Summary
Præsenteret her er en protokol til initiering, vedligeholdelse og analyse af musehæmatopoietiske stamcellekulturer ved hjælp af ex vivo polyvinylalkoholbaseret ekspansion samt metoder til genetisk manipulation af dem ved lentiviral transduktion og elektroporation.
Abstract
Selvfornyende multipotente hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) er en vigtig celletype på grund af deres evne til at understøtte hæmatopoiesis gennem hele livet og rekonstituere hele blodsystemet efter transplantation. HSC'er anvendes klinisk i stamcelletransplantationsterapier, som repræsenterer helbredende behandling for en række blodsygdomme. Der er stor interesse for både at forstå de mekanismer, der regulerer HSC-aktivitet og hæmatopoiese, og udvikle nye HSC-baserede terapier. Imidlertid har den stabile kultur og udvidelse af HSC'er ex vivo været en stor barriere for at studere disse stamceller i et medgørligt ex vivo-system. Vi har for nylig udviklet et polyvinylalkoholbaseret dyrkningssystem, der kan understøtte den langsigtede og storstilede udvidelse af transplanterelige HSC'er til mus og metoder til genetisk redigering af dem. Denne protokol beskriver metoder til dyrkning og genetisk manipulation af HSC'er til mus via elektroporation og lentiviral transduktion. Denne protokol forventes at være nyttig for en bred vifte af eksperimentelle hæmatologer, der er interesseret i HSC-biologi og hæmatopoiesis.
Introduction
Det hæmatopoietiske system understøtter en række vigtige processer hos pattedyr, fra iltforsyning til bekæmpelse af patogener, gennem specialiserede blod- og immuncelletyper. Kontinuerlig blodproduktion (hæmatopoiese) er nødvendig for at understøtte blodsystemets homeostase, som opretholdes af hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er)1. Den mest primitive hæmatopoietiske celle er den hæmatopoietiske stamcelle (HSC), som har unikke kapaciteter til selvfornyelse og multilineagedifferentiering 2,3. Dette er en sjælden cellepopulation, der hovedsageligt findes i den voksne knoglemarv4, hvor de forekommer med en frekvens på kun ca. en hver 30.000 celler. HSC'er menes at understøtte livslang hæmatopoiesis og hjælpe med at genoprette hæmatopoiesis efter hæmatologisk stress. Denne kapacitet gør det også muligt for HSC'er stabilt at rekonstituere hele det hæmatopoietiske system efter transplantation til en bestrålet recipient5. Dette repræsenterer den funktionelle definition af en HSC og danner også det videnskabelige grundlag for HSC-transplantationsterapi, en helbredende behandling af en række blod- og immunsygdomme6. Af disse grunde er HSC'er et vigtigt fokus for eksperimentel hæmatologi.
På trods af et stort forskningsfokus har det fortsat været udfordrende at stabilt udvide HSC'er ex vivo7. Vi har for nylig udviklet det første langsigtede ex vivo-ekspansionskultursystem til HSC'er8 til mus. Tilgangen kan udvide transplanterelige HSC'er med 234-899 gange over en 4 ugers kultur. I sammenligning med alternative tilgange var den største ændring i protokollen fjernelsen af serumalbumin og dets erstatning med en syntetisk polymer. Polyvinylalkohol (PVA) blev identificeret som en optimal polymer til HSC-kulturer8 hos mus, som nu også er blevet brugt til dyrkning af andre hæmatopoietiske celletyper9. Imidlertid er en anden polymer kaldet Soluplus (en polyvinylcaprolactam-acetat-polyethylenglycolgraft-copolymer) også for nylig blevet identificeret, hvilket ser ud til at forbedre klonal HSC-ekspansion10. Før anvendelse af polymerer blev serumalbumin i form af føtalt bovint serum, bovin serumalbumin fraktion V eller rekombinant serumalbumin anvendt, men disse havde begrænset støtte til HSC-ekspansion og understøttede kun kortvarig (~ 1 uge) ex vivo-kultur 7. Det skal dog bemærkes, at HSC-kulturprotokoller, der bevarer HSC'er i hviletilstand, kan understøtte en længere ex vivo-kulturtid11,12.
I sammenligning med andre dyrkningsmetoder er en stor fordel ved PVA-baserede kulturer antallet af celler, der kan genereres, og hvor lang tid protokollen kan bruges til at spore HSC'er ex vivo. Dette overvinder flere barrierer inden for eksperimentel hæmatologi, såsom det lave antal HSC'er, der kan isoleres pr. mus (kun et par tusinde) og vanskeligheden ved at spore HSC'er over tid in vivo. Det er dog vigtigt at huske, at disse kulturer stimulerer HSC-spredning, mens in vivo HSC-puljen overvejende er hvilende ved en stabil tilstand13. Selvom kulturerne er selektive for HSC'er, akkumuleres yderligere celletyper med kulturerne over tid, og transplanterelige HSC'er repræsenterer kun ca. en ud af 34 celler efter 1 måned. Myeloide hæmatopoietiske stamceller synes at være den største forurenende celletype i disse HSC-kulturer8. Ikke desto mindre kan vi bruge disse kulturer til at berige HSC'er fra heterogene cellepopulationer (f.eks. c-Kit+ knoglemarv HSPC'er14). Det understøtter også transduktion eller elektroporation af HSC'er til genetisk manipulation14,15,16. For at hjælpe med at identificere HSC'er fra den heterogene dyrkede HSPC-population er CD201 (EPCR) for nylig blevet identificeret som en nyttig ex vivo HSC-markør10,17,18, med transplanterelige HSC'er begrænset til CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-fraktionen.
Denne protokol beskriver metoder til at initiere, vedligeholde og vurdere PVA-baserede HSC-ekspansionskulturer med mus samt protokoller til genetisk manipulation inden for disse kulturer ved hjælp af elektroporation eller lentiviral vektortransduktion. Disse metoder forventes at være nyttige for en række eksperimentelle hæmatologer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg, herunder avl og eutanasi, skal udføres inden for institutionelle og nationale retningslinjer. De nedenfor beskrevne forsøg blev godkendt af det britiske indenrigsministerium. Se materialetabellen for en liste over alle materialer, reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Klargøring af stamopløsninger
- PVA-lageropløsning
- Tag 50 ml vand af vævskulturkvalitet i en lille glasflaske (egnet til autoklavering). Varm vandet op til næsten kogning i en mikrobølgeovn.
- Vej 5 g PVA-pulver ud og tilsæt vandet.
BEMÆRK: Det anbefales kun at opløse 1-5 g PVA. Opløsning af større mængder kan resultere i ufuldstændig rekonstitution. - Luk låget tæt og ryst for at blande. Løsn derefter låget.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du åbner igen, da trykket kan ændre sig på grund af den skiftende vandtemperatur. - Autoklave og lad afkøle. Luk låget tæt og ryst for at blande. Der fremstilles alikvoter i sterile reagensglas og opbevares i op til 3 måneder ved 4 °C.
- Opløs frysetørrede cytokiner i F-12-medium indeholdende 1 mg / ml PVA. Rekonstituer stamcellefaktoren til 10 μg/ml og trombopoietin til 100 μg/ml for at generere 1:1.000 bestande. Der fremstilles alikvoter i sterile reagensglas og opbevares langtidsved -80 °C. Alternativt opbevares delprøverne ved 4 °C i op til 1 uge.
BEMÆRK: Undgå rekonstitution af cytokiner i bovin serumalbumin på grund af den negative indvirkning på HSC-ekspansion hos mus.
2. HSC knoglemarvsekstraktion og c-Kit+ berigelse
- Dissekere lårben, tibias, bækkener og rygsøjle fra nyligt aflivede 8-12 uger gamle C57BL/6 mus (via CO2 kvælning og / eller cervikal dislokation) og læg knoglerne i PBS på is.
BEMÆRK: Sørg for, at overflader og værktøjer er steriliseret med 70% ethanol. - Rens knoglerne ved hjælp af fnugfri sarte opgaveservietter, fjern muskler og rygmarv, og tilsæt til en mørtel med ~ 3 ml PBS.
BEMÆRK: Sørg for, at støderen og mørtlen steriliseres med 70% ethanol og derefter vaskes ud en gang med PBS. - Knus knoglerne med støderen uden at slibe for at minimere skærekræfterne. Opdel store knoglemarvsfragmenter, der frigives i PBS, ved hjælp af en 19 G kanyle fastgjort til en 5 ml sprøjte. Overfør cellesuspensionen gennem et 70 μm filter til et 50 ml konisk rør.
- Når suspensionen er overført, gentages med frisk PBS, indtil knoglerne er bleget, og der ikke er synlig marv. Sigt efter en slutvolumen på ~30 ml pr. mus og ~50 ml for to mus.
- Bland knoglemarvscellerne, saml 10 μL celler, og tæl med Türks 'opløsning ved en fortynding på 1: 10-1: 20 med et hæmocytometer.
BEMÆRK: En mus forventes at give 2-5 × 108 hele knoglemarvsceller. - Spin ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C, kassér supernatanten, og genopslæm pellet i kold PBS (350 μL for én mus eller 500 μL for to mus).
- Der tilsættes 0,2 μL allophycocyanin (APC) anti-c-Kit-antistof pr. 10 millioner celler og inkuberes i 30 minutter i mørke ved 4 °C.
- Tilsæt 5 ml kold PBS til de inkuberede celler for at vaske overskydende antistof af og filtrer gennem et 50 μm filter i et frisk 15 ml konisk rør.
- Vask det originale glas med 7 ml koldt PBS og overfør gennem filteret. Hvis der opstår tilstopning af filteret, skal du ridse filteroverfladen med en P1000-spids.
- Spin ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C, kassér supernatanten, og genopslæm pelletten i kold PBS (350 μL for én mus eller 500 μL for to mus).
- Der tilsættes 0,2 μL anti-APC-mikroperler pr. 10 millioner celler, og de inkuberes i 15 minutter i mørke ved 4 °C. Tilsæt 12 ml steril PBS for at vaske overskydende mikroperler af.
- Centrifuger cellerne ned ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C og resuspender i 2 ml kold PBS. Mens cellerne roterer i dette trin, skal du fortsætte til trin 2.13.
- Forbered dig på kolonneberigelse ved at placere en magnetisk filtreringssøjle i magneten på en magnetisk søjleseparator med et 50 μm filter ovenpå og et 15 ml konisk rør nedenunder.
- Der køres 3 ml sterilt PBS gennem 50 μm filteret og filtreringssøjlen. Når PBS er løbet igennem, føres cellesuspensionen gennem søjlen efterfulgt af tre vaske på 3 ml kold PBS hver gang. For hver vask skal du vente på, at kolonnen holder op med at dryppe, før du tilføjer den næste vask.
- Fjern søjlen fra magneten og læg den oven på et frisk 15 ml rør. Tilsæt 5 ml kold PBS, sæt søjlestemplet på søjlen, og eluer cellerne ved at trykke på stemplet.
- Bland de c-Kit-berigede celler, saml 10 μL celler, og tæl ved hjælp af Türks 'opløsning ved en fortynding på 1: 2 med et hæmocytometer. Det typiske udbytte fra en mus er 2-5 × 106 c-Kit+ celler.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan cellerne podes direkte i HSC-medier eller forberedes til HSC-fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) oprensning.
3. Initiering af cellekulturer med c-Kit-berigede HSPC'er
- Der fremstilles et frisksubstrat (tabel 1) til det nødvendige antal celler/huller. Frø 0,5-1 million celler pr. ml til c-Kit-berigede HSPC'er.
- Drej de c-Kit-berigede celler ned, og resuspender i HSC-medium ved den ønskede celletæthed.
- Overfør cellerne til fibronectinbelagte eller negative overfladeladede plader ved 200 μL pr. 96-brøndplade eller 1 ml pr. 24-brøndplade.
- Cellerne anbringes i en vævskulturkuvøse indstillet til 37 °C og 5 % CO2.
4. Initiering af cellekulturer med FACS-rensede HSC'er
- Forbered et passende volumen af den biotinylerede afstamningsantistofplet: 3 μL masterblanding (tabel 2) pr. 10 millioner celler, fortyndet 1:100 i PBS.
- Drej de c-Kit-berigede celler ned og resuspender i afstamningsantistofpletten i 30 minutter ved 4 °C.
- Der vaskes med 10 ml sterilt PBS og centrifugeres ned ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Der fremstilles en passende mængde af den friske HSC-antistofplet (tabel 3): 300 μL pr. 10 millioner celler. Ved siden af denne prøvefarvning skal du forberede passende farvningskontrolprøver til kompensation og gating.
BEMÆRK: Arbejd i en vævskulturhætte med lyset slukket, når du bruger farvestofkonjugerede antistoffer. - Resuspender cellerne i HSC-antistofpletten og inkuber ved 4 °C i 90 minutter. Bland cellerne hvert 20.-30. minut ved at tappe for at forhindre cellepelletering.
- Der vaskes med 10 ml sterilt PBS og centrifugeres ned ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges, pelleten svirpes for at forstyrre, og opslæmmes i steril PBS med 0,5 μg/ml propidiumiodid (PI).
- Forbered frisk medium (tabel 1) for antallet af nødvendige brønde, og plade i fibronectin eller negative overfladeladede plader (200 μL pr. 96-brøndplade eller 1 ml pr. 24-brøndplade).
- Forbered FACS-maskinen til sortering og sortering af CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSC'er direkte i medieholdige brønde (se figur 1 for den standard FACS-gatingstrategi, der anvendes her). Sorter op til 200 celler pr. 96-brønds pladebrønd eller op til 1.000 celler pr. 24-brønds pladebrønd.
BEMÆRK: FACS-maskiner skal betjenes af en uddannet videnskabsmand. Det anbefales, at brugerne kontakter deres lokale FACS-facilitet for at diskutere denne sorteringsstrategi, hvis de ikke har erfaring med FACS-isolering af HSC'er til mus.
5. Udførelse af medieændringer
- For cellekulturer, der initieres fra c-Kit-berigede celler, påbegyndes medieændringer efter 2 dage. For cellekulturer, der initieres fra FACS-isolerede HSC'er, skal medieændringer påbegyndes efter 5 dage.
- Der fremstilles tilstrækkeligt med friskt forvarmet (~37 °C) HSC-substrat (tabel 1) til alle huller.
- Fjern forsigtigt pladen fra vævskulturinkubatoren.
BEMÆRK: Da HSPC'er på negative overfladeladede plader lettere forstyrres end dem på fibronectin, skal der udvises ekstra forsigtighed, når mediet skiftes på negative overfladeladede plader for at undgå at forstyrre cellekulturerne. - Brug en pipette eller vakuumpumpe til langsomt at fjerne ~90%-95% af mediet fra brøndmenisken.
BEMÆRK: Undgå at trække mediet op fra bunden af brønden, ellers fjernes mange celler. - Der tilsættes 200 μL (til plader med 96 brønde; 1 ml til plader med 24 brønde) frisk substrat til brønden.
- Sæt pladen tilbage til vævskulturinkubatoren.
- Gentag trin 5.1-5.6 hver 2.-3. dag indtil det eksperimentelle slutpunkt.
- For cellekulturer, der initieres med c-Kit-berigede HSPC'er (afsnit 3), opdeles kulturerne i forholdet 1: 2-1: 3 efter ~ 3 uger. For cellekulturer, der initieres med FACS-rensede HSC'er (afsnit 4), opdeles kulturerne i forholdet 1: 2-1: 3 efter ~ 3 uger, og når kulturerne er >90% sammenflydende.
BEMÆRK: Den nøjagtige tidslinje afhænger af de eksperimentelle interesser. Disse kulturer har været karakteriseret i 4-8 uger8, men yderligere kulturlængder kan være mulige.
6. Elektroporerende dyrkede HSPC'er
BEMÆRK: Denne protokol er til elektroporation af Cas9/sgRNA ribonukleoprotein (RNP), men kan tilpasses til elektroporation af mRNA eller andre rekombinante proteiner. Initiere kulturer med et tilstrækkeligt antal celler for at udføre dette på det ønskede eksperimentelle tidspunkt.
- Udfør et medieskift 1 dag før elektroporation, som beskrevet i punkt 5.
BEMÆRK: Mindst en kultur natten over før elektroporation anbefales. Imidlertid dyrkes celler typisk i 1-3 uger før transduktion. - På dagen for elektroporation skal du oprette nukleofektoren. Tænd for maskinen. På berøringsskærmen skal du vælge X-modulet og derefter den anvendte kuvettestørrelse .
- Der fremstilles tilstrækkelig P3-opløsning (i henhold til fabrikantens anvisninger) til elektroporationsskalaen (100 μL pr. kuvette eller 20 μL pr. mikrokuvett), og den bringes i ligevægt til stuetemperatur.
- Der fremstilles et tilstrækkeligt frisksubstrat (tabel 1) til antallet af huller, der belægges, og der tilsættes 500 μL substrat til et pladehul med 24 huller eller 100 μL medier til et pladehul med 96 huller.
- Optø sgRNA (forfortyndet til 2 μg/ml i RNasefrit vand) på is og bland 16 μg sgRNA med 30 μg Cas9-enzym (ved 10 μg/ml) i et sterilt PCR-rør. Inkluder et ekstra PCR-rør, der kun indeholder Cas9-protein som kontrol. Bland ved at svirpe røret, og drej derefter kort ned. Der inkuberes ved 25 °C i 10 minutter i en termocyklist for at kompleksisere RNP, og hold derefter rørene på is.
BEMÆRK: Dette kan nedskaleres fem gange, hvis der udføres elektroporation i mikrokuvetter. - Bland og overfør HSPC'erne til elektroporation i et rør; 10 μL af cellerne opsamles, og Türks' opløsning tælles med en fortynding på 1:2 med et hæmocytometer.
BEMÆRK: Det anbefales at elektroporate 1-5 millioner celler pr. 100 μL kuvette (skaleret fem gange ned for mikrokuvetten). - Drej de relevante antal celler ned i et 1,5 ml rør ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C. Der suges så meget af supernatanten som muligt, og der resuspenderes med 100 μl nukleofektionsbuffer.
- Overfør straks cellesuspensionen til PCR-røret, der indeholder den kompleksbundne RNP, og pipette langsomt op og ned for forsigtigt at blande og overføre til en 100 μL elektroporationskuvette. Skub blandingen langsomt ud i kuvetten og i en flydende bevægelse for at undgå dannelse af luftbobler i kuvetten.
- På elektroporatoren skal du vælge placeringen af de brønde, der elektroporeres. Brug berøringsskærmen til at vælge celletypeprogrammet CD34+, human, eller indtast pulskoden EO100. Tryk på knappen OK .
- Overfør kuvetterne til elektroporatoren. Tryk på Start-knappen på berøringsskærmen for at starte elektroporation. Umiddelbart efter elektroporation tilsættes 500 μL af dyrkningsmediet til kuvetten (100 μL, hvis der anvendes en mikrokuvette).
- Overfør forsigtigt cellerne til den forberedte plade og vend tilbage til vævskulturinkubatoren.
- For procedurer, der anvender en AAV6-donorskabelon, tilsættes vektoren umiddelbart efter, at cellerne er blevet overført til en fibronectinbelagt plade i en koncentration på 5.000 vektorer / celle.
- Efter 6-18 timer klargøres frisksubstratet, og medieskiftet udføres som beskrevet i punkt 5. For denne medieændring skal du kun fjerne 80% -90% af mediet.
BEMÆRK: Undgå at trække mediet op fra bunden af brønden. - Cellerne analyseres ved hjælp af flowcytometri efter 2 dage eller mere (se punkt 8 for detaljer).
- Fortsæt med at udføre medieskift hver 2. dag, som beskrevet i afsnit 5, indtil det eksperimentelle endepunkt er nået.
BEMÆRK: Redigeringshastigheder for CRISPR / Cas9 ved hjælp af denne metode er meget afhængige af målretningseffektiviteten af det designede sgRNA. Redigeringshastigheder på op til 95% er blevet observeret med en effektiv vejledning15. Retningslinjer for sgRNA-design er tidligere beskrevet andetsteds 19,20.
7. Transducering af dyrkede HSPC'er med lentiviral vektor
BEMÆRK: Start kulturer med et tilstrækkeligt antal celler til at udføre dette på det ønskede eksperimentelle tidspunkt.
- Generer og titer lentiviral vektor (afhængigt af de eksperimentelle mål). Optø lentiviral vektor på is.
- Udfør en medieændring (som i afsnit 5); Bland og overfør derefter HSPC'erne til transduktion i et rør. Der opsamles 10 μL af cellerne og tælles med Türks' opløsning i en fortynding på 1:2 med et hæmocytometer.
BEMÆRK: Celler kan transduceres umiddelbart efter plettering. Imidlertid dyrkes celler typisk i 1-3 uger før transduktion. - Omplade den nødvendige dosis celler til transduktion (typisk 100.000 celler pr. 96-brøndplade). Separat plade ikke-transducerede negative kontrolceller.
BEMÆRK: Hvis du bruger negative overfladeladede plader, skal du overføre cellerne til fibronectinbelagte plader til lentiviral vektortransduktion. - Tilføj lentiviral vektor til hver brønd af celler: tilføj 20 transduktionsenheder pr. celle for at opnå ~ 30% transduktionseffektivitet. Imidlertid bestemmes lentiviral vektordosis empirisk afhængigt af de eksperimentelle krav.
BEMÆRK: Sørg for, at lentiviral vektor bortskaffes i henhold til institutionelle retningslinjer. - Returner cellerne til vævskulturinkubatoren i 6 timer. Udfør derefter et medieskift som beskrevet i afsnit 5.
BEMÆRK: Supernatanten indeholder levende virus. Bortskaf i henhold til institutionelle retningslinjer. - Analyser cellerne ved flowcytometri (f.eks. til GFP-ekspression) efter 2 dage eller mere. Se afsnit 8 for detaljer.
- Fortsæt med at udføre medieskift hver 2. dag, som beskrevet i afsnit 5, indtil det eksperimentelle endepunkt er nået.
8. Flowcytometrisk analyse af HSPC-kulturer
- Der fremstilles en koncentreret dyrket ex vivo HSC-antistofblanding i PBS indeholdende 2% FBS (tabel 4). Opbevar blandingen ved 4 °C i mørke i op til 1 måned.
BEMÆRK: Arbejd i en vævskulturhætte med lyset slukket, når du bruger farvestofkonjugerede antistoffer. - Tilsæt 2 μL koncentreret antistofblanding til 50 μL celler. Der inkuberes i 30 minutter ved 4 °C i mørke. Ved siden af denne prøvefarvning skal du forberede passende farvningskontrolprøver til kompensation og gating.
- Der tilsættes 200-1.000 μL PBS indeholdende 2 % FBS og centrifugeres ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C. Så meget supernatant som muligt fjernes og resuspenderes i 100-500 μl PBS indeholdende 2 % FBS og 0,5 μg/ml PI.
- Opsæt flowcytometeret, og registrer mindst 10.000 levende celler pr. Prøver.
BEMÆRK: Flowcytometre skal betjenes af en uddannet videnskabsmand. Brugere skal kontakte deres lokale FACS-facilitet for at diskutere denne analyse, hvis de ikke har erfaring med flowcytometri. - Eksporter dataene i FCS-format, og analyser dataene ved hjælp af passende flowcytometrianalysesoftware. Se figur 2 for den standardgatingstrategi, der anvendes her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til FACS-oprensning af HSC'er forventer vi, at inden for den c-Kit-berigede knoglemarv er ~0,2% af cellerne CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-populationen for unge (8-12 uger gamle) C57BL/6-mus (figur 1). Det er dog sandsynligt, at transgene mus eller mus i forskellige aldre udviser forskellige HSC-frekvenser. Efter 4 ugers kultur forventer vi, at CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-fraktionen vil være ~10% (figur 2). Disse resultater er ens for cellekulturer initieret fra c-Kit-beriget knoglemarv eller FACS-oprensede HSC'er. Efter transduktion med en GFP-udtrykkende lentiviral vektor (ved 20 transduktionsenheder/celle) forventer vi ~30% GFP+ celler (figur 3).
Når vi flyder sammen, forventer vi, at kulturerne er på ~ 2 millioner celler / ml. Inden for kulturen forventer vi hovedsageligt at se små runde celler, selvom det er normalt at se en lille frekvens af større runde (megakaryocytlignende) celler. Inden for de cellekulturer, der initieres fra c-Kit-beriget knoglemarv, forventes en vis indledende celledød14. Ca. 50% celledød forventes inden for de første 24-48 timer, før de første medieændringer udføres. Indledende døde cellerester i disse kulturer kommer sandsynligvis fra celledød inden for kulturerne snarere end knoglerester (fra de knuste knogler), da c-Kit-berigelsestrinnet skulle nedbryde sådanne knoglerester. Cellenumre vender dog tilbage til 80% -100% af de seedede cellenumre efter 1 uge (se tabel 5 for forventede celletæthedsværdier). Hvis der ses dårlige resultater, anbefaler vi fejlfinding af protokollen (tabel 6). I dette tilfælde kan det være mest enkelt at batchteste reagenser ved hjælp af c-Kit-beriget knoglemarvsprotokol (afsnit 3), da dette undgår komplikationer forbundet med FACS-sortering. Bemærk, at de repræsentative resultater er baseret på brugen af reagenser og udstyr, der er beskrevet i materialetabellen; Lignende resultater kan opnås ved anvendelse af reagenser fra forskellige leverandører, men validering (og titrering) af nye reagenser vil sandsynligvis være nødvendig.
Figur 1: Gating strategi for FACS-oprensning af HSC'er fra c-Kit-beriget knoglemarv. Sekventiel gating bruges til at identificere CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- celler fra c-Kit-beriget knoglemarv. Forkortelser: FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; HSC'er = hæmatopoietiske stamceller; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; FSC-W = fremadrettet spredning-peak bredde; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; SSC-H = sidespredning-tophøjde; PI = propidiumiodid PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gating strategi for flow cytometrisk analyse af dyrkede HSPC'er. Sekventiel gating bruges til at identificere CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- celler fra HSPC-kulturer. Forkortelser: HSPC'er = hæmatopoietiske stamceller og stamceller; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; FSC-W = fremadrettet spredning-peak bredde; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; SSC-H = sidespredning-tophøjde; PI = propidiumiodid PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater fra lentiviral vektortransduktion. Repræsentativ GFP-ekspression efter dyrket HSPC-transduktion med en GFP-ekspressiv lentiviral vektor (20 transduktionsenheder/celle) 48 timer efter transduktion. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; HSPC'er = hæmatopoietiske stamceller og stamceller; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Endelig koncentration i F-12 | Volumen (μL) |
| Hams F-12 medium | NIELSEN | 958 |
| 100x penicillin-streptomycin-glutamin | 1x | 10 |
| 1 M HEPES | 10 mM | 10 |
| 100 mg/ml PVA-lager | 1 mg/ml | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| 100 μg/ml TPO-lager | 100 ng/ml | 1 |
| 10 μg/ml SCF-lager | 10 ng/ml | 1 |
Tabel 1: HSC's mediesammensætning. Mediereagensvolumener til 1 ml komplet medium. Forkortelser: PVA = polyvinylalkohol; SCF = stamcellefaktor; TPO = trombopoietin; ITSX = insulin-transferrin-selen-ethanolamin.
| Antistof | Koncentration (μg/ml) | Volumen (μL) |
| Ly6G/Ly6C – biotin | 0.5 | 100 |
| Ter119 – biotin | 0.5 | 100 |
| CD4 – biotin | 0.5 | 25 |
| CD8a – biotin | 0.5 | 25 |
| CD45R – biotin | 0.5 | 50 |
| CD127 – biotin | 0.5 | 50 |
| Steril PBS | NIELSEN | 350 |
Tabel 2: Biotinyleret antistofcocktail. Antistofvolumener for bestanden af biotinantistofcocktailen.
| Antistof | Koncentration (mg/ml) | Volumen (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| c-Kit APC | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Streptavidin APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| Steril PBS | NIELSEN | 291 |
Tabel 3: Frisk HSC-antistofcocktail. Antistofvolumen til den friske HSC-antistofcocktail. Forkortelser: PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisothiocyanat.
| Antistof | Koncentration (mg/ml) | Volumen (μL) |
| c-sæt BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| Steril PBS | NIELSEN | 27.5 |
Tabel 4: Kultiveret HSC-antistofcocktail (100x). Antistofmængder for 100x lageret af den dyrkede HSC-antistofcocktail. Forkortelser: PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisothiocyanat.
| Kultur | Celletæthed ved 24-48 timer | % KSL ved 24-48 timer | Celletæthed efter 1 uge | % KSL efter 1 uge |
| Frisk c-Kit+ knoglemarvsbelægning | 0,5x106 ml-1 | 25-35% | 1-2x106 ml-1 | 50-60% |
| HSPC-elektroporation | 0,5x106 ml-1 | 25-35% | 0,5-1,5x106 ml-1 | 25-35% |
| HSPC lentivirus | 1,5x106 ml-1 | 20-25% | 1-2x106 ml-1 | 45-55% |
Tabel 5: Forventede resultater. Forventede celletætheder og frekvenser af c-Kit+Sca1+afstamningsceller efter (1) såning af c-Kit+ knoglemarv, (2) elektroporation og (3) lentiviral vektortransduktion baseret på såning ved 1 × 106 celler ml-1. Forkortelser: KSL = c-Kit+Sca1+Afstamning-; HSPC = hæmatopoietisk stam- og stamcelle.
| Spørgsmål | Sandsynlig(e) årsag(er) | Løsning(er) | |||
| Strømningshastigheden for LS-søjlen er usædvanlig langsom. | LS-kolonnen er tilstoppet. | Fjern søjlen fra magneten. Eluer cellesuspensionen ved hjælp af stemplet og gentag med yderligere 5 ml PBS. Gentag kolonneforbedringen med en ny kolonne og et nyt filter. | |||
| Stor mængde celledød inden for de første 7 dage af kulturen | Brug af udløbne reagenser eller reagenser i forkerte forhold. | Sørg for, at regenter er i korrekt koncentration og opbevares korrekt. | |||
| Unøjagtig inkubator temperatur. | Regelmæssig service af inkubatorer og sikring af, at inkubatoren holdes lukket så meget som muligt. | ||||
| Kulturkollaps efter 7 dages kultur | Forkert celletype sorteret | Søg råd hos HSC FACS-eksperter om sorteringsprotokoller. Valider reagenser med c-Kit-beriget knoglemarv. | |||
| Ufuldstændige medieændringer udføres | Udfør mere komplette medieændringer. | ||||
| Overdreven (f.eks. >50%) samlet celledød efter transduktion | Lentiviral vektortoksicitet. | Reducer mængden af anvendte viruspartikler. | |||
| Forkort inkubationstider til 5 timer. | |||||
| Overdreven (f.eks. >50%) samlet celledød efter transfektion | Celler tilbage i P3-opløsning for længe | Genvind celler i medier så hurtigt som muligt, elektroporer kun 2 prøver ad gangen, og vær forsigtig, når du pipetterer (og brug pipettespidser med bred boring). | |||
| Pipettering dræber celler for kraftigt | |||||
| Lav transfektionseffektivitet | Nedbrydning af RNP'er og/eller Cas9-enzym. | Forkert opbevaring, opbevar Cas9 ved -20 °C og RNA ved -80 °C (rekonstitueret med RNasefrit vand). | |||
| Lav transduktionseffektivitet | Lav lentiviral vektoraktivitet | Titrer lentiviral vektor for specifik cellepopulation, undgå frysning / optøning af lentiviral vektor | |||
Tabel 6: Almindelige fejlfindingsproblemer. Oversigt over almindelige problemer og foreslået fejlfinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi håber, at denne protokol giver en nyttig tilgang til at undersøge HSC-biologi, hæmatopoiesis og hæmatologi mere generelt. Siden den indledende udvikling af den PVA-baserede dyrkningsmetode til FACS-rensede HSC'er8 er metoden blevet udvidet. For eksempel har metoden vist sig at virke med c-Kit beriget med knoglemarv og med negative overfladeladede plader14. Dens kompatibilitet med transduktion og elektroporation er også blevet påvist14,15. In vivo-valideringen af disse HSC- og c-Kit+ HSPC-kulturer findes i disse publikationer, mens læserne kan henvise til andre offentliggjorte protokoller for in vivo-transplantationsprotokoller21. Vi ser ikke store forskelle i afstamningskimærisme mellem friske og dyrkede HSPC'er efter transplantation, men rekonstitutionsstyrken af individuelle HSC'er efter ex vivo-ekspansion er endnu ikke bestemt i detaljer. Det store antal HSC'er, der genereres af denne tilgang, åbner nye måder at forhøre HSC'er ved hjælp af molekylære eller biokemiske assays, der kræver store celletal. Derudover bør det at være i stand til at generere genetisk modificerede HSC'er inden for disse dyrkningssystemer give os mulighed for yderligere at undersøge de mekanismer, der regulerer HSC-aktivitet og det hæmatopoietiske system. For eksempel kan disse systemer udføre genetiske screeninger16.
Mekanisk forstår vi endnu ikke fuldt ud, hvorfor PVA og andre polymerer kan erstatte serumalbumin og understøtte effektiv HSC-ekspansion; vi mener, at PVA i det mindste delvist erstatter serumalbumin gennem stabiliserende cytokiner i medierne9. Desuden synes manglen på dårligt definerede bioaktive forurenende stoffer, der findes i serumalbuminprodukter, at reducere HSC-differentieringen. Anvendelsen af syntetiske polymerer bør også bidrage til at reducere batch-til-batch-variabilitet og forstyrrende virkninger forbundet med disse bioaktive forurenende stoffer ved undersøgelse af HSC'er ex vivo22. Der er også stadig mere at lære om, hvorfor visse polymerer giver bedre støtte til HSC'er ex vivo.
Selvom de allerede er kraftfulde, bør yderligere optimering og karakterisering af disse kulturprotokoller være mulige. Det ville især være nyttigt at forbedre renheden af HSC'er inden for disse kulturer. Yderligere markører, der adskiller det langsigtede HSC-rum fra disse kulturer, ville også hjælpe med at spore og isolere disse celletyper. Det er også interessant at se, om dette system i sidste ende kan anvendes til at kvantificere HSC-aktivitet ex vivo uden behov for in vivo-transplantationsanalyser. Vi forstår heller ikke endnu, hvor længe HSC'er kan udvides ex vivo, selvom det bestemt er længere end 6-8 uger, hvis de vedligeholdes korrekt8. Endelig, mens disse kulturer giver en nyttig model til at studere HSC'er til mus, er det også vigtigt at udvikle ækvivalente kultursystemer til humane HSC'er for at tilvejebringe et mere håndterbart system til at studere human HSC-biologi og hæmatopoiesis og i sidste ende at generere HSC'er til kliniske stamcelletransplantationsterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker WIMM Flow Cytometry Core for flowcytometriadgang og WIMM Virus Screening Core for lentiviral vektorgenerering. Dette arbejde blev finansieret af Kay Kendall Leukæmi Fund og UK Medical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
