Summary
여기에 제시된 것은 생체 외 폴리비닐 알코올 기반 확장을 사용하여 마우스 조혈 줄기 세포 배양을 시작, 유지 및 분석하는 프로토콜과 렌티바이러스 형질도입 및 전기천공을 통해 유전적으로 조작하는 방법입니다.
Abstract
자가 재생 다능성 조혈 줄기 세포(HSC)는 평생 동안 조혈을 지원하고 이식 후 전체 혈액 시스템을 재구성하는 능력으로 인해 중요한 세포 유형입니다. HSC는 다양한 혈액 질환에 대한 근치적 치료를 나타내는 줄기 세포 이식 요법에 임상적으로 사용됩니다. HSC 활동과 조혈을 조절하는 메커니즘을 이해하고 새로운 HSC 기반 치료법을 개발하는 데 상당한 관심이 있습니다. 그러나 생체 외에서 HSC의 안정적인 배양과 확장은 다루기 쉬운 생체 외 시스템에서 이러한 줄기 세포를 연구하는 데 주요 장벽이었습니다. 우리는 최근 이식 가능한 마우스 HSC의 장기 및 대규모 확장을 지원할 수 있는 폴리비닐알코올 기반 배양 시스템과 이를 유전자 편집하는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 전기천공 및 렌티바이러스 형질도입을 통해 마우스 HSC를 배양하고 유전적으로 조작하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 HSC 생물학 및 조혈에 관심이 있는 광범위한 실험적 혈액학자에게 유용할 것으로 예상됩니다.
Introduction
조혈 시스템은 산소 공급에서 병원균 퇴치, 특수 혈액 및 면역 세포 유형을 통해 포유류의 다양한 필수 과정을 지원합니다. 지속적인 혈액 생산(조혈)은 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에 의해 유지되는 혈액 시스템 항상성을 지원하는 데 필요합니다1. 가장 원시적인 조혈 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)로, 자가 재생 및 다계통 분화를 위한 독특한 능력을 가지고 있습니다 2,3. 이 세포집단은 주로 성인 골수에서 발견되는 희귀한 세포집단이다4, 30,000개 세포마다 약 1개의 빈도로 발생한다. HSC는 평생 조혈을 지원하고 혈액학적 스트레스 후 조혈을 재건하는 데 도움이 되는 것으로 생각됩니다. 이러한 능력은 또한 HSC가 방사선 조사를 받은 수용자에게 이식된 후 전체 조혈 시스템을 안정적으로 재구성할 수 있도록 한다5. 이는 HSC의 기능적 정의를 나타내며 다양한 혈액 및 면역 질환에 대한 치료 치료인 HSC 이식 요법의 과학적 근거를 형성합니다6. 이러한 이유로 HSC는 실험적 혈액학의 주요 초점입니다.
많은 연구에도 불구하고 생체 외 HSC를 안정적으로 확장하는 것은 여전히 어려운 과제입니다 7. 우리는 최근 마우스 HSC를 위한 최초의 장기 생체 외 확장 배양 시스템을 개발했습니다8. 이 접근법은 4주간의 배양 기간 동안 이식 가능한 HSC를 234-899배까지 확장할 수 있습니다. 대체 접근법과 비교하여 프로토콜의 주요 변경 사항은 혈청 알부민을 제거하고 합성 고분자로 대체하는 것이었습니다. 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol, PVA)은 마우스 HSC 배양을 위한 최적의 고분자로 확인되었다8, 현재는 다른 조혈 세포 유형9 배양에도 사용되고 있다. 그러나, Soluplus(폴리비닐 카프로락탐-아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그라프트 공중합체)라고 불리는 또 다른 중합체도 최근에 확인되었는데, 이는 클론 HSC 확장을 개선하는 것으로 보인다10. 중합체를 사용하기 전에는 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민 분획 V 또는 재조합 혈청 알부민 형태의 혈청 알부민이 사용되었으나, 이들은 HSC 확장에 대한 지원이 제한적이었고 단기간(~1주) 생체 외 배양만 지원했다7. 그러나, HSC를 정지 상태로 유지하는 HSC 배양 프로토콜은 더 긴 생체외 배양 시간을 지원할 수 있다는 점에 유의해야 한다(11,12).
다른 배양 방법과 비교할 때 PVA 기반 배양의 주요 이점은 생성할 수 있는 세포의 수와 프로토콜을 사용하여 생체 외에서 HSC를 추적할 수 있는 시간입니다. 이는 마우스당 분리할 수 있는 HSC의 수가 적고(수천 개에 불과) 생체 내에서 시간 경과에 따른 HSC를 추적하기 어렵다는 것과 같은 실험적 혈액학 분야의 여러 장벽을 극복합니다. 그러나, 이들 배양물은 HSC 증식을 자극하는 반면, 생체내 HSC 풀은 정상 상태에서 주로 정지 상태라는 것을 기억하는 것이 중요하다13. 또한 배양은 HSC에 대해 선택적이지만 시간이 지남에 따라 추가 세포 유형이 배양과 함께 축적되며 이식 가능한 HSC는 1개월 후 34개 세포 중 약 1개만 나타냅니다. 골수성 조혈 전구세포는 이들 HSC 배양물에서 주요 오염 세포 유형인 것으로 나타난다8. 그럼에도 불구하고 우리는 이러한 배양을 사용하여 이종 세포 집단(예: c-Kit+ 골수 HSPC에서 HSC를 풍부하게 할 수 있습니다14). 또한 유전자 조작을 위한 HSC의 형질도입 또는 전기천공을 지원합니다14,15,16. 이질적인 배양된 HSPC 집단에서 HSC를 식별하는 데 도움이 되도록 CD201(EPCR)은 최근 유용한 생체 외 HSC 마커10,17,18로 확인되었으며 이식 가능한 HSC는 CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- 분획으로 제한됩니다.
이 프로토콜은 PVA 기반 마우스 HSC 확장 배양을 시작, 유지 및 평가하는 방법과 전기천공 또는 렌티바이러스 벡터 형질도입을 사용하여 이러한 배양 내에서 유전자 조작을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 방법은 다양한 실험적 혈액학자에게 유용할 것으로 예상됩니다.
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Protocol
번식 및 안락사를 포함한 모든 동물 절차는 제도적 및 국가적 지침 내에서 수행되어야 합니다. 아래에 자세히 설명된 실험은 영국 내무부의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오.
1. 원액 준비
- PVA 원액
- 작은 유리병(고압증기멸균에 적합)에 조직 배양 품질의 물 50mL를 섭취합니다. 전자레인지에 물을 거의 끓을 때까지 데웁니다.
- PVA 분말 5g의 무게를 달아 물에 첨가하십시오.
알림: PVA 1-5g만 녹이는 것이 좋습니다. 더 많은 양을 용해하면 재구성이 불완전해질 수 있습니다. - 뚜껑을 꼭 닫고 흔들어 섞어주세요. 그런 다음 뚜껑을 풉니다.
알림: 다시 열 때 수온 변화로 인해 압력이 변할 수 있으므로 주의하십시오. - 오토클레이브하고 식히십시오. 뚜껑을 꼭 닫고 흔들어 섞어주세요. 멸균 튜브에 분취량을 만들고 4°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다.
- 동결건조된 사이토카인을 1mg/mL PVA를 함유하는 F-12 배지에 용해합니다. 줄기세포 인자를 10μg/mL로, 트롬보포이에틴을 100μg/mL로 재구성하여 1:1,000 스톡을 생성합니다. 멸균 튜브에 분취량을 만들고 -80 °C에서 장기간 보관하십시오. 또는 분취액을 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
참고: 마우스 HSC 확장에 부정적인 영향을 미치므로 소 혈청 알부민에서 사이토카인의 재구성을 피하십시오.
2. HSC 골수 추출 및 c-Kit+ 농축
- 갓 안락사된 8-12주 된 C57BL/6 마우스(CO2 질식 및/또는 자궁경부 탈구를 통해)에서 대퇴골, 경골, 골반 및 척추를 해부하고 뼈를 얼음 위의 PBS에 놓습니다.
알림: 표면과 도구가 70% 에탄올로 멸균되었는지 확인하십시오. - 보푸라기가 없는 섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 뼈를 청소하고 근육과 척수를 제거하고 ~3mL의 PBS가 든 박격포에 추가합니다.
알림: 유봉과 모르타르를 70% 에탄올로 멸균한 다음 PBS로 한 번 씻어냅니다. - 전단력을 최소화하기 위해 연삭하지 않고 유봉으로 뼈를 부수십시오. 5 mL 주사기에 부착된 19 G 바늘을 사용하여 PBS로 방출된 큰 골수 단편을 분해합니다. 70μm 필터를 통해 세포 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 현탁액이 옮겨지면 뼈가 표백되고 골수가 보이지 않을 때까지 신선한 PBS로 반복합니다. 마우스당 ~30mL, 마우스 2마리의 경우 ~50mL의 최종 부피를 목표로 합니다.
- 골수 세포를 혼합하고 10 μL의 세포를 수집 한 다음 Türks의 용액을 사용하여 혈구 계로 1 : 10-1 : 20의 희석으로 계산합니다.
참고: 한 마우스는 2-5 × 108 개의 전체 골수 세포를 생성할 것으로 예상됩니다. - 4°C에서 5분 동안 450× g 으로 회전시키고, 상층액을 버리고, 펠릿을 차가운 PBS(한 마우스의 경우 350μL 또는 두 마리의 마우스의 경우 500μL)에 재현탁합니다.
- 세포 1,000만 개당 알로피코시아닌(APC) 항-c-Kit 항체 0.2μL를 추가하고 4°C의 암실에서 30분 동안 배양합니다.
- 배양된 세포에 5mL의 차가운 PBS를 추가하여 과량의 항체를 씻어내고 50μm 필터를 통해 여과하여 신선한 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
- 7mL의 차가운 PBS로 원래 튜브를 세척하고 필터를 통해 옮깁니다. 필터 막힘이 발생하면 P1000 팁으로 필터 표면을 긁으십시오.
- 4°C에서 5분 동안 450× g 으로 회전시키고, 상청액을 버리고, 펠릿을 차가운 PBS(한 마우스의 경우 350μL 또는 두 마리의 마우스의 경우 500μL)에 재현탁합니다.
- 세포 1,000만 개당 0.2μL의 항-APC 마이크로비드를 추가하고 4°C의 암실에서 15분 동안 배양합니다. 12mL의 멸균 PBS를 첨가하여 과도한 마이크로비드를 씻어냅니다.
- 세포를 4°C에서 5분 동안 450× g 으로 스핀다운하고 2mL의 차가운 PBS에 재현탁합니다. 이 단계에서 셀이 회전하는 동안 2.13 단계로 진행합니다.
- 마그네틱 컬럼 분리기의 자석에 마그네틱 여과 컬럼을 배치하고 상단에는 50μm 필터를, 하단에는 15mL 원뿔형 튜브를 배치하여 컬럼 농축을 준비합니다.
- 50μm 필터 및 여과 컬럼을 통해 3mL의 멸균 PBS를 실행합니다. PBS가 통과되면 세포 현탁액을 컬럼에 통과시킨 다음 매번 3mL의 차가운 PBS를 3회 세척합니다. 각 세척에 대해 컬럼이 떨어지지 않을 때까지 기다렸다가 다음 세척을 추가합니다.
- 자석에서 컬럼을 제거하고 새 15mL 튜브 위에 놓습니다. 차가운 PBS 5mL를 넣고 컬럼 플런저를 컬럼에 장착하고 플런저를 밀어 세포를 용출합니다.
- c-Kit가 풍부한 세포를 혼합하고 10μL의 세포를 수집한 다음 Türks의 용액을 사용하여 혈구계로 1:2로 희석하여 계산합니다. 한 마우스의 일반적인 수율은 2-5 × 106 c-Kit+ 세포입니다.
참고: 이 시점에서 세포를 HSC 배지에 직접 시딩하거나 HSC 형광 활성화 세포 분류(FACS) 정제를 위해 준비할 수 있습니다.
3. c-Kit가 풍부한 HSPC를 사용한 세포 배양 시작
- 필요한 세포/웰 수에 맞는 새로운 배지(표 1)를 준비합니다. c-Kit가 풍부한 HSPC를 위해 mL당 0.5-1백만 개의 세포를 시드합니다.
- c-Kit가 풍부한 세포를 스핀다운하고 원하는 세포 밀도로 HSC 배지에서 재현탁합니다.
- 세포를 96웰 플레이트당 200μL 또는 24웰 플레이트당 1mL로 피브로넥틴 코팅 또는 음극 표면 대전 플레이트로 옮깁니다.
- 세포를 37°C 및 5%CO2로 설정된 조직 배양 배양기에 넣는다.
4. FACS 정제 HSC로 세포 배양 시작
- 적절한 부피의 비오티닐화 리니지 항체 염색을 준비한다: PBS에서 1:100으로 희석한 1,000만 개의 세포당 3 μL의 마스터 믹스(표 2).
- c-Kit-enriched 세포를 스핀다운하고 4°C에서 30분 동안 혈통 항체 염색에 재현탁합니다.
- 10mL의 멸균 PBS로 세척하고 4°C에서 5분 동안 450× g 에서 스핀다운합니다.
- 적절한 부피의 신선한 HSC 항체를 준비하여 염색하였다(표 3): 1,000만 세포당 300 μL. 이 샘플 염색과 함께 보상 및 게이팅을 위한 적절한 염색 제어 샘플을 준비합니다.
참고: 염료 결합 항체를 사용할 때는 불이 꺼진 상태에서 조직 배양 후드에서 작업하십시오. - 세포를 HSC 항체 염색에 재현탁하고 4°C에서 90분 동안 배양합니다. 세포 펠릿화를 방지하기 위해 두드려서 20-30분마다 세포를 혼합합니다.
- 10mL의 멸균 PBS로 세척하고 4°C에서 5분 동안 450× g 에서 스핀다운합니다.
- 상층액을 흡인하고, 펠릿을 플릭하여 파쇄하고, 0.5μg/mL 프로피듐 요오드화물(PI)로 멸균 PBS에 재현탁합니다.
- 필요한 웰 수에 맞는 새로운 배지(표 1)를 준비하고, 피브로넥틴 또는 음극 표면 대전 플레이트(96웰 플레이트당 200μL 또는 24웰 플레이트당 1mL)에 플레이트를 넣는다.
- CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-HSC를 배지 함유 웰로 직접 분류하고 분류하기 위해 FACS 기계를 준비합니다(여기에 사용된 표준 FACS 게이팅 전략은 그림 1 참조). 96웰 플레이트 웰당 최대 200개 세포 또는 24웰 플레이트 웰당 최대 1,000개 세포를 분류할 수 있습니다.
알림: FACS 기계는 숙련된 과학자가 작동해야 합니다. 사용자가 마우스 HSC의 FACS 격리에 경험이 없는 경우 이 분류 전략에 대해 논의하기 위해 지역 FACS 시설에 문의하는 것이 좋습니다.
5. 미디어 변경 수행
- c-Kit가 풍부한 세포에서 시작된 세포 배양의 경우 2일 후에 배지 교체를 시작합니다. FACS 분리 HSC에서 시작된 세포 배양의 경우 5일 후에 배지 교체를 시작합니다.
- 모든 웰에 대해 충분히 신선하게 예열된(~37°C) HSC 배지(표 1)를 준비합니다.
- 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 부드럽게 제거합니다.
참고: 음극 표면 대전 플레이트의 HSPC는 피브로넥틴의 HSPC보다 더 쉽게 방해를 받기 때문에 음극 표면 대전 플레이트의 배지를 변경할 때 세포 배양을 방해하지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다. - 피펫 또는 진공 펌프를 사용하여 웰 메니스커스에서 배지의 ~90%-95%를 천천히 제거합니다.
참고 : 우물 바닥에서 배지를 끌어 올리지 마십시오, 그렇지 않으면 많은 세포가 제거됩니다. - 200 μL(96-웰 플레이트의 경우, 24-웰 플레이트의 경우 1 mL)의 새로운 배지를 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 되돌립니다.
- 실험 종료점까지 2-3일마다 5.1-5.6단계를 반복합니다.
- c-Kit가 풍부한 HSPC(섹션 3)로 시작된 세포 배양의 경우 ~3주 후에 배양물을 1:2-1:3의 비율로 분할합니다. FACS 정제 HSC(섹션 4)로 시작된 세포 배양의 경우 ~3주 후 및 배양이 >90% 합류할 때 1:2-1:3의 비율로 배양을 분할합니다.
참고: 정확한 일정은 실험 관심사에 따라 다릅니다. 이러한 배양은 4-8주 동안 특성화되었으나추가적인 배양 기간도 가능할 수 있다.
6. 배양된 HSPC를 전기천공하는
참고: 이 프로토콜은 Cas9/sgRNA 리보핵단백질(RNP)의 전기천공을 위한 것이지만 mRNA 또는 기타 재조합 단백질의 전기천공에 적용할 수 있습니다. 원하는 실험 시점에서 이를 수행하기 위해 충분한 수의 세포로 배양을 시작합니다.
- 섹션 1에 설명된 대로 전기천공 5일 전에 배지 교체를 수행합니다.
알림: 전기 천공 전에 최소한 하룻밤 동안 배양하는 것이 좋습니다. 그러나, 세포는 전형적으로 형질도입 전에 1-3주 동안 배양된다. - electroporation의 날에, nucleofector를 설치하십시오. 기기를 켭니다. 터치스크린에서 X 모듈을 선택한 다음 사용된 큐벳 크기를 선택합니다.
- 전기천공 스케일(큐벳당 100μL 또는 마이크로큐벳당 20μL)에 충분한 P3 용액(제조업체의 지침에 따라)을 준비하고 실온과 평형을 이루도록 합니다.
- 플레이팅되는 웰 수에 대해 충분한 양의 신선한 배지(표 1)를 준비하고 24웰 플레이트 웰에 500μL의 배지 또는 96웰 플레이트 웰에 100μL의 배지를 추가합니다.
- sgRNA(RNase가 없는 물에서 2μg/mL로 미리 희석됨)를 얼음에서 해동하고 멸균 PCR 튜브에서 16μg의 sgRNA와 30μg의 Cas9 효소(10μg/mL)를 혼합합니다. Cas9 단백질만 포함하는 추가 PCR 튜브를 대조군으로 포함합니다. 튜브를 튕겨서 섞은 다음 짧게 회전시킵니다. RNP를 복합체화하기 위해 열순환기에서 25°C에서 10분 동안 인큐베이션한 다음 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
참고: 마이크로큐벳에서 전기천공을 수행하는 경우 5배로 축소할 수 있습니다. - 전기천공을 위해 HSPC를 튜브에 혼합하고 옮깁니다. 세포 10μL를 수집하고 Türks 용액을 사용하여 혈구계로 1:2로 희석하여 계산합니다.
참고: 100μL 큐벳당 1-500만 개의 세포를 전기천공하는 것이 좋습니다(마이크로큐벳의 경우 5배 축소). - 4°C에서 5분 동안 450× g 의 1.5mL 튜브에 적절한 수의 세포를 스핀다운합니다. 가능한 한 많은 상층액을 흡인하고 100μL의 뉴클레옥션 완충액으로 재현탁합니다.
- 복합체가 포함된 RNA 및 피펫이 들어 있는 PCR 튜브에 세포 현탁액을 즉시 옮겨 천천히 위아래로 부드럽게 혼합하고 100 μL 전기천공 큐벳으로 옮깁니다. 큐벳에 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 혼합물을 천천히 한 번의 유체 동작으로 큐벳으로 배출합니다.
- electroporator에서 전기 천공되는 웰의 위치를 선택합니다. 터치스크린을 사용하여 셀 유형 프로그램 CD34+, 사람을 선택하거나 펄스 코드 EO100을 입력합니다. OK 버튼을 누릅니다.
- 큐벳을 전기 천공기로 옮깁니다. 터치스크린의 시작 버튼을 눌러 전기천공을 시작합니다. 전기천공 직후 배양액 500μL를 큐벳에 추가합니다(마이크로큐벳을 사용하는 경우 100μL).
- 세포를 준비된 플레이트로 부드럽게 옮기고 조직 배양 인큐베이터로 돌아갑니다.
- AAV6 기증자 템플릿을 사용하는 절차의 경우 세포가 5,000 벡터/세포 농도로 피브로넥틴 코팅 플레이트로 옮겨진 직후 벡터를 추가합니다.
- 6-18시간 후, 새로운 배지를 준비하고 섹션 5에 설명된 대로 배지 변경을 수행합니다. 이 배지 변경의 경우 배지의 80%-90%만 제거합니다.
알림: 우물 바닥에서 매체를 끌어올리지 마십시오. - 2일 이상 경과 후 유세포 분석법으로 세포를 분석한다(자세한 내용은 섹션 8 참조).
- 실험 종료점에 도달할 때까지 섹션 2에 설명된 대로 5일마다 배지 변경을 계속 수행합니다.
참고: 이 방법을 사용한 CRISPR/Cas9의 편집 속도는 설계된 sgRNA의 표적화 효율에 크게 의존합니다. 최대 95%의 편집률이 효율적인 가이드로 관찰되었다15. sgRNA 설계에 대한 가이드라인은 이전에 다른 곳에서 상세히 설명되었다19,20.
7. 렌티바이러스 벡터로 배양된 HSPC를 형질도입
참고: 원하는 실험 시점에서 이를 수행하기 위해 충분한 수의 세포로 배양을 시작합니다.
- 렌티바이러스 벡터를 생성하고 역가합니다(실험 목표에 따라 다름). 얼음 위에서 렌티바이러스 벡터를 해동합니다.
- 중간 변경을 수행합니다(섹션 5에서와 같이). 그런 다음 튜브로 형질도입하기 위해 HSPC를 혼합하고 전사합니다. 세포 10μL를 수집하고 Türks 용액을 사용하여 혈구계로 1:2로 희석하여 계산합니다.
참고: 세포는 도금 직후에 형질도입될 수 있습니다. 그러나, 세포는 전형적으로 형질도입 전에 1-3주 동안 배양된다. - 형질도입에 필요한 세포 용량을 재플레이트합니다(일반적으로 96웰 플레이트당 100,000개 세포). 별도로, 형질도입되지 않은 음성 대조군 세포를 플레이트에 넣는다.
참고: 음극 표면 대전 플레이트를 사용하는 경우 렌티바이러스 벡터 형질도입을 위해 세포를 피브로넥틴 코팅 플레이트로 옮깁니다. - 세포의 각 웰에 렌티바이러스 벡터 추가: ~30% 형질도입 효율을 달성하기 위해 세포당 20개의 형질도입 단위를 추가합니다. 그러나, 렌티바이러스 벡터 투여량은 실험 요건에 따라 경험적으로 결정한다.
참고: 렌티바이러스 벡터가 기관 지침에 따라 폐기되는지 확인하십시오. - 세포를 조직 배양 인큐베이터로 6시간 동안 되돌립니다. 그런 다음 섹션 5에 설명된 대로 매체 변경을 수행합니다.
참고: 상청액에는 살아있는 바이러스가 포함되어 있습니다. 기관 지침에 따라 폐기하십시오. - 2일 이상 후에 유세포 분석기(예를 들어, GFP 발현에 대해)에 의해 세포를 분석한다. 자세한 내용은 섹션 8을 참조하십시오.
- 실험 종료점에 도달할 때까지 섹션 2에 설명된 대로 5일마다 배지 변경을 계속 수행합니다.
8. HSPC 배양의 유세포 분석
- 2% FBS를 함유하는 PBS에서 농축 배양된 생체외 HSC 항체 믹스를 준비하였다(표 4). 혼합물을 4°C의 어두운 곳에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
참고: 염료 결합 항체를 사용할 때는 불을 끈 상태에서 조직 배양 후드에서 작업하십시오. - 50 μL의 세포에 농축된 항체 혼합물 2 μL를 추가합니다. 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 이 샘플 염색과 함께 보상 및 게이팅을 위한 적절한 염색 제어 샘플을 준비합니다.
- 2% FBS를 함유하는 PBS 200-1,000 μL를 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 450 × g 에서 원심분리한다. 가능한 한 많은 상청액을 제거하고 2% FBS 및 0.5μg/mL PI를 포함하는 100-500μL의 PBS에 재현탁합니다.
- 유세포 분석기를 설정하고 샘플당 최소 10,000개의 살아있는 세포를 기록합니다.
참고: 유세포 분석기는 숙련된 과학자가 작동해야 합니다. 사용자는 유세포 분석에 경험이 없는 경우 현지 FACS 시설에 연락하여 이 분석에 대해 논의해야 합니다. - 데이터를 FCS 형식으로 내보내고 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 여기에 사용된 표준 게이팅 전략은 그림 2 를 참조하십시오.
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Representative Results
HSC의 FACS 정제를 위해 c-Kit가 풍부한 골수 내에서 세포의 ~0.2%가 어린(8-12주령) C57BL/6 마우스의 CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- 개체군일 것으로 예상합니다(그림 1). 그러나 형질전환 마우스 또는 다른 연령의 마우스는 다른 HSC 빈도를 나타낼 가능성이 있습니다. 배양 4주 후 CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- 분획은 ~10%가 될 것으로 예상합니다(그림 2). 이러한 결과는 c-Kit 농축 골수 또는 FACS 정제 HSC에서 시작된 세포 배양과 유사합니다. GFP 발현 렌티바이러스 벡터(20 transduction units/cell)로 형질도입한 후 ~30% GFP+ 세포가 예상됩니다(그림 3).
합류할 때 배양액은 ~2백만 cells/mL가 될 것으로 예상합니다. 배양 내에서 우리는 주로 작은 원형 세포를 볼 것으로 예상하지만 더 큰 원형(거핵구 유사) 세포의 작은 빈도를 보는 것은 정상입니다. c-Kit가 풍부한 골수에서 시작된 세포 배양 내에서, 일부 초기 세포 사멸이 예상된다14. 첫 번째 배지 변경이 수행되기 전에 처음 24-48시간 이내에 약 50%의 세포 사멸이 예상됩니다. 이러한 배양에서 초기 죽은 세포 파편은 c-Kit-농축 단계가 이러한 뼈 파편을 고갈시켜야 하기 때문에 뼈 파편(으깬 뼈에서)이 아닌 배양 내 세포 사멸에서 비롯될 가능성이 높습니다. 그러나 세포 번호는 1주일 후에 시드된 세포 수의 80%-100%로 돌아갑니다(예상 세포 밀도 값은 표 5 참조). 결과가 좋지 않으면 프로토콜 문제를 해결하는 것이 좋습니다(표 6). 이 경우 c-Kit-enriched bone marrow protocol(섹션 3)을 사용하여 시약을 배치로 테스트하는 것이 가장 간단할 수 있으며, 이는 FACS 분류와 관련된 합병증을 피할 수 있기 때문입니다. 대표적인 결과는 재료 표에 자세히 설명된 시약 및 장비의 사용을 기반으로 합니다. 다른 공급업체의 시약을 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있지만 새로운 시약의 검증(및 적정)이 필요할 수 있습니다.
그림 1: c-Kit가 풍부한 골수에서 HSC의 FACS 정제를 위한 게이팅 전략. c-Kit가 풍부한 골수에서 CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- 세포를 식별하는 데 사용되는 순차적 게이팅. 약어: FACS = 형광 활성화 세포 분류; HSCs = 조혈 줄기 세포; SSC-A = 측면 산란-피크 면적; FSC-A = 전방 산란-피크 면적; FSC-W = 순방향 산란 피크 폭; FSC-H = 전방 산란-피크 높이; SSC-H = 측면 산란-피크 높이; PI = 요오드화 프로피듐; PE = 피코에리트린; APC = 알로피코시아닌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배양된 HSPC의 유세포 분석을 위한 게이팅 전략. HSPC 배양에서 CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- 세포를 식별하는 데 사용되는 순차적 게이팅. 약어: HSPCs = 조혈 줄기 및 전구 세포; SSC-A = 측면 산란-피크 면적; FSC-A = 전방 산란-피크 면적; FSC-W = 순방향 산란 피크 폭; FSC-H = 전방 산란-피크 높이; SSC-H = 측면 산란-피크 높이; PI = 요오드화 프로피듐; PE = 피코에리트린; APC = 알로피코시아닌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 렌티바이러스 벡터 형질도입의 대표적인 결과. 형질도입 후 48시간에 GFP 발현 렌티바이러스 벡터(20 형질도입 단위/세포)로 배양된 HSPC 형질도입 후 대표적인 GFP 발현. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; HSPCs = 조혈 줄기 및 전구 세포; FSC-H = 순방향 산란 피크 높이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | F-12의 최종 농도 | 부피 (μL) |
| 햄의 F-12 매체 | 해당 사항 없음 | 958 |
| 100x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 | 1배 | 10 |
| 1 M 헤페스 | 10 밀리엠 | 10 |
| 100 mg/mL PVA 주식 | 1 밀리그램/mL | 10 |
| ITSX 100배 | 1배 | 10 |
| 100 μg/mL TPO 스톡 | 100ng/mL | 1 |
| 10 μg/mL SCF 스톡 | 10ng/mL | 1 |
표 1: HSC 매체 조성. 1mL의 완전 배지에 대한 배지 시약 부피. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; SCF = 줄기 세포 인자; TPO = 트롬보포이에틴; ITSX = 인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민.
| 항체 | 농도 (μg/mL) | 부피 (μL) |
| Ly6G/Ly6C – 비오틴 | 0.5 | 100 |
| Ter119 – 비오틴 | 0.5 | 100 |
| CD4 – 비오틴 | 0.5 | 25 |
| CD8a – 비오틴 | 0.5 | 25 |
| CD45R – 비오틴 | 0.5 | 50 |
| CD127 – 비오틴 | 0.5 | 50 |
| 멸균 PBS | 해당 사항 없음 | 350 |
표 2: 비오티닐화 항체 칵테일. 비오틴 항체 칵테일의 재고에 대한 항체 부피.
| 항체 | 농도(mg/mL) | 부피 (μL) |
| CD34 핏 | 0.5 | 4 |
| c-키트 APC | 0.2 | 1 |
| 스카1 PE | 0.2 | 1 |
| 스트렙타비딘 APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| 멸균 PBS | 해당 사항 없음 | 291 |
표 3: 신선한 HSC 항체 칵테일. 신선한 HSC 항체 칵테일에 대한 항체 부피. 약어: PE = 피코에리트린; APC = 알로피코시아닌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트.
| 항체 | 농도(mg/mL) | 부피 (μL) |
| c- 키트 BV421 | 0.2 | 12.5 |
| 스카1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| 테르119 APC/CY7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| 멸균 PBS | 해당 사항 없음 | 27.5 |
표 4: 배양된 HSC 항체 칵테일 (100x). 배양된 HSC 항체 칵테일의 100x 스톡에 대한 항체 부피. 약어: PE = 피코에리트린; APC = 알로피코시아닌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트.
| 문화 | 24-48시간에서의 세포 밀도 | 24-48시간에 % KSL | 1주일의 세포 밀도 | 1주일에 % KSL |
| 신선한 c-Kit+ 골수 도금 | 0.5x10 6mL-1 | 25-35% | 1-2x10 6mL-1 | 50-60% |
| HSPC 전기천공법 | 0.5x10 6mL-1 | 25-35% | 0.5-1.5x10 6mL-1 | 25-35% |
| HSPC 렌티바이러스 | 1.5x10 6mL-1 | 20-25% | 1-2x10 6mL-1 | 45-55% |
표 5: 예상 결과. (1) c-Kit+ 골수의 파종, (2) 전기천공 및 (3) 1 ×10 6 세포 mL-1에서의 파종에 기초한 렌티바이러스 벡터 형질도입 후 c-Kit+Sca1+Lineage- 세포의 예상 세포 밀도 및 빈도. 약어: KSL = c-Kit+Sca1+Lineage-; HSPC = 조혈 줄기 및 전구 세포.
| 출판하다 | 가능한 원인 | 해결 방법 | |||
| LS 컬럼의 유속은 비정상적으로 느립니다. | LS 컬럼이 막혔습니다. | 자석에서 컬럼을 제거합니다. 플런저를 사용하여 세포 현탁액을 용출하고 PBS 5mL를 추가로 반복합니다. 새로운 컬럼과 새로운 필터로 컬럼 보강을 반복합니다. | |||
| 배양 후 처음 7일 이내에 다량의 세포 사멸 | 만료된 시약 또는 잘못된 비율의 시약 사용. | 리젠트가 적절한 농도에 있고 올바르게 보관되어 있는지 확인하십시오. | |||
| 부정확 한 인큐베이터 온도. | 인큐베이터를 정기적으로 서비스하고 인큐베이터를 가능한 한 많이 닫아 둡니다. | ||||
| 문화 7 일 후 문화 붕괴 | 잘못된 셀 유형 정렬 | 분류 프로토콜에 대해 HSC FACS 전문가의 조언을 구하십시오. c-Kit가 풍부한 골수로 시약을 검증합니다. | |||
| 불완전한 미디어 변경이 수행되고 있습니다. | 보다 완전한 미디어 변경을 수행합니다. | ||||
| 형질도입 후 과도한(예: >50%) 전체 세포 사멸 | 렌티바이러스 벡터 독성. | 사용되는 바이러스 입자의 양을 줄입니다. | |||
| 배양 시간을 5 시간으로 단축하십시오. | |||||
| 형질감염 후 과도한(예를 들어, >50%) 전체 세포 사멸 | P3 용액에 세포가 너무 오래 남아 있습니다. | 가능한 한 빨리 배지에서 세포를 회수하고, 한 번에 2개의 샘플만 전기천공하고, 피펫팅할 때 부드럽게 하십시오(그리고 광구경 피펫 팁 사용). | |||
| 피펫팅은 세포를 너무 세게 죽인다 | |||||
| 낮은 transfection 효율 | RNP 및/또는 Cas9 효소의 분해. | 잘못된 보관, Cas9를 -20°C에서 보관하고 RNA를 -80°C에서 보관합니다(RNase가 없는 물로 재구성). | |||
| 낮은 형질도입 효율 | 낮은 렌티바이러스 벡터 활성 | 특정 세포 집단에 대한 렌티바이러스 벡터를 적정하고 렌티바이러스 벡터를 동결/해동하지 마십시오. | |||
표 6: 일반적인 문제 해결 문제 일반적인 문제 및 제안된 문제 해결에 대한 요약입니다.
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Discussion
우리는 이 프로토콜이 HSC 생물학, 조혈 및 혈액학을 보다 일반적으로 조사하는 데 유용한 접근 방식을 제공하기를 바랍니다. FACS 정제 HSCs에 대한 PVA 기반 배양 방법의 초기 개발 8 이후, 이 방법은 확장되었다. 예를 들어, 상기 방법은 골수가 풍부한 c-Kit 및 음극 표면 대전 플레이트(14)와 함께 작동하는 것으로 나타났다. 형질도입 및 전기천공법과의 상용성도 입증되었다14,15. 이러한 HSC 및 c-Kit+ HSPC 배양의 생체 내 검증은 이 간행물에서 찾을 수 있으며, 독자는 생체 내 이식 프로토콜에 대해 공개된 다른 프로토콜을 참조할 수 있습니다21. 이식 후 신선 HSPC와 배양된 HSPC 사이의 계통 키메라에 큰 차이가 보이지 않지만, 생체 외 확장 후 개별 HSC의 재구성 효능은 아직 자세히 결정되지 않았습니다. 이 접근법에 의해 생성 된 많은 수의 HSC는 많은 세포 수를 필요로하는 분자 또는 생화학 분석을 사용하여 HSC를 조사하는 새로운 방법을 열어줍니다. 또한 이러한 배양 시스템 내에서 유전자 변형 HSC를 생성할 수 있게 되면 HSC 활성과 조혈 시스템을 조절하는 메커니즘을 추가로 조사할 수 있습니다. 예를 들어, 이들 시스템은 유전자 스크리닝(genetic screen)을 수행할 수 있다(16).
기계적으로 우리는 PVA 및 기타 폴리머가 혈청 알부민을 대체하고 효율적인 HSC 확장을 지원할 수 있는 이유를 아직 완전히 이해하지 못합니다. 우리는 PVA가 배지 내에서 사이토카인을 안정화시킴으로써 혈청 알부민을 적어도 부분적으로 대체한다고 믿는다9. 또한, 혈청 알부민 제품에서 발견되는 잘 정의되지 않은 생리 활성 오염 물질의 부족은 HSC 분화를 감소시키는 것으로 보입니다. 합성 폴리머의 사용은 또한 생체 외 HSC를 연구할 때 이러한 생리 활성 오염 물질과 관련된 배치 간 변동성 및 교란 효과를 줄이는 데 도움이 될 것입니다 22. 또한 특정 폴리머가 생체 외에서 HSC를 더 잘 지원하는 이유에 대해 더 많은 것을 배워야 합니다.
이미 강력하지만 이러한 배양 프로토콜의 추가 최적화 및 특성화가 가능해야 합니다. 특히, 이러한 배양 내에서 HSC의 순도를 향상시키는 것이 유용할 것입니다. 이러한 배양물에서 장기 HSC 구획을 구별하는 추가 마커는 또한 이러한 세포 유형을 추적하고 분리하는 데 도움이 될 것입니다. 이 시스템이 생체 내 이식 분석 없이 생체 외에서 HSC 활성을 정량화하는 데 궁극적으로 사용될 수 있는지 여부도 흥미롭습니다. 또한 HSC가 생체 외에서 얼마나 오래 확장될 수 있는지는 아직 알 수 없지만, 적절하게 유지된다면 확실히 6-8주보다 더 길다. 마지막으로, 이러한 배양은 마우스 HSC를 연구하는 데 유용한 모델을 제공하지만, 인간 HSC 생물학 및 조혈을 연구하기 위해 보다 다루기 쉬운 시스템을 제공하고 궁극적으로 임상 줄기 세포 이식 요법을 위한 HSC를 생성하기 위해 인간 HSC에 대한 동등한 배양 시스템을 개발하는 것도 중요합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
유세포 분석에 대한 WIMM 유세포 분석 코어(Flow Cytometry Core)와 렌티바이러스 벡터 생성을 위한 WIMM 바이러스 스크리닝 코어(WIMM Virus Screening Core)에 감사드립니다. 이 연구는 Kay Kendall Leukaemia Fund와 UK Medical Research Council의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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