Summary
Aqui, descrevemos um sistema microfisiológico padronizado e fácil de implementar que reflete a complexidade da estrutura in vivo da medula óssea humana, fornecendo um modelo pertinente para estudar finamente uma ampla gama de eventos normais e patológicos.
Abstract
O nicho medular é um ecossistema complexo que é essencial para manter a homeostase das células residentes. De fato, a medula óssea, que inclui uma matriz extracelular complexa e vários tipos de células, como células-tronco mesenquimais, osteoblastos e células endoteliais, está profundamente envolvida na regulação das células-tronco hematopoiéticas através de interações diretas célula-célula, bem como na produção de citocinas. Para imitar de perto essa estrutura in vivo e conduzir experimentos que reflitam as respostas da medula óssea humana, vários modelos 3D foram criados com base em biomateriais, confiando principalmente em células estromais primárias. Aqui, um protocolo é descrito para obter um sistema mínimo e padronizado que seja fácil de configurar e forneça características de estrutura semelhante à medula óssea, que combina diferentes populações celulares, incluindo células endoteliais, e reflete a heterogeneidade do tecido da medula óssea in vivo . Esta estrutura 3D semelhante à medula óssea - montada usando partículas à base de fosfato de cálcio e linhas celulares humanas, representativas do microambiente da medula óssea - permite o monitoramento de uma ampla variedade de processos biológicos, combinando ou substituindo diferentes populações de células primárias dentro do sistema. As estruturas 3D finais podem então ser colhidas para análise de imagem após fixação, incorporação de parafina e coloração histológica/imuno-histoquímica para localização celular dentro do sistema, ou dissociadas para coletar cada componente celular para caracterização molecular ou funcional.
Introduction
A medula óssea (BM) é encontrada dentro das cavidades centrais dos ossos axiais e longos e dos ossos planos trabeculares, e contém uma variedade de componentes celulares e não celulares distintos. No nível estrutural, é constituída por ilhas de tecido hematopoiético (também chamadas de "hematons")1,2 e células adiposas circundadas por seios vasculares intercalados dentro do osso trabecular3. Em ossos longos e planos, o suprimento sanguíneo para o osso e a medula óssea estão interligados através de uma rede endosteal de vasos4. Escondidas nessa sólida rede protetora, a BM hospeda células muito imaturas imersas em um estroma esponjoso e constitui o local para a diferenciação de células-tronco mesenquimais residentes (CTMs) e células-tronco hematopoiéticas (HSCs)5. De fato, além da renovação dos tecidos ósseos por meio da produção de osteoblastos, uma das principais funções conhecidas da BM reside no desenvolvimento da hematopoiese6.
O tecido hematopoiético BM inclui uma variedade de tipos celulares, a saber, HSCs, precursores e células sanguíneas mais diferenciadas, como linfócitos, neutrófilos, eritrócitos, granulócitos, monócitos e trombócitos7. As células hematopoiéticas não estão dispostas aleatoriamente no espaço BM, mas exibem uma organização particular dentro dos nichos hematopoiéticos, que incluem muitos tipos celulares de diferentes origens (osteoblastos, osteoclastos, CTMs, adipócitos, endotélio sinusoidal e células estromais perivasculares, células imunes, células nervosas e células hematopoiéticas maduras distintas), formando uma estrutura complexa para garantir a hematopoiese normal8 . As funções biológicas do nicho hematopoiético incluem regulação da sobrevida do HSC, adesão, quiescência, homing e diferenciação através de diferentes mecanismos (interações célula-célula e célula-matriz, produção de fatores solúveis, hipóxia) em resposta a múltiplos estresses fisiológicos ou não fisiológicos 3,6. Embora esses nichos hematopoiéticos tenham sido inicialmente percebidos como entidades homogêneas, avanços tecnológicos como análises unicelulares e de imagem têm revelado progressivamente sua complexidade, dinâmica e propriedades adaptativas 9,10,11.
A necessidade crucial de substituir e reduzir o uso de animais para decifrar processos fisiológicos e patológicos humanos leva a novas oportunidades e desafios11,12. Dentre as ferramentas in vitro recém-descritas, modelos tridimensionais (3D) que imitam a BM humana in vivo melhor do que as culturas bidimensionais clássicas (2D) 13,14,15,16,17 têm sido propostos. A modelagem 3D, portanto, parece ser uma abordagem promissora para observar as interações célula-célula e célula-matriz, mais próximas daquelas que ocorrem in vivo. Utilizando uma variedade desses modelos, algumas equipes demonstraram a sobrevivência e proliferação de HSCs18,19. Vários modelos 3D estão disponíveis, sendo a abordagem mais comum o uso de biomateriais 3D à base de andaimes, como hidrogéis, coloides ou colágenos, associados a CTMs aproveitando suas capacidades de diferenciação de linhagem osteoblástica20,21,22. No entanto, nenhum consentimento global foi alcançado para atender a todos os requisitos para estudos em células humanas de maneira amigável e padronizada23, especialmente porque esses sistemas 3D atuais dependem principalmente de células estromais primárias e, portanto, sofrem de acesso limitado a amostras primárias, disponibilidade tecidual e heterogeneidade.
Além disso, o compartimento das células endoteliais deve ser introduzido, pois essas células representam um componente importante das interações célula-célula e estão envolvidas no destino das células-tronco e no desenvolvimento da doença BM, tanto na leucemia24 quanto na metástase25. Relatamos anteriormente que a adição de elementos patológicos em um modelo padronizado de medula óssea 3D humana recapitula características observadas em amostras de pacientes, como alterações da matriz extracelular (MEC)26. Para entender melhor a dinâmica e as interações entre o microambiente BM humano e as células residentes, fornecemos um protocolo detalhado para um sistema padronizado e fácil de usar para construir uma estrutura mínima, bem organizada e semelhante à BM. Este sistema é composto por três tipos de células da medula óssea humana - células endoteliais e células estromais, que representam o microambiente, e HSCs. Usando contas específicas como um andaime e um meio de diferenciação osteoblástica, a estrutura 3D obtida imitará o nicho medular humano, permitindo um estudo prático da medula óssea humana.
Protocol
NOTA: Para preparar a estrutura da espinha dorsal semelhante à medula óssea, este protocolo baseia-se na combinação de contas com células endoteliais HMEC-1 e células estromais HS27A em esferas bifásicas de fosfato de cálcio (BCP). As contas BCP servirão como um andaime permitindo, com um meio específico, a modelagem estrutural 3D.
1. Preparação e esterilização de grânulos
- Pesar 35-40 mg de grânulos de BCP (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) para cada inserção (prato de plástico pequeno, cilíndrico com uma membrana de policarbonato no fundo) num tubo de 1,5 ml (ver Tabela de Materiais). Depois de pesar as contas, faça um pequeno orifício com uma agulha limpa através da parte superior do tubo de 1,5 mL para evitar que a tampa se abra durante o ciclo de autoclave (121 °C por 60 min) e coloque os tubos em uma posição vertical em uma caixa estéril fechada.
2.3D preparar a inserção sob um exaustor estéril
- Coloque inserções estéreis de cultura de células de policarbonato dentro dos poços de uma placa de 6 poços. Despeje esferas de BCP estéreis de um tubo de 1,5 mL na inserção. Lave cuidadosamente as contas pingando 350 μL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) dentro da pastilha e, em seguida, adicione 4,5 mL de 1x PBS ao poço. Remova e descarte o PBS usando vácuo ou uma pipeta de 5 mL, colocando a ponta em um canto do poço. Repita a etapa de lavagem duas vezes.
- Uma vez que as contas são lavadas, use 1x PBS suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) para bloquear o sistema. Adicionar cuidadosamente 350 μL da solução de bloqueio à inserção e 4,5 ml ao alvéolo e colocar toda a placa numa incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
Observação : etapas 2.1 e 2.2 ajudam a minimizar a liberação de íons de contas BCP antes da propagação de células.
3. Colheita da linhagem celular e manutenção 3D
NOTA: Após esta etapa de incubação, as células microambientais são adicionadas para formar a espinha dorsal da estrutura 3D. Este sistema baseia-se no uso de HMEC-1, células endoteliais microvasculares humanas imortalizadas com grande antígeno T de SV40, e HS27A, células estromais da medula óssea humana imortalizadas com papilomavírus humano, devido à sua capacidade de formar uma estrutura sólida semelhante ao BM e à sua compatibilidade com a inclusão de células endoteliais.
- Antes de adicionar células ao sistema, prepare os seguintes meios de incubação:
- Para 50 mL de Meio de Diferenciação Osteo (DMO) completo, misture 45 mL de meio águia modificada (DMEM) da Dulbecco + 5 mL de FBS + 0,5 mL de penicilina-estreptomicina + 8 × 10-4 mg/L de dexametasona + 2,16 g/L de beta-glicerofosfato + 44 mg/L de ácido ascórbico.
- Para 50 mL de meio HMEC-1 completo, misture 45 mL de MCDB 131 + 5 mL de FBS + 0,5 mL de penicilina-estreptomicina + 1% de substituto de glutamina + 1 mg/L de hidrocortisona + 10 μg/L de EGF.
- Remova a solução de bloqueio do sistema. Misture 1 × 10 6 células HMEC-1 (representando o compartimento vascular) e 2 × 106 células HS27A (representando o compartimento de células estromais mesenquimais) em um tubo de 15 mL e centrífuga por 5 min a 1.575 × g à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e adicione 175 μL de meio HMEC-1 (meio específico para crescimento celular HMEC-1) com 175 μL de ODM (meio específico para osteodiferenciação HS27A).
- Deitar 350 μL desta suspensão contendo 3 × 106 células totais no interior de cada inserção. Em seguida, despeje 4,5 mL do meio combinado (2,25 mL de meio HMEC-1 + 2,25 mL de ODM) sem células nos poços da placa. Aspirar suavemente e dispensar a mistura várias vezes com uma micropipeta de 1 ml para homogeneizar as células e as esferas de BCP dentro da pastilha. Aloque toda a mistura para assentar na parte inferior da inserção.
NOTA: Recomenda-se uma preparação de mistura com um volume morto se várias inserções forem cultivadas. Por exemplo, se quatro inserções forem cultivadas, sempre prepare o volume necessário para cinco inserções. - Uma vez que as células endoteliais e mesenquimais estejam homogeneizadas dentro da inserção, mantenha a placa de 6 poços dentro de uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 por 3 semanas. Troque o meio dentro da pastilha e o poço 2x por semana, removendo cuidadosamente o meio da inserção usando uma micropipeta de 1 mL e colocando a ponta na parede interna da inserção para evitar perturbar o canto da pastilha.
NOTA: O sobrenadante recuperado pode ser armazenado a -80 °C em qualquer passo para posterior quantificação da proteína.
4. Adição de células de interesse no sistema
NOTA: Após 3 semanas de cultivo de HMEC-1 e HS27A, a osteodiferenciação das células HS27A permitiu a rigidez do sistema. Nesta etapa, adicione células hematológicas de interesse (o número de células adicionadas pode variar de 1 × 104 a 1 × 106) dentro da inserção. As células adicionadas foram células TF1 transfectadas com oncogene BCR-ABL e células CD34+ mononucleadas primárias provenientes de pacientes com leucemia mieloide aguda ou doadores saudáveis.
- Altere a composição do meio nesta etapa, pois o composto ODM é tóxico para as células hematológicas e não há necessidade de continuar adicionando-o uma vez que a rigidez do sistema é feita. Por exemplo, para apoiar a manutenção hematopoiética, substitua o meio ODM por RPMI completo por linhagens celulares hematopoiéticas (RPMI suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina) ou IMDM por células hematopoiéticas primárias. Prepare um lote de 50% de meio HMEC-1 completo e 50% de meio RPMI/IMDM completo para o meio 3D (duas vezes) de mudanças semanais.
- Ressuspenda as células hematológicas de interesse neste meio de combinação e adicione-o dentro da inserção. Se um protocolo de tratamento medicamentoso for necessário, aguarde 24 horas após a adição das células de interesse antes de tratar, dando-lhes tempo para aderir à estrutura óssea.
- Adaptar o período de cultura de células 3D de acordo com os requisitos. Atualize o meio (50% HMEC-1 meio completo + 50% RPMI meio completo) duas vezes por semana.
NOTA: Ao longo da cultura de células 3D, algumas células aderentes podem vazar para fora da inserção no fundo dos poços, aumentando o consumo médio. Verifique sob o microscópio a dispersão celular além da inserção e substitua a inserção em uma nova placa de 6 poços sob um capô estéril, se necessário.
5.3D resultados experimentais semelhantes à medula óssea
NOTA: Após a cultura 3D, vários resultados podem ser alcançados de acordo com os objetivos do experimento.
- Análise de proteínas
NOTA: Ao longo do experimento 3D, as proteínas secretadas pelas células presentes na estrutura semelhante à medula óssea podem ser coletadas para análises adicionais.- Quando o meio de cultura for trocado 2x por semana, armazenar o sobrenadante recuperado do interior da pastilha a -80 °C para avaliar a produção de proteínas de interesse dentro do sistema.
- Dissociar as células da estrutura 3D (sob um capô estéril se as células precisarem ser classificadas)
NOTA: As células cultivadas no sistema 3D semelhante à medula óssea podem ser recuperadas, classificadas e analisadas mais detalhadamente.- Ao final do experimento, em tubo de 15 mL, misture 4,5 mL de RPMI com 0,5 mL de FBS suplementado com 0,4 mg/mL de colagenase e aqueça a solução a 37 °C por 10 min.
- Coloque a inserção de cabeça para baixo (lado da membrana branca na parte superior) em uma tampa de placa estéril de 6 poços para cortar a membrana corretamente. Use um bisturi estéril para cortar a membrana dos lados, recuperando assim um disco sólido branco. Colocar o disco no interior do tubo quente de 15 ml preparado na fase 5.2.1.
- Coloque o tubo numa roda activa numa incubadora a 37 °C e incube durante 10 minutos para permitir a digestão (em contacto com a colagenase). Aplique o mesmo tempo de incubação para todas as membranas para evitar uma análise distorcida.
- Após 10 min, centrifugar o tubo de 15 mL por 5 min a 1.575 × g à temperatura ambiente, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de PBS 1x quente. NOTA: Nesta etapa, como a membrana de policarbonato geralmente flutua na fração sobrenadante, ela pode ser descartada usando uma ponta de pipeta estéril. Se a membrana ainda estiver incluída no pellet, deixe-a e remova-a no final da próxima etapa.
- Ressuscite o pellet em 300 μL de tripsina morna, faça um vórtice do tubo por 10 s e coloque-o em banho-maria de 37 °C por 1 min.
- Pare a digestão enzimática adicionando 1 mL de FBS puro quente. Com uma micropipeta de 1 mL, aspirar mecanicamente e dispensar o meio para dissociar completamente o disco.
CUIDADO: A etapa de aspiração/dosagem deve ser muito rápida, caso contrário, as contas se sedimentarão dentro da ponta. - Centrifugar o tubo por 5 min a 1.575 × g. Ressuscite o pellet em 3 mL de 1x PBS suplementado com FBS a 10%.
- Deixe as contas sedimentarem por 5 s antes de coletar o sobrenadante e filtrá-lo através de um filtro celular de 35 μm colocado em um tubo de coleta. Centrifugar o filtrado recuperado durante 5 minutos a 1.575 × g. Conte as células com azul de tripano para avaliar a viabilidade e proceder às análises de citometria de fluxo.
NOTA: O número de células viáveis recuperadas após a incubação azul de tripano é de ~1-2 × 105 células por inserção digerida.
- Marcação por citometria de fluxo de células recuperadas
NOTA: As células recuperadas da estrutura 3D semelhante à medula óssea podem ser marcadas e analisadas por citometria de fluxo. Use uma mistura de anticorpos para detectar os diferentes compartimentos após a dissociação 3D. Aqui, CD45 (colore as células hematológicas de interesse), CD31 (colore o compartimento vascular) e CD73 (colore o compartimento osteoblástico) foram utilizados a 1 μL em 50 μL de PBS + 2% FBS. Mantenha todas as células e anticorpos preparados no gelo (4 °C) longe da luz durante todo o processo.- Ressuscite os pellets na mistura de anticorpos e incube por 30-40 minutos no gelo longe da luz.
- Adicionar 1 mL de PBS + 2% FBS para lavar as células e centrifugar por 5 min a 1.575 × g.
- Ressuspender o pellet recuperado em 200 μL de 1x PBS + 10% FBS suplementado com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, diluído 1:2.000).
- Analisar os tubos em um citômetro utilizando os seguintes parâmetros: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Use um gráfico FSC-H versus FSC-W para portar a população singlete. Na fração singleta, use um gráfico DAPI-A versus FSC-A para determinar a população de células viáveis (DAPI-negativa). Com a população DAPI-negativa previamente delimitada, use um gráfico APC-A versus FSC-A para determinar a população CD45-positiva.
- Fixação da estrutura 3D semelhante à medula óssea
NOTA: A fixação da estrutura 3D semelhante à BM é geralmente realizada para imuno-histoquímica ou imunofluorescência para visualizar células in situ e para coloração mais específica.- Para fixar a estrutura semelhante a BM, transfira a pastilha (etapa 4.3) da placa antiga para uma nova placa de 6 poços preenchida com 1x PBS. Em seguida, substitua suavemente o meio dentro da pastilha por 1x PBS.
NOTA: Não lave a estrutura formada com PBS; a pressão do líquido pode prejudicar a estrutura 3D. - Uma vez lavada a pastilha, coloque-a dentro de uma nova placa de 6 poços e encha o poço e a pastilha com paraformaldeído (PFA) recém-aberto a 4% (diluído 16% em 1x PBS).
- Deixe o processo de fixação prosseguir por 4 h à temperatura ambiente longe da luz.
- No final do processo de fixação, lavar a pastilha uma vez com 1x PBS e guardá-la a 4 °C longe da luz.
- Corte a membrana na parte inferior da pastilha, conforme descrito na etapa 5.2.2, para recuperar o disco sólido.
- Incubar o disco 4x por 48 h em EDTA (0,5 M, pH 8) para descalcificar a estrutura.
- Incorpore a estrutura em parafina e corte seções de 4 μm de espessura.
- Usando um imunosestanizador automatizado, incube as seções com anticorpos anti-CD45, anti-CD73 e Ki67. Visualize a coloração com uma peroxidase de rabanete de cavalo anti-coelho ou rato (HRP) e com 3,3'-diaminobenzidina como substrato cromogênico e contracorante com hematoxilina de Gill.
- Para fixar a estrutura semelhante a BM, transfira a pastilha (etapa 4.3) da placa antiga para uma nova placa de 6 poços preenchida com 1x PBS. Em seguida, substitua suavemente o meio dentro da pastilha por 1x PBS.
Representative Results
Usando este protocolo, é possível recapitular um microambiente mínimo, in vitro , 3D, semelhante ao BM humano, a partir do qual células viáveis de três compartimentos celulares diferentes podem ser recuperadas (Figura 1). De fato, após a exposição desejada, estruturas 3D semelhantes à BM podem ser dissociadas e as CTMs, células endoteliais e células hematopoiéticas podem ser avaliadas/caracterizadas por citometria de fluxo (Figura 2A). Até o momento, os resultados sugerem que é possível manter as células hematológicas por pelo menos 6 semanas dentro do modelo 3D, antes de recuperar as células viáveis (Figura 2B). No entanto, investigações futuras são necessárias para estimar o limite deste modelo 3D. Além disso, se necessário, é possível substituir a linhagem celular HS27A por MSC primária de Medula Óssea Normal (NBM) ou Leucemia Mieloide Aguda (LMA) MSC neste modelo 3D semelhante ao BM (Figura 2C) ou substituir a linhagem celular hematopoiética por HSCs primárias (Figura 2D). Além disso, ao analisar as interações entre os compartimentos celulares ou a localização de marcadores específicos de interesse, as estruturas 3D semelhantes à BM podem ser fixadas e processadas com incorporação de parafina e imunoquímica. Por exemplo, a análise dos teores de CD45 (hematológico) ou CD73 (MSC) foi realizada utilizando esses modelos 3D (Figura 3).
Figura 1: Diagrama esquemático da configuração inicial do sistema humano 3D BM-like. Após 3 semanas de co-cultura, o tecido sólido semelhante ao BM pode ser coletado ou semeado com células hematopoiéticas (como no exemplo) ou outros tipos de células. Se necessário, uma vez que as células são aderentes, o tratamento pode ser adicionado e as mudanças médias realizadas duas vezes por semana. No final do experimento, estruturas semelhantes à BM podem ser fixadas e processadas para estudos de localização ou dissociadas para avaliar o conteúdo celular. Abreviaturas: BCP = fosfato de cálcio bifásico; BM = medula óssea. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Recuperação de células viáveis de diferentes compartimentos após a cultura no modelo 3D do tipo BM. (A) Padrão típico de recuperação celular de uma estrutura dissociada do tipo BM com 9,84% de células viáveis (DAPI-). Gráficos representativos de células hematopoiéticas (66,6% CD45+), MSC/osteoblastos (88,6% células CD73+ dentro da população CD45- e células endoteliais (22,1% células CD31+ dentro da população CD45-) recuperadas após dissociação 3D. (B) O sistema 3D permite a manutenção de células hematopoiéticas viáveis (CD45+) até 6 semanas após a cultura. (C) Sistemas 3D feitos de MSCs primárias de NBM ou AML ao lado de HMEC-1 (colorido com Kusabira-Orange neste exemplo) podem manter HSCs (3,88% CD45+ DAPI-células) in situ (D). Abreviaturas: BM = medula óssea; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; CTM = células-tronco mesenquimais; NBM = medula óssea normal; LMA = leucemia mieloide aguda; HSCs = células-tronco hematopoiéticas; FSC = dispersão para a frente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização das interações celulares e proliferação dentro do modelo 3D do tipo BM. Os sistemas foram coletados após 3 semanas de cocultura 3D com HS27A e HMEC-1 e a adição de células hematopoiéticas após 1 semana. A coloração imuno-histoquímica típica (visualizada em marrom) pela IHC foi visualizada usando uma peroxidase de rabanete anti-coelho ou rato e visualizada com 3,3′-diaminobenzidina como substrato cromogênico e contracorada com hematoxilina de Gill e mostra a presença de células hematopoiéticas com CD45 (painel esquerdo), células estromais com CD73 (painel médio) ou proliferação de todas as células com KI67 (painel direito). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: BM = medula óssea; IHC = imuno-histoquímica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Um dos desafios atuais enfrentados pelos estudos sobre questões fisiológicas humanas e patológicas associadas é a falta de modelos que imitem com precisão as funções complexas dos órgãos humanos. No caso dos modelos BM 3D humanos, muitos modelos utilizam hidrogéis e reproduzem parcialmente o BM, ilustrando o poder das condições de cultura 3D em comparação com as culturas 2D clássicas em garantir, por exemplo, uma melhor diferenciação osteoblástica27,28. No entanto, apesar da boa reprodutibilidade e facilidade de uso, esses sistemas não imitam a estrutura e a arquitetura humana do BM 3D, o que pode afetar significativamente outras análises. Os avanços tecnológicos permitiram que os cientistas reproduzissem melhor o ambiente de nicho osteoblástico humano nativo usando um sistema de biorreator baseado em perfusão para manter algumas propriedades do HSC29. O desenvolvimento de dispositivos microfluídicos levou a novas abordagens para reproduzir uma estrutura relevante semelhante à medula óssea, mas até agora só alcançaram características limitadas da medula óssea e, portanto, restringiram as aplicações30,31,32,33.
Os avanços nas ciências dos materiais contribuíram para o desenvolvimento de uma ampla gama de biomateriais naturais ou sintéticos, que podem ser usados para desenvolver sistemas relevantes de cultura óssea 3D. No entanto, tais sistemas às vezes são difíceis de desenvolver em laboratórios biológicos padrão sem habilidades internas em biofísica. Além disso, na maioria dos casos, esses sistemas alcançam uma capacidade limitada de imitar a estrutura 3D do osso humano, incluindo o microambiente BM, e têm utilizado grandes quantidades de citocinas e fatores de crescimento, criando um meio de cultura artificialmente rico34.
A escolha por induzir diferenciação osteoblástica em vez de diferenciação adipocítica baseou-se no fato de que pré-osteoblastos e osteoblastos têm sido descritos como parte do nicho endosteal35. Isso identificou as células osteoblásticas como componentes solicitados do osso e da medula óssea. Dentre os componentes celulares da medula óssea, as células endoteliais e estromais ocupam grande proporção do microambiente. Além disso, esses dois tipos celulares produzem componentes estruturais não celulares da matriz extracelular e citocinas envolvidas na regulação da homeostase e diferenciação, aqui solicitadas para gerar uma estrutura calcificada. Assim, isso justifica o uso de células endoteliais e estromais, e nossa escolha de linhagens celulares para permitir fácil acesso e aumentar a reprodutibilidade entre os laboratórios. Com a cultura da linha HMEC-1 sendo mais estável ao longo do tempo, esta linhagem celular foi mantida para o desenvolvimento do sistema 3D. Para as células estromais, comparamos em cultura 2D a capacidade de diferenciação de osteoblastos das linhagens celulares estromais derivadas da medula óssea normal: HS5 e HS27A. Descobrimos que a linha HS5 não se diferenciava tanto quanto a linha HS27A no sistema 3D gerado com qualquer uma das linhagens celulares. A este respeito, as tentativas de substituir as células HS27A pela linha HS5 resultaram na produção de uma estrutura menos rígida, sugerindo que as HS27A são mais adequadas.
Ambas as linhagens celulares HS27A e HMEC-1 foram cultivadas em diferentes combinações de meios, nas quais se provoca a melhor estrutura rígida e alinhamentos de HMEC-1 ao longo de estruturas osteoblásticas para que a produção da matriz extracelular traga uma relativa rigidez à estrutura básica. A análise do avanço da diferenciação em D14 mostrou que a diferenciação foi mais avançada em D21 (medida de BSP, marcador osteoblástico tardio), com proporção de 1:2 para HMEC-1:HS27A e com melhores resultados quando 2 × 106 HS27A foram introduzidos. As células endoteliais também têm um papel importante na regulação da homeostase e diferenciação (entre outras coisas através do fornecimento de citocinas). O fato de as células HMEC-1 serem mantidas nesse sistema indica que elas podem, pelo menos, cumprir esse papel, e isso contribui para a legitimidade do nosso modelo. Para a linha endotelial HMEC-1, era importante introduzi-la cedo o suficiente para que pudesse ser adequadamente integrada à estrutura e com a esperança de que essas células pudessem formar alinhamentos ou mesmo tubos dentro da estrutura. Testes de cocultura de HS27A e HMEC-1 foram realizados introduzindo-se este último em diferentes estágios: D0, D7, D14; não foram observadas diferenças notáveis, nem na diferenciação das células estromais, nem na manutenção ou posicionamento das células endoteliais. Assim, essas células foram introduzidas no início do processo. As células hematopoiéticas foram introduzidas em um momento em que a diferenciação osteoblástica estaria avançada o suficiente para favorecer as interações célula-célula. Essa escolha também foi condicionada pelo fato de que essa diferenciação osteoblástica é condicionada pelo uso de um meio, que, de acordo com nossos testes, não suporta totalmente a manutenção das células hematopoiéticas. As células hematológicas podem ser linhagens celulares ou células hematopoiéticas primárias BM CD45.
A partir desse modelo 3D, poderíamos imaginar a substituição de cada tipo de célula por células primárias, normais ou patológicas, ou mesmo adicionar outros tipos de células para aumentar as propriedades biomiméticas, como células imunes, adipócitos ou fibroblastos26. De fato, a linhagem celular HS27A foi substituída por MSCs BM primárias com baixa aprovação. Da mesma forma, linhagens celulares hematológicas foram substituídas por células hematopoiéticas BM primárias. No entanto, a substituição de células HMEC-1 por células endoteliais primárias ainda não foi testada. Atualmente, esse modelo ainda pode ser melhorado em termos de representação da vasculatura, pois embora as células endoteliais estejam presentes e interajam corretamente com outras células do microambiente (por exemplo, células hematopoiéticas), elas não formam vasos estruturados, impedindo assim a perfusão de fluxo para imitar vasos sanguíneos funcionais. No geral, isso poderia aumentar progressivamente a complexidade e a representatividade do atual modelo 3D mínimo. A adição de outros tipos de células pode facilitar estudos que investiguem outras questões, como a importância da inflamação local da BM ou a resistência à imunoterapia.
No entanto, este sistema 3D precisa de 3 semanas antes que as células de interesse, células hematológicas ou células cancerosas epiteliais, se o processo de metástase for avaliado, possam ser adicionadas. Condições estéreis precisam ser mantidas, pois as mudanças de meio duas vezes por semana às vezes podem levar à contaminação média. Além disso, uma vez que algumas células podem migrar através dos poros da inserção e começar a se dispersar no poço, levando ao aumento do consumo de meios, recomenda-se o monitoramento regular.
Descrevemos aqui um andaime 3D que permite a diferenciação osteoblástica e desenvolvemos um microambiente humano , in vitro , 3D, semelhante ao BM. Este sistema permite a análise in situ e a recuperação final de células vivas. Este sistema fornece uma ferramenta nova e altamente flexível, reprodutível e fácil de usar, com uma ampla gama de aplicações para estudar interações e mecanismos dentro do microambiente BM humano.
Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a P. Battiston-Montagne e A. Jambon da plataforma de citometria CRCL e N. Gadot e C. Leneve da Plataforma de Patologia de Pesquisa, Departamento de Pesquisa Translacional e Inovação, Centro Léon Bérard. Os autores são gratos a B. Manship pela edição em inglês. Este trabalho foi financiado pelo Inserm e FI-LMC para V. M. S., e S. L. K. A. e L. B. foram apoiados por uma subvenção da Société Française d'Hématologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
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