Summary
Her beskriver vi et enkelt å implementere, standardisert, mikrofysiologisk system som gjenspeiler kompleksiteten til den menneskelige benmargens in vivo-struktur , og gir en relevant modell for å studere et bredt spekter av normale og patologiske hendelser.
Abstract
Den medulære nisje er et komplekst økosystem som er viktig for å opprettholde homeostase for bosatte celler. Faktisk er benmargen, som inkluderer en kompleks ekstracellulær matrise og forskjellige celletyper, som mesenkymale stamceller, osteoblaster og endotelceller, dypt involvert i hematopoietisk stamcelleregulering gjennom direkte celle-celle-interaksjoner, samt cytokinproduksjon. For å nøye etterligne denne in vivo-strukturen og gjennomføre eksperimenter som reflekterer responsene til den menneskelige benmargen, har flere 3D-modeller blitt opprettet basert på biomaterialer, hovedsakelig avhengig av primære stromale celler. Her beskrives en protokoll for å oppnå et minimalt og standardisert system som er enkelt å sette opp og gir funksjoner i benmargslignende struktur, som kombinerer forskjellige cellepopulasjoner, inkludert endotelceller, og reflekterer heterogeniteten til in vivo benmargsvev. Denne 3D-benmargslignende strukturen som er montert ved hjelp av kalsiumfosfatbaserte partikler og humane cellelinjer, som er representativ for benmargsmikromiljøet - tillater overvåking av et bredt spekter av biologiske prosesser ved å kombinere eller erstatte forskjellige primære cellepopulasjoner i systemet. De endelige 3D-strukturene kan da enten høstes for bildeanalyse etter fiksering, parafininnbygging og histologisk/immunhistokjemisk farging for cellelokalisering i systemet, eller dissosieres for å samle hver cellulær komponent for molekylær eller funksjonell karakterisering.
Introduction
Benmarg (BM) finnes i både de sentrale hulrommene i aksiale og lange bein og trabekulære flate bein, og inneholder en rekke forskjellige cellulære og ikke-cellulære komponenter. På strukturelt nivå består den av hematopoietiske vevsøyer (også kalt "hematoner")1,2 og fettceller omgitt av vaskulære bihuler ispedd trabekulært bein3. I lange og flate bein er blodtilførselen til bein og benmarg sammenkoblet gjennom et endosteal nettverk av fartøy4. Skjult i dette solide beskyttende nettverket, er BM vert for svært umodne celler nedsenket i en svampete stroma og utgjør stedet for differensiering av bosatte mesenkymale stamceller (MSCs) og hematopoietiske stamceller (HSCs)5. Faktisk, bortsett fra fornyelse av beinvev gjennom produksjon av osteoblaster, ligger en av de viktigste kjente funksjonene til BM i hematopoiesis utvikling6.
BM hematopoietisk vev inkluderer en rekke celletyper, nemlig HSC, forløpere og mer differensierte blodceller som lymfocytter, nøytrofiler, erytrocytter, granulocytter, monocytter og trombocytter7. Hematopoietiske celler er ikke tilfeldig arrangert i BM-rommet, men viser en bestemt organisasjon innenfor hematopoietiske nisjer, som inkluderer mange celletyper av forskjellig opprinnelse (osteoblaster, osteoklaster, MSCs, adipocytter, sinusformet endotel og perivaskulære stromale celler, immunceller, nerveceller og forskjellige modne hematopoietiske celler), som danner en kompleks struktur for å sikre normal hematopoiesis8 . De biologiske funksjonene til den hematopoietiske nisjen inkluderer regulering av HSC-overlevelse, adhesjon, hvile, homing og differensiering gjennom forskjellige mekanismer (celle-celle- og cellematriseinteraksjoner, produksjon av løselige faktorer, hypoksi) som svar på flere fysiologiske eller ikke-fysiologiske påkjenninger 3,6. Selv om disse hematopoietiske nisjene i utgangspunktet ble oppfattet som homogene enheter, har teknologiske fremskritt som enkeltcelle- og bildebehandlingsanalyser gradvis avslørt deres kompleksitet, dynamikk og adaptive egenskaper 9,10,11.
Det avgjørende behovet for å erstatte og redusere bruken av dyr for å dechiffrere menneskelige fysiologiske og patologiske prosesser fører til nye muligheter og utfordringer11,12. Blant nylig beskrevne in vitro-verktøy har tredimensjonale (3D) modeller som etterligner in vivo menneskelig BM bedre enn klassiske todimensjonale (2D) kulturer 13,14,15,16,17 blitt foreslått. 3D-modellering ser dermed ut til å være en lovende tilnærming for å observere celle-celle- og cellematriseinteraksjoner, nærmere de som forekommer in vivo. Ved hjelp av en rekke av disse modellene har noen lag demonstrert overlevelse og spredning av HSCs18,19. Flere 3D-modeller er tilgjengelige, den vanligste tilnærmingen er bruk av stillasbaserte 3D-biomaterialer som hydrogeler, kolloider eller kollagener, assosiert med MSCs som utnytter deres osteoblastiske avstamningsdifferensieringskapasiteter20,21,22. Likevel er det ikke oppnådd noe globalt samtykke for å oppfylle alle krav til studier på humane celler på en brukervennlig og standardisert måte23, spesielt siden disse nåværende 3D-systemene hovedsakelig er avhengige av primære stromale celler, og dermed lider av begrenset tilgang til primære prøver, vevstilgjengelighet og heterogenitet.
I tillegg bør endotelcellerommet innføres da disse cellene representerer en viktig komponent i celle-celle-interaksjoner og er involvert i stamcelleskjebne og BM-sykdomsutvikling, både i leukemi24 og metastase25. Vi har tidligere rapportert at tillegg av patologiske elementer i en standardisert human 3D benmargsmodell rekapitulerer trekk observert i pasientprøver som ekstracellulær matriks (ECM) endringer26. For bedre å forstå dynamikken og samspillet mellom det menneskelige BM-mikromiljøet og de bosatte cellene, gir vi en detaljert protokoll for et brukervennlig og standardisert system for å bygge en minimal, velorganisert, BM-lignende struktur. Dette systemet består av tre humane benmargscelletyper - endotelceller og stromale celler, som representerer mikromiljøet, og HSCs. Ved å bruke spesifikke perler som et stillas og et osteoblastisk differensieringsmedium, vil den oppnådde 3D-strukturen etterligne den menneskelige medulære nisjen, noe som muliggjør en praktisk studie av menneskelig benmarg.
Protocol
MERK: For å forberede den benmargslignende ryggradsstrukturen, er denne protokollen avhengig av å kombinere perler med HMEC-1 endotelceller og HS27A stromale celler på bifasiske kalsiumfosfat (BCP) perler. BCP-perlene vil fungere som et stillas som tillater, med et bestemt medium, 3D-strukturell forming.
1. Perlepreparasjon og sterilisering
- Vei 35-40 mg BCP-perler (HA / β-TCP 60/40; 45-75 μm) for hver innsats (liten, sylindrisk plastskål med en polykarbonatmembran nederst) i et 1,5 ml rør (se materialtabell). Etter å ha veid perlene, bar du et lite hull med en ren nål gjennom toppen av 1,5 ml røret for å unngå at lokket spretter opp under autoklavsyklusen (121 ° C i 60 minutter), og plasser rørene i vertikal stilling i en lukket steril boks .
2.3D sett inn preparat under en steril hette
- Sett sterile polykarbonatcellekulturinnlegg i brønnene på en 6-brønns plate. Hell sterile BCP-perler fra et 1,5 ml rør inn i innsatsen. Vask perlene forsiktig ved å dryppe 350 μL 1x fosfatbufret saltvann (PBS) inne i innsatsen, og tilsett deretter 4,5 ml 1x PBS i brønnen. Fjern og kast PBS enten ved å bruke vakuum eller en 5 ml pipette ved å plassere spissen i et hjørne av brønnen. Gjenta vasketrinnet to ganger.
- Når perlene er vasket, bruk 1x PBS supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) for å blokkere systemet. Tilsett forsiktig 350 μL av blokkeringsoppløsningen til innsatsen og 4,5 ml i brønnen og legg hele platen i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 over natten.
MERK: Trinn 2.1 og 2.2 bidrar til å minimere ionfrigivelse fra BCP-perler før cellesåing.
3. Cellelinjehøsting og 3D-vedlikehold
MERK: Etter dette inkubasjonstrinnet tilsettes mikromiljøceller for å danne 3D-strukturryggraden. Dette systemet er basert på bruk av HMEC-1, humane mikrovaskulære endotelceller udødeliggjort med stort T-antigen fra SV40, og HS27A, humane benmargstromalceller udødeliggjort med humant papillomavirus, på grunn av deres evne til å danne en solid BM-lignende struktur og deres kompatibilitet med inkludering av endotelceller.
- Før du legger til celler i systemet, klargjør du følgende inkubasjonsmedier:
- For 50 ml komplett osteodifferensieringsmedium (ODM), bland 45 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) + 5 ml FBS + 0,5 ml penicillin-streptomycin + 8 × 10-4 mg / L deksametason + 2,16 g / L beta-glycerofosfat + 44 mg / L askorbinsyre.
- For 50 ml komplett HMEC-1-medium, bland 45 ml MCDB 131 + 5 ml FBS + 0,5 ml penicillin-streptomycin + 1% glutaminerstatning + 1 mg / L hydrokortison + 10 μg / L EGF.
- Fjern blokkeringsløsningen fra systemet. Bland 1 × 106 HMEC-1-celler (som representerer det vaskulære rommet) og 2 × 106 HS27A-celler (som representerer det mesenkymale stromale cellerommet) i et 15 ml rør og sentrifuge i 5 minutter ved 1 575 × g ved romtemperatur. Kast supernatanten og tilsett 175 μL HMEC-1 medium (spesifikt medium for HMEC-1 cellevekst) med 175 μL ODM (spesifikt medium for HS27A osteodifferensiering).
- Hell 350 μL av denne suspensjonen som inneholder 3 × 106 celler totalt inne i hver innsats. Hell deretter 4,5 ml av det kombinerte mediet (2,25 ml HMEC-1 medium + 2,25 ml ODM) uten celler i brønnene på platen. Aspirer forsiktig og dispenser blandingen flere ganger med en 1 ml mikropipette for å homogenisere cellene og BCP-perlene i innsatsen. Tildel hele blandingen for å slå seg ned i bunnen av innsatsen.
MERK: Et blandingspreparat med ett dødt volum anbefales hvis flere innlegg dyrkes. For eksempel, hvis fire innlegg er dyrket, må du alltid forberede volumet som kreves for fem innlegg. - Når endotel- og mesenkymale celler er homogenisert inne i innsatsen, hold 6-brønnsplaten inne i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 uker. Bytt medium inne i innsatsen og brønnen 2x i uken ved å fjerne mediet forsiktig fra innsatsen ved hjelp av en 1 ml mikropipette og plassere spissen ved den indre innsatsveggen for å unngå å forstyrre hjørnet av innsatsen.
MERK: Den hentede supernatanten kan lagres ved -80 °C når som helst for senere proteinkvantifisering.
4. Tilsetning av celler av interesse i systemet
MERK: Etter 3 uker med HMEC-1 og HS27A dyrking, osteodifferensiering av HS27A celler aktivert stivning av systemet. På dette trinnet legger du til hematologiske celler av interesse (antall tilsatte celler kan variere fra 1 × 104 til 1 × 106) i innsatsen. De tilsatte cellene var TF1-celler transfisert med BCR-ABL-onkogen og primære mononukleerte CD34+ -celler som kom enten fra pasienter med akutt myelogen leukemi eller friske donorer.
- Endre mediumsammensetningen på dette trinnet, da ODM-forbindelsen er giftig for hematologiske celler, og det er ikke nødvendig å fortsette å legge den til når systemstivningen er ferdig. For eksempel, for å støtte hematopoietisk vedlikehold, erstatt ODM-medium med komplett RPMI for hematopoietiske cellelinjer (RPMI supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin) eller IMDM for primære hematopoietiske celler. Forbered en gruppe med 50% komplett HMEC-1 medium og 50% komplett RPMI / IMDM medium for 3D medium (to ganger) ukentlige endringer.
- Resuspend de hematologiske cellene av interesse i dette kombinasjonsmediet og legg det til i innsatsen. Hvis en narkotikabehandlingsprotokoll er nødvendig, vent 24 timer etter å ha lagt til cellene av interesse før behandling, noe som gir dem tid til å holde seg til den beinlignende strukturen.
- Tilpass perioden med 3D-cellekultur i henhold til kravene. Oppdater mediet (50 % HMEC-1 komplett medium + 50 % RPMI komplett medium) to ganger i uken.
MERK: I løpet av 3D-cellekulturen kan noen tilstøtende celler lekke utenfor innsatsen i bunnen av brønnene, noe som øker middels forbruk. Sjekk under mikroskopet for celledispersjon utover innsatsen og erstatt innsatsen i en ny 6-brønns plate under en steril hette om nødvendig.
5.3D benmargslignende eksperimentelle resultater
MERK: Etter 3D-dyrking kan flere utfall oppnås i henhold til eksperimentets mål.
- Protein analyse
MERK: I løpet av 3D-eksperimentet kan proteinene som skilles ut av cellene som er tilstede i benmargslignende struktur, samles inn for videre analyser.- Når kulturmedium skiftes 2x i uken, lagrer du den hentede supernatanten fra innsiden av innsatsen ved -80 ° C for å evaluere produksjonen av proteiner av interesse i systemet.
- Dissosiere celler fra 3D-strukturen (under en steril hette hvis celler må sorteres)
MERK: Cellene dyrket i 3D benmargslignende system kan hentes, sorteres og analyseres videre.- På slutten av forsøket, i et 15 ml rør, bland 4,5 ml RPMI med 0,5 ml FBS supplert med 0,4 mg / ml kollagenase, og varm løsningen ved 37 ° C i 10 minutter.
- Plasser innsatsen opp ned (hvit membranside på toppen) på et sterilt 6-brønns platedeksel for å kutte membranen ordentlig ut. Bruk en steril skalpell til å kutte membranen fra sidene, og hent dermed en hvit solid plate. Plasser platen inne i det varme 15 ml røret som er tilberedt i trinn 5.2.1.
- Plasser røret i et aktivt hjul i en 37 °C inkubator og inkuber i 10 minutter for å tillate fordøyelsen (i kontakt med kollagenase). Påfør samme inkubasjonstid for alle membraner for å unngå en skjev analyse.
- Etter 10 min, sentrifuger 15 ml røret i 5 minutter ved 1,575 × g ved romtemperatur, kast supernatanten og resuspend pelleten i 5 ml varm 1x PBS. MERK: På dette trinnet, da polykarbonatmembranen vanligvis flyter i supernatantfraksjonen, kan den kastes ved å bruke en steril pipettespiss. Hvis membranen fortsatt er inkludert i pelleten, la den stå og fjern den på slutten av neste trinn.
- Resuspend pelleten i 300 μL varm trypsin, virvle røret i 10 s, og legg det i et 37 ° C vannbad i 1 min.
- Stopp den enzymatiske fordøyelsen ved å tilsette 1 ml varm ren FBS. Med en 1 ml mikropipette, aspirer mekanisk og dispenser mediet for å dissosiere platen helt.
FORSIKTIG: Aspirasjons-/dispenseringstrinnet må være veldig raskt, ellers vil perlene sedimentere inne i spissen. - Sentrifuger røret i 5 minutter ved 1.575 × g. Resuspend pelleten i 3 ml 1x PBS supplert med 10% FBS.
- La perlene sedimentere i 5 s før du samler supernatanten og filtrerer den gjennom en 35 μm cellesil plassert på et oppsamlingsrør. Sentrifuge det hentede filtratet i 5 min ved 1 575 × g. Tell cellene med trypanblå for å evaluere levedyktigheten og fortsett til flowcytometrianalyser.
MERK: Antall levedyktige celler hentet etter trypanblå inkubasjon er ~ 1-2 × 105 celler per fordøyd innsats.
- Flowcytometrimerking av hentede celler
MERK: Cellene hentet fra 3D benmargslignende struktur kan merkes og analyseres videre ved flowcytometri. Bruk en blanding av antistoffer for å oppdage de forskjellige delene etter 3D-dissosiasjon. Her ble CD45 (flekker de hematologiske cellene av interesse), CD31 (flekker det vaskulære rommet) og CD73 (flekker det osteoblastiske rommet) brukt ved 1 μL i 50 μL PBS + 2% FBS. Hold alle forberedte celler og antistoffer på is (4 °C) borte fra lys under hele prosessen.- Resuspend pellets i antistoffblandingen og inkuber i 30-40 minutter på is vekk fra lys.
- Tilsett 1 ml PBS + 2% FBS for å vaske cellene og sentrifugen i 5 minutter ved 1,575 × g.
- Resuspend den hentede pelleten i 200 μL av 1x PBS + 10% FBS supplert med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, fortynnet 1: 2,000).
- Analyser rørene i et cytometer ved hjelp av følgende parametere: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Bruk et FSC-H versus FSC-W-grafplott for å portere singletpopulasjonen. I singletfraksjonen bruker du et DAPI-A versus FSC-A-grafplott for å bestemme den levedyktige cellepopulasjonen (DAPI-negativ). Med den DAPI-negative populasjonen tidligere inngjerdet, bruk et APC-A versus FSC-A-grafplott for å bestemme CD45-positiv populasjon.
- Fiksering av 3D benmargslignende struktur
MERK: Fiksering av den 3D BM-lignende strukturen utføres vanligvis for immunhistokjemi eller immunfluorescens for å visualisere celler in situ og for ytterligere spesifikk farging.- For å fikse den BM-lignende strukturen, overfør innsatsen (trinn 4.3) fra den gamle platen til en ny 6-brønns plate fylt med 1x PBS. Bytt deretter forsiktig ut mediet inne i innsatsen med 1x PBS.
NOTAT: Ikke skyll den dannede strukturen med PBS; væskens trykk kan svekke 3D-strukturen. - Når innsatsen er vasket, legg den i en ny 6-brønns plate og fyll både brønnen og innsatsen med nyåpnet paraformaldehyd (PFA) 4% (fortynnet 16% i 1x PBS).
- La fikseringsprosessen fortsette i 4 timer ved romtemperatur vekk fra lys.
- På slutten av fikseringsprosessen, vask innsatsen en gang med 1x PBS og oppbevar den ved 4 ° C vekk fra lys.
- Klipp membranen i bunnen av innsatsen som beskrevet i trinn 5.2.2 for å hente den faste disken.
- Inkuber disken 4x i 48 timer i EDTA (0,5 M, pH 8) for å avkalke strukturen.
- Legg inn strukturen i parafin og skjær 4 μm tykke seksjoner.
- Bruk en automatisert immunostainer, inkuber seksjonene med anti-CD45, anti-CD73 og Ki67 antistoffer. Visualiser fargingen med en anti-kanin eller -mus hest reddikperoksidase (HRP) og med 3,3'-diaminobenzidin som et kromogent substrat og motvekt med Gills-hematoksylin.
- For å fikse den BM-lignende strukturen, overfør innsatsen (trinn 4.3) fra den gamle platen til en ny 6-brønns plate fylt med 1x PBS. Bytt deretter forsiktig ut mediet inne i innsatsen med 1x PBS.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen er det mulig å rekapitulere et minimalt, in vitro, 3D, menneskelig BM-lignende mikromiljø, hvorfra levedyktige celler fra tre forskjellige cellerom kan hentes fra (figur 1). Faktisk, etter ønsket eksponering, kan 3D BM-lignende strukturer dissosieres og MSCs, endotelceller og hematopoietiske celler kan evalueres / karakteriseres ved hjelp av flowcytometri (figur 2A). Så langt tyder resultatene på at det er mulig å opprettholde hematologiske celler i minst 6 uker innenfor 3D-modellen, før man henter levedyktige celler (figur 2B). Det er imidlertid nødvendig med fremtidige undersøkelser for å estimere grensen for denne 3D-modellen. I tillegg er det ved behov mulig å erstatte HS27A-cellelinjen med primær normal benmarg (NBM) MSC eller akutt myelogen leukemi (AML) MSC i denne 3D BM-lignende modellen (figur 2C) eller erstatte hematopoietisk cellelinje med primære HSC-er (figur 2D). Videre, når man analyserer samspillet mellom cellerom eller lokalisering av spesifikke markører av interesse, kan 3D BM-lignende strukturer løses og viderebehandles med parafininnbygging og immunokjemi. For eksempel ble analysen av innholdet i CD45 (hematologisk) eller CD73 (MSC) utført ved hjelp av disse 3D-modellene (figur 3).
Figur 1: Skjematisk diagram over det første oppsettet av det menneskelige 3D BM-lignende systemet. Etter 3 uker med co-kultur, kan solid BM-lignende vev samles eller sådd med hematopoietiske celler (som i eksemplet) eller andre celletyper. Om nødvendig, når cellene er vedheftig, kan behandling legges til og middels endringer utføres to ganger i uken. På slutten av eksperimentet kan BM-lignende strukturer enten fikses og viderebehandles for lokaliseringsstudier eller dissosieres for å evaluere celleinnhold. Forkortelser: BCP = bifasisk kalsiumfosfat; BM = benmarg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gjenoppretting av levedyktige celler fra forskjellige rom etter kultur i den BM-lignende 3D-modellen. (A) Typisk mønster for celleutvinning fra en dissosiert BM-lignende struktur med 9,84% av levedyktige celler (DAPI-). Representative plott av hematopoietiske (66,6 % CD45+), MSC/osteoblastceller (88,6 % CD73+-celler i CD45-populasjonen) og endotelceller (22,1 % CD31+-celler i CD45-populasjonen) ble gjenfunnet etter 3D-dissosiasjon. (B) 3D-systemet tillater vedlikehold av levedyktige hematopoietiske celler (CD45+) opptil 6 uker etter kultur. (C) 3D-systemer laget av primære MSC-er fra NBM eller AML sammen med HMEC-1 (farget med Kusabira-Orange i dette eksemplet) kan opprettholde HSC-er (3,88 % CD45+ DAPI-celler) in situ (D). Forkortelser: BM = benmarg; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; MSC = mesenkymal stamcelle; NBM = normal benmarg; AML = akutt myelogen leukemi; HSC = hematopoietiske stamceller; FSC = fremover spredning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Visualisering av celleinteraksjoner og proliferasjon innenfor den BM-lignende 3D-modellen. Systemene ble samlet inn etter 3 uker med 3D-kokultur med HS27A og HMEC-1 og tillegg av hematopoietiske celler etter 1 uke. Typisk immunhistokjemifarging (visualisert i brunt) av IHC ble visualisert ved hjelp av en anti-kanin eller -mus hest reddik peroksidase og visualisert med 3,3′-diaminobenzidin som et kromogent substrat og motfarget med Gills-hematoxylin og viser tilstedeværelsen av enten hematopoietiske celler med CD45 (venstre panel), stromale celler med CD73 (midtpanel) eller spredning av alle celler med KI67 (høyre panel). Skala barer = 50 μm. Forkortelser: BM = benmarg; IHC = immunhistokjemi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
En av de nåværende utfordringene som studier på menneskelige fysiologiske og tilhørende patologiske problemer står overfor, er mangelen på modeller som nøyaktig etterligner de komplekse funksjonene til menneskelige organer. Når det gjelder menneskelige BM 3D-modeller, bruker mange modeller hydrogeler og delvis reproduserer BM, noe som illustrerer kraften i 3D-kulturforhold sammenlignet med klassiske 2D-kulturer for å sikre for eksempel en bedre osteoblastisk differensiering27,28. Likevel, til tross for god reproduserbarhet og brukervennlighet, etterligner disse systemene ikke den menneskelige BM 3D-strukturen og arkitekturen, noe som kan påvirke videre analyser betydelig. Teknologiske fremskritt har gjort det mulig for forskere å bedre reprodusere det innfødte humane osteoblastiske nisjemiljøet ved hjelp av et perfusjonsbasert bioreaktorsystem for å opprettholde noen HSC-egenskaper29. Utviklingen av mikrofluidiske enheter har ført til nye tilnærminger for å reprodusere en relevant benmargslignende struktur, men har hittil bare oppnådd begrensede egenskaper i benmargen, og har derfor begrenset applikasjoner30,31,32,33.
Fremskritt innen materialvitenskap har bidratt til utviklingen av et bredt spekter av naturlige eller syntetiske biomaterialer, som kan brukes til å utvikle relevante 3D-beinkultursystemer. Imidlertid er slike systemer noen ganger vanskelige å utvikle i standard biologiske laboratorier uten interne ferdigheter i biofysikk. Videre oppnår disse systemene i de fleste tilfeller en begrenset evne til å etterligne 3D-strukturen til det menneskelige beinet, inkludert BM-mikromiljøet, og har brukt store mengder cytokiner og vekstfaktorer, noe som skaper et kunstig rikt kulturmedium34.
Valget om å indusere osteoblastisk differensiering i stedet for adipocytisk differensiering var basert på det faktum at preosteoblaster og osteoblaster har blitt beskrevet som en del av endosteal nisje35. Dette identifiserte osteoblastiske celler som forespurte komponenter i både bein og benmarg. Blant de cellulære komponentene i benmargen opptar endotel- og stromalceller en stor del av mikromiljøet. I tillegg produserer disse to celletyper strukturelle ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrisen og cytokiner involvert i regulering av homeostase og differensiering, forespurt her for å generere en forkalket struktur. Dermed rettferdiggjør dette bruken av endotel- og stromale celler, og vårt valg av cellelinjer for å gi enkel tilgang og øke reproduserbarheten mellom laboratorier. Med kulturen til HMEC-1-linjen som er mer stabil over tid, ble denne cellelinjen beholdt for utviklingen av 3D-systemet. For stromale celler sammenlignet vi i 2D-kultur osteoblastdifferensieringskapasiteten til stromalcellelinjene avledet fra normal benmarg: HS5 og HS27A. Vi fant at HS5-linjen ikke differensierte så mye som HS27A-linjen i 3D-systemet generert med begge cellelinjene. I denne forbindelse har forsøk på å erstatte HS27A-celler med HS5-linjen resultert i produksjon av en mindre stiv struktur, noe som tyder på at HS27A er mer egnet.
Både HS27A- og HMEC-1-cellelinjer ble dyrket i forskjellige mediekombinasjoner, hvor man fremkaller den beste stive strukturen og justeringene av HMEC-1 langs osteoblaststrukturer, slik at produksjonen av den ekstracellulære matrisen gir en relativ stivhet til grunnstrukturen. Analyse av utviklingen av differensiering ved D14 viste at differensieringen var mer avansert ved D21 (måling av BSP, sen osteoblastisk markør), med forholdet 1: 2 for HMEC-1: HS27A og med bedre resultater når 2 × 106 HS27A ble introdusert. Endotelceller har også en viktig rolle i regulering av homeostase og differensiering (blant annet gjennom tilførsel av cytokiner). Det faktum at HMEC-1-celler opprettholdes i dette systemet indikerer at de i det minste kan oppfylle denne rollen, og dette bidrar til legitimiteten til modellen vår. For HMEC-1 endotellinjen var det viktig å introdusere den tidlig nok slik at den kunne integreres riktig i strukturen og med håp om at disse cellene kunne danne justeringer eller til og med rør i strukturen. Samkulturtester av HS27A og HMEC-1 ble utført ved å introdusere sistnevnte på forskjellige stadier: D0, D7, D14; Ingen merkbar forskjell ble observert, verken i differensieringen av stromalcellene eller i vedlikehold eller posisjonering av endotelcellene. Dermed ble disse cellene introdusert i begynnelsen av prosessen. Hematopoietiske celler ble introdusert på et tidspunkt da osteoblastisk differensiering ville være avansert nok til å favorisere celle-celle-interaksjoner. Dette valget ble også betinget av det faktum at denne osteoblastiske differensieringen er betinget av bruk av et medium, som ifølge våre tester ikke fullt ut støtter vedlikehold av hematopoietiske celler. Hematologiske celler kan enten være cellelinjer eller primære BM CD45 hematopoietiske celler.
Fra denne 3D-modellen kan vi se for oss å erstatte hver celletype med primære celler, normale eller patologiske, eller til og med å legge til andre celletyper for å øke biomimetiske egenskaper, for eksempel immunceller, adipocytter eller fibroblaster26. Faktisk har HS27A-cellelinjen blitt erstattet med primære BM MSC-er med lav passasje. Tilsvarende ble hematologiske cellelinjer erstattet med primære BM hematopoietiske celler. Imidlertid har erstatning av HMEC-1-celler av primære endotelceller ikke blitt testet ennå. For tiden kan denne modellen fortsatt forbedres når det gjelder vaskulaturrepresentasjon, som selv om endotelceller er tilstede og korrekt interagerer med andre celler fra mikromiljøet (f.eks. hematopoietiske celler), danner de ikke strukturerte kar, og utelukker dermed strømningsperfusjon for å etterligne funksjonelle blodkar. Samlet sett kan dette gradvis øke kompleksiteten og representativiteten til dagens minimale 3D-modell. Tilsetning av andre celletyper kan lette studier som undersøker andre problemer, for eksempel betydningen av lokal BM-betennelse eller motstand mot immunterapi.
Imidlertid trenger dette 3D-systemet 3 uker før celler av interesse, hematologiske celler eller epitelkreftceller hvis metastaseprosessen evalueres, kan legges til. Sterile forhold må opprettholdes, da middels endringer to ganger i uken noen ganger kan føre til middels forurensning. Videre, siden noen celler kan migrere gjennom porene i innsatsen og begynne å spre seg i brønnen, noe som fører til økt mediumforbruk, anbefales regelmessig overvåking.
Vi beskrev her et 3D-stillas som tillater osteoblastisk differensiering og utviklet et relevant, in vitro , 3D, menneskelig BM-lignende mikromiljø. Dette systemet tillater in situ-analyse og endelig gjenfinning av levende celler. Dette systemet gir et nytt og svært fleksibelt verktøy, reproduserbart og brukervennlig, med et bredt spekter av applikasjoner for å studere interaksjoner og mekanismer i det menneskelige BM-mikromiljøet.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker P. Battiston-Montagne og A. Jambon fra CRCL-cytometriplattformen og N. Gadot og C. Leneve fra Research Pathology Platform, Institutt for translasjonsforskning og innovasjon, Centre Léon Bérard. Forfatterne takker B. Manship for den engelske utgaven. Dette arbeidet ble finansiert av Inserm og FI-LMC til V. M. S., og S. L. K. A. og L. B. ble støttet av et stipend fra Société Française d'Hématologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
- Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
- Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
- Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S.
- Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
- Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
- Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462 (2022).
- Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A.
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
- Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
- Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
- Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77 (2018).
- Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
- Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
- Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002 (2016).
- Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
- Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
- Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
- de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796 (2021).
- Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683 (2021).
- Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).
