Summary
Здесь представлен протокол инициирования, поддержания и анализа культур гемопоэтических стволовых клеток мыши с использованием экспансии на основе поливинилового спирта ex vivo , а также методы генетического манипулирования ими с помощью лентивирусной трансдукции и электропорации.
Abstract
Самообновляющиеся мультипотентные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются важным типом клеток из-за их способности поддерживать кроветворение на протяжении всей жизни и восстанавливать всю систему крови после трансплантации. ГСК клинически используются в терапии трансплантации стволовых клеток, которая представляет собой лечебное лечение целого ряда заболеваний крови. Существует значительный интерес как к пониманию механизмов, регулирующих активность ГСК и кроветворение, так и к разработке новых методов лечения на основе ГСК. Тем не менее, стабильная культура и экспансия ГСК ex vivo были основным препятствием при изучении этих стволовых клеток в управляемой системе ex vivo . Недавно мы разработали культуральную систему на основе поливинилового спирта, которая может поддерживать долгосрочное и крупномасштабное распространение трансплантируемых ГСК мыши и методов их генетического редактирования. Этот протокол описывает методы культивирования и генетического манипулирования ГСК мыши с помощью электропорации и лентивирусной трансдукции. Ожидается, что этот протокол будет полезен широкому кругу экспериментальных гематологов, интересующихся биологией ГСК и кроветворением.
Introduction
Кроветворная система поддерживает ряд важных процессов у млекопитающих, от снабжения кислородом до борьбы с патогенами, с помощью специализированных типов клеток крови и иммунных клеток. Непрерывная выработка крови (кроветворение) необходима для поддержания гомеостаза системы крови, который поддерживается гемопоэтическими стволовыми клетками и клетками-предшественниками (HSPC)1. Самой примитивной кроветворной клеткой является гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК), обладающая уникальными способностями к самообновлению и многолинейной дифференцировке 2,3. Это редкая клеточная популяция, в основном обнаруженная во взрослом костном мозге4, где они встречаются с частотой примерно одна на каждые 30 000 клеток. Считается, что ГСК поддерживают кроветворение на протяжении всей жизни и помогают восстановить кроветворение после гематологического стресса. Эти возможности также позволяют ГСК стабильно восстанавливать всю кроветворную систему после трансплантации облученному реципиенту5. Это представляет собой функциональное определение ГСК, а также формирует научную основу для трансплантационной терапии ГСК, лечебного лечения ряда заболеваний крови и иммунитета6. По этим причинам ГСК являются основным направлением экспериментальной гематологии.
Несмотря на большое внимание к исследованиям, по-прежнему сложно стабильно расширять HSC ex vivo7. Недавно мы разработали первую долгосрочную систему культивирования ex vivo для мышей HSC8. Этот подход может расширить трансплантируемые ГСК в 234-899 раз за 4-недельную культуру. По сравнению с альтернативными подходами, основным изменением в протоколе стало удаление сывороточного альбумина и замена его синтетическим полимером. Поливиниловый спирт (ПВС) был идентифицирован как оптимальный полимер для культурГСК мышей 8, который в настоящее время также используется для культивирования других типов гемопоэтических клеток9. Однако недавно был идентифицирован другой полимер под названием Soluplus (сополимер трансплантата поливинилкапролактамацетата и полиэтиленгликоля), который, по-видимому, улучшает клональное расширениеГСК 10. До использования полимеров использовали сывороточный альбумин в форме эмбриональной бычьей сыворотки, бычьего сывороточного альбумина фракции V или рекомбинантного сывороточного альбумина, но они имели ограниченную поддержку экспансии ГСК и поддерживали только краткосрочную (~ 1 неделю) культуру ex vivo 7. Однако следует отметить, что протоколы культивирования ГСК, которые сохраняют ГСК в состоянии покоя, могут поддерживать более длительное время культивирования ex vivo 11,12.
По сравнению с другими методами культивирования, основным преимуществом культур на основе ПВА является количество клеток, которые могут быть сгенерированы, и продолжительность времени, в течение которого протокол может использоваться для отслеживания ГСК ex vivo. Это преодолевает несколько барьеров в области экспериментальной гематологии, таких как низкое количество ГСК, выделяемых на мышь (всего несколько тысяч), и сложность отслеживания ГСК с течением времени in vivo. Однако важно помнить, что эти культуры стимулируют пролиферацию ГСК, в то время как пул ГСК in vivo преимущественно находится в состоянии покоя в устойчивом состоянии13. Кроме того, хотя культуры являются селективными в отношении ГСК, дополнительные типы клеток накапливаются вместе с культурами с течением времени, и трансплантируемые ГСК представляют собой примерно одну из 34 клеток через 1 месяц. Миелоидные гемопоэтические клетки-предшественники, по-видимому, являются основным контаминирующим типом клеток в этих культурах ГСК8. Тем не менее, мы можем использовать эти культуры для обогащения ГСК из гетерогенных клеточных популяций (например, c-Kit+ HSPCs14 костного мозга). Он также поддерживает трансдукцию или электропорацию ГСК для генетических манипуляций14,15,16. Чтобы помочь идентифицировать ГСК из гетерогенной культивируемой популяции HSPC, CD201 (EPCR) недавно был идентифицирован как полезный маркер ex vivo HSC 10,17,18, при этом трансплантируемые ГСК ограничены фракцией CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-.
В этом протоколе описываются методы инициирования, поддержания и оценки культур экспансии ГСК мышей на основе ПВА, а также протоколы генетических манипуляций в этих культурах с использованием электропорации или трансдукции лентивирусного вектора. Ожидается, что эти методы будут полезны для целого ряда экспериментальных гематологов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных, включая разведение и эвтаназию, должны выполняться в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями. Эксперименты, подробно описанные ниже, были одобрены Министерством внутренних дел Великобритании. Список всех материалов, реагентов и оборудования, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Подготовка стоковых растворов
- Стоковый раствор ПВА
- Возьмите 50 мл качественной воды для культуры тканей в маленькую стеклянную бутылку (подходит для автоклавирования). Нагрейте воду почти до кипения в микроволновой печи.
- Взвесьте 5 г порошка ПВА и добавьте в воду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется растворять только 1-5 г ПВА. Растворение больших количеств может привести к неполному восстановлению. - Плотно закройте крышку и встряхните, чтобы перемешать. Затем ослабьте крышку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при повторном открытии, так как давление может измениться из-за изменения температуры воды. - Автоклавируйте и дайте остыть. Плотно закройте крышку и встряхните, чтобы перемешать. Сделайте аликвоты в стерильных пробирках и храните до 3 месяцев при температуре 4 °C.
- Растворяют лиофилизированные цитокины в среде F-12, содержащей 1 мг/мл ПВА. Восстановите фактор стволовых клеток до 10 мкг/мл и тромбопоэтин до 100 мкг/мл для получения запасов 1:1000. Сделайте аликвоты в стерильных пробирках и храните в течение длительного времени при температуре -80 °C. В качестве альтернативы храните аликвоты при температуре 4 °C до 1 недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте восстановления цитокинов в сывороточном альбумине крупного рогатого скота из-за негативного влияния на расширение ГСК мышей.
2. Экстракция костного мозга HSC и обогащение c-Kit+
- Препарируйте бедренные кости, большеберцовые кости, таз и позвоночник у только что усыпленных 8-12-недельных мышей C57BL / 6 (через асфиксию CO2 и / или вывих шейки матки) и поместите кости в PBS на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что поверхности и инструменты стерилизованы 70% этанолом. - Очистите кости с помощью безворсовых деликатных рабочих салфеток, удаляя мышцы и спинной мозг, и добавьте в ступку ~ 3 мл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пестик и ступка стерилизованы 70% этанолом, а затем один раз промыты PBS. - Раздавите кости пестиком, не измельчая, чтобы свести к минимуму усилия сдвига. Разбейте большие фрагменты костного мозга, высвобожденные в PBS, с помощью иглы 19 G, прикрепленной к шприцу объемом 5 мл. Перенесите клеточную суспензию через фильтр 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл.
- После переноса суспензии повторите со свежим PBS до тех пор, пока кости не обесцвечены и костный мозг не будет виден. Стремитесь к конечному объему ~ 30 мл на мышь и ~ 50 мл на двух мышей.
- Смешайте клетки костного мозга, соберите 10 мкл клеток и подсчитайте с помощью раствора Тюркса в разведении 1:10-1:20 с помощью гемоцитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что одна мышь даст 2-5 ×10-8 целых клеток костного мозга. - Отжим при 450 × г в течение 5 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в холодном PBS (350 мкл для одной мыши или 500 мкл для двух мышей).
- Добавьте 0,2 мкл антитела аллофикоцианина (APC) против c-Kit на 10 миллионов клеток и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при 4 ° C.
- Добавьте 5 мл холодного PBS в инкубированные клетки, чтобы смыть избыток антител и отфильтровать через фильтр 50 мкм в свежую коническую пробирку объемом 15 мл.
- Промойте оригинальную пробирку 7 мл холодного PBS и пропустите через фильтр. В случае засорения фильтра поцарапайте поверхность фильтра наконечником P1000.
- Отжим при 450 × г в течение 5 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в холодном PBS (350 мкл для одной мыши или 500 мкл для двух мышей).
- Добавьте 0,2 мкл микрогранул против APC на 10 миллионов клеток и инкубируйте в течение 15 минут в темноте при 4 ° C. Добавьте 12 мл стерильного PBS, чтобы смыть излишки микрогранул.
- Отжимают клетки при 450 × г в течение 5 мин при 4 °C и ресуспендируют в 2 мл холодного PBS. Пока ячейки вращаются на этом шаге, перейдите к шагу 2.13.
- Подготовьтесь к обогащению колонны, поместив магнитную фильтрационную колонку в магнит сепаратора магнитной колонки с фильтром 50 мкм сверху и конической трубкой объемом 15 мл внизу.
- Пропустите 3 мл стерильного PBS через фильтр и фильтрующую колонну 50 мкм. После того, как PBS пройдет, пропустите клеточную суспензию через колонку, а затем каждый раз трижды промывайте 3 мл холодного PBS. Для каждой стирки подождите, пока колонка перестанет капать, прежде чем добавлять следующую стирку.
- Снимите колонку с магнита и поместите ее поверх свежей пробирки объемом 15 мл. Добавьте 5 мл холодного PBS, установите поршень колонки на колонку и разбавьте ячейки, нажав на поршень.
- Смешайте клетки, обогащенные c-Kit, соберите 10 мкл клеток и подсчитайте с помощью раствора Тюркса в разведении 1:2 с помощью гемоцитометра. Типичный выход от одной мыши составляет 2-5 × 106 клеток c-Kit+ .
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки могут быть непосредственно засеяны в среду ГСК или подготовлены для очистки ГСК, активированной флуоресценцией (FACS).
3. Инициация клеточных культур с помощью ГССР, обогащенных c-Kit
- Подготовьте свежую среду (таблица 1) для необходимого количества ячеек/лунок. Затравите 0,5-1 миллион клеток на мл для HSPC, обогащенных c-Kit.
- Отжимайте клетки, обогащенные c-Kit, и ресуспендируйте в среде HSC при желаемой плотности клеток.
- Перенесите клетки на пластины, покрытые фибронектином, или пластины с отрицательной поверхностью в дозе 200 мкл на 96-луночную пластину или 1 мл на 24-луночную пластину.
- Поместите клетки в инкубатор для тканевых культур, настроенный на 37 ° C и 5% CO2.
4. Инициация клеточных культур с помощью очищенных FACS ГСК
- Подготовьте соответствующий объем окрашивания антител биотинилированной линии: 3 мкл основной смеси (таблица 2) на 10 миллионов клеток, разведенных 1:100 в PBS.
- Отжимают клетки, обогащенные c-Kit, и ресуспендируют в окрашивании антителами линии в течение 30 мин при 4 ° C.
- Промыть 10 мл стерильного PBS и отжимать при 450 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Подготовьте соответствующий объем свежего окрашивания антителами к ГСК (таблица 3): 300 мкл на 10 миллионов клеток. Наряду с этим окрашиванием образца подготовьте соответствующие контрольные образцы окрашивания для компенсации и стробирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте в вытяжке для культивирования тканей с выключенным светом при использовании антител, конъюгированных с красителем. - Ресуспендируют клетки в окрашивании антителами к ГСК и инкубируют при 4 °C в течение 90 мин. Перемешивайте ячейки каждые 20-30 минут, постукивая, чтобы предотвратить гранулирование клеток.
- Промыть 10 мл стерильного PBS и отжимать при 450 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Аспирируйте надосадочную жидкость, щелкните гранулу, чтобы разрушить, и ресуспендируйте в стерильном PBS с 0,5 мкг / мл йодида пропидия (PI).
- Подготовьте свежую среду (таблица 1) для необходимого количества лунок и поместите пластину в фибронектин или пластины с отрицательной поверхностью (200 мкл на 96-луночную пластину или 1 мл на 24-луночную пластину).
- Подготовьте машину FACS к сортировке и отсортируйте CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage-HSC непосредственно в скважины, содержащие среду (см. Рисунок 1 для стандартной стратегии стробирования FACS, используемой здесь). Сортировка до 200 ячеек на 96-луночную пластинчатую лунку или до 1 000 ячеек на 24-луночную пластинчатую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Машины FACS должны эксплуатироваться обученным ученым. Пользователям рекомендуется связаться с местным центром FACS для обсуждения этой стратегии сортировки, если у них нет опыта выделения FACS ГСК мышей.
5. Внесение изменений в носители
- Для клеточных культур, инициированных из клеток, обогащенных c-Kit, начинайте смену среды через 2 дня. Для клеточных культур, инициированных из FACS-изолированных ГСК, начинайте смену среды через 5 дней.
- Подготовьте достаточное количество свежей предварительно подогретой (~37 °C) среды HSC (таблица 1) для всех скважин.
- Аккуратно извлеките пластину из инкубатора для культивирования тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку HSPC на заряженных пластинах с отрицательной поверхностью легче нарушаются, чем на фибронектине, следует проявлять особую осторожность при смене среды на заряженных пластинах с отрицательной поверхностью, чтобы избежать нарушения клеточных культур. - С помощью пипетки или вакуумного насоса медленно удалите ~ 90%-95% среды из лунки мениска.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вытягивания среды из основания лунки, иначе многие ячейки будут удалены. - Добавьте в лунку 200 мкл (для 96-луночных планшетов; 1 мл для 24-луночных планшетов) свежей среды.
- Верните тарелку в инкубатор для культивирования тканей.
- Повторяйте шаги 5.1-5.6 каждые 2-3 дня до окончания эксперимента.
- Для клеточных культур, инициированных с помощью HSPC, обогащенных c-Kit (раздел 3), разделите культуры в соотношении 1:2-1:3 через ~ 3 недели. Для клеточных культур, инициированных с помощью очищенных FACS ГСК (раздел 4), разделите культуры в соотношении 1:2-1:3 через ~ 3 недели и когда культуры будут сливаться на >90%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точные сроки будут зависеть от экспериментальных интересов. Эти культуры были охарактеризованы в течение 4-8 недель8, но возможна дополнительная продолжительность культивирования.
6. Электропорирующие культивируемые HSPC
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для электропорации рибонуклеопротеина Cas9 / sgRNA (RNP), но может быть адаптирован для электропорации мРНК или других рекомбинантных белков. Инициируйте культуры с достаточным количеством клеток, чтобы выполнить это в желаемый экспериментальный момент времени.
- Проведите смену среды за 1 день до электропорации, как описано в разделе 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед электропорацией рекомендуется провести как минимум ночную культуру. Однако клетки обычно культивируют в течение 1-3 недель перед трансдукцией. - В день электропорации устанавливают ядро. Включите машину. На сенсорном экране выберите модуль X , а затем используемый размер кюветы .
- Приготовьте достаточное количество раствора P3 (в соответствии с инструкциями производителя) для масштаба электропорации (100 мкл на кювету или 20 мкл на микрокювету) и дайте уравновеситься до комнатной температуры.
- Подготовьте достаточное количество пресной среды (таблица 1) для количества гальванических лунок и добавьте 500 мкл среды для 24-луночной пластинчатой лунки или 100 мкл среды в 96-луночную пластинчатую лунку.
- Разморозьте сгРНК (предварительно разведенную до 2 мкг/мл в воде, не содержащей РНКазы) на льду и смешайте 16 мкг сгРНК с 30 мкг фермента Cas9 (при 10 мкг/мл) в стерильной пробирке для ПЦР. Включите дополнительную пробирку для ПЦР, содержащую только белок Cas9, в качестве контроля. Перемешайте, щелкнув трубкой, затем ненадолго поверните вниз. Инкубируйте при 25 ° C в течение 10 минут в термоциклере для комплексирования RNP, а затем держите пробирки на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно уменьшить в пять раз, если выполнять электропорацию в микрокюветах. - Смешайте и перелейте HSPC для электропорации в пробирку; собрать 10 мкл клеток и посчитать с помощью раствора Тюркса в разведении 1:2 гемоцитометром.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется гальванизировать 1-5 миллионов клеток на кювету объемом 100 мкл (уменьшено в пять раз для микрокюветы). - Отжимают клетки соответствующего числа в пробирке объемом 1,5 мл при 450 × г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте как можно больше надосадочной жидкости и ресуспендируйте со 100 мкл нуклеофекционного буфера.
- Немедленно перенесите клеточную суспензию в пробирку для ПЦР, содержащую комплексную РНП и пипетку, медленно вверх и вниз, чтобы аккуратно перемешать и перенести в электропорационную кювету объемом 100 мкл. Выталкивайте смесь в кювету медленно и одним плавным движением, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в кювете.
- На электропораторе выберите положение электропорируемых скважин. С помощью сенсорного экрана выберите тип ячейки программы CD34+, человек или введите импульсный код EO100. Нажмите кнопку OK .
- Перенесите кюветы в электропоратор. Нажмите кнопку «Пуск » на сенсорном экране, чтобы начать электропорацию. Непосредственно после электропорации добавляют в кювету 500 мкл питательной среды (100 мкл при использовании микрокюветы).
- Аккуратно перенесите клетки на подготовленную пластину и верните в инкубатор для тканевых культур.
- Для процедур с использованием донорского шаблона AAV6 добавьте вектор сразу после того, как клетки были перенесены на пластину, покрытую фибронектином, в концентрации 5000 векторов на клетку.
- Через 6-18 ч приготовьте свежую среду и выполните смену среды, как описано в разделе 5. Для этой смены среды удалите только 80-90% среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вытягивания среды из основания колодца. - Проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии через 2 или более дней (подробнее см. Раздел 8).
- Продолжайте выполнять смену среды каждые 2 дня, как описано в разделе 5, пока не будет достигнута конечная точка эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость редактирования CRISPR/Cas9 с использованием этого метода в значительной степени зависит от эффективности нацеливания разработанной сгРНК. Скорость редактирования до 95% наблюдалась с эффективным руководством15. Рекомендации по дизайну сгРНК были ранее подробно описаны в другом месте19,20.
7. Трансдуцирование культивируемых HSPC лентивирусным вектором
ПРИМЕЧАНИЕ: Инициируйте культуры с достаточным количеством клеток, чтобы выполнить это в желаемый экспериментальный момент времени.
- Генерируют и титрируют лентивирусный вектор (в зависимости от целей эксперимента). Размораживание лентивирусного вектора на льду.
- Выполните замену среды (как в разделе 5); затем смешайте и перенесите HSPC для трансдукции в пробирку. Соберите 10 мкл клеток и подсчитайте с помощью раствора Тюркса в разведении 1:2 гемоцитометром.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть трансдуцированы сразу после нанесения покрытия. Однако клетки обычно культивируют в течение 1-3 недель перед трансдукцией. - Перераспределите необходимую дозу клеток для трансдукции (обычно 100 000 клеток на 96-луночную пластину). Отдельно пластинчатые нетрансдуцированные отрицательные контрольные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании заряженных пластин с отрицательной поверхностью перенесите клетки на пластины, покрытые фибронектином, для трансдукции лентивирусного вектора. - Добавьте лентивирусный вектор в каждую лунку клеток: добавьте 20 единиц трансдукции на клетку, чтобы достичь эффективности трансдукции ~ 30%. Однако определяют дозу лентивирусного вектора эмпирически, в зависимости от экспериментальных требований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лентивирусный вектор утилизируется в соответствии с руководящими принципами учреждения. - Возвращают клетки в инкубатор для тканевых культур на 6 ч. После этого выполните смену среды, как описано в разделе 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Надосадочная жидкость содержит живой вирус. Утилизировать в соответствии с руководящими принципами учреждения. - Анализируйте клетки с помощью проточной цитометрии (например, на экспрессию GFP) через 2 дня или более. Подробнее см. раздел 8.
- Продолжайте выполнять смену среды каждые 2 дня, как описано в разделе 5, пока не будет достигнута конечная точка эксперимента.
8. Проточный цитометрический анализ культур HSPC
- Приготовьте концентрированную культивируемую смесь антител к ГСК ex vivo в PBS, содержащую 2% FBS (таблица 4). Храните смесь при температуре 4 °C в темноте до 1 месяца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте в вытяжке для культивирования тканей с выключенным светом при использовании антител, конъюгированных с красителем. - Добавьте 2 мкл концентрированной смеси антител к 50 мкл клеток. Инкубировать 30 мин при 4 °C в темноте. Наряду с этим окрашиванием образца подготовьте соответствующие контрольные образцы окрашивания для компенсации и стробирования.
- Добавьте 200-1000 мкл PBS, содержащего 2% FBS, и центрифугу при 450 × г в течение 5 мин при 4 ° C. Удалите как можно больше надосадочной жидкости и ресуспендируйте в 100-500 мкл PBS, содержащего 2% FBS и 0,5 мкг / мл PI.
- Настройте проточный цитометр и запишите не менее 10 000 живых клеток на образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проточные цитометры должны эксплуатироваться обученным ученым. Пользователи должны связаться со своим местным учреждением FACS, чтобы обсудить этот анализ, если они не имеют опыта в проточной цитометрии. - Экспортируйте данные в формате FCS и проанализируйте данные с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа проточной цитометрии. На рисунке 2 показана стандартная стратегия стробирования, используемая здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для очистки FACS ГСК мы ожидаем, что в костном мозге, обогащенном c-Kit, ~ 0,2% клеток составляют популяцию CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage для молодых (8-12-недельных) мышей C57BL / 6 (рис. 1). Однако вполне вероятно, что трансгенные мыши или мыши разного возраста демонстрируют разные частоты ГСК. После 4 недель культивирования мы ожидаем, что фракция CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage- составит ~ 10% (рис. 2). Эти результаты аналогичны для клеточных культур, инициированных из костного мозга, обогащенного c-Kit, или очищенных FACS ГСК. После трансдукции лентивирусным вектором, экспрессирующим GFP (при 20 единицах трансдукции на клетку), мы ожидаем ~ 30% клеток GFP+ (рис. 3).
При слиянии мы ожидаем, что культуры будут на уровне ~ 2 миллиона клеток / мл. В культуре мы ожидаем увидеть в основном небольшие круглые клетки, хотя нормально видеть небольшую частоту более крупных круглых (мегакариоцитоподобных) клеток. В клеточных культурах, инициированных из костного мозга, обогащенного c-Kit, ожидается некоторая начальная гибель клеток14. Приблизительно 50% гибель клеток ожидается в течение первых 24-48 часов, до того, как будут выполнены первые изменения среды. Первоначальный дебрис мертвых клеток в этих культурах, вероятно, происходит из-за гибели клеток внутри культур, а не из-за костного мусора (из раздробленных костей), поскольку стадия обогащения c-Kit должна истощить такой костный мусор. Номера ячеек, однако, возвращаются к 80-100% номеров посеянных ячеек через 1 неделю (см. Таблицу 5 для ожидаемых значений плотности ячеек). Если видны плохие результаты, мы рекомендуем устранить неполадки протокола (таблица 6). В этом случае проще всего провести пакетное тестирование реагентов с использованием протокола костного мозга, обогащенного c-Kit (раздел 3), так как это позволяет избежать осложнений, связанных с сортировкой FACS. Обратите внимание, что репрезентативные результаты основаны на использовании реагентов и оборудования, подробно описанных в таблице материалов; Аналогичные результаты могут быть достигнуты при использовании реагентов от разных поставщиков, однако, вероятно, потребуется валидация (и титрование) новых реагентов.
Рисунок 1: Стратегия стробирования для очистки FACS ГСК из костного мозга, обогащенного c-Kit. Последовательное стробирование, используемое для идентификации CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- клеток из костного мозга, обогащенного c-Kit. Сокращения: FACS = сортировка клеток, активируемая флуоресценцией; ГСК = гемопоэтические стволовые клетки; SSC-A = площадь пика бокового рассеяния; FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; FSC-W = ширина пика прямого рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; SSC-H = высота пика бокового рассеяния; PI = йодид пропидия; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия стробирования для проточного цитометрического анализа культивируемых HSPC. Последовательное стробирование, используемое для идентификации CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage- клеток из культур HSPC. Сокращения: HSPCs = гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники; SSC-A = площадь пика бокового рассеяния; FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; FSC-W = ширина пика прямого рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; SSC-H = высота пика бокового рассеяния; PI = йодид пропидия; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты трансдукции лентивирусного вектора. Репрезентативная экспрессия GFP после культивируемой трансдукции HSPC лентивирусным вектором, экспрессирующим GFP (20 трансдукционных единиц на клетку) через 48 ч после трансдукции. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; HSPCs = гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники; FSC-H = высота пика прямого рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Реагент | Конечная концентрация в F-12 | Объем (мкл) |
| Средний F-12 Хэма | Н/Д | 958 |
| 100x пенициллин-стрептомицин-глютамин | 1x | 10 |
| 1 М HEPES | 10 мМ | 10 |
| Запас ПВА 100 мг/мл | 1 мг/мл | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| Запас ТПО 100 мкг/мл | 100 нг/мл | 1 |
| Запас SCF 10 мкг/мл | 10 нг/мл | 1 |
Таблица 1: Состав среды HSC. Объемы реагента среды на 1 мл полной среды. Сокращения: ПВС = поливиниловый спирт; SCF = фактор стволовых клеток; ТПО = тромбопоэтин; ITSX = инсулин-трансферрин-селен-этаноламин.
| Антитело | Концентрация (мкг/мл) | Объем (мкл) |
| Ly6G/Ly6C – биотин | 0.5 | 100 |
| Ter119 – биотин | 0.5 | 100 |
| CD4 – биотин | 0.5 | 25 |
| CD8a – биотин | 0.5 | 25 |
| CD45R – биотин | 0.5 | 50 |
| CD127 – биотин | 0.5 | 50 |
| Стерильный PBS | Н/Д | 350 |
Таблица 2: Коктейль биотинилированных антител. Объемы антител для запаса коктейля антител к биотину.
| Антитело | Концентрация (мг/мл) | Объем (мкл) |
| CD34 ФИТК | 0.5 | 4 |
| С-Кит БТР | 0.2 | 1 |
| СКА1 ПЭ | 0.2 | 1 |
| Стрептавидин APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| КД48 БВ421 | 0.2 | 1 |
| Стерильный PBS | Н/Д | 291 |
Таблица 3: Коктейль свежих антител к ГСК. Объемы антител для свежего коктейля антител HSC. Сокращения: ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина.
| Антитело | Концентрация (мг/мл) | Объем (мкл) |
| c-Kit BV421 | 0.2 | 12.5 |
| СКА1 ПЭ | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| БТР CD201 | 0.2 | 5 |
| Стерильный PBS | Н/Д | 27.5 |
Таблица 4: Коктейль культивируемых антител к ГСК (100x). Объемы антител для 100-кратного запаса культивируемого коктейля антител к ГСК. Сокращения: ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина.
| Культура | Плотность ячеек через 24-48 ч | % KSL через 24-48 ч | Плотность клеток через 1 неделю | % KSL через 1 неделю |
| Покрытие костного мозга Fresh c-Kit+ | 0,5х106 мл-1 | 25-35% | 1-2x106 мл-1 | 50-60% |
| Электропорация HSPC | 0,5х106 мл-1 | 25-35% | 0,5-1,5х106 мл-1 | 25-35% |
| Лентивирус HSPC | 1,5x106 мл-1 | 20-25% | 1-2x106 мл-1 | 45-55% |
Таблица 5: Ожидаемые результаты. Ожидаемая плотность клеток и частота клеток c-Kit + Sca1 + Lineage после (1) посева костного мозга c-Kit +, (2) электропорации и (3) трансдукции лентивирусного вектора на основе посева в 1 × 106 клеток мл-1. Сокращения: KSL = c-Kit+Sca1+Lineage-; HSPC = гемопоэтическая стволовая клетка и клетка-предшественник.
| Выпуск | Вероятная причина(ы) | Решение/ы | |||
| Расход колонны LS необычайно низкий. | Колонна LS забита. | Снимите колонку с магнита. Разбавьте клеточную суспензию с помощью поршня и повторите с еще 5 мл PBS. Повторите обогащение колонки свежей колонкой и свежим фильтром. | |||
| Большое количество гибели клеток в течение первых 7 дней культивирования | Использование реагентов с истекшим сроком годности или реагентов в неправильных соотношениях. | Убедитесь, что регенты находятся в надлежащей концентрации и правильно хранятся. | |||
| Неточная температура в инкубаторе. | Регулярное обслуживание инкубаторов и обеспечение максимально возможного содержания инкубатора закрытым. | ||||
| Культурный коллапс после 7 дней культивирования | Отсортирована неправильная ячейка | Обратитесь за консультацией к экспертам HSC FACS по протоколам сортировки. Валидируйте реагенты с помощью костного мозга, обогащенного c-Kit. | |||
| Выполняется неполная смена носителя | Выполните более полную смену носителя. | ||||
| Чрезмерная (например, >50%) общая гибель клеток после трансдукции | Токсичность лентивирусного вектора. | Уменьшите количество используемых вирусных частиц. | |||
| Сократите время инкубации до 5 часов. | |||||
| Чрезмерная (например, >50%) общая гибель клеток после трансфекции | Клетки, оставленные в растворе P3 слишком долго | Как можно скорее восстановите клетки в среде, электроповалите только 2 образца за раз и будьте осторожны при пипетировании (и используйте наконечники для пипеток с широким отверстием). | |||
| Пипеты слишком энергично убивают клетки | |||||
| Низкая эффективность трансфекции | Деградация РНП и/или фермента Cas9. | При неправильном хранении храните Cas9 при -20 ° C, а РНК при -80 ° C (восстановленной водой, не содержащей РНКазы). | |||
| Низкая эффективность трансдукции | Низкая активность лентивирусного вектора | Титруйте лентивирусный вектор для конкретной клеточной популяции, избегайте замораживания / размораживания лентивирусного вектора | |||
Таблица 6: Распространенные проблемы устранения неполадок. Сводка распространенных проблем и рекомендуемые способы их устранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы надеемся, что этот протокол обеспечит полезный подход к изучению биологии ГСК, кроветворения и гематологии в целом. С момента первоначальной разработки метода культивирования на основе ПВА для FACS-очищенных ГСК8 этот метод был расширен. Например, было показано, что метод работает с c-Kit, обогащенным костным мозгом, и с отрицательно заряженными поверхностными пластинами14. Также была продемонстрирована его совместимость с трансдукцией и электропорацией14,15. Валидация in vivo этих культур HSC и c-Kit+ HSPC может быть найдена в этих публикациях, в то время как читатели могут обратиться к другим опубликованным протоколам для протоколов трансплантации in vivo 21. Мы не видим существенных различий в химеризме линий между свежими и культивируемыми HSPC после трансплантации, однако эффективность восстановления отдельных ГСК после экспансии ex vivo еще предстоит детально определить. Большое количество ГСК, полученных с помощью этого подхода, открывает новые способы опроса ГСК с использованием молекулярных или биохимических анализов, которые требуют большого количества клеток. Кроме того, возможность генерировать генетически модифицированные ГСК в этих культуральных системах должна позволить нам дополнительно исследовать механизмы, регулирующие активность ГСК и кроветворную систему. Например, эти системы поддаются выполнению генетического скрининга16.
Механистически мы еще не до конца понимаем, почему ПВС и другие полимеры могут заменить сывороточный альбумин и поддерживать эффективное расширение ГСК; мы считаем, что ПВА, по крайней мере, частично заменяет сывороточный альбумин за счет стабилизации цитокинов в среде9. Кроме того, отсутствие плохо определенных биологически активных загрязнителей, обнаруженных в сывороточных альбуминных продуктах, по-видимому, снижает дифференциацию ГСК. Использование синтетических полимеров также должно помочь уменьшить вариабельность от партии к партии и смешанные эффекты, связанные с этими биологически активными загрязнителями, при изучении ГСК ex vivo22. Кроме того, еще предстоит выяснить, почему некоторые полимеры обеспечивают лучшую поддержку ГСК ex vivo.
Несмотря на то, что эти протоколы культуры уже являются мощными, дальнейшая оптимизация и характеристика этих протоколов культуры должны быть возможны. В частности, было бы полезно улучшить чистоту ГСК в этих культурах. Дополнительные маркеры, отличающие долгосрочный компартмент ГСК от этих культур, также помогут отслеживать и изолировать эти типы клеток. Также интересно посмотреть, можно ли в конечном итоге использовать эту систему для количественной оценки активности ГСК ex vivo без необходимости проведения анализов трансплантации in vivo . Мы также пока не понимаем, как долго ГСК могут быть расширены ex vivo, хотя это, безусловно, дольше, чем 6-8 недель при правильном поддержании8. Наконец, в то время как эти культуры обеспечивают полезную модель для изучения ГСК мышей, также важно разработать эквивалентные системы культивирования для ГСК человека, чтобы обеспечить более удобную систему для изучения биологии ГСК человека и кроветворения и, в конечном итоге, для получения ГСК для клинической трансплантации стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов отсутствует конфликт интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Центр проточной цитометрии WIMM за доступ к проточной цитометрии и Центр скрининга вирусов WIMM за генерацию лентивирусного вектора. Эта работа финансировалась Фондом лейкемии Кей Кендалл и Советом по медицинским исследованиям Великобритании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
