत्येक सेल प्रकार को प्राथमिक कोशिकाओं, सामान्य या पैथोलॉजिकल द्वारा प्रतिस्थापित करने की परिकल्पना कर सकते हैं, या यहां तक कि बायोमिमेटिक गुणों को बढ़ावा देने के लिए अन्य सेल प्रकारों को जोड़ने के लिए, जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाएं, एडिपोसाइट्स, या फाइब्रोब्लास्ट26। वास्तव में, एचएस 27 ए सेल लाइन को कम पासिंग के साथ प्राथमिक बीएम एमएससी के साथ बदल दिया गया है। इसी तरह, हेमेटोलॉजिकल सेल लाइनों को प्राथमिक बीएम हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के साथ बदल दिया गया था। हालांकि, प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा एचएमईसी -1 कोशिकाओं के प्रतिस्थापन का अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है। वर्तमान में, इस मॉडल को अभी भी वाहिका प्रतिनिधित्व के संदर्भ में बेहतर बनाया जा सकता है, भले ही एंडोथेलियल कोशिकाएं मौजूद हों और माइक्रोएन्वायरमेंट (जैसे, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं) से अन्य कोशिकाओं के साथ सही ढंग से बातचीत करती हैं, वे संरचित वाहिकाओं का निर्माण नहीं करती हैं, इस प्रकार कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं की नकल करने के लिए प्रवाह छिड़काव को रोकती हैं। कुल मिलाकर, यह वर्तमान न्यूनतम 3 डी मॉडल की जटिलता और प्रतिनिधित्व को उत्तरोत्तर बढ़ा सकता है। अन्य सेल प्रकारों के अलावा अन्य मुद्दों की जांच करने वाले अध्ययन की सुविधा हो सकती है, जैसे कि स्थानीय बीएम सूजन का महत्व या इम्यूनोथेरेपी के प्रतिरोध।

हालांकि, इस 3 डी प्रणाली को रुचि की कोशिकाओं से पहले 3 सप्ताह की आवश्यकता होती है, हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं या उपकला कैंसर कोशिकाओं यदि मेटास्टेसिस प्रक्रिया का मूल्यांकन किया जाता है, तो जोड़ा जा सकता है। बाँझ स्थितियों को बनाए रखने की आवश्यकता है, क्योंकि साप्ताहिक रूप से दो बार मध्यम परिवर्तन कभी-कभी मध्यम संदूषण का कारण बन सकता है। इसके अलावा, चूंकि कुछ कोशिकाएं इंसर्ट के छिद्रों के माध्यम से पलायन कर सकती हैं और कुएं में फैलना शुरू कर सकती हैं, जिससे मध्यम खपत बढ़ जाती है, नियमित निगरानी की सिफारिश की जाती है।

हमने यहां ओस्टियोब्लास्टिक भेदभाव की अनुमति देने वाले एक 3 डी पाड़ का वर्णन किया और एक प्रासंगिक , इन विट्रो, 3 डी, मानव बीएम जैसे माइक्रोएन्वायरमेंट विकसित किया। यह प्रणाली सीटू विश्लेषण और अंतिम लाइव सेल पुनर्प्राप्ति में अनुमति देती है। यह प्रणाली मानव बीएम माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर बातचीत और तंत्र का अध्ययन करने के लिए अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक नया और अत्यधिक लचीला उपकरण, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रदान करती है।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

हम सीआरसीएल साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म से पी बैटिस्टन-मोंटेने और ए जाम्बन और रिसर्च पैथोलॉजी प्लेटफॉर्म, ट्रांसलेशनल रिसर्च एंड इनोवेशन विभाग, सेंटर लेओन बेरार्ड से एन गैडोट और सी लेनवे को धन्यवाद देते हैं। लेखक अंग्रेजी संस्करण के लिए बी मैनशिप के आभारी हैं। इस काम को इंसरम और एफआई-एलएमसी द्वारा वीएमएस को वित्त पोषित किया गया था, और एस एलकेए और एलबी को सोसाइटी फ्रैंकाइस डी'हेमेटोलॉजी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System MERCK SIGMA D7304 IHC staining
5 mL Pipette SARSTEDT 861253001 Medium change
Anti Mouse HRP Thermofisher 62-6520 IHC secondary staining
Anti Rabbit HRP Thermofisher 31460 IHC secondary staining
Ascorbic Acid 250 μM MERCK SIGMA A92902 ODM medium
BCP CaP Biomaterials
LLC-US		 3D Beads
Beta Glycerophosphate 10 mM MERCK SIGMA G9422 ODM medium
CD31-BV711 BD 744078 3D endothelial Cell population labelling
CD34-APC BD 555824 3D immature hematological Cell population labelling
CD38-PE-Cy5 BD 555461 3D progenitor hematological Cell population labelling
CD45 Miltenyibiotec 130-110-637 IHC staining of hematological cells
CD45-APC BD 555485 3D hematological Cell population labelling
CD45-BV500 BD 560777 3D hematological Cell population labelling
CD73 Miltenyibiotec 130-120-066 IHC staining of stromal compartment
CD73-BV605 BD 563199 3D osteoblastic Cell population labelling
Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube FALCON 352235 Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads
Collagenase MERCK SIGMA C2674-1G 3D enzymatic dissociation
Cytometry filtration tube Thermofisher 10585801 3D retrieved cells filtration
Cytometry tube Thermofisher 10100151 3D retrieved cells labelling 
DAPI (Solution 12) Chemometec 910-3012 3D retrieved viable cells labelling
Dexamethasone Thermofisher A13449 ODM medium
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL Thermofisher 31966021 ODM medium
EGF MERCK SIGMA E9644-0.2MG  HMED-1 medium
Eppendorf 1.5 mL tube SARSTEDT 72696 For beads autoclave and supernatant retieve
Falcon 15 mL FALCON 352096 For 3D Dissociation
FBS DUTSCHER S1900-500 To supplement culturing medium and stop trypsin action
Glutamax Thermofisher A1286001 glutamine substitute for HMED-1 medium
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 MERCK SIGMA GHS132-1L IHC staining
HMEC-1 ATCC CRL-3243 3D endothelial Cell population 
HS27A ATCC CRL-2496 3D osteoblastic Cell population 
Hydrocortisone MERCK SIGMA H0135-1MG HMED-1 medium
Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates THERMO SCIENTIFIC NUNC 140627 To harvest cells and form a 3D Bone like structure
KI-67 IHC Thermofisher MA5-14520 IHC staining of proliferative cells
MCDB 131 Medium, no glutamine Thermofisher 10372019 HMED-1 medium
Micropipette (1,000 µL) Eppendorf  4924000088 Medium change
PBS D 1x Thermofisher 14190169 Cells/ Insert wash
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher 15140122 To supplement culturing medium 
PFA (Formaldehyde 16%) EUROMEDEX EM-15710 3D Fixation (dilution with PBS 1X)
RMPI 1640 medium, glutamax supplement Thermofisher 61870044 Cuture medium
Scalpel   FISHER SCIENTIFIC 11768353 3D membrane cutting
Six well plate FALCON 353046 3D culture
TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) Thermofisher 25300096 3D enzymatic dissociation

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फिजियोलॉजिकल या ट्यूमरल संदर्भों में निवासी कोशिकाओं के बीच गतिशीलता और बातचीत की जांच करने के लिए एक मानव अस्थि मज्जा 3 डी मॉडल
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Arizkane, K., Geistlich, K., Moindrot, L., Risson, E., Jeanpierre, S., Barral, L., Bobard, A., Menegazzi, G., Voeltzel, T., Maguer-Satta, V., Lefort, S. A Human Bone Marrow 3D Model to Investigate the Dynamics and Interactions Between Resident Cells in Physiological or Tumoral Contexts. J. Vis. Exp. (190), e64736, doi:10.3791/64736 (2022).

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