Summary
Apresentamos aqui um protocolo para iniciar, manter e analisar culturas de células-tronco hematopoéticas de camundongos usando expansão ex vivo à base de álcool polivinílico, bem como métodos para manipulá-las geneticamente por transdução lentiviral e eletroporação.
Abstract
As células-tronco hematopoéticas (CTHs) multipotentes auto-renovadoras são um tipo celular importante devido à sua capacidade de suportar a hematopoiese ao longo da vida e reconstituir todo o sistema sanguíneo após o transplante. As CTHs são usadas clinicamente em terapias de transplante de células-tronco, que representam tratamento curativo para uma série de doenças do sangue. Há um interesse substancial tanto na compreensão dos mecanismos que regulam a atividade da TH e da hematopoiese, quanto no desenvolvimento de novas terapias baseadas em HSC. No entanto, o cultivo estável e a expansão de CTHs ex vivo têm sido uma grande barreira no estudo dessas células-tronco em um sistema ex vivo tratável. Recentemente, desenvolvemos um sistema de cultura à base de álcool polivinílico que pode apoiar a expansão a longo prazo e em larga escala de HSCs transplantáveis de camundongos e métodos para editá-los geneticamente. Este protocolo descreve métodos para cultura e manipulação genética de HSCs de camundongos via eletroporação e transdução lentiviral. Espera-se que este protocolo seja útil para uma ampla gama de hematologistas experimentais interessados em biologia da CAR e hematopoese.
Introduction
O sistema hematopoiético suporta uma série de processos essenciais em mamíferos, desde o fornecimento de oxigênio até o combate a patógenos, passando por tipos especializados de células sanguíneas e imunológicas. A produção contínua de sangue (hematopoiese) é necessária para dar suporte à homeostase do sistema sanguíneo, que é sustentada por células-tronco hematopoéticas e células progenitoras (HSPCs)1. A célula hematopoética mais primitiva é a célula-tronco hematopoética (CTH), que possui capacidades únicas de auto-renovação e diferenciação de multilinhagens2,3. Esta é uma população celular rara, encontrada principalmente na medula óssea adulta4, onde ocorrem com uma frequência de apenas aproximadamente uma a cada 30.000 células. Acredita-se que as CTHs apoiem a hematopoiese ao longo da vida e ajudem a restabelecer a hematopoiese após o estresse hematológico. Essas capacidades também permitem que as HSCs reconstituam de forma estável todo o sistema hematopoiético após o transplante em um receptor irradiado5. Isso representa a definição funcional de uma CAR e também forma a base científica para a terapia de transplante de THC, um tratamento curativo para uma série de doenças hematológicas e imunológicas6. Por essas razões, as HSCs são um dos principais focos da hematologia experimental.
Apesar de um grande foco de pesquisa, tem permanecido desafiador expandir de forma estável HSCs ex vivo7. Recentemente, desenvolvemos o primeiro sistema de cultura de expansão ex vivo de longo prazo para HSCs de camundongos8. A abordagem pode expandir HSCs transplantáveis em 234-899 vezes ao longo de uma cultura de 4 semanas. Em comparação com abordagens alternativas, a principal mudança no protocolo foi a remoção da albumina sérica e sua substituição por um polímero sintético. O álcool polivinílico (PVA) foi identificado como um polímero ótimo para culturas de HSC em camundongos8, que agora também tem sido usado para culturas de outros tipos de células hematopoéticas9. No entanto, outro polímero chamado Soluplus (um copolímero de enxerto de polivinil caprolactama-acetato-polietilenoglicol) também foi identificado recentemente, o que parece melhorar a expansão clonal de CTE10. Antes do uso de polímeros, albumina sérica na forma de soro fetal bovino, albumina sérica V de soro bovino ou albumina sérica recombinante eram usadas, mas estas tinham suporte limitado para expansão de CTE e suportavam apenas cultura ex vivo de curto prazo (~1 semana)7. No entanto, deve-se ressaltar que protocolos de cultura de CAR que retêm as HSC em estado quiescente podem suportar um tempo de cultura ex vivo maior11,12.
Em comparação com outros métodos de cultura, uma grande vantagem das culturas baseadas em PVA é o número de células que podem ser geradas e o tempo que o protocolo pode ser usado para rastrear HSCs ex vivo. Isso supera várias barreiras no campo da hematologia experimental, como o baixo número de HSCs isoláveis por camundongo (apenas alguns milhares) e a dificuldade de rastrear HSCs ao longo do tempo in vivo. No entanto, é importante lembrar que essas culturas estimulam a proliferação de HSC, enquanto o pool de HSC in vivo é predominantemente quiescente em estado estacionário13. Além disso, embora as culturas sejam seletivas para CTHs, tipos celulares adicionais se acumulam com as culturas ao longo do tempo, e as CTHs transplantáveis representam apenas aproximadamente uma em cada 34 células após 1 mês. As células progenitoras hematopoéticas mieloides parecem ser o principal tipo celular contaminante nessas culturas deCTH8. No entanto, podemos usar essas culturas para enriquecer para HSCs de populações celulares heterogêneas (por exemplo, c-Kit+ HSPCs de medula óssea14). Também suporta a transdução ou eletroporação de CTHs para manipulação genética14,15,16. Para ajudar a identificar HSCs da população heterogênea de HSPC cultivadas, CD201 (EPCR) foi recentemente identificado como um marcador útil ex vivo de HSC10,17,18, com HSCs transplantáveis restritas à fração CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.
Este protocolo descreve métodos para iniciar, manter e avaliar culturas de expansão de HSC de camundongos baseadas em PVA, bem como protocolos para manipulação genética dentro dessas culturas usando eletroporação ou transdução de vetor lentiviral. Espera-se que esses métodos sejam úteis para uma variedade de hematologistas experimentais.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais, incluindo a criação e a eutanásia, devem ser realizados dentro das diretrizes institucionais e nacionais. Os experimentos detalhados abaixo foram aprovados pelo Ministério do Interior do Reino Unido. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Preparação de soluções de estoque
- Solução de estoque PVA
- Tomar 50 mL de água de qualidade para cultura de tecidos em uma pequena garrafa de vidro (adequada para autoclavagem). Aqueça a água até quase ferver no micro-ondas.
- Pesar 5 g de pó de PVA e adicionar à água.
NOTA: Recomenda-se dissolver apenas 1-5 g de PVA. Dissolver quantidades maiores pode resultar em reconstituição incompleta. - Feche bem a tampa e agite para misturar. Em seguida, solte a tampa.
NOTA: Tenha cuidado ao reabrir, pois a pressão pode mudar devido à mudança de temperatura da água. - Autoclave e deixe esfriar. Feche bem a tampa e agite para misturar. Faça alíquotas em tubos estéreis e armazene por até 3 meses a 4 °C.
- Dissolver citocinas liofilizadas em meio F-12 contendo 1 mg/mL de PVA. Reconstituir o fator de células-tronco para 10 μg/mL e a trombopoietina para 100 μg/mL para gerar estoques de 1:1.000. Faça alíquotas em tubos estéreis e armazene a longo prazo a -80 °C. Como alternativa, guarde as alíquotas a 4 °C por até 1 semana.
NOTA: Evitar a reconstituição de citocinas na albumina do soro bovino devido ao impacto negativo na expansão da HSC em camundongos.
2. Extração de medula óssea por HSC e enriquecimento com c-Kit+
- Disseque os fêmures, tíbias, pelve e coluna vertebral de camundongos C57BL/6 recém-eutanasiados com 8-12 semanas de idade (via asfixia por CO2 e/ou luxação cervical) e coloque os ossos em PBS sobre gelo.
NOTA: Certifique-se de que as superfícies e ferramentas estão esterilizadas com etanol 70%. - Limpe os ossos usando lenços de tarefas delicadas sem fiapos, removendo o músculo e a medula espinhal, e adicione a uma argamassa com ~3 mL de PBS.
NOTA: Certifique-se de que o pilão e a argamassa sejam esterilizados com etanol 70% e depois lavados uma vez com PBS. - Esmague os ossos com o pilão sem moer para minimizar as forças de cisalhamento. Quebrar grandes fragmentos de medula óssea liberados no PBS usando uma agulha de 19 G acoplada a uma seringa de 5 mL. Transferir a suspensão celular através de um filtro de 70 μm para um tubo cônico de 50 mL.
- Uma vez transferida a suspensão, repita com PBS fresco até que os ossos estejam branqueados e nenhuma medula seja visível. Procure um volume final de ~30 mL por camundongo e ~50 mL para dois camundongos.
- Misturar as células da medula óssea, coletar 10 μL de células e contar usando solução de Türks em uma diluição de 1:10-1:20 com um hemocitômetro.
NOTA: Espera-se que um camundongo produza 2-5 ×10 8 células inteiras da medula óssea. - Girar a 450 × g por 5 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em PBS frio (350 μL para um camundongo ou 500 μL para dois camundongos).
- Adicionar 0,2 μL de anticorpo anti-c-Kit aloficocianina (APC) por 10 milhões de células e incubar durante 30 minutos no escuro a 4 °C.
- Adicionar 5 mL de PBS frio às células incubadas para lavar o excesso de anticorpos e filtrar através de um filtro de 50 μm para um tubo cônico fresco de 15 mL.
- Lave o tubo original com 7 mL de PBS frio e transfira através do filtro. Se ocorrer entupimento do filtro, risque a superfície do filtro com uma ponta P1000.
- Girar a 450 × g por 5 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em PBS frio (350 μL para um camundongo ou 500 μL para dois camundongos).
- Adicionar 0,2 μL de microesferas anti-APC por 10 milhões de células e incubar por 15 min no escuro a 4 °C. Adicione 12 mL de PBS estéril para lavar o excesso de microesferas.
- Gire as células a 450 × g por 5 min a 4 °C e ressuspenda em 2 mL de PBS frio. Enquanto as células estiverem girando nesta etapa, prossiga para a etapa 2.13.
- Prepare-se para o enriquecimento da coluna colocando uma coluna de filtração magnética no ímã de um separador de coluna magnética, com um filtro de 50 μm na parte superior e um tubo cônico de 15 mL abaixo.
- Executar 3 mL de PBS estéril através do filtro de 50 μm e da coluna de filtração. Uma vez que o PBS tenha passado, passe a suspensão celular através da coluna, seguido de três lavagens de 3 mL de PBS frio de cada vez. Para cada lavagem, espere a coluna parar de pingar antes de adicionar a próxima lavagem.
- Retire a coluna do ímã e coloque-a em cima de um tubo fresco de 15 mL. Adicione 5 mL de PBS frio, encaixe o êmbolo da coluna na coluna e elimine as células empurrando o êmbolo.
- Misturar as células enriquecidas com c-Kit, coletar 10 μL de células e contar usando a solução de Türks em uma diluição de 1:2 com um hemocitômetro. O rendimento típico de um camundongo é de 2-5 × 106 células c-Kit+ .
NOTA: Neste ponto, as células podem ser semeadas diretamente em meios HSC ou preparadas para purificação de células ativadas por fluorescência (FACS) HSC.
3. Iniciando culturas de células com HSPCs enriquecidos com c-Kit
- Preparar meio fresco (Tabela 1) para o número de células/poços necessários. Semear 0,5-1 milhão de células por mL para HSPCs enriquecidos com c-Kit.
- Gire as células enriquecidas com c-Kit e ressuspenda em meio HSC na densidade celular desejada.
- Transferir as células para placas revestidas com fibronectina ou com carga superficial negativa, a 200 μL por placa de 96 poços ou 1 mL por placa de 24 poços.
- Colocar as células numa incubadora de cultura de tecidos regulada para 37 °C e 5% CO2.
4. Iniciando culturas celulares com HSCs purificadas FACS
- Preparar um volume apropriado da coloração de anticorpos de linhagem biotinilada: 3 μL de mistura mestre (Tabela 2) por 10 milhões de células, diluídos 1:100 em PBS.
- Gire as células enriquecidas com c-Kit e ressuspenda na coloração de anticorpos de linhagem por 30 min a 4 °C.
- Lavar com 10 ml de PBS estéril e girar para baixo a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C.
- Preparar um volume adequado da coloração de anticorpos HSC frescos (Tabela 3): 300 μL por 10 milhões de células. Juntamente com esta coloração da amostra, prepare amostras de controle de coloração apropriadas para compensação e gating.
NOTA: Trabalhe em uma capa de cultura de tecidos com a luz apagada ao usar anticorpos conjugados com corante. - Ressuspender as células na coloração de anticorpos HSC e incubar a 4 °C por 90 min. Misture as células a cada 20-30 min tocando para evitar a peletização celular.
- Lavar com 10 ml de PBS estéril e girar para baixo a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C.
- Aspirar o sobrenadante, agitar o pellet para interromper e ressuspender em PBS estéril com 0,5 μg/mL de iodeto de propídio (PI).
- Preparar meio fresco (Tabela 1) para o número de poços necessários e placa em fibronectina ou placas com carga superficial negativa (200 μL por placa de 96 poços ou 1 mL por placa de 24 poços).
- Prepare a máquina FACS para classificar e classificar CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSCs diretamente em poços contendo mídia (consulte a Figura 1 para a estratégia de vedação FACS padrão usada aqui). Classifique até 200 células por poço de placa de 96 poços ou até 1.000 células por poço de placa de 24 poços.
NOTA: As máquinas FACS devem ser operadas por um cientista treinado. Recomenda-se que os usuários entrem em contato com o recurso FACS local para discutir essa estratégia de classificação se não tiverem experiência no isolamento FACS de HSCs de camundongos.
5. Realizando alterações de mídia
- Para culturas de células iniciadas a partir de células enriquecidas com c-Kit, iniciar as trocas de meios após 2 dias. Para culturas de células iniciadas a partir de CTHs isoladas de FACS, iniciar as trocas de meios após 5 dias.
- Preparar meio HSC pré-aquecido (~37 °C) fresco suficiente (Tabela 1) para todos os poços.
- Remova suavemente a placa da incubadora de cultura de tecidos.
NOTA: Como os HSPCs em placas carregadas de superfície negativa são mais facilmente perturbados do que aqueles em fibronectina, deve-se tomar cuidado extra ao trocar o meio em placas carregadas de superfície negativa para evitar perturbar as culturas celulares. - Usando uma pipeta ou bomba de vácuo, remova lentamente ~90%-95% do meio do menisco do poço.
NOTA: Evite retirar o meio da base do poço, caso contrário muitas células serão removidas. - Adicionar 200 μL (para placas de 96 poços; 1 mL para placas de 24 poços) de meio fresco ao poço.
- Retorne a placa para a incubadora de cultura de tecidos.
- Repita as etapas 5.1-5.6 a cada 2-3 dias até o desfecho experimental.
- Para culturas celulares iniciadas com HSPCs enriquecidas com c-Kit (seção 3), dividir as culturas em uma proporção de 1:2-1:3 após ~3 semanas. Para culturas celulares iniciadas com HSCs purificadas FACS (seção 4), dividir as culturas em uma proporção de 1:2-1:3 após ~3 semanas e quando as culturas estiverem >90% confluentes.
NOTA: O cronograma exato dependerá dos interesses experimentais. Essas culturas foram caracterizadas por 4-8 semanas8, mas comprimentos de cultura adicionais podem ser possíveis.
6. HSPCs cultivados eletroporando
NOTA: Este protocolo é para eletroporação de ribonucleoproteína Cas9/sgRNA (RNP), mas poderia ser adaptado para eletroporação de mRNA ou outras proteínas recombinantes. Iniciar culturas com número suficiente de células para realizá-lo no momento experimental desejado.
- Efectuar uma mudança do meio 1 dia antes da electroporação, conforme descrito na secção 5.
NOTA: Recomenda-se um mínimo de uma cultura noturna antes da eletroporação. No entanto, as células são tipicamente cultivadas por 1-3 semanas antes da transdução. - No dia da eletroporação, configure o nucleofector. Ligue a máquina. Na tela sensível ao toque, selecione o módulo X e, em seguida, o tamanho da cubeta usado.
- Preparar solução P3 suficiente (de acordo com as instruções do fabricante) para a escala da eletroporação (100 μL por cubeta ou 20 μL por microcubeta) e deixar equilibrar-se à temperatura ambiente.
- Preparar meio fresco suficiente (Tabela 1) para o número de poços a serem banhados e adicionar 500 μL de meio para um poço de placa de 24 poços ou 100 μL de meio para um poço de placa de 96 poços.
- Descongelar o sgRNA (pré-diluído a 2 μg/mL em água livre de RNase) no gelo e misturar 16 μg de sgRNA com 30 μg da enzima Cas9 (a 10 μg/mL) em um tubo de PCR estéril. Incluir um tubo de PCR extra contendo apenas a proteína Cas9 como controle. Misture mexendo o tubo e, em seguida, gire brevemente para baixo. Incubar a 25 °C por 10 min em um termociclador para complexar o RNP e, em seguida, manter os tubos no gelo.
NOTA: Isso pode ser reduzido em cinco vezes se for realizada eletroporação em microcubetas. - Misturar e transferir os HSPCs para eletroporação em um tubo; coletar 10 μL das células e contar usando solução de Türks em uma diluição de 1:2 com um hemocitômetro.
NOTA: Recomenda-se eletroporar 1-5 milhões de células por 100 μL de cubeta (reduzido em cinco vezes para a microcubeta). - Gire o número adequado de células em um tubo de 1,5 mL a 450 × g por 5 min a 4 °C. Aspirar o máximo possível do sobrenadante e ressuspender com 100 μL de tampão de nucleofeção.
- Transfira a suspensão celular imediatamente para o tubo de PCR contendo o RNP complexado e pipeta para cima e para baixo lentamente para misturar suavemente e transferir para uma cubeta de eletroporação de 100 μL. Ejete a mistura na cubeta lentamente e em um movimento fluido para evitar a formação de bolhas de ar na cubeta.
- No eletroporador, selecione a posição dos poços que estão sendo eletroporados. Usando a tela sensível ao toque, selecione o programa de tipo de célula CD34+, humano, ou digite o código de pulso EO100. Pressione o botão OK .
- Transfira as cubetas para o eletroporador. Pressione o botão Iniciar na tela sensível ao toque para iniciar a eletroporação. Logo após a eletroporação, adicionar 500 μL do meio de cultura à cubeta (100 μL se utilizar uma microcubeta).
- Transfira suavemente as células para a placa preparada e retorne à incubadora de cultura de tecidos.
- Para procedimentos que empregam um modelo de doador AAV6, adicione o vetor imediatamente após as células terem sido transferidas para uma placa revestida com fibronectina a uma concentração de 5.000 vetores/célula.
- Após 6-18 h, prepare o meio fresco e efectue uma mudança do meio conforme descrito na secção 5. Para esta mudança de meio, remova apenas 80%-90% do meio.
OBS: Evite retirar o meio da base do poço. - Analisar as células por citometria de fluxo após 2 ou mais dias (ver secção 8 para mais detalhes).
- Continuar a efectuar trocas de meios de 2 em 2 dias, conforme descrito na secção 5, até atingir o ponto final experimental.
NOTA: As taxas de edição de CRISPR/Cas9 usando esse método dependem muito da eficiência de direcionamento do sgRNA projetado. Taxas de edição de até 95% têm sido observadas com um guia eficiente15. Diretrizes para o projeto de sgRNA foram previamente detalhadas em outros estudos19,20.
7. Transdução de HSPCs cultivadas com vetor lentiviral
NOTA: Iniciar culturas com número suficiente de células, para realizar isso no momento experimental desejado.
- Gerar e titular vetor lentiviral (dependendo dos objetivos experimentais). Descongelar o vetor lentiviral no gelo.
- Realizar uma mudança de meio (como na seção 5); em seguida, misture e transfira os HSPCs para transdução em um tubo. Recolher 10 μL das células e contar utilizando a solução de Türks numa diluição de 1:2 com um hemocitómetro.
NOTA: As células podem ser transduzidas imediatamente após o plaqueamento. No entanto, as células são tipicamente cultivadas por 1-3 semanas antes da transdução. - Replaquear a dose necessária de células para transdução (tipicamente 100.000 células por placa de 96 poços). Separadamente, as células de controle negativo não transduzidas em placa.
NOTA: Se usar placas com carga superficial negativa, transfira as células para placas revestidas com fibronectina para transdução de vetor lentiviral. - Adicione vetor lentiviral a cada poço de células: adicione 20 unidades de transdução por célula para alcançar ~30% de eficiência de transdução. No entanto, determinar a dose do vetor lentiviral empiricamente, dependendo das exigências experimentais.
OBS: Garantir que o vetor lentiviral seja descartado de acordo com as diretrizes institucionais. - Retornar as células à incubadora de cultura de tecidos por 6 h. Depois, efectue uma mudança de meio conforme descrito na secção 5.
NOTA: O sobrenadante contém vírus vivo. Descarte de acordo com as diretrizes institucionais. - Analisar as células por citometria de fluxo (por exemplo, para expressão de GFP) após 2 dias ou mais. Consulte a seção 8 para obter detalhes.
- Continuar a efectuar trocas de meios de 2 em 2 dias, conforme descrito na secção 5, até atingir o ponto final experimental.
8. Análise por citometria de fluxo de culturas de HSPC
- Preparar uma mistura de anticorpos HSC cultivada concentrada ex vivo em PBS contendo SFB a 2% (Tabela 4). Conservar a mistura a 4 °C no escuro até 1 mês.
NOTA: Trabalhe em uma capela de cultura de tecidos com as luzes apagadas ao usar anticorpos conjugados com corante. - Adicionar 2 μL de mistura concentrada de anticorpos a 50 μL de células. Incubar durante 30 min a 4 °C no escuro. Juntamente com esta coloração da amostra, prepare amostras de controle de coloração apropriadas para compensação e gating.
- Adicionar 200-1.000 μL de PBS contendo 2% de FBS e centrifugar a 450 × g por 5 min a 4 °C. Remover o sobrenadante possível e ressuspender em 100-500 μL de PBS contendo 2% de SFB e 0,5 μg/mL de IP.
- Configure o citômetro de fluxo e registre pelo menos 10.000 células vivas por amostra.
NOTA: Os citômetros de fluxo devem ser operados por um cientista treinado. Os usuários devem entrar em contato com a instalação local do FACS para discutir essa análise se não tiverem experiência em citometria de fluxo. - Exporte os dados no formato FCS e analise os dados usando o software de análise de citometria de fluxo apropriado. Consulte a Figura 2 para a estratégia de vedação padrão usada aqui.
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Representative Results
Para a purificação FACS de HSCs, esperamos que, dentro da medula óssea enriquecida com c-Kit, ~0,2% das células sejam a população CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- para camundongos jovens (8-12 semanas de idade) C57BL/6 (Figura 1). No entanto, é provável que camundongos transgênicos ou de diferentes idades apresentem diferentes frequências de HSC. Após 4 semanas de cultura, esperamos que a fração CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- seja de ~10% (Figura 2). Esses resultados são semelhantes para culturas de células iniciadas a partir de CTHs purificadas de medula óssea enriquecida com c-Kit ou FACS. Após a transdução com um vetor lentiviral que expressa GFP (a 20 unidades de transdução/célula), esperamos ~30% de células GFP+ (Figura 3).
Quando confluentes, esperamos que as culturas estejam em ~2 milhões de células/mL. Dentro da cultura, esperamos ver principalmente pequenas células redondas, embora seja normal ver uma pequena frequência de células redondas maiores (megacariócitos-like). Dentro das culturas celulares iniciadas a partir da medula óssea enriquecida com c-Kit, espera-se alguma morte celular inicial14. Aproximadamente 50% de morte celular é esperada dentro das primeiras 24-48 h, antes que as primeiras mudanças de meio sejam realizadas. Os restos iniciais de células mortas nessas culturas provavelmente vêm da morte celular dentro das culturas, em vez de detritos ósseos (dos ossos esmagados), uma vez que a etapa de enriquecimento do c-Kit deve esgotar esses detritos ósseos. Os números de células, no entanto, retornam a 80%-100% dos números de células semeadas após 1 semana (consulte a Tabela 5 para valores esperados de densidade celular). Se resultados ruins forem observados, recomendamos a solução de problemas do protocolo (Tabela 6). Nesse caso, pode ser mais simples testar reagentes em lote usando o protocolo de medula óssea enriquecido com c-Kit (Seção 3), pois isso evita complicações associadas à classificação por FACS. Observe que os resultados representativos são baseados no uso de reagentes e equipamentos detalhados na Tabela de Materiais; Resultados semelhantes podem ser obtidos usando reagentes de diferentes fornecedores, no entanto, a validação (e titulação) de novos reagentes provavelmente será necessária.
Figura 1: Estratégia de Gating para purificação FACS de HSCs de medula óssea enriquecida com c-Kit. Gating sequencial usado para identificar células CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- da medula óssea enriquecida com c-Kit. Abreviações: FACS = fluorescence-activated cell sorting; CTHs = células-tronco hematopoéticas; SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-A = área do pico de dispersão anterior; FSC-W = largura do pico de dispersão para frente; FSC-H = altura do pico de dispersão anterior; SSC-H = altura do pico de dispersão lateral; IP = iodeto de propídio; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégia de Gating para análise por citometria de fluxo de HSPCs cultivadas. Gating sequencial usado para identificar células CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- de culturas de HSPC. Abreviações: HSPCs = células-tronco hematopoéticas e progenitoras; SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-A = área do pico de dispersão anterior; FSC-W = largura do pico de dispersão para frente; FSC-H = altura do pico de dispersão anterior; SSC-H = altura do pico de dispersão lateral; IP = iodeto de propídio; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos da transdução do vetor lentiviral. Expressão representativa de GFP após transdução de HSPC cultivada com um vetor lentiviral que expressa GFP (20 unidades de transdução/célula) em 48 h após a transdução. Abreviações: GFP = proteína fluorescente verde; HSPCs = células-tronco hematopoéticas e progenitoras; FSC-H = altura do pico de dispersão para frente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Concentração final em F-12 | Volume (μL) |
| F-12 médio de presunto | N/A | 958 |
| 100x Penicilina-Estreptomicina-Glutamina | 1x | 10 |
| 1 M HEPES | 10 mM | 10 |
| 100 mg/mL PVA estoque | 1 mg/mL | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| Estoque de TPO de 100 μg/mL | 100 ng/mL | 1 |
| Estoque de 10 μg/mL de SCF | 10 ng/mL | 1 |
Tabela 1: Composição dos meios HSC. Volumes de reagentes para 1 mL de meio completo. Abreviações: PVA = álcool polivinílico; SCF = fator de células-tronco; TPO = trombopoietina; ITSX = insulina-transferrina-selênio-etanolamina.
| Anticorpo | Concentração (μg/mL) | Volume (μL) |
| Ly6G/Ly6C – biotina | 0.5 | 100 |
| Ter119 – biotina | 0.5 | 100 |
| CD4 – biotina | 0.5 | 25 |
| CD8a – biotina | 0.5 | 25 |
| CD45R – biotina | 0.5 | 50 |
| CD127 – biotina | 0.5 | 50 |
| PBS estéril | N/A | 350 |
Tabela 2: Coquetel de anticorpos biotinilados. Volumes de anticorpos para o estoque do coquetel de anticorpos de biotina.
| Anticorpo | Concentração (mg/mL) | Volume (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| c-Kit APC | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Estreptavidina APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| PBS estéril | N/A | 291 |
Tabela 3: Coquetel de anticorpos HSC frescos. Volumes de anticorpos para o coquetel de anticorpos HSC fresco. Abreviações: PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína.
| Anticorpo | Concentração (mg/mL) | Volume (μL) |
| Kit c-BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| PBS estéril | N/A | 27.5 |
Tabela 4: Coquetel de anticorpos HSC cultivados (100x). Volumes de anticorpos para o estoque de 100x do coquetel de anticorpos HSC cultivado. Abreviações: PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína.
| Cultura | Densidade celular em 24-48 h | % KSL em 24-48 h | Densidade celular em 1 semana | % KSL em 1 semana |
| Revestimento fresco da medula óssea c-Kit+ | 0,5x106 mL-1 | 25-35% | 1-2x106 mL-1 | 50-60% |
| Eletroporação HSPC | 0,5x106 mL-1 | 25-35% | 0,5-1,5x106 mL-1 | 25-35% |
| Lentivírus HSPC | 1,5x106 mL-1 | 20-25% | 1-2x106 mL-1 | 45-55% |
Tabela 5: Resultados esperados. Densidades e frequências celulares esperadas de células c-Kit+Sca1+Linhagem- seguindo (1) semeadura da medula óssea c-Kit+, (2) eletroporação e (3) transdução de vetor lentiviral com base na semeadura em 1 × 106 células mL-1. Abreviações: KSL = c-Kit+Sca1+Lineage-; HSPC = células-tronco hematopoéticas e progenitoras.
| Questão | Causa(s) provável(is) | Solução/s | |||
| A taxa de fluxo da coluna LS é excepcionalmente lenta. | A coluna LS está entupida. | Remova a coluna do ímã. Eluir a suspensão celular usando o êmbolo e repetir com mais 5 mL de PBS. Repita o enriquecimento da coluna com uma coluna fresca e um filtro fresco. | |||
| Grande quantidade de morte celular nos primeiros 7 dias de cultura | Utilizar reagentes expirados ou em proporções incorretas. | Certifique-se de que os regentes estejam na concentração adequada e armazenados corretamente. | |||
| Temperatura imprecisa da incubadora. | Manutenção regular das incubadoras e garantia de que a incubadora seja mantida fechada o máximo possível. | ||||
| Colapso cultural após 7 dias de cultura | Tipo de célula incorreto classificado | Procure aconselhamento de especialistas do HSC FACS sobre protocolos de classificação. Validar reagentes com medula óssea enriquecida com c-Kit. | |||
| Alterações de mídia incompletas sendo executadas | Execute alterações de mídia mais completas. | ||||
| Morte celular global excessiva (por exemplo, >50%) após transdução | Toxicidade do vetor lentiviral. | Reduzir a quantidade de partículas virais utilizadas. | |||
| Encurtar o tempo de incubação para 5 h. | |||||
| Morte celular global excessiva (por exemplo, >50%) após transfecção | Células deixadas na solução P3 por muito tempo | Recupere células em meios o mais rápido possível, eletroporate apenas 2 amostras de cada vez e seja suave ao pipetar (e use pontas de pipeta de furo largo). | |||
| Pipetting muito vigorosamente matar células | |||||
| Baixa eficiência de transfecção | Degradação de RNPs e/ou enzima Cas9. | Armazenamento incorreto, armazenar Cas9 a -20 °C e RNA a -80 °C (reconstituído com água livre de RNase). | |||
| Baixa eficiência de transdução | Baixa atividade do vetor lentiviral | Titular vetor lentiviral para população celular específica, evitar congelamento/descongelamento do vetor lentiviral | |||
Tabela 6: Problemas comuns de solução de problemas. Resumo de problemas comuns e solução de problemas sugerida.
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Discussion
Esperamos que este protocolo forneça uma abordagem útil para investigar a biologia da THS, hematopoese e hematologia de forma mais geral. Desde o desenvolvimento inicial do método de cultura à base de PVA para HSCs purificadas porFACS8, o método tem sido ampliado. Por exemplo, foi demonstrado que o método funciona com c-Kit enriquecido com medula óssea e com placas carregadas superficialmentenegativas14. Sua compatibilidade com transdução e eletroporação também foi demonstrada14,15. A validação in vivo dessas culturas de HSC e c-Kit+ HSPC pode ser encontrada nessas publicações, enquanto os leitores podem consultar outros protocolos publicados para protocolos de transplante in vivo21. Não vemos grandes diferenças no quimerismo de linhagem entre HSPCs frescos e cultivados após o transplante, no entanto, a potência de reconstituição de HSCs individuais após expansão ex vivo ainda não foi determinada em detalhes. O grande número de CTHs geradas por essa abordagem abre novas maneiras de interrogar as CTHs usando ensaios moleculares ou bioquímicos que requerem um grande número de células. Além disso, a capacidade de gerar HSCs geneticamente modificados dentro desses sistemas de cultura deve nos permitir investigar melhor os mecanismos que regulam a atividade das HSC e o sistema hematopoiético. Por exemplo, esses sistemas são passíveis de realização de rastreamentos genéticos16.
Mecanisticamente, ainda não entendemos completamente por que o PVA e outros polímeros podem substituir a albumina sérica e suportar a expansão eficiente de HSC; acreditamos que o PVA substitui, pelo menos parcialmente, a albumina sérica por meio de citocinas estabilizadoras na média9. Além disso, a falta de contaminantes bioativos mal definidos encontrados em produtos de albumina sérica parece reduzir a diferenciação de HSC. O uso de polímeros sintéticos também deve ajudar a reduzir a variabilidade lote a lote e os efeitos de confusão associados a esses contaminantes bioativos ao estudar HSCs ex vivo22. Há ainda mais a ser aprendido sobre por que certos polímeros fornecem melhor suporte para HSCs ex vivo.
Embora já poderosos, uma maior otimização e caracterização desses protocolos de cultura devem ser possíveis. Em particular, seria útil melhorar a pureza dos HSCs dentro dessas culturas. Marcadores adicionais distinguindo o compartimento de HSC de longo prazo dessas culturas também ajudariam a rastrear e isolar esses tipos celulares. Também é interessante verificar se esse sistema pode ser eventualmente utilizado para quantificar a atividade da CAR ex vivo, sem a necessidade de ensaios de transplante in vivo . Também ainda não entendemos por quanto tempo os HSCs podem ser expandidos ex vivo, embora certamente seja maior do que 6-8 semanas se mantido adequadamente8. Finalmente, embora essas culturas forneçam um modelo útil para estudar HSCs de camundongos, também é importante desenvolver sistemas de cultura equivalentes para HSCs humanas para fornecer um sistema mais tratável para estudar a biologia e hematopoiese de HSC humanas e, eventualmente, gerar HSCs para terapias clínicas de transplante de células-tronco.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao WIMM Flow Cytometry Core pelo acesso à citometria de fluxo e ao WIMM Virus Screening Core pela geração do vetor lentiviral. Este trabalho foi financiado pelo Kay Kendall Leukaemia Fund e pelo UK Medical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
