Summary
Presentato qui è un protocollo per avviare, mantenere e analizzare colture di cellule staminali ematopoietiche di topo utilizzando l'espansione ex vivo a base di alcol polivinilico, nonché metodi per manipolarle geneticamente mediante trasduzione lentivirale ed elettroporazione.
Abstract
Le cellule staminali ematopoietiche multipotenti (HSC) autorinnovanti sono un tipo di cellula importante grazie alla loro capacità di sostenere l'ematopoiesi per tutta la vita e ricostituire l'intero sistema sanguigno dopo il trapianto. Le HSC sono utilizzate clinicamente nelle terapie di trapianto di cellule staminali, che rappresentano un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue. C'è un notevole interesse sia nella comprensione dei meccanismi che regolano l'attività delle HSC e l'emopoiesi, sia nello sviluppo di nuove terapie basate sulle HSC. Tuttavia, la coltura stabile e l'espansione delle HSC ex vivo è stata una barriera importante nello studio di queste cellule staminali in un sistema ex vivo trattabile. Recentemente abbiamo sviluppato un sistema di coltura a base di alcol polivinilico in grado di supportare l'espansione a lungo termine e su larga scala delle HSC di topo trapiantabili e dei metodi per modificarle geneticamente. Questo protocollo descrive i metodi per coltivare e manipolare geneticamente le HSC del topo tramite elettroporazione e trasduzione lentivirale. Questo protocollo dovrebbe essere utile a una vasta gamma di ematologi sperimentali interessati alla biologia delle HSC e all'emopoiesi.
Introduction
Il sistema ematopoietico supporta una serie di processi essenziali nei mammiferi, dall'apporto di ossigeno alla lotta contro gli agenti patogeni, attraverso tipi specializzati di cellule del sangue e immunitarie. La produzione continua di sangue (emopoiesi) è necessaria per sostenere l'omeostasi del sistema sanguigno, che è sostenuta dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC)1. La cellula ematopoietica più primitiva è la cellula staminale ematopoietica (HSC), che ha capacità uniche di auto-rinnovamento e differenziazione multilineare 2,3. Questa è una popolazione di cellule rare, che si trova principalmente nel midollo osseo adulto4, dove si verificano ad una frequenza di circa una ogni 30.000 cellule. Si ritiene che le HSC supportino l'ematopoiesi per tutta la vita e contribuiscano a ristabilire l'ematopoiesi dopo stress ematologico. Queste capacità consentono inoltre alle HSC di ricostituire stabilmente l'intero sistema ematopoietico dopo il trapianto in un ricevente irradiato5. Questo rappresenta la definizione funzionale di una HSC e costituisce anche la base scientifica per la terapia di trapianto di HSC, un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue e immunitarie6. Per questi motivi, le HSC sono un obiettivo importante dell'ematologia sperimentale.
Nonostante un grande focus di ricerca, è rimasto difficile espandere stabilmente le HSC ex vivo7. Recentemente abbiamo sviluppato il primo sistema di coltura di espansione ex vivo a lungo termine per HSC di topo8. L'approccio può espandere le HSC trapiantabili di 234-899 volte in una coltura di 4 settimane. Rispetto agli approcci alternativi, il principale cambiamento nel protocollo è stata la rimozione dell'albumina sierica e la sua sostituzione con un polimero sintetico. L'alcol polivinilico (PVA) è stato identificato come un polimero ottimale per le colture HSC di topo8, che ora è stato utilizzato anche per la coltura di altri tipi di cellule ematopoietiche9. Tuttavia, è stato recentemente identificato anche un altro polimero chiamato Soluplus (un copolimero di innesto di polivinil-caprolattame-acetato-polietilenglicole), che sembra migliorare l'espansione clonale HSC10. Prima dell'uso dei polimeri, venivano utilizzate albumina sierica sotto forma di siero bovino fetale, frazione di albumina sierica bovina V o albumina sierica ricombinante, ma questi avevano un supporto limitato per l'espansione HSC e supportavano solo colture ex vivo a breve termine (~ 1 settimana)7. Tuttavia, va notato che i protocolli di coltura HSC che mantengono le HSC in uno stato quiescente possono supportare un tempo di coltura ex vivo più lungo11,12.
Rispetto ad altri metodi di coltura, uno dei principali vantaggi delle colture basate su PVA è il numero di cellule che possono essere generate e il periodo di tempo in cui il protocollo può essere utilizzato per tracciare le HSC ex vivo. Questo supera diverse barriere nel campo dell'ematologia sperimentale, come il basso numero di HSC isolabili per topo (solo poche migliaia) e la difficoltà di tracciare le HSC nel tempo in vivo. Tuttavia, è importante ricordare che queste colture stimolano la proliferazione delle HSC, mentre il pool di HSC in vivo è prevalentemente quiescente allo stato stazionario13. Inoltre, sebbene le colture siano selettive per le HSC, ulteriori tipi di cellule si accumulano con le colture nel tempo e le HSC trapiantabili rappresentano solo circa una su 34 cellule dopo 1 mese. Le cellule progenitrici ematopoietiche mieloidi sembrano essere il principale tipo di cellula contaminante in queste colture di HSC8. Tuttavia, possiamo usare queste colture per arricchire per HSC da popolazioni cellulari eterogenee (ad esempio, c-Kit+ midollo osseo HSPCs14). Supporta anche la trasduzione o l'elettroporazione delle HSC per la manipolazione genetica14,15,16. Per aiutare a identificare le HSC dalla popolazione eterogenea di HSPC, CD201 (EPCR) è stato recentemente identificato come un utile marcatore HSC ex vivo 10,17,18, con HSC trapiantabili limitate alla frazione CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.
Questo protocollo descrive i metodi per avviare, mantenere e valutare colture di espansione HSC di topo basate su PVA, nonché protocolli per la manipolazione genetica all'interno di queste colture utilizzando l'elettroporazione o la trasduzione del vettore lentivirale. Questi metodi dovrebbero essere utili per una serie di ematologi sperimentali.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali, compreso l'allevamento e l'eutanasia, devono essere eseguite all'interno di linee guida istituzionali e nazionali. Gli esperimenti descritti di seguito sono stati approvati dal Ministero degli Interni del Regno Unito. Vedere la tabella dei materiali per un elenco di tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione delle soluzioni stock
- Soluzione stock PVA
- Prelevare 50 ml di acqua di qualità per colture tissutali in una piccola bottiglia di vetro (adatta per l'autoclave). Riscaldare l'acqua fino quasi all'ebollizione in un forno a microonde.
- Pesare 5 g di polvere di PVA e aggiungere all'acqua.
NOTA: Si consiglia di sciogliere solo 1-5 g di PVA. Lo scioglimento di quantità maggiori può comportare una ricostituzione incompleta. - Chiudere bene il coperchio e agitare per mescolare. Quindi, allentare il coperchio.
NOTA: Prestare attenzione quando si riapre, poiché la pressione potrebbe cambiare a causa del cambiamento della temperatura dell'acqua. - Autoclave e lasciare raffreddare. Chiudere bene il coperchio e agitare per mescolare. Preparare aliquote in provette sterili e conservare fino a 3 mesi a 4 °C.
- Sciogliere le citochine liofilizzate in terreno F-12 contenente 1 mg/mL di PVA. Ricostituire il fattore delle cellule staminali a 10 μg/mL e la trombopoietina a 100 μg/mL per generare 1:1.000 stock. Preparare aliquote in provette sterili e conservare a lungo termine a -80 °C. In alternativa, conservare le aliquote a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
NOTA: Evitare la ricostituzione di citochine nell'albumina sierica bovina a causa dell'impatto negativo sull'espansione delle HSC del topo.
2. Estrazione del midollo osseo HSC e arricchimento c-Kit+
- Sezionare i femori, le tibie, il bacino e la colonna vertebrale da topi C57BL / 6 di 8-12 settimane appena eutanizzati (tramite asfissia CO2 e / o lussazione cervicale) e posizionare le ossa in PBS sul ghiaccio.
NOTA: Assicurarsi che le superfici e gli strumenti siano sterilizzati con etanolo al 70%. - Pulire le ossa usando salviette delicate prive di lanugine, rimuovendo muscoli e midollo spinale e aggiungere a un mortaio con ~ 3 ml di PBS.
NOTA: Assicurarsi che il pestello e il mortaio siano sterilizzati con etanolo al 70% e quindi lavati una volta con PBS. - Schiacciare le ossa con il pestello senza macinare per ridurre al minimo le forze di taglio. Rompere i grandi frammenti di midollo osseo rilasciati nel PBS utilizzando un ago da 19 G collegato a una siringa da 5 ml. Trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 μm in un tubo conico da 50 ml.
- Una volta trasferita la sospensione, ripetere con PBS fresco fino a quando le ossa sono sbiancate e non è visibile il midollo. Punta a un volume finale di ~ 30 ml per mouse e ~ 50 ml per due mouse.
- Mescolare le cellule del midollo osseo, raccogliere 10 μL di cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:10-1:20 con un emocitometro.
NOTA: Si prevede che un topo produca 2-5 × 108 cellule intere del midollo osseo. - Centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in PBS freddo (350 μL per un topo o 500 μL per due topi).
- Aggiungere 0,2 μL di anticorpo anti-c-Kit alloficocianina (APC) per 10 milioni di cellule e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
- Aggiungere 5 ml di PBS freddo alle cellule incubate per lavare via l'anticorpo in eccesso e filtrare attraverso un filtro da 50 μm in un tubo conico fresco da 15 ml.
- Lavare il tubo originale con 7 ml di PBS freddo e trasferire attraverso il filtro. Se si verifica l'intasamento del filtro, grattare la superficie del filtro con una punta P1000.
- Centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e risospendere il pellet in PBS freddo (350 μL per un topo o 500 μL per due topi).
- Aggiungere 0,2 μL di microsfere anti-APC per 10 milioni di cellule e incubare per 15 minuti al buio a 4 °C. Aggiungere 12 ml di PBS sterile per lavare via le microsfere in eccesso.
- Centrifugare le cellule a 450 × g per 5 minuti a 4 °C e risospendere in 2 ml di PBS freddo. Mentre le celle ruotano in questo passaggio, procedere al passaggio 2.13.
- Preparare l'arricchimento della colonna posizionando una colonna di filtrazione magnetica nel magnete di un separatore di colonne magnetiche, con un filtro da 50 μm sulla parte superiore e un tubo conico da 15 ml sotto.
- Far passare 3 mL di PBS sterile attraverso il filtro da 50 μm e la colonna di filtrazione. Una volta che il PBS è passato, passare la sospensione cellulare attraverso la colonna, seguita da tre lavaggi di 3 ml di PBS freddo ogni volta. Per ogni lavaggio, attendere che la colonna smetta di gocciolare prima di aggiungere il lavaggio successivo.
- Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra un tubo fresco da 15 ml. Aggiungere 5 ml di PBS freddo, montare lo stantuffo della colonna sulla colonna ed eluire le celle spingendo lo stantuffo.
- Mescolare le cellule arricchite con c-Kit, raccogliere 10 μL di cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro. La resa tipica di un topo è di 2-5 × 106 celle c-Kit+ .
NOTA: A questo punto, le cellule possono essere seminate direttamente in terreni HSC o preparate per la purificazione della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) HSC.
3. Avvio di colture cellulari con HSPC arricchiti con c-Kit
- Preparare il terreno fresco (Tabella 1) per il numero di celle/pozzetti necessari. Seme 0,5-1 milione di cellule per mL per HSPC arricchiti con c-Kit.
- Ruotare verso il basso le celle arricchite con c-Kit e risospenderle nel mezzo HSC alla densità cellulare desiderata.
- Trasferire le cellule su piastre rivestite di fibronectina o caricate superficialmente negativa, a 200 μL per piastra a 96 pozzetti o 1 ml per piastra a 24 pozzetti.
- Collocare le cellule in un incubatore per colture tissutali impostato a 37 °C e al 5% di CO2.
4. Iniziare colture cellulari con HSC purificate FACS
- Preparare un volume appropriato della colorazione anticorpale della linea biotinilata: 3 μL di master mix (Tabella 2) per 10 milioni di cellule, diluito 1:100 in PBS.
- Ruotare le cellule arricchite con c-Kit e risospendere la colorazione anticorpale di lignaggio per 30 minuti a 4 °C.
- Lavare con 10 mL di PBS sterile e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C.
- Preparare un volume appropriato della colorazione anticorpale HSC fresca (Tabella 3): 300 μL per 10 milioni di cellule. Oltre a questa colorazione del campione, preparare campioni di controllo della colorazione appropriati per la compensazione e il gating.
NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con la luce spenta quando si utilizzano anticorpi coniugati con colorante. - Risospendere le cellule nella colorazione anticorpale HSC e incubare a 4 °C per 90 minuti. Mescolare le celle ogni 20-30 minuti picchiettando per evitare la pellettizzazione cellulare.
- Lavare con 10 mL di PBS sterile e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante, far scorrere il pellet per interrompere e risospendere in PBS sterile con 0,5 μg/mL di ioduro di propidio (PI).
- Preparare il terreno fresco (Tabella 1) per il numero di pozzetti necessari e placcare in fibronectina o piastre caricate superficialmente negative (200 μL per piastra a 96 pozzetti o 1 ml per piastra da 24 pozzetti).
- Preparare la macchina FACS per lo smistamento e ordinare CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSC direttamente in pozzi contenenti supporti (vedere la Figura 1 per la strategia di gating FACS standard utilizzata qui). Ordina fino a 200 celle per pozzetto a 96 pozzetti o fino a 1.000 celle per pozzetto a 24 pozzetti.
NOTA: le macchine FACS devono essere gestite da uno scienziato qualificato. Si consiglia agli utenti di contattare la struttura FACS locale per discutere di questa strategia di selezione se non hanno esperienza nell'isolamento FACS delle HSC del topo.
5. Esecuzione delle modifiche ai supporti
- Per le colture cellulari iniziate da cellule arricchite con c-Kit, iniziare i cambi di terreno dopo 2 giorni. Per le colture cellulari iniziate da HSC isolate da FACS, iniziare i cambiamenti dei terreni dopo 5 giorni.
- Preparare un mezzo HSC fresco preriscaldato (~37 °C) sufficiente (Tabella 1) per tutti i pozzetti.
- Rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatore di coltura tissutale.
NOTA: Poiché le HSPC su piastre caricate superficialmente negative sono più facilmente disturbate di quelle su fibronectina, è necessario prestare particolare attenzione quando si cambia il mezzo su piastre caricate superficialmente negative per evitare di disturbare le colture cellulari. - Utilizzando una pipetta o una pompa per vuoto, rimuovere lentamente ~ 90% -95% del mezzo dal menisco del pozzo.
NOTA: Evitare di disegnare il mezzo dalla base del pozzetto, altrimenti molte cellule verranno rimosse. - Aggiungere 200 μL (per piastre da 96 pozzetti; 1 ml per piastre da 24 pozzetti) di terreno fresco nel pozzetto.
- Restituire la piastra all'incubatore di coltura tissutale.
- Ripetere i passaggi 5.1-5.6 ogni 2-3 giorni fino al punto finale sperimentale.
- Per le colture cellulari iniziate con HSPC arricchiti con c-Kit (sezione 3), dividere le colture in un rapporto di 1:2-1:3 dopo ~3 settimane. Per le colture cellulari iniziate con HSC purificate FACS (sezione 4), dividere le colture in un rapporto di 1:2-1:3 dopo ~3 settimane e quando le colture sono >90% confluenti.
NOTA: La tempistica esatta dipenderà dagli interessi sperimentali. Queste colture sono state caratterizzate per 4-8 settimane8, ma potrebbero essere possibili ulteriori lunghezze di coltura.
6. HSPC in coltura elettroporigante
NOTA: Questo protocollo è per l'elettroporazione della ribonucleoproteina Cas9/sgRNA (RNP), ma potrebbe essere adattato per l'elettroporazione di mRNA o altre proteine ricombinanti. Avviare colture con un numero sufficiente di cellule per eseguire questo nel momento sperimentale desiderato.
- Effettuare un cambio di mezzo 1 giorno prima dell'elettroporazione, come descritto nel paragrafo 5.
NOTA: Si raccomanda almeno una coltura durante la notte prima dell'elettroporazione. Tuttavia, le cellule sono tipicamente coltivate per 1-3 settimane prima della trasduzione. - Il giorno dell'elettroporazione, impostare il nucleofector. Accendere la macchina. Sul touchscreen, selezionare il modulo X e quindi la dimensione della cuvetta utilizzata.
- Preparare una soluzione P3 sufficiente (secondo le istruzioni del produttore) per la scala dell'elettroporazione (100 μL per cuvetta o 20 μL per microcuvetta) e lasciare equilibrare a temperatura ambiente.
- Preparare un terreno fresco sufficiente (Tabella 1) per il numero di pozzetti placcati e aggiungere 500 μL di terreno per un pozzetto a piastre da 24 pozzetti o 100 μL di terreno in un pozzetto a 96 pozzetti.
- Scongelare lo sgRNA (prediluito a 2 μg/ml in acqua priva di RNasi) sul ghiaccio e mescolare 16 μg di sgRNA con 30 μg di enzima Cas9 (a 10 μg/ml) in una provetta PCR sterile. Includere un tubo PCR supplementare contenente solo la proteina Cas9 come controllo. Mescolare facendo scorrere il tubo, quindi ruotare brevemente verso il basso. Incubare a 25 °C per 10 minuti in un termociclatore per complessare l'RNP, quindi mantenere i tubi sul ghiaccio.
NOTA: Questo può essere ridotto di cinque volte se si esegue l'elettroporazione in microcuvette. - Mescolare e trasferire gli HSPC per l'elettroporazione in un tubo; raccogliere 10 μL di cellule e contare utilizzando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro.
NOTA: Si raccomanda di elettropolare 1-5 milioni di cellule per cuvetta da 100 μL (ridotta di cinque volte per la microcuvetta). - Centrifugare il numero appropriato di celle in una provetta da 1,5 mL a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il più possibile il surnatante e risospendere con 100 μL di tampone di nucleofezione.
- Trasferire immediatamente la sospensione cellulare nel tubo PCR contenente l'RNP complessato e la pipetta su e giù lentamente per miscelare delicatamente e trasferire in una cuvetta di elettroporazione da 100 μL. Espellere la miscela nella cuvetta lentamente e con un movimento fluido per evitare la formazione di bolle d'aria nella cuvetta.
- Sull'elettroporatore, selezionare la posizione dei pozzetti da elettroporare. Utilizzando il touchscreen, selezionare il tipo di cella programma CD34+, umano, o digitare il codice di impulso EO100. Premere il pulsante OK .
- Trasferire le cuvette all'elettroporatore. Premere il pulsante Start sul touchscreen per avviare l'elettroporazione. Subito dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 μL del terreno di coltura alla cuvetta (100 μL se si utilizza una microcuvetta).
- Trasferire delicatamente le cellule sulla piastra preparata e tornare all'incubatore di coltura tissutale.
- Per le procedure che utilizzano un modello di donatore AAV6, aggiungere il vettore immediatamente dopo che le cellule sono state trasferite su una piastra rivestita di fibronectina ad una concentrazione di 5.000 vettori / cellula.
- Dopo 6-18 ore, preparare il terreno fresco ed eseguire un cambio di mezzo come descritto nella sezione 5. Per questa modifica del mezzo, rimuovere solo l'80% -90% del supporto.
NOTA: Evitare di disegnare il mezzo dalla base del pozzo. - Analizzare le cellule mediante citometria a flusso dopo 2 o più giorni (vedere paragrafo 8 per i dettagli).
- Continuare a eseguire modifiche medie ogni 2 giorni, come descritto nella sezione 5, fino al raggiungimento del punto finale sperimentale.
NOTA: I tassi di editing di CRISPR / Cas9 utilizzando questo metodo dipendono fortemente dall'efficienza di targeting dello sgRNA progettato. Tassi di editing fino al 95% sono stati osservati con una guida efficiente15. Le linee guida per la progettazione di sgRNA sono state precedentemente dettagliate altrove19,20.
7. Trasduzione di HSPC in coltura con vettore lentivirale
NOTA: Avviare colture con un numero sufficiente di cellule, per eseguire questa operazione nel punto temporale sperimentale desiderato.
- Generare e titolare il vettore lentivirale (a seconda degli obiettivi sperimentali). Vettore lentivirale di scongelamento sul ghiaccio.
- Eseguire una modifica media (come nella sezione 5); quindi, mescolare e trasferire gli HSPC per la trasduzione in un tubo. Raccogliere 10 μL delle cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro.
NOTA: Le cellule possono essere trasdotte immediatamente dopo la placcatura. Tuttavia, le cellule sono tipicamente coltivate per 1-3 settimane prima della trasduzione. - Riplaccare la dose necessaria di cellule per la trasduzione (tipicamente 100.000 cellule per piastra a 96 pozzetti). Separatamente, piastre celle di controllo negativo non trasdotte.
NOTA: Se si utilizzano piastre caricate in superficie negativa, trasferire le cellule in piastre rivestite di fibronectina per la trasduzione del vettore lentivirale. - Aggiungi vettore lentivirale a ciascun pozzetto di cellule: aggiungi 20 unità di trasduzione per cellula per ottenere ~ 30% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, determinare empiricamente la dose del vettore lentivirale, a seconda dei requisiti sperimentali.
NOTA: Assicurarsi che il vettore lentivirale sia smaltito secondo le linee guida istituzionali. - Restituire le cellule all'incubatore di coltura tissutale per 6 ore. Successivamente, eseguire una modifica media come descritto nella sezione 5.
NOTA: il surnatante contiene virus vivi. Smaltire secondo le linee guida istituzionali. - Analizzare le cellule mediante citometria a flusso (ad esempio, per l'espressione di GFP) dopo 2 giorni o più. Vedere la sezione 8 per i dettagli.
- Continuare a eseguire modifiche medie ogni 2 giorni, come descritto nella sezione 5, fino al raggiungimento del punto finale sperimentale.
8. Analisi citometrica a flusso di colture HSPC
- Preparare una miscela concentrata di anticorpi HSC ex vivo in PBS contenente il 2% di FBS (Tabella 4). Conservare la miscela a 4 °C al buio per un massimo di 1 mese.
NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con le luci spente quando si utilizzano anticorpi coniugati con colorante. - Aggiungere 2 μL di miscela di anticorpi concentrati a 50 μL di cellule. Incubare per 30 minuti a 4 °C al buio. Oltre a questa colorazione del campione, preparare campioni di controllo della colorazione appropriati per la compensazione e il gating.
- Aggiungere 200-1.000 μL di PBS contenente il 2% di FBS e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il più possibile il surnatante e risospendere in 100-500 μL di PBS contenente il 2% di FBS e 0,5 μg/mL di PI.
- Impostare il citometro a flusso e registrare almeno 10.000 cellule vive per campione.
NOTA: I citometri a flusso devono essere utilizzati da uno scienziato qualificato. Gli utenti devono contattare la propria struttura FACS locale per discutere questa analisi se non hanno esperienza nella citometria a flusso. - Esportare i dati in formato FCS e analizzarli utilizzando un apposito software di analisi della citometria a flusso. Vedere la Figura 2 per la strategia di gating standard utilizzata qui.
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Representative Results
Per la purificazione FACS delle HSC, ci aspettiamo che all'interno del midollo osseo arricchito con c-Kit, ~ 0,2% delle cellule siano la popolazione CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- per topi C57BL / 6 giovani (8-12 settimane) (Figura 1). Tuttavia, è probabile che topi transgenici o topi di età diverse mostrino frequenze HSC diverse. Dopo 4 settimane di coltura, ci aspettiamo che la frazione CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- sia ~10% (Figura 2). Questi risultati sono simili per le colture cellulari iniziate da midollo osseo arricchito con c-Kit o HSC purificate FACS. Dopo la trasduzione con un vettore lentivirale che esprime GFP (a 20 unità di trasduzione/cellula), ci aspettiamo ~30% di cellule GFP+ (Figura 3).
Quando confluente, ci aspettiamo che le colture siano a ~ 2 milioni di cellule / ml. All'interno della coltura, ci aspettiamo di vedere principalmente piccole cellule rotonde, anche se è normale vedere una piccola frequenza di cellule rotonde più grandi (simili ai megacariociti). All'interno delle colture cellulari iniziate dal midollo osseo arricchito con c-Kit, è prevista una morte cellulare iniziale14. Circa il 50% di morte cellulare è prevista entro le prime 24-48 ore, prima che vengano eseguiti i primi cambiamenti del mezzo. I detriti di cellule morte iniziali in queste colture provengono probabilmente dalla morte cellulare all'interno delle colture piuttosto che dai detriti ossei (dalle ossa frantumate), poiché la fase di arricchimento c-Kit dovrebbe esaurire tali detriti ossei. Il numero di cellule, tuttavia, ritorna all'80% -100% del numero di cellule seminate dopo 1 settimana (vedere Tabella 5 per i valori attesi di densità cellulare). Se si riscontrano risultati scarsi, si consiglia di risolvere i problemi relativi al protocollo (Tabella 6). In questo caso, può essere più semplice testare in batch i reagenti utilizzando il protocollo del midollo osseo arricchito con c-Kit (Sezione 3), in quanto ciò evita complicazioni associate alla selezione FACS. Si noti che i risultati rappresentativi si basano sull'uso di reagenti e attrezzature dettagliate nella tabella dei materiali; Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando reagenti di fornitori diversi, tuttavia, è probabile che sia necessaria la convalida (e la titolazione) di nuovi reagenti.
Figura 1: Strategia di gating per la purificazione FACS di HSC da midollo osseo arricchito con c-Kit. Gating sequenziale utilizzato per identificare cellule CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- dal midollo osseo arricchito con c-Kit. Abbreviazioni: FACS = selezione cellulare attivata da fluorescenza; HSCs = cellule staminali ematopoietiche; SSC-A = area laterale del picco di dispersione; FSC-A = area di picco di dispersione in avanti; FSC-W = larghezza del picco di dispersione in avanti; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti; SSC-H = altezza del picco di dispersione laterale; PI = ioduro di propidio; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Strategia di gating per l'analisi citometrica a flusso di HSPC in coltura. Gating sequenziale utilizzato per identificare cellule CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- da colture HSPC. Abbreviazioni: HSPCs = cellule staminali e progenitrici ematopoietiche; SSC-A = area laterale del picco di dispersione; FSC-A = area di picco di dispersione in avanti; FSC-W = larghezza del picco di dispersione in avanti; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti; SSC-H = altezza del picco di dispersione laterale; PI = ioduro di propidio; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi della trasduzione del vettore lentivirale. Espressione rappresentativa di GFP dopo trasduzione HSPC in coltura con un vettore lentivirale che esprime GFP (20 unità di trasduzione/cellula) a 48 ore dopo la trasduzione. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; HSPCs = cellule staminali e progenitrici ematopoietiche; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Reagente | Concentrazione finale in F-12 | Volume (μL) |
| Mezzo F-12 di Ham | N/D | 958 |
| 100x penicillina-streptomicina-glutammina | 1x | 10 |
| 1 M HEPES | 10 mM | 10 |
| 100 mg/mL di PVA stock | 1 mg/ml | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| 100 μg/mL di materiale in TPO | 100 ng/mL | 1 |
| 10 μg/mL di SCF stock | 10 ng/mL | 1 |
Tabella 1: Composizione dei supporti HSC. Volumi dei reagenti per 1 mL di terreno completo. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; SCF = fattore delle cellule staminali; TPO = trombopoietina; ITSX = insulina-transferrina-selenio-etanolamina.
| Anticorpo | Concentrazione (μg/ml) | Volume (μL) |
| Ly6G/Ly6C – biotina | 0.5 | 100 |
| Ter119 – biotina | 0.5 | 100 |
| CD4 – biotina | 0.5 | 25 |
| CD8a – biotina | 0.5 | 25 |
| CD45R – biotina | 0.5 | 50 |
| CD127 – biotina | 0.5 | 50 |
| Sterile PBS | N/D | 350 |
Tabella 2: Cocktail di anticorpi biotinilati. Volumi di anticorpi per lo stock del cocktail di anticorpi alla biotina.
| Anticorpo | Concentrazione (mg/ml) | Volume (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| c-Kit APC | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Streptavidina APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| Sterile PBS | N/D | 291 |
Tabella 3: Cocktail di anticorpi HSC freschi. Volumi anticorpali per il cocktail di anticorpi HSC fresco. Abbreviazioni: PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina; FITC = isotiocianato di fluoresceina.
| Anticorpo | Concentrazione (mg/ml) | Volume (μL) |
| c-Kit BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| Sterile PBS | N/D | 27.5 |
Tabella 4: Cocktail di anticorpi HSC in coltura (100x). Volumi di anticorpi per lo stock 100x del cocktail di anticorpi HSC in coltura. Abbreviazioni: PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina; FITC = isotiocianato di fluoresceina.
| Cultura | Densità cellulare a 24-48 h | % KSL a 24-48 h | Densità cellulare a 1 settimana | % KSL a 1 settimana |
| Placcatura midollare fresca c-Kit+ | 0,5x106 mL-1 | 25-35% | 1-2x106 mL-1 | 50-60% |
| Elettroporazione HSPC | 0,5x106 mL-1 | 25-35% | 0,5-1,5x106 mL-1 | 25-35% |
| Lentivirus HSPC | 1,5x106 mL-1 | 20-25% | 1-2x106 mL-1 | 45-55% |
Tabella 5: Risultati attesi. Densità cellulari attese e frequenze delle cellule c-Kit+Sca1+Lineage- dopo (1) semina del midollo osseo c-Kit+, (2) elettroporazione e (3) trasduzione vettoriale lentivirale basata sulla semina a 1 × 106 cellule mL-1. Abbreviazioni: KSL = c-Kit+Sca1+Lineage-; HSPC = cellule staminali e progenitrici ematopoietiche.
| Questione | Causa/e probabile/i | Soluzione/i | |||
| La portata della colonna LS è insolitamente lenta. | La colonna LS è intasata. | Rimuovere la colonna dal magnete. Eluire la sospensione cellulare usando lo stantuffo e ripetere con altri 5 mL di PBS. Ripetere l'arricchimento della colonna con una colonna nuova e un filtro nuovo. | |||
| Grande quantità di morte cellulare entro i primi 7 giorni di coltura | Utilizzo di reagenti scaduti o reagenti in rapporti errati. | Assicurarsi che i reggenti siano alla giusta concentrazione e conservati correttamente. | |||
| Temperatura dell'incubatore imprecisa. | Manutenzione regolare degli incubatori e garantire che l'incubatore sia tenuto chiuso il più possibile. | ||||
| Crollo culturale dopo 7 giorni di cultura | Tipo di cella errato ordinato | Chiedi consiglio agli esperti HSC FACS sui protocolli di smistamento. Convalidare i reagenti con midollo osseo arricchito con c-Kit. | |||
| Modifiche ai supporti incomplete in corso | Eseguire modifiche multimediali più complete. | ||||
| Eccessiva (ad es. >50%) morte cellulare complessiva dopo trasduzione | Tossicità del vettore lentivirale. | Ridurre la quantità di particelle virali utilizzate. | |||
| Ridurre i tempi di incubazione a 5 ore. | |||||
| Eccessiva (ad esempio, >50%) morte cellulare complessiva dopo la trasfezione | Cellule lasciate in soluzione P3 troppo a lungo | Recuperare le cellule nei fluidi il prima possibile, elettropare solo 2 campioni alla volta ed essere delicati durante il pipettaggio (e utilizzare punte per pipette ad ampio diametro). | |||
| Il pipettaggio uccide troppo vigorosamente le cellule | |||||
| Bassa efficienza di trasfezione | Degradazione degli RNP e/o dell'enzima Cas9. | Conservazione errata, conservare Cas9 a -20 °C e RNA a -80 °C (ricostituito con acqua priva di RNasi). | |||
| Bassa efficienza di trasduzione | Bassa attività vettoriale lentivirale | Titolare il vettore lentivirale per una specifica popolazione cellulare, evitare il congelamento/scongelamento del vettore lentivirale | |||
Tabella 6: Problemi comuni di risoluzione dei problemi. Riepilogo dei problemi comuni e risoluzione dei problemi suggerita.
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Discussion
Speriamo che questo protocollo fornisca un approccio utile per indagare la biologia delle HSC, l'ematopoiesi e l'ematologia più in generale. Dopo lo sviluppo iniziale del metodo di coltura basato su PVA per le HSC purificate FACS8, il metodo è stato esteso. Ad esempio, il metodo ha dimostrato di funzionare con c-Kit arricchito con midollo osseo e con piastre caricate superficialmente negative14. La sua compatibilità con la trasduzione e l'elettroporazione è stata dimostrata anche14,15. La validazione in vivo di queste colture HSC e c-Kit+ HSPC può essere trovata in queste pubblicazioni, mentre i lettori possono fare riferimento ad altri protocolli pubblicati per i protocolli di trapianto in vivo 21. Non vediamo grandi differenze nel chimerismo di lignaggio tra HSPC freschi e coltivati dopo il trapianto, tuttavia, la potenza di ricostituzione delle singole HSC dopo l'espansione ex vivo deve ancora essere determinata in dettaglio. Il gran numero di HSC generate da questo approccio apre nuovi modi per interrogare le HSC utilizzando saggi molecolari o biochimici che richiedono un numero elevato di cellule. Inoltre, essere in grado di generare HSC geneticamente modificate all'interno di questi sistemi di coltura dovrebbe permetterci di sondare ulteriormente i meccanismi che regolano l'attività delle HSC e il sistema ematopoietico. Ad esempio, questi sistemi sono suscettibili di eseguire screening genetici16.
Meccanicamente, non comprendiamo ancora appieno perché il PVA e altri polimeri possano sostituire l'albumina sierica e supportare un'efficiente espansione delle HSC; riteniamo che il PVA sostituisca almeno parzialmente l'albumina sierica attraverso citochine stabilizzanti all'interno dei media9. Inoltre, la mancanza di contaminanti bioattivi scarsamente definiti trovati nei prodotti a base di albumina sierica sembra ridurre la differenziazione delle HSC. L'uso di polimeri sintetici dovrebbe anche contribuire a ridurre la variabilità da lotto a lotto e gli effetti confondenti associati a questi contaminanti bioattivi durante lo studio delle HSC ex vivo22. C'è ancora molto da imparare sul perché alcuni polimeri forniscono un migliore supporto per le HSC ex vivo.
Sebbene già potenti, dovrebbe essere possibile un'ulteriore ottimizzazione e caratterizzazione di questi protocolli di coltura. In particolare, sarebbe utile migliorare la purezza delle HSC all'interno di queste colture. Ulteriori marcatori che distinguono il compartimento HSC a lungo termine da queste colture aiuterebbero anche a tracciare e isolare questi tipi di cellule. È anche interessante vedere se questo sistema può essere eventualmente utilizzato per quantificare l'attività delle HSC ex vivo, senza la necessità di saggi di trapianto in vivo . Inoltre non capiamo ancora per quanto tempo le HSC possono essere espanse ex vivo, anche se è certamente più lungo di 6-8 settimane se mantenuto correttamente8. Infine, mentre queste colture forniscono un modello utile per studiare le HSC di topo, è anche importante sviluppare sistemi di coltura equivalenti per le HSC umane per fornire un sistema più trattabile per studiare la biologia e l'ematopoiesi delle HSC umane e, infine, per generare HSC per terapie cliniche di trapianto di cellule staminali.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il WIMM Flow Cytometry Core per l'accesso alla citometria a flusso e il WIMM Virus Screening Core per la generazione di vettori lentivirali. Questo lavoro è stato finanziato dal Kay Kendall Leukaemia Fund e dal Medical Research Council del Regno Unito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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