Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het initiëren, onderhouden en analyseren van hematopoëtische stamcelculturen van muizen met behulp van ex vivo polyvinylalcoholgebaseerde expansie, evenals methoden om ze genetisch te manipuleren door lentivirale transductie en elektroporatie.
Abstract
Zelfvernieuwende multipotente hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn een belangrijk celtype vanwege hun vermogen om hematopoëse gedurende het hele leven te ondersteunen en het hele bloedsysteem na transplantatie te reconstrueren. HSC's worden klinisch gebruikt in stamceltransplantatietherapieën, die een curatieve behandeling voor een reeks bloedziekten vertegenwoordigen. Er is veel belangstelling voor zowel het begrijpen van de mechanismen die HSC-activiteit en hematopoëse reguleren, als het ontwikkelen van nieuwe HSC-gebaseerde therapieën. De stabiele kweek en uitbreiding van HSC's ex vivo is echter een belangrijke barrière geweest bij het bestuderen van deze stamcellen in een handelbaar ex vivo systeem. We hebben onlangs een op polyvinylalcohol gebaseerd kweeksysteem ontwikkeld dat de langdurige en grootschalige uitbreiding van transplanteerbare HSC's van muizen en methoden om ze genetisch te bewerken kan ondersteunen. Dit protocol beschrijft methoden om HSC's van muizen te kweken en genetisch te manipuleren via elektroporatie en lentivirale transductie. Dit protocol zal naar verwachting nuttig zijn voor een breed scala aan experimentele hematologen die geïnteresseerd zijn in HSC-biologie en hematopoiese.
Introduction
Het hematopoietische systeem ondersteunt een reeks essentiële processen bij zoogdieren, van zuurstoftoevoer tot het bestrijden van ziekteverwekkers, via gespecialiseerde bloed- en immuunceltypen. Continue bloedproductie (hematopoiese) is nodig ter ondersteuning van de homeostase van het bloedsysteem, die wordt ondersteund door hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's)1. De meest primitieve hematopoëtische cel is de hematopoietische stamcel (HSC), die unieke capaciteiten heeft voor zelfvernieuwing en multilineage differentiatie 2,3. Dit is een zeldzame celpopulatie, voornamelijk te vinden in het volwassen beenmerg4, waar ze voorkomen met een frequentie van slechts ongeveer één per 30.000 cellen. Van HSC's wordt gedacht dat ze levenslange hematopoiese ondersteunen en helpen om hematopoiese te herstellen na hematologische stress. Deze capaciteiten stellen HSC's ook in staat om het gehele hematopoietische systeem stabiel te reconstrueren na transplantatie in een bestraalde ontvanger5. Dit vertegenwoordigt de functionele definitie van een HSC en vormt ook de wetenschappelijke basis voor HSC-transplantatietherapie, een curatieve behandeling voor een reeks bloed- en immuunziekten6. Om deze redenen zijn HSC's een belangrijk aandachtspunt van de experimentele hematologie.
Ondanks een grote focus van onderzoek, is het een uitdaging gebleven om HSC's ex vivo7 stabiel uit te breiden. We hebben onlangs het eerste langdurige ex vivo expansiecultuursysteem voor muis HSCs8 ontwikkeld. De aanpak kan transplanteerbare HSC's 234-899-voudig uitbreiden over een cultuur van 4 weken. In vergelijking met alternatieve benaderingen was de belangrijkste verandering in het protocol de verwijdering van serumalbumine en de vervanging ervan door een synthetisch polymeer. Polyvinylalcohol (PVA) werd geïdentificeerd als een optimaal polymeer voor de HSC-culturen van de muis8, die nu ook is gebruikt om andere hematopoëtische celtypen9 te kweken. Een ander polymeer genaamd Soluplus (een polyvinylcaprolactam-acetaat-polyethyleenglycol-transplantaatcopolymeer) is echter onlangs ook geïdentificeerd, wat de klonale HSC-expansie lijkt te verbeteren10. Voorafgaand aan het gebruik van polymeren werden serumalbumine in de vorm van foetaal runderserum, runderserumalbuminefractie V of recombinant serumalbumine gebruikt, maar deze hadden beperkte ondersteuning voor HSC-expansie en ondersteunden alleen kortdurende (~ 1 week) ex vivo cultuur7. Er moet echter worden opgemerkt dat HSC-cultuurprotocollen die HSC's in een rustige toestand houden, een langere ex vivo cultuurtijd11,12 kunnen ondersteunen.
In vergelijking met andere kweekmethoden is een groot voordeel van PVA-gebaseerde culturen het aantal cellen dat kan worden gegenereerd en de tijdsduur dat het protocol kan worden gebruikt om HSC's ex vivo te volgen. Dit overwint verschillende barrières op het gebied van experimentele hematologie, zoals het lage aantal HSC's dat per muis kan worden geïsoleerd (slechts een paar duizend) en de moeilijkheid om HSC's in de loop van de tijd in vivo te volgen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat deze culturen HSC-proliferatie stimuleren, terwijl de in vivo HSC-pool overwegend rustig is bij een steady state13. Bovendien, hoewel de culturen selectief zijn voor HSC's, hopen extra celtypen zich in de loop van de tijd op met de culturen, en transplanteerbare HSC's vertegenwoordigen slechts ongeveer één op de 34 cellen na 1 maand. Myeloïde hematopoëtische voorlopercellen lijken het belangrijkste verontreinigende celtype te zijn in deze HSC-culturen8. Niettemin kunnen we deze culturen gebruiken om te verrijken voor HSC's uit heterogene celpopulaties (bijv. c-Kit + beenmerg HSPC's14). Het ondersteunt ook transductie of elektroporatie van HSC's voor genetische manipulatie14,15,16. Om HSC's uit de heterogene gekweekte HSPC-populatie te helpen identificeren, is CD201 (EPCR) onlangs geïdentificeerd als een nuttige ex vivo HSC-marker 10,17,18, met transplanteerbare HSC's beperkt tot de CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-fractie.
Dit protocol beschrijft methoden voor het initiëren, onderhouden en beoordelen van op PVA gebaseerde HSC-expansieculturen van muizen, evenals protocollen voor genetische manipulatie binnen deze culturen met behulp van elektroporatie of lentivirale vectortransductie. Deze methoden zullen naar verwachting nuttig zijn voor een reeks experimentele hematologen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures, inclusief fokken en euthanasie, moeten worden uitgevoerd binnen institutionele en nationale richtlijnen. De hieronder beschreven experimenten werden goedgekeurd door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken. Zie de Tabel met materialen voor een lijst van alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorraadoplossingen voorbereiden
- PVA stock oplossing
- Neem 50 ml water van weefselkweekkwaliteit in een kleine glazen fles (geschikt voor autoclaveren). Verwarm het water tot bijna kokend in een magnetron.
- Weeg 5 g PVA-poeder af en voeg toe aan het water.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om slechts 1-5 g PVA op te lossen. Het oplossen van grotere hoeveelheden kan leiden tot onvolledige reconstitutie. - Sluit het deksel goed en schud om te mengen. Maak vervolgens het deksel los.
OPMERKING: Wees voorzichtig bij het heropenen, omdat de druk kan veranderen als gevolg van de veranderende watertemperatuur. - Autoclaaf en laat afkoelen. Sluit het deksel goed en schud om te mengen. Maak aliquots in steriele tubes en bewaar ze maximaal 3 maanden bij 4 °C.
- Los gelyofiliseerde cytokines op in F-12 medium dat 1 mg/ml PVA bevat. Reconstitueer de stamcelfactor tot 10 μg/ml en trombopoietine tot 100 μg/ml om 1:1.000 voorraden te genereren. Maak aliquots in steriele buisjes en bewaar ze langdurig bij -80 °C. U kunt de aliquots ook maximaal 1 week bij 4 °C bewaren.
OPMERKING: Vermijd de reconstitutie van cytokines in runderserumalbumine vanwege de negatieve impact op de HSC-expansie van muizen.
2. HSC beenmergextractie en c-Kit+ verrijking
- Ontleed de dijbenen, scheenbenen, bekkens en wervelkolom van vers geëuthanaseerde 8-12 weken oude C57BL / 6-muizen (via CO 2-verstikking en / of cervicale dislocatie) en plaats de botten in PBS op ijs.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de oppervlakken en gereedschappen zijn gesteriliseerd met 70% ethanol. - Reinig de botten met pluisvrije delicate taakdoekjes, verwijder spieren en ruggenmerg en voeg toe aan een vijzel met ~ 3 ml PBS.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de stamper en vijzel worden gesteriliseerd met 70% ethanol en vervolgens eenmaal worden uitgewassen met PBS. - Plet de botten met de stamper zonder te slijpen om schuifkrachten te minimaliseren. Breek grote beenmergfragmenten die in de PBS vrijkomen met behulp van een naald van 19 G die is bevestigd aan een spuit van 5 ml. Breng de celsuspensie door een filter van 70 μm over in een conische buis van 50 ml.
- Zodra de suspensie is overgebracht, herhaalt u dit met verse PBS totdat de botten zijn gebleekt en er geen merg zichtbaar is. Streef naar een eindvolume van ~30 ml per muis en ~50 ml voor twee muizen.
- Meng de beenmergcellen, verzamel 10 μL cellen en tel met behulp van Türks' oplossing in een verdunning van 1:10-1:20 met een hemocytometer.
OPMERKING: Van één muis wordt verwacht dat hij 2-5 × 108 hele beenmergcellen oplevert. - Draai gedurende 5 minuten bij 450 × g bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in koude PBS (350 μL voor één muis of 500 μL voor twee muizen).
- Voeg 0,2 μl allophycocyanine (APC) anti-c-Kit antilichaam per 10 miljoen cellen toe en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C.
- Voeg 5 ml koude PBS toe aan de geïncubeerde cellen om overtollig antilichaam af te spoelen en filtreer door een filter van 50 μm in een verse conische buis van 15 ml.
- Was de originele tube met 7 ml koude PBS en breng deze door het filter. Als er filterverstopping optreedt, krast u het filteroppervlak met een P1000-tip.
- Draai gedurende 5 minuten bij 450 × g bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in koude PBS (350 μL voor één muis of 500 μL voor twee muizen).
- Voeg 0,2 μL anti-APC microbeads per 10 miljoen cellen toe en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4 °C. Voeg 12 ml steriele PBS toe om overtollige microbeads af te wassen.
- Draai de cellen bij 450 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en resuspensie in 2 ml koude PBS. Terwijl de cellen in deze stap draaien, gaat u verder met stap 2.13.
- Bereid u voor op kolomverrijking door een magnetische filtratiekolom in de magneet van een magnetische kolomscheider te plaatsen, met een filter van 50 μm aan de bovenkant en een conische buis van 15 ml eronder.
- Laat 3 ml steriele PBS door het 50 μm filter en de filtratiekolom lopen. Zodra de PBS is doorlopen, passeert u de celsuspensie door de kolom, gevolgd door drie wasbeurten van 3 ml koude PBS elke keer. Wacht voor elke wasbeurt tot de kolom stopt met druppelen voordat u de volgende wasbeurt toevoegt.
- Verwijder de kolom van de magneet en plaats deze op een verse buis van 15 ml. Voeg 5 ml koude PBS toe, plaats de kolomzuiger op de kolom en elueer de cellen door op de zuiger te duwen.
- Meng de c-Kit-verrijkte cellen, verzamel 10 μL cellen en tel met behulp van Türks' oplossing in een verdunning van 1:2 met een hemocytometer. De typische opbrengst van één muis is 2-5 × 106 c-Kit+ cellen.
OPMERKING: Op dit punt kunnen de cellen direct in HSC-media worden gezaaid of worden voorbereid voor HSC-fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) zuivering.
3. Het initiëren van celculturen met c-kit-verrijkte HSPC's
- Bereid vers medium (tabel 1) voor het aantal benodigde cellen/putjes. Zaai 0,5-1 miljoen cellen per ml voor c-Kit-verrijkte HSPC's.
- Spin de c-Kit-verrijkte cellen af en resuspensie in HSC-medium bij de gewenste celdichtheid.
- Breng de cellen over naar fibronectine-gecoate of negatieve oppervlaktegeladen platen, bij 200 μL per 96-well plaat of 1 ml per 24-well plaat.
- Plaats de cellen in een weefselkweekincubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2.
4. Het initiëren van celculturen met FACS gezuiverde HSC's
- Bereid een geschikt volume van de gebiotinyleerde afstammingsantilichaamkleuring: 3 μL mastermix (tabel 2) per 10 miljoen cellen, verdund 1:100 in PBS.
- Spin de c-Kit-verrijkte cellen af en resuspensie in de afstammingsantilichaamvlek gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Wassen met 10 ml steriele PBS en gedurende 5 minuten bij 450 × g draaien bij 4 °C.
- Bereid een passend volume van de verse HSC-antilichaamkleuring (tabel 3): 300 μl per 10 miljoen cellen. Bereid naast deze monsterkleuring de juiste kleuringscontrolemonsters voor compensatie en gating voor.
OPMERKING: Werk in een weefselkweekkap met het licht uit bij gebruik van kleurstof-geconjugeerde antilichamen. - Resuspendeer de cellen in de HSC-antilichaamkleuring en incubeer gedurende 90 minuten bij 4 °C. Meng de cellen elke 20-30 minuten door te tikken om celpellets te voorkomen.
- Wassen met 10 ml steriele PBS en gedurende 5 minuten bij 450 × g draaien bij 4 °C.
- Zuig het supernatant op, veeg de pellet om te verstoren en resuspensie in steriele PBS met 0,5 μg / ml propidiumjodide (PI).
- Bereid vers medium (tabel 1) voor het aantal benodigde putjes en plaat in fibronectine of negatieve oppervlaktegeladen platen (200 μL per 96-well plaat of 1 ml per 24-well plaat).
- Bereid de FACS-machine voor op het sorteren en sorteer CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSC's rechtstreeks in mediabevattende putten (zie figuur 1 voor de standaard FACS-gatingstrategie die hier wordt gebruikt). Sorteer tot 200 cellen per 96-well plaat put of tot 1.000 cellen per 24-well plaat put.
OPMERKING: FACS-machines moeten worden bediend door een getrainde wetenschapper. Het wordt aanbevolen dat gebruikers contact opnemen met hun lokale FACS-faciliteit om deze sorteerstrategie te bespreken als ze geen ervaring hebben met FACS-isolatie van muis-HSC's.
5. Mediawijzigingen uitvoeren
- Voor celculturen die zijn gestart met c-Kit-verrijkte cellen, begint u na 2 dagen met mediaveranderingen. Voor celculturen die zijn geïnitieerd met FACS-geïsoleerde HSC's, begint u na 5 dagen met mediaveranderingen.
- Bereid voldoende vers voorverwarmd (~37 °C) HSC medium (tabel 1) voor alle putjes.
- Verwijder de plaat voorzichtig uit de weefselkweekincubator.
OPMERKING: Aangezien HSPC's op negatieve oppervlaktegeladen platen gemakkelijker worden verstoord dan die op fibronectine, moet extra voorzichtig worden gehandeld bij het veranderen van het medium op negatieve oppervlaktegeladen platen om te voorkomen dat de celculturen worden verstoord. - Verwijder met behulp van een pipet of vacuümpomp langzaam ~ 90% -95% van het medium uit de meniscus van de put.
OPMERKING: Vermijd het opzuigen van het medium vanaf de basis van de put, anders worden veel cellen verwijderd. - Voeg 200 μL (voor 96-well platen; 1 ml voor 24-well platen) vers medium toe aan de put.
- Breng de plaat terug naar de weefselkweekincubator.
- Herhaal stap 5.1-5.6 elke 2-3 dagen tot het experimentele eindpunt.
- Voor celculturen die zijn gestart met c-Kit-verrijkte HSPC's (sectie 3), splitst u de culturen in een verhouding van 1:2-1:3 na ~ 3 weken. Voor celculturen die zijn gestart met FACS-gezuiverde HSC's (sectie 4), splitst u de culturen in een verhouding van 1: 2-1: 3 na ~ 3 weken en wanneer de culturen >90% confluent zijn.
OPMERKING: De exacte tijdlijn is afhankelijk van de experimentele interesses. Deze culturen zijn gekarakteriseerd voor 4-8 weken8, maar extra kweeklengtes kunnen mogelijk zijn.
6. Elektropoleren van gekweekte HSPC's
OPMERKING: Dit protocol is voor elektroporatie van Cas9/sgRNA ribonucleoproteïne (RNP), maar kan worden aangepast voor elektroporatie van mRNA of andere recombinante eiwitten. Initieer culturen met voldoende aantallen cellen om dit op het gewenste experimentele tijdstip uit te voeren.
- Voer 1 dag voor elektroporatie een mediumwissel uit, zoals beschreven in rubriek 5.
OPMERKING: Een minimum van een nachtelijke cultuur vóór elektroporatie wordt aanbevolen. Cellen worden echter meestal 1-3 weken vóór transductie gekweekt. - Stel op de dag van elektroporatie de nucleofector in. Schakel het apparaat in. Selecteer op het touchscreen de X-module en vervolgens de gebruikte cuvetmaat .
- Bereid voldoende P3-oplossing (volgens de instructies van de fabrikant) voor de schaal van de elektroporatie (100 μL per cuvette of 20 μL per microcuvet) en laat balanceren tot kamertemperatuur.
- Bereid voldoende vers medium (tabel 1) voor het aantal putjes dat wordt verguld en voeg 500 μL medium voor een 24-well plaatput of 100 μL media toe aan een 96-well plaatput.
- Ontdooi sgRNA (voorverdund tot 2 μg/ml in RNase-vrij water) op ijs en meng 16 μg sgRNA met 30 μg Cas9-enzym (bij 10 μg/ml) in een steriele PCR-buis. Voeg een extra PCR-buis toe met alleen Cas9-eiwit als controle. Meng door met de buis te vegen en draai vervolgens kort naar beneden. Incubeer bij 25 °C gedurende 10 minuten in een thermocycler om de RNP te complexeren en houd de buizen vervolgens op ijs.
OPMERKING: Dit kan vervijfvoudigd worden als elektroporatie in microcuvetten wordt uitgevoerd. - Meng en breng de HSPC's voor elektroporatie over in een buis; verzamel 10 μL van de cellen en tel met behulp van de oplossing van Türks in een verdunning van 1:2 met een hemocytometer.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 1-5 miljoen cellen per 100 μL cuvet te elektroporeren (vervijfvoudigd voor de microcuvet). - Draai het juiste aantal cellen in een buis van 1,5 ml bij 450 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig zoveel mogelijk van het supernatant op en resuspendien met 100 μL nucleofectiebuffer.
- Breng de celsuspensie onmiddellijk over in de PCR-buis met de gecomplexeerde RNP en pipet langzaam op en neer om voorzichtig te mengen en over te brengen naar een elektroporatiecuvet van 100 μL. Werp het mengsel langzaam en in één vloeiende beweging in de cuvette om de vorming van luchtbellen in de cuvette te voorkomen.
- Selecteer op de elektroporator de positie van de putten die worden geëlektroporeerd. Selecteer op het touchscreen het celtypeprogramma CD34+, mens of typ de pulscode EO100 in. Druk op de knop OK .
- Breng de cuvetten over naar de elektroporator. Druk op de Start-knop op het touchscreen om de elektroporatie te starten. Voeg direct na elektroporatie 500 μL van het kweekmedium toe aan de cuvette (100 μL bij gebruik van een microcuvet).
- Breng de cellen voorzichtig over naar de voorbereide plaat en keer terug naar de weefselkweekincubator.
- Voor procedures waarbij een AAV6-donorsjabloon wordt gebruikt, voegt u de vector toe onmiddellijk nadat de cellen zijn overgebracht naar een met fibronectine gecoate plaat in een concentratie van 5.000 vectoren / cel.
- Bereid na 6-18 uur vers medium en voer een mediumwissel uit zoals beschreven in rubriek 5. Verwijder voor deze mediumverandering slechts 80% -90% van het medium.
OPMERKING: Vermijd het optrekken van het medium vanaf de basis van de put. - Analyseer de cellen door middel van flowcytometrie na 2 of meer dagen (zie rubriek 8 voor meer informatie).
- Blijf elke 2 dagen mediumveranderingen uitvoeren, zoals beschreven in rubriek 5, totdat het experimentele eindpunt is bereikt.
OPMERKING: Bewerkingssnelheden van CRISPR/Cas9 met behulp van deze methode zijn sterk afhankelijk van de targetingefficiëntie van het ontworpen sgRNA. Bewerkingspercentages tot 95% zijn waargenomen met een efficiënte gids15. Richtlijnen voor sgRNA-ontwerp zijn eerder elders beschreven19,20.
7. Transduceren van gekweekte HSPC's met lentivirale vector
OPMERKING: Start culturen met voldoende aantallen cellen, om dit uit te voeren op het gewenste experimentele tijdstip.
- Lentivirale vector genereren en titeren (afhankelijk van de experimentele doelen). Ontdooi lentivirale vector op ijs.
- Voer een mediumwissel uit (zoals in sectie 5); meng en breng vervolgens de HSPC's over voor transductie in een buis. Verzamel 10 μL van de cellen en tel met behulp van de oplossing van Türks in een verdunning van 1:2 met een hemocytometer.
OPMERKING: Cellen kunnen onmiddellijk na plating worden getransduceerd. Cellen worden echter meestal 1-3 weken vóór transductie gekweekt. - Herplaat de vereiste dosis cellen voor transductie (meestal 100.000 cellen per 96-well plaat). Afzonderlijk, plaat niet-getransduceerde negatieve controlecellen.
OPMERKING: Als u negatieve oppervlaktegeladen platen gebruikt, breng de cellen dan over naar met fibronectine gecoate platen voor lentivirale vectortransductie. - Voeg lentivirale vector toe aan elke bron van cellen: voeg 20 transductie-eenheden per cel toe om ~ 30% transductie-efficiëntie te bereiken. Bepaal de lentivirale vectordosis echter empirisch, afhankelijk van de experimentele vereisten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat lentivirale vector wordt verwijderd volgens de institutionele richtlijnen. - Breng de cellen gedurende 6 uur terug naar de weefselkweekincubator. Voer daarna een mediumwissel uit zoals beschreven in rubriek 5.
OPMERKING: Het supernatant bevat levend virus. Weggooien volgens institutionele richtlijnen. - Analyseer de cellen door flowcytometrie (bijvoorbeeld voor GFP-expressie) na 2 dagen of meer. Zie rubriek 8 voor meer informatie.
- Blijf elke 2 dagen mediumveranderingen uitvoeren, zoals beschreven in rubriek 5, totdat het experimentele eindpunt is bereikt.
8. Flowcytometrische analyse van HSPC-culturen
- Bereid een geconcentreerd gekweekt ex vivo HSC-antilichaammengsel in PBS met 2% FBS (tabel 4). Bewaar het mengsel bij 4 °C in het donker gedurende maximaal 1 maand.
OPMERKING: Werk in een weefselkweekkap met de lichten uit bij gebruik van kleurstof-geconjugeerde antilichamen. - Voeg 2 μL geconcentreerd antilichaammengsel toe aan 50 μL cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. Bereid naast deze monsterkleuring de juiste kleuringscontrolemonsters voor compensatie en gating voor.
- Voeg 200-1.000 μL PBS met 2% FBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 × g bij 4 °C. Verwijder zoveel mogelijk supernatant en resuspensie in 100-500 μL PBS met 2% FBS en 0,5 μg/ml PI.
- Stel de flowcytometer in en registreer ten minste 10.000 levende cellen per monster.
OPMERKING: Flowcytometers moeten worden bediend door een getrainde wetenschapper. Gebruikers moeten contact opnemen met hun lokale FACS-faciliteit om deze analyse te bespreken als ze geen ervaring hebben met flowcytometrie. - Exporteer de gegevens in FCS-indeling en analyseer de gegevens met behulp van de juiste flowcytometrie-analysesoftware. Zie figuur 2 voor de hier gebruikte standaard gatingstrategie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor de FACS-zuivering van HSC's verwachten we dat binnen het c-Kit-verrijkte beenmerg ~0,2% van de cellen de CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-populatie zijn voor jonge (8-12 weken oude) C57BL/6 muizen (Figuur 1). Het is echter waarschijnlijk dat transgene muizen of muizen van verschillende leeftijden verschillende HSC-frequenties vertonen. Na 4 weken kweek verwachten we dat de CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-fractie ~10% zal zijn (figuur 2). Deze resultaten zijn vergelijkbaar voor celculturen geïnitieerd uit c-Kit verrijkt beenmerg of FACS gezuiverde HSC's. Na transductie met een GFP-expresserende lentivirale vector (bij 20 transductie-eenheden/cel) verwachten we ~30% GFP+ cellen (figuur 3).
Bij samenvloeiing verwachten we dat de culturen ~ 2 miljoen cellen / ml hebben. Binnen de kweek verwachten we vooral kleine ronde cellen te zien, hoewel het normaal is om een kleine frequentie van grotere ronde (megakaryocyt-achtige) cellen te zien. Binnen de celculturen geïnitieerd uit c-Kit-verrijkt beenmerg, wordt enige initiële celdood verwacht14. Ongeveer 50% celdood wordt verwacht binnen de eerste 24-48 uur, voordat de eerste mediumveranderingen worden uitgevoerd. Aanvankelijk dood celafval in deze culturen is waarschijnlijk afkomstig van celdood in de culturen in plaats van botresten (van de verbrijzelde botten), omdat de c-Kit-verrijkingsstap dergelijk botresten zou moeten uitputten. Celnummers keren echter na 1 week terug naar 80%-100% van de gezaaide celaantallen (zie tabel 5 voor verwachte celdichtheidswaarden). Als er slechte resultaten worden gezien, raden we u aan problemen met het protocol op te lossen (tabel 6). In dit geval kan het het meest eenvoudig zijn om reagentia batchgewijs te testen met behulp van het c-Kit-verrijkte beenmergprotocol (sectie 3), omdat dit complicaties in verband met FACS-sortering voorkomt. Merk op dat de representatieve resultaten gebaseerd zijn op het gebruik van reagentia en apparatuur zoals beschreven in de materiaaltabel; Vergelijkbare resultaten kunnen worden bereikt met behulp van reagentia van verschillende leveranciers, maar validatie (en titratie) van nieuwe reagentia is waarschijnlijk noodzakelijk.
Figuur 1: Gating strategie voor FACS zuivering van HSC's uit c-Kit-verrijkt beenmerg. Sequentiële gating gebruikt om CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-cellen uit c-Kit-verrijkt beenmerg te identificeren. Afkortingen: FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; HSC's = hematopoëtische stamcellen; SSC-A = zijwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-A = voorwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-W = voorwaartse scatter-piekbreedte; FSC-H = voorwaartse verstrooiing-piekhoogte; SSC-H = zijverstrooiing-piekhoogte; PI = propidiumjodide; PE = fycoerythrin; APC = allophycocyanine; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gating strategie voor flow cytometrische analyse van gekweekte HSPC's. Sequentiële gating gebruikt om CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-cellen uit HSPC-culturen te identificeren. Afkortingen: HSPC's = hematopoëtische stam- en voorlopercellen; SSC-A = zijwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-A = voorwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-W = voorwaartse scatter-piekbreedte; FSC-H = voorwaartse verstrooiing-piekhoogte; SSC-H = zijverstrooiing-piekhoogte; PI = propidiumjodide; PE = fycoerythrin; APC = allophycocyanine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van lentivirale vectortransductie. Representatieve GFP-expressie na gekweekte HSPC-transductie met een GFP-tot expressie brengende lentivirale vector (20 transductie-eenheden/cel) 48 uur na transductie. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; HSPC's = hematopoëtische stam- en voorlopercellen; FSC-H = voorwaartse scatter-piekhoogte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Eindconcentratie in F-12 | Volume (μL) |
| Ham's F-12 medium | N.V.T | 958 |
| 100x Penicilline-Streptomycine-Glutamine | 1x | 10 |
| 1 M HEPES | 10 mM | 10 |
| 100 mg/ml PVA-voorraad | 1 mg/ml | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| 100 μg/ml TPO-voorraad | 100 ng/ml | 1 |
| 10 μg/ml SCF-voorraad | 10 ng/ml | 1 |
Tabel 1: HSC-mediasamenstelling. Mediareagensvolumes voor 1 ml volledig medium. Afkortingen: PVA = polyvinylalcohol; SCF = stamcelfactor; TPO = trombopoietine; ITSX = insuline-transferrine-selenium-ethanolamine.
| Antistof | Concentratie (μg/ml) | Volume (μL) |
| Ly6G/Ly6C – biotine | 0.5 | 100 |
| Ter119 – biotine | 0.5 | 100 |
| CD4 – biotine | 0.5 | 25 |
| CD8a – biotine | 0.5 | 25 |
| CD45R – biotine | 0.5 | 50 |
| CD127 – biotine | 0.5 | 50 |
| Steriele PBS | N.V.T | 350 |
Tabel 2: Gebiotinyleerde antilichaamcocktail. Antilichaamvolumes voor de voorraad van de biotine-antilichaamcocktail.
| Antistof | Concentratie (mg/ml) | Volume (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| c-Kit APC | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Streptavidin APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| Steriele PBS | N.V.T | 291 |
Tabel 3: Verse HSC antilichaamcocktail. Antilichaamvolumes voor de verse HSC-antilichaamcocktail. Afkortingen: PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanine; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat.
| Antistof | Concentratie (mg/ml) | Volume (μL) |
| c-Kit BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| Steriele PBS | N.V.T | 27.5 |
Tabel 4: Gekweekte HSC-antilichaamcocktail (100x). Antilichaamvolumes voor de 100x voorraad van de gekweekte HSC-antilichaamcocktail. Afkortingen: PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanine; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat.
| Cultuur | Celdichtheid bij 24-48 h | % KSL bij 24-48 h | Celdichtheid na 1 week | % KSL na 1 week |
| Verse c-Kit+ beenmergbeplating | 0,5x106 ml-1 | 25-35% | 1-2x106 ml-1 | 50-60% |
| HSPC-elektroporatie | 0,5x106 ml-1 | 25-35% | 0,5-1,5x106 ml-1 | 25-35% |
| HSPC lentivirus | 1,5x106 ml-1 | 20-25% | 1-2x106 ml-1 | 45-55% |
Tabel 5: Verwachte resultaten. Verwachte celdichtheden en frequenties van c-Kit+Sca1+Lineage-cellen na (1) zaaien van c-Kit+ beenmerg, (2) elektroporatie en (3) lentivirale vectortransductie op basis van zaaien bij 1 × 106 cellen ml-1. Afkortingen: KSL = c-Kit+Sca1+Lineage-; HSPC = hematopoëtische stam- en voorlopercel.
| Uitgeven | Waarschijnlijke oorzaak(en) | Oplossing(en) | |||
| De stroomsnelheid van de LS-kolom is ongewoon traag. | LS-kolom is verstopt. | Verwijder de kolom van de magneet. Elueer de celsuspensie met behulp van de zuiger en herhaal dit met nog eens 5 ml PBS. Herhaal de kolomverrijking met een nieuwe kolom en een nieuw filter. | |||
| Grote hoeveelheid celdood binnen de eerste 7 dagen van kweek | Het gebruik van verlopen reagentia of reagentia in onjuiste verhoudingen. | Zorg ervoor dat regenten in de juiste concentratie zijn en correct worden bewaard. | |||
| Onnauwkeurige incubatortemperatuur. | Regelmatig onderhoud van couveuses en zorgen dat de couveuse zoveel mogelijk gesloten blijft. | ||||
| Cultuur instorten na 7 dagen cultuur | Verkeerd celtype gesorteerd | Vraag advies aan HSC FACS-experts over sorteerprotocollen. Valideer reagentia met c-kit-verrijkt beenmerg. | |||
| Onvolledige mediawijzigingen worden uitgevoerd | Voer volledigere mediawijzigingen uit. | ||||
| Overmatige (bijv. >50%) totale celdood na transductie | Lentivirale vectortoxiciteit. | Verminder de hoeveelheid gebruikte virusdeeltjes. | |||
| Verkort de incubatietijd tot 5 uur. | |||||
| Overmatige (bijv. >50%) totale celdood na transfectie | Cellen die te lang in P3-oplossing zijn achtergelaten | Herstel cellen zo snel mogelijk in media, elektropoer slechts 2 monsters tegelijk en wees voorzichtig bij het pipetteren (en gebruik pipetpunten met brede boring). | |||
| Pipetteren doodt cellen te krachtig | |||||
| Lage transfectie-efficiëntie | Afbraak van RNP's en/of Cas9 enzym. | Onjuiste opslag, bewaar Cas9 bij -20 °C en RNA bij -80 °C (gereconstitueerd met RNase-vrij water). | |||
| Lage transductie-efficiëntie | Lage lentivirale vectoractiviteit | Titreer lentivirale vector voor specifieke celpopulatie, vermijd bevriezen/ontdooien lentivirale vector | |||
Tabel 6: Veelvoorkomende problemen met het oplossen van problemen. Overzicht van veelvoorkomende problemen en voorgestelde probleemoplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hopen dat dit protocol een nuttige benadering biedt om HSC-biologie, hematopoëse en hematologie in het algemeen te onderzoeken. Sinds de initiële ontwikkeling van de PVA-gebaseerde kweekmethode voor FACS-gezuiverde HSC's8 is de methode uitgebreid. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat de methode werkt met c-Kit verrijkt met beenmerg en met negatieve oppervlaktegeladen platen14. De compatibiliteit met transductie en elektroporatie is ook aangetoond14,15. De in vivo validatie van deze HSC en c-Kit+ HSPC culturen is te vinden in deze publicaties, terwijl lezers kunnen verwijzen naar andere gepubliceerde protocollen voor in vivo transplantatieprotocollen21. We zien geen grote verschillen in afstammingschimerisme tussen verse en gekweekte HSPC's na transplantatie, maar de reconstitutiepotentie van individuele HSC's na ex vivo expansie moet nog in detail worden bepaald. De grote aantallen HSC's die door deze aanpak worden gegenereerd, openen nieuwe manieren om HSC's te ondervragen met behulp van moleculaire of biochemische assays die grote celaantallen vereisen. Bovendien zou het kunnen genereren van genetisch gemodificeerde HSC's binnen deze kweeksystemen ons in staat moeten stellen om de mechanismen die de HSC-activiteit en het hematopoietische systeem reguleren verder te onderzoeken. Deze systemen zijn bijvoorbeeld vatbaar voor het uitvoeren van genetische screenings16.
Mechanistisch begrijpen we nog niet volledig waarom PVA en andere polymeren serumalbumine kunnen vervangen en een efficiënte HSC-expansie kunnen ondersteunen; wij geloven dat PVA op zijn minst gedeeltelijk serumalbumine vervangt door cytokines in de mediate stabiliseren 9. Bovendien lijkt het ontbreken van slecht gedefinieerde bioactieve verontreinigingen in serumalbumineproducten de HSC-differentiatie te verminderen. Het gebruik van synthetische polymeren moet ook helpen om de variabiliteit van batches en verstorende effecten van deze bioactieve verontreinigingen te verminderen bij het bestuderen van HSC's ex vivo22. Er is ook nog meer te leren over waarom bepaalde polymeren een betere ondersteuning bieden voor HSC's ex vivo.
Hoewel ze al krachtig zijn, zou verdere optimalisatie en karakterisering van deze cultuurprotocollen mogelijk moeten zijn. In het bijzonder zou het nuttig zijn om de zuiverheid van HSC's binnen deze culturen te verbeteren. Extra markers die het HSC-compartiment op lange termijn onderscheiden van deze culturen zouden ook helpen bij het volgen en isoleren van deze celtypen. Het is ook van belang om te zien of dit systeem uiteindelijk kan worden gebruikt om HSC-activiteit ex vivo te kwantificeren, zonder dat er in vivo transplantatietests nodig zijn. We begrijpen ook nog niet hoe lang HSC's ex vivo kunnen worden uitgebreid, hoewel het zeker langer is dan 6-8 weken als het goed wordt onderhouden8. Ten slotte, hoewel deze culturen een nuttig model bieden om HSC's van muizen te bestuderen, is het ook belangrijk om gelijkwaardige kweeksystemen voor menselijke HSC's te ontwikkelen om een meer handelbaar systeem te bieden om menselijke HSC-biologie en hematopoiese te bestuderen, en uiteindelijk om HSC's te genereren voor klinische stamceltransplantatietherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We danken de WIMM Flow Cytometry Core voor toegang tot flowcytometrie en de WIMM Virus Screening Core voor lentivirale vectorgeneratie. Dit werk werd gefinancierd door het Kay Kendall Leukaemia Fund en de UK Medical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
