Summary
ここでは、 ex vivo ポリビニルアルコールベースの増殖を使用してマウス造血幹細胞培養を開始、維持、および分析するためのプロトコルと、レンチウイルス形質導入およびエレクトロポレーションによってそれらを遺伝子操作する方法を紹介します。
Abstract
自己複製型多能性造血幹細胞(HSC)は、生涯を通じて造血をサポートし、移植後に血液系全体を再構成する能力があるため、重要な細胞型です。造血幹細胞は、さまざまな血液疾患の治癒的治療を表す幹細胞移植療法で臨床的に使用されています。造血幹細胞活性と造血を調節するメカニズムの理解と、新しいHSCベースの治療法の開発の両方に大きな関心が寄せられています。しかしながら、幹細胞幹細胞の ex vivoでの安定した培養および増殖は、取り扱い可能な ex vivo システムでこれらの幹細胞を研究する上で大きな障壁となってきた。我々は最近、移植可能なマウス造血幹細胞の長期的・大規模拡大を支援できるポリビニルアルコールベースの培養系と、それらを遺伝子編集する方法を開発しました。このプロトコルは、エレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入 を介して マウスHSCを培養および遺伝子操作する方法について説明しています。このプロトコルは、HSC生物学と造血に関心のある幅広い実験血液学者に役立つことが期待されます。
Introduction
造血系は、酸素供給から病原体との戦いまで、特殊な血液および免疫細胞タイプを通じて、哺乳類のさまざまな重要なプロセスをサポートします。造血幹および前駆細胞(HSPC)1によって維持される血液系の恒常性をサポートするためには、継続的な血液産生(造血)が必要です1。最も原始的な造血細胞は造血幹細胞(HSC)であり、これは自己複製および多系統分化のためのユニークな能力を有する2,3。これはまれな細胞集団であり、主に成体の骨髄4に見られ、約30,000細胞に1個の頻度で発生します。造血幹細胞は、生涯にわたる造血をサポートし、血液学的ストレス後の造血を再確立するのに役立つと考えられています。これらの能力はまた、HSCが照射されたレシピエントへの移植後に造血系全体を安定して再構成することを可能にする5。これは、HSCの機能的定義を表しており、さまざまな血液および免疫疾患の治癒的治療法であるHSC移植療法の科学的根拠も形成します6。これらの理由から、造血幹細胞は実験血液学の主要な焦点です。
研究の大きな焦点にもかかわらず、HSCをex vivo7で安定的に増殖させることは依然として困難でした。私たちは最近、マウス造血幹細胞8用の最初の長期生体外増殖培養システムを開発しました。このアプローチは、移植可能なHSCを4週間の培養で234〜899倍拡大することができます。他のアプローチと比較して、プロトコルの主な変更は、血清アルブミンの除去と合成ポリマーへの置き換えでした。ポリビニルアルコール(PVA)は、マウスHSC培養8に最適なポリマーとして同定され、現在では他の造血細胞タイプ9の培養にも使用されています。しかし、Soluplus(ポリビニルカプロラクタム-アセテート - ポリエチレングリコールグラフトコポリマー)と呼ばれる別のポリマーも最近同定されており、クローンHSCの膨張を改善するようです10。ポリマーを使用する前は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン画分V、または組換え血清アルブミンの形態の血清アルブミンが使用されていましたが、これらはHSC増殖のサポートが限られており、短期間(~1週間)のex vivo培養のみをサポートしていました7。しかしながら、HSCを静止状態で保持するHSC培養プロトコルは、より長いエクスビボ培養時間をサポートできることに留意すべきである11、12。
他の培養方法と比較して、PVAベースの培養の主な利点は、生成できる細胞の数と、プロトコルを使用して幹細胞をex vivoで追跡できる時間の長さです。これは、マウスあたりの単離可能なHSCの数が少ない(数千人のみ)ことや、in vivoでHSCを経時的に追跡することの難しさなど、実験血液学の分野におけるいくつかの障壁を克服します。ただし、これらの培養物はHSC増殖を刺激しますが、in vivo HSCプールは主に定常状態で静止していることを覚えておくことが重要です13。さらに、培養物は造血幹細胞に選択的ですが、時間の経過とともに追加の細胞型が培養物とともに蓄積し、移植可能な造血幹細胞は1か月後に34細胞に約1個しか表しません。骨髄系造血前駆細胞は、これらのHSC培養において主要な夾雑細胞型であると思われる8。それにもかかわらず、これらの培養物を使用して、不均一な細胞集団からの造血幹細胞を濃縮することができます(例:c-Kit+骨髄HSPC14)。また、遺伝子操作のためのHSCの形質導入またはエレクトロポレーションもサポートしています14,15,16。不均一な培養HSPC集団からの造血幹細胞の同定を支援するために、CD201(EPCR)は最近、有用なex vivo HSCマーカー10,17,18として同定され、移植可能な造血幹細胞はCD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統画分に限定されています。
このプロトコルでは、PVAベースのマウスHSC増殖培養を開始、維持、および評価する方法、およびエレクトロポレーションまたはレンチウイルスベクター形質導入を使用したこれらの培養内での遺伝子操作のプロトコルについて説明します。これらの手法は、様々な実験的血液学者にとって有用であることが期待されます。
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Protocol
繁殖や安楽死を含むすべての動物の手順は、制度的および国のガイドラインの範囲内で実行されなければなりません。以下に詳述する実験は、英国内務省によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器のリストについては、 材料の表 を参照してください。
1.ストックソリューションの準備
- PVAストックソリューション
- 50 mLの組織培養品質の水を小さなガラス瓶に入れます(オートクレーブに適しています)。電子レンジで沸騰近くまで水を温めます。
- 5 gのPVA粉末を量り、水に加える。
注意: 1〜5 gのPVAのみを溶解することをお勧めします。大量に溶解すると、再構成が不完全になる可能性があります。 - 蓋をしっかり閉め、振って混ぜます。次に、蓋を緩めます。
注意: 水温の変化により圧力が変化する可能性があるため、再開するときは注意してください。 - オートクレーブして冷まします。蓋をしっかり閉め、振って混ぜます。滅菌チューブにアリコートを入れ、4°Cで最大3ヶ月間保存します。
- 凍結乾燥サイトカインを1 mg/mL PVAを含むF-12培地に溶解します。幹細胞因子を10 μg/mLに、トロンボポエチンを100 μg/mLに再構成して、1:1,000のストックを生成します。滅菌チューブにアリコートを入れ、-80°Cで長期保存します。 または、アリコートを4°Cで最大1週間保存します。
注:マウスHSCの増殖に悪影響を与えるため、ウシ血清アルブミン中のサイトカインの再構成は避けてください。
2. HSC骨髄抽出とc-Kit+ エンリッチメント
- 安楽死させたばかりの8〜12週齢のC57BL / 6マウスから大腿骨、脛骨、骨盤、および脊椎を解剖し(CO2窒息および/または頸椎脱臼を介して)、骨を氷上のPBSに置きます。
注意: 表面とツールが70%エタノールで滅菌されていることを確認してください。 - 糸くずの出ない繊細なタスクワイプを使用して骨をきれいにし、筋肉と脊髄を取り除き、~3mLのPBSを乳鉢に加えます。
注意: 乳棒と乳鉢が70%エタノールで滅菌されていることを確認してから、PBSで一度洗い流してください。 - せん断力を最小限に抑えるために、粉砕せずに乳棒で骨を粉砕します。5 mLシリンジに取り付けられた19 G針を使用して、PBSに放出された大きな骨髄断片を分解します。細胞懸濁液を70 μmフィルターを通して50 mLコニカルチューブに移します。
- 懸濁液が移されたら、骨が漂白され、骨髄が見えなくなるまで、新鮮なPBSで繰り返します。マウスあたり~30 mL、2匹のマウスで~50 mLのエンドボリュームを目指します。
- 骨髄細胞を混合し、10 μLの細胞を収集し、血球計算盤で1:10〜1:20の希釈でTürksの溶液を使用してカウントします。
注:1匹のマウスは、2〜5×108 個の全骨髄細胞を生成すると予想されます。 - 450 × g で4°Cで5分間スピンし、上清を捨て、ペレットを冷たいPBS(1匹のマウスで350 μL、2匹のマウスで500 μL)に再懸濁します。
- 1,000万細胞あたり0.2 μLのアロフィコシアニン(APC)抗c-Kit抗体を添加し、4°Cの暗所で30分間インキュベートします。
- インキュベートした細胞に5 mLのコールドPBSを加えて余分な抗体を洗い流し、50 μmのフィルターを通して新しい15 mLコニカルチューブにろ過します。
- 元のチューブを7 mLの冷たいPBSで洗浄し、フィルターを通過させます。フィルターの目詰まりが発生した場合は、P1000チップでフィルター表面を傷つけてください。
- 450 × g で4°Cで5分間スピンし、上清を捨て、ペレットを冷たいPBS(1匹のマウスで350 μL、または2匹のマウスで500 μL)に再懸濁します。
- 1,000万細胞あたり0.2 μLの抗APCマイクロビーズを添加し、4°Cの暗所で15分間インキュベートします。 12 mLの滅菌PBSを加えて、余分なマイクロビーズを洗い流します。
- 細胞を450 × g で4°Cで5分間スピンダウンし、2 mLのコールドPBSに再懸濁します。このステップでセルが回転している間に、ステップ2.13に進みます。
- 磁気ろ過カラムを磁気カラムセパレーターの磁石に配置し、上部に50 μmフィルター、下部に15 mLコニカルチューブを配置して、カラム濃縮の準備をします。
- 3 mLの滅菌PBSを50 μmのフィルターとろ過カラムに通します。PBSが通過したら、細胞懸濁液をカラムに通し、毎回3 mLの冷たいPBSを3回洗浄します。洗浄ごとに、カラムの滴下が止まるのを待ってから、次の洗浄を追加します。
- カラムをマグネットから取り外し、新しい15 mLチューブの上に置きます。5 mLのコールドPBSを加え、カラムプランジャーをカラムに取り付け、プランジャーを押して細胞を溶出します。
- c-Kit濃縮細胞を混合し、10 μLの細胞を収集し、Türksの溶液を血球計算盤で1:2の希釈でカウントします。1匹のマウスからの典型的な収量は、2〜5×106 c-Kit+ 細胞です。
注:この時点で、細胞をHSC培地に直接播種するか、HSC蛍光活性化セルソーティング(FACS)精製用に調製することができます。
3. c-Kit濃縮HSPCによる細胞培養の開始
- 必要な細胞/ウェル数に合わせて新鮮な培地(表1)を準備します。c-Kit濃縮HSPC用にmLあたり0.5〜100万個の細胞を播種します。
- c-Kit濃縮細胞をスピンダウンし、目的の細胞密度でHSC培地に再懸濁します。
- 細胞をフィブロネクチンコーティングまたはネガティブ表面荷電プレートに、96ウェルプレートあたり200 μLまたは24ウェルプレートあたり1 mLで移します。
- 細胞を37°Cおよび5%CO2に設定された組織培養インキュベーターに入れる。
4. FACS精製造血幹細胞による細胞培養の開始
- 適量のビオチン化系統抗体染色剤を調製する:1000万細胞あたり3μLのマスターミックス(表2)をPBSで1:100に希釈する。
- c-Kit濃縮細胞をスピンダウンし、4°Cで30分間、系統抗体染色剤に再懸濁します。
- 10 mLの滅菌PBSで洗浄し、450 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。
- 適切な量の新鮮なHSC抗体染色剤(表3)を調製する:1000万細胞あたり300μL。このサンプル染色と並行して、補正とゲーティングのために適切な染色コントロールサンプルを準備します。
注:色素結合抗体を使用する場合は、ライトをオフにして組織培養フード内で作業してください。 - 細胞をHSC抗体染色剤に再懸濁し、4°Cで90分間インキュベートします。細胞のペレット化を防ぐために、タップして20〜30分ごとに細胞を混合します。
- 10 mLの滅菌PBSで洗浄し、450 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。
- 上清を吸引し、ペレットをフリックして破砕し、0.5 μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)を含む滅菌PBSに再懸濁します。
- 必要なウェル数分の新しい培地(表1)を調製し、フィブロネクチンまたは負の表面荷電プレート(96ウェルプレートあたり200 μLまたは24ウェルプレートあたり1 mL)にプレートします。
- FACSマシンをソーティング用に準備し、CD150+CD34-c-Kit+Sca1+系統-HSCを培地含有ウェルに直接ソーティングします(ここで使用する標準的なFACSゲーティング戦略については、図1を参照してください)。96ウェルプレートウェルあたり最大200セル、または24ウェルプレートウェルあたり最大1,000セルをソーティングできます。
注意: FACSマシンは、訓練を受けた科学者が操作する必要があります。マウスHSCのFACS分離の経験がない場合は、最寄りのFACS施設に連絡して、このソーティング戦略について話し合うことをお勧めします。
5. メディア変更の実行
- c-Kit濃縮細胞から開始した細胞培養の場合は、2日後に培地交換を開始します。FACS単離された造血幹細胞から開始された細胞培養の場合は、5日後に培地交換を開始します。
- すべてのウェルに十分な新鮮な予温(~37°C)HSC培地(表1)を準備します。
- プレートを組織培養インキュベーターからそっと取り外します。
注:負の表面帯電プレート上のHSPCはフィブロネクチン上のHSPCよりも乱されやすいため、負の表面帯電プレート上の培地を交換するときは、細胞培養を乱さないように特に注意する必要があります。 - ピペットまたは真空ポンプを使用して、ウェルメニスカスから培地の~90%-95%をゆっくりと除去します。
注:ウェルのベースから培地を引き出さないでください、さもなければ多くの細胞が取り除かれます。 - 200 μL(96ウェルプレートの場合は1 mL)、新鮮な培地をウェルに加えます。
- プレートを組織培養インキュベーターに戻します。
- 実験の終了点まで、5.1〜5.6日ごとに手順2〜3を繰り返します。
- c-Kit濃縮HSPCで開始した細胞培養(セクション3)では、~3週間後に培養液を1:2-1:3の比率で分割します。FACS精製造血幹細胞で開始した細胞培養(セクション4)では、~3週間後、培養物が>90%コンフルエントになった時点で、培養物を1:2-1:3の比率で分割します。
注:正確なタイムラインは、実験の関心によって異なります。これらの培養物は4〜8週間特徴付けられています8、しかし、追加の培養長は可能かもしれません。
6. エレクトロポレーション培養HSPC
注:このプロトコルは、Cas9 / sgRNAリボ核タンパク質(RNP)のエレクトロポレーション用ですが、mRNAまたは他の組換えタンパク質のエレクトロポレーションにも適用できます。目的の実験時点でこれを実行するために、十分な数の細胞で培養を開始します。
- セクション5で説明されているように、エレクトロポレーションの1日前に培地交換を実行します。
注:エレクトロポレーションの前に、少なくとも一晩培養することをお勧めします。ただし、細胞は通常、形質導入の前に1〜3週間培養されます。 - エレクトロポレーション当日、ヌクレオフェクターを設置します。マシンの電源を入れます。タッチスクリーンで、 X モジュールを選択してから、使用する キュベットサイズ を選択します。
- エレクトロポレーションのスケール(キュベットあたり100 μLまたはマイクロキュベットあたり20 μL)に十分なP3溶液を(製造元の指示に従って)調製し、室温に平衡化させます。
- 播種するウェル数に対して十分な新鮮な培地(表1)を準備し、24ウェルプレートウェル用に500 μLの培地を、96ウェルプレートウェルに100 μLの培地を追加します。
- sgRNA(RNaseフリー水で2 μg/mLに希釈済み)を氷上で解凍し、滅菌PCRチューブ内で16 μgのsgRNAと30 μgのCas9酵素(10 μg/mL)を混合します。コントロールとしてCas9タンパク質のみを含む追加のPCRチューブを含めます。チューブをフリックして混合し、次に短く回転させます。サーモサイクラーで25°Cで10分間インキュベートしてRNPを複雑にした後、チューブを氷上に保ちます。
注:マイクロキュベットでエレクトロポレーションを行う場合、これは5倍に縮小できます。 - エレクトロポレーション用のHSPCを混合してチューブに移します。10 μLの細胞を収集し、血球計算盤で1:2の希釈でTürksの溶液を使用してカウントします。
注:100 μLキュベットあたり1〜500万個の細胞をエレクトロポレーションすることをお勧めします(マイクロキュベットの場合は5倍に縮小)。 - 1.5 mLチューブで450 × g 、4°Cで5分間、適切な数のセルをスピンダウンします。 できるだけ多くの上清を吸引し、100 μLのヌクレオフェクションバッファーで再懸濁します。
- 細胞懸濁液を複合RNPとピペットを含むPCRチューブに直ちに移し、ゆっくりと混合し、100 μLのエレクトロポレーションキュベットに移します。混合物をゆっくりと1回の流体運動でキュベットに排出し、キュベット内の気泡の形成を回避します。
- エレクトロポレーターで、エレクトロポレーションするウェルの位置を選択します。タッチスクリーンを使用して、細胞タイプ プログラムCD34+、 ヒトを選択するか、パルスコード EO100を入力します。 OK ボタンを押します。
- キュベットをエレクトロポレーターに移します。タッチスクリーンの スタート ボタンを押して、エレクトロポレーションを開始します。エレクトロポレーションの直後に、500 μLの培養液をキュベットに加えます(マイクロキュベットを使用する場合は100 μL)。
- 細胞を準備したプレートに静かに移し、組織培養インキュベーターに戻します。
- AAV6ドナーテンプレートを使用する手順では、細胞をフィブロネクチンコーティングプレートに5,000ベクター/細胞の濃度で転写した直後にベクターを追加します。
- 6〜18時間後、新しい培地を準備し、セクション5に記載されているように培地交換を実行します。この培地交換では、培地の80%〜90%のみを除去します。
注意: ウェルの底から培地を引き上げることは避けてください。 - 2日以上経過した時点でフローサイトメトリーで細胞を分析します(詳細はセクション8を参照)。
- 実験の終点に達するまで、セクション5で説明されているように、2日ごとに培地交換を実行し続けます。
注:この方法を使用したCRISPR/Cas9の編集速度は、設計されたsgRNAのターゲティング効率に大きく依存します。最大95%の編集率が効率的なガイド15で観察されています。sgRNA設計のガイドラインは、以前に他の場所で詳述されている19,20。
7. レンチウイルスベクターによる培養造血幹細胞の形質導入
注:十分な数の細胞で培養を開始し、目的の実験時点でこれを実行します。
- レンチウイルスベクターの生成と力価(実験目標による)。レンチウイルスベクターを氷上で解凍します。
- 中程度の変更を実行します(セクション5のように)。次に、形質導入用のHSPCを混合してチューブに移します。10 μLの細胞を収集し、血球計算盤で1:2の希釈でTürksの溶液を使用してカウントします。
注:細胞はメッキ直後に形質導入することができます。ただし、細胞は通常、形質導入の前に1〜3週間培養されます。 - 形質導入に必要な量の細胞を再プレートします(通常、96ウェルプレートあたり100,000細胞)。別に、形質導入されていないネガティブコントロール細胞をプレート化する。
注:負の表面帯電プレートを使用する場合は、レンチウイルスベクター形質導入のために細胞をフィブロネクチンコーティングプレートに移します。 - レンチウイルスベクターを細胞の各ウェルに添加:細胞あたり20の形質導入ユニットを追加して、~30%の形質導入効率を達成します。ただし、実験要件に応じて、レンチウイルスベクターの用量を経験的に決定します。
注:レンチウイルスベクターが施設のガイドラインに従って廃棄されていることを確認してください。 - 細胞を組織培養インキュベーターに6時間戻す。その後、セクション5の説明に従って培地交換を実行します。
注:上清には生きたウイルスが含まれています。機関のガイドラインに従って廃棄してください。 - 2日以上後にフローサイトメトリー(例えば、GFP発現)によって細胞を分析する。詳細については、セクション 8 を参照してください。
- 実験の終点に達するまで、セクション5で説明されているように、2日ごとに培地交換を実行し続けます。
8. HSPC培養物のフローサイトメトリー解析
- 2%FBSを含むPBS中で濃縮培養 したエクスビボ HSC抗体ミックスを調製する(表4)。混合物を暗所で4°Cで最大1か月間保管します。
注:色素標識抗体を使用する場合は、ライトをオフにして組織培養フードで作業してください。 - 2 μLの濃縮抗体ミックスを50 μLの細胞に加えます。暗所で4°Cで30分間インキュベートします。このサンプル染色と並行して、補正とゲーティングのために適切な染色コントロールサンプルを準備します。
- 2% FBSを含むPBSを200〜1,000 μL加え、450 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 できるだけ多くの上清を除去し、2%FBSおよび0.5 μg/mL PIを含む100〜500 μLのPBSに再懸濁します。
- フローサイトメーターをセットアップし、サンプルあたり少なくとも10,000の生細胞を記録します。
注意: フローサイトメーターは、訓練を受けた科学者が操作する必要があります。フローサイトメトリーの経験がない場合は、最寄りのFACS施設に連絡して、この分析について話し合う必要があります。 - データをFCS形式でエクスポートし、適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを解析します。ここで使用する標準のゲーティング戦略については、 図 2 を参照してください。
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Representative Results
造血幹細胞のFACS精製では、c-Kitが豊富な骨髄内で、細胞の~0.2%が若い(8-12週齢)C57BL/6マウスのCD150+CD34-c-Kit+Sca1+系統集団であると予想しています(図1)。ただし、トランスジェニックマウスまたは異なる年齢のマウスは、異なるHSC頻度を示す可能性があります。4週間の培養後、CD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統画分は~10%になると予想しています(図2)。これらの結果は、c-Kit濃縮骨髄またはFACS精製HSCから開始された細胞培養についても同様である。GFP発現レンチウイルスベクター(20形質導入単位/細胞)による形質導入後、~30%のGFP+細胞が期待されます(図3)。
コンフルエントの場合、培養液は~200万細胞/mLになると予想しています。培養内では、主に小さな丸い細胞が見られると予想されますが、より大きな丸い(巨核球のような)細胞の頻度は小さいのが普通です。c-Kit濃縮骨髄から開始された細胞培養内では、いくつかの初期細胞死が予想される14。最初の培地交換が行われる前の最初の24〜48時間以内に約50%の細胞死が予想されます。.これらの培養物における初期の死細胞破片は、c-Kit濃縮ステップがそのような骨片を枯渇させるはずであるため、骨破片(粉砕された骨から)ではなく培養物内の細胞死に由来する可能性が高い。しかしながら、細胞数は、1週間後に播種された細胞数の80%〜100%に戻る(予想される細胞密度値については 表5 を参照されたい)。悪い結果が見られる場合は、プロトコルのトラブルシューティングをお勧めします(表6)。この場合、c-Kit濃縮骨髄プロトコル(セクション3)を使用して試薬をバッチテストするのが最も簡単で、FACSソーティングに関連する合併症を回避できます。代表的な結果は、 材料表に詳述されている試薬および機器の使用に基づいていることに注意してください。異なるベンダーの試薬を使用しても同様の結果が得られる可能性がありますが、新しい試薬の検証(および滴定)が必要になる可能性があります。
図1:c-Kit濃縮骨髄からの造血幹細胞のFACS精製のためのゲーティング戦略。c-Kitが豊富な骨髄からCD150 + CD34-c-Kit+ Sca1 +系統細胞を同定するために使用されるシーケンシャルゲーティング。略語:FACS =蛍光活性化細胞選別;造血幹細胞=造血幹細胞;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;FSC-W = 前方散乱ピーク幅;FSC-H = 前方散乱ピークの高さ;SSC-H = 側方散乱ピークの高さ;PI = ヨウ化プロピジウム;PE =フィコエリスリン;APC =アロフィコシアニン;FITC=フルオレセインイソチオシアネート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:培養HSPCのフローサイトメトリー解析のためのゲーティング戦略。HSPC培養物からCD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統細胞を同定するために使用されるシーケンシャルゲーティング。略語:HSPC =造血幹および前駆細胞;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;FSC-W = 前方散乱ピーク幅;FSC-H = 前方散乱ピークの高さ;SSC-H = 側方散乱ピークの高さ;PI = ヨウ化プロピジウム;PE =フィコエリスリン;APC =アロフィコシアニン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:レンチウイルスベクター形質導入の代表的な結果。 代表的な 形質導入後48時間でGFP発現レンチウイルスベクター(20形質導入ユニット/細胞)によるHSPC形質導入培養後。略語:GFP =緑色蛍光タンパク質;HSPC =造血幹および前駆細胞。FSC-H = 前方散乱ピークの高さ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | F-12の最終濃度 | 容量(μL) |
| ハムのF-12ミディアム | 該当なし | 958 |
| 100x ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン | 1倍速 | 10 |
| 1 M ヘペス | 10ミリメートル | 10 |
| 100 mg/mL PVA ストック | 1ミリグラム/ミリリットル | 10 |
| 100倍速 ITSX | 1倍速 | 10 |
| 100 μg/mL TPO ストック | 100 ng/mL | 1 |
| 10 μg/mL SCF ストック | 10 ng/mL | 1 |
表1:HSC培地組成。 1 mLの完全培地に対する培地試薬容量。略語:PVA =ポリビニルアルコール;SCF =幹細胞因子;TPO =トロンボポエチン;ITSX = インスリン - トランスフェリン - セレン - エタノールアミン。
| 抗体 | 濃度 (μg/mL) | 容量(μL) |
| Ly6G/Ly6C – ビオチン | 0.5 | 100 |
| Ter119 – ビオチン | 0.5 | 100 |
| CD4 – ビオチン | 0.5 | 25 |
| CD8a – ビオチン | 0.5 | 25 |
| CD45R – ビオチン | 0.5 | 50 |
| CD127 – ビオチン | 0.5 | 50 |
| 滅菌PBS | 該当なし | 350 |
表2:ビオチン化抗体カクテル。 ビオチン抗体カクテルのストックに対する抗体量。
| 抗体 | 濃度(ミリグラム/ミリリットル) | 容量(μL) |
| CD34 フィット | 0.5 | 4 |
| c-キット APC | 0.2 | 1 |
| スカ1 PE | 0.2 | 1 |
| ストレプトアビジンAPC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| 滅菌PBS | 該当なし | 291 |
表3:新鮮なHSC抗体カクテル。 新鮮なHSC抗体カクテルの抗体量。略語:PE =フィコエリスリン;APC =アロフィコシアニン;FITC=フルオレセインイソチオシアネート。
| 抗体 | 濃度(ミリグラム/ミリリットル) | 容量(μL) |
| Cキット BV421 | 0.2 | 12.5 |
| スカ1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| 滅菌PBS | 該当なし | 27.5 |
表4:培養HSC抗体カクテル(100倍)。 培養HSC抗体カクテルのストック100倍に対する抗体量。略語:PE =フィコエリスリン;APC =アロフィコシアニン;FITC=フルオレセインイソチオシアネート。
| 文化 | 24〜48時間での細胞密度 | 24-48時間で%KSL | 1週間での細胞密度 | 1週間でKSLの割合 |
| フレッシュc-Kit + 骨髄メッキ | 0.5x106 mL-1 | 25-35% | 1-2x106 mL-1 | 50-60% |
| HSPCエレクトロポレーション | 0.5x106 mL-1 | 25-35% | 0.5-1.5x106 mL-1 | 25-35% |
| HSPCレンチウイルス | 1.5x106 mL-1 | 20-25% | 1-2x106 mL-1 | 45-55% |
表 5: 期待される結果。(1)c-Kit+骨髄の播種、(2)エレクトロポレーション、および(3)1×106細胞mL-1での播種に基づくレンチウイルスベクター形質導入後のc-Kit+Sca1+系統細胞の予想される細胞密度と頻度。略語: KSL = c-キット+スカ1+系統-;HSPC =造血幹および前駆細胞。
| 発行 | 考えられる原因 | ソリューション | |||
| LSカラムの流速は異常に遅い。 | LS カラムが詰まっています。 | マグネットからカラムを取り外します。プランジャーを使用して細胞懸濁液を溶出し、さらに5 mLのPBSで繰り返します。新しいカラムと新しいフィルターでカラム濃縮を繰り返します。 | |||
| 培養後7日以内の大量の細胞死 | 期限切れの試薬または誤った比率の試薬を使用する。 | 摂政が適切な濃度にあり、正しく保管されていることを確認してください。 | |||
| 不正確なインキュベーター温度。 | インキュベーターの定期的な整備とインキュベーターができるだけ閉じたままになっていることを確認する。 | ||||
| 培養7日後に文化崩壊 | 間違ったセルタイプがソートされています | 選別プロトコルについては、HSC FACSの専門家にアドバイスを求めてください。c-Kit濃縮骨髄で試薬を検証します。 | |||
| 不完全なメディア変更が実行されている | より完全なメディア変更を実行します。 | ||||
| 過剰(例えば、形質導入後の>50%)の全体的な細胞死 | レンチウイルスベクター毒性。 | 使用するウイルス粒子の量を減らします。 | |||
| インキュベーション時間を5時間に短縮します。 | |||||
| トランスフェクション後の過剰(例:>50%)の全体的な細胞死 | P3溶液に残された細胞が長すぎる | できるだけ早く培地中の細胞を回収し、一度に2つのサンプルのみをエレクトロポレーションし、ピペッティング時には穏やかにしてください(そしてワイドボアピペットチップを使用してください)。 | |||
| ピペッティングはあまりにも激しく細胞を殺します | |||||
| 低いトランスフェクション効率 | RNPおよび/またはCas9酵素の分解。 | 不適切な保存、Cas9を-20°Cで保存し、RNAを-80°Cで保存します(RNaseフリー水で再構成)。 | |||
| 低い形質導入効率 | 低レンチウイルスベクター活性 | 特定の細胞集団に対してレンチウイルスベクターを滴定し、レンチウイルスベクターの凍結/融解を避けます | |||
表 6: 一般的なトラブルシューティングの問題 一般的な問題の概要と推奨されるトラブルシューティング。
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Discussion
このプロトコルが、HSC生物学、造血、および血液学をより一般的に調査するための有用なアプローチを提供することを願っています。FACS精製HSCs8のPVAベースの培養法の最初の開発以来、この方法は拡張されてきた。例えば、この方法は、骨髄および負の表面荷電プレート14で富化されたc−Kitで機能することが示されている。形質導入およびエレクトロポレーションとの適合性も実証されている14,15。これらのHSCおよびc-Kit+ HSPC培養物のin vivo検証はこれらの出版物に記載されていますが、読者はin vivo移植プロトコルに関する他の公開プロトコルを参照できます21。移植後の新鮮なHSPCと培養されたHSPCの間で系統キメラに大きな違いは見られませんが、ex vivo拡張後の個々のHSCの再構成効力はまだ詳細に決定されていません。このアプローチによって生成された多数のHSCは、多数の細胞数を必要とする分子または生化学的アッセイを使用してHSCを調べる新しい方法を開きます。さらに、これらの培養系内で遺伝子組み換え造血幹細胞を作製できることで、造血幹細胞の活性や造血系を制御するメカニズムをさらに解明できるはずです。例えば、これらのシステムは、遺伝子スクリーニング16を実行するのに適している。
機構的には、PVAや他のポリマーが血清アルブミンに取って代わり、効率的なHSC増殖をサポートできる理由はまだ完全には理解されていません。本発明者らは、PVAが培地内のサイトカインを安定化させることによって血清アルブミンを少なくとも部分的に置換すると考える9。さらに、血清アルブミン製品に見られる明確に定義されていない生理活性汚染物質の欠如は、HSC分化を減少させるようです。合成ポリマーの使用は、幹細胞幹細胞をex vivoで研究する際に、これらの生理活性汚染物質に関連するバッチ間の変動性および交絡効果を減らすのにも役立つはずです22。また、特定のポリマーが生体外でのHSCをより適切にサポートする理由についても、さらに学ぶ必要があります。
すでに強力ですが、これらの培養プロトコルのさらなる最適化と特性評価は可能であるはずです。特に、これらの培養物内の造血幹細胞の純度を向上させることは有用であろう。長期のHSCコンパートメントをこれらの培養物と区別する追加のマーカーも、これらの細胞型を追跡および分離するのに役立ちます。また、このシステムが、in vivo移植アッセイを必要とせずに、ex vivoでHSC活性を定量するために最終的に使用できるかどうかも興味深い。また、HSCをex vivoで拡張できる期間はまだわかっていませんが、適切に維持されれば6〜8週間より長くなることは確かです8。最後に、これらの培養はマウス造血幹細胞を研究するための有用なモデルを提供しますが、ヒト造血幹細胞生物学と造血を研究するためのより扱いやすいシステムを提供し、最終的には臨床幹細胞移植療法のための造血幹細胞を生成するために、ヒト造血幹細胞と同等の培養システムを開発することも重要です。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
フローサイトメトリーへのアクセスを提供してくれたWIMMフローサイトメトリーコアと、レンチウイルスベクターの生成にWIMMウイルススクリーニングコアに感謝します。この研究は、Kay Kendall Leukaemia FundとUK Medical Research Councilによって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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