Summary
यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो पूर्व विवो पॉलीविनाइल अल्कोहल-आधारित विस्तार का उपयोग करके माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल संस्कृतियों को शुरू करने, बनाए रखने और विश्लेषण करने के लिए है, साथ ही साथ लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के तरीके भी हैं।
Abstract
स्व-नवीनीकृत मल्टीपोटेंट हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) जीवन भर हेमटोपोइजिस का समर्थन करने और प्रत्यारोपण के बाद पूरे रक्त प्रणाली को पुनर्गठित करने की उनकी क्षमताओं के कारण एक महत्वपूर्ण सेल प्रकार हैं। एचएससी का उपयोग स्टेम सेल प्रत्यारोपण उपचारों में चिकित्सकीय रूप से किया जाता है, जो रक्त रोगों की एक श्रृंखला के लिए उपचारात्मक उपचार का प्रतिनिधित्व करते हैं। एचएससी गतिविधि और हेमटोपोइजिस को विनियमित करने वाले तंत्र को समझने और नए एचएससी-आधारित उपचार विकसित करने दोनों में पर्याप्त रुचि है। हालांकि, एचएससी एक्स विवो की स्थिर संस्कृति और विस्तार एक वापस लेने योग्य पूर्व विवो प्रणाली में इन स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने में एक प्रमुख बाधा रही है। हमने हाल ही में एक पॉलीविनाइल अल्कोहल-आधारित संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो प्रत्यारोपण योग्य माउस एचएससी के दीर्घकालिक और बड़े पैमाने पर विस्तार और आनुवंशिक रूप से उन्हें संपादित करने के तरीकों का समर्थन कर सकती है। यह प्रोटोकॉल इलेक्ट्रोपोरेशन और लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन के माध्यम से माउस एचएससी को कल्चर और आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के तरीकों का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल एचएससी जीव विज्ञान और हेमटोपोइजिस में रुचि रखने वाले प्रयोगात्मक हेमेटोलॉजिस्ट की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होने की उम्मीद है।
Introduction
हेमटोपोइएटिक प्रणाली स्तनधारियों में आवश्यक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला का समर्थन करती है, विशेष रक्त और प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के माध्यम से ऑक्सीजन की आपूर्ति से लेकर रोगजनकों से लड़ने तक। रक्त प्रणाली होमियोस्टैसिस का समर्थन करने के लिए निरंतर रक्त उत्पादन (हेमटोपोइजिस) की आवश्यकता होती है, जो हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) 1 द्वारा बनाए रखा जाता है। सबसे आदिम हेमटोपोइएटिक सेल हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) है, जिसमें आत्म-नवीकरण और बहुवंशीय भेदभाव 2,3 के लिए अद्वितीय क्षमता है। यह एक दुर्लभ कोशिका आबादी है, जो मुख्य रूप से वयस्क अस्थि मज्जा4 में पाई जाती है, जहां वे हर 30,000 कोशिकाओं में लगभग एक की आवृत्ति पर होते हैं। एचएससी को जीवन भर हेमटोपोइजिस का समर्थन करने और हेमेटोलॉजिकल तनाव के बाद हेमटोपोइजिस को फिर से स्थापित करने में मदद करने के लिए माना जाता है। ये क्षमताएं एचएससी को एक विकिरणित प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपण के बाद पूरे हेमटोपोइएटिक प्रणाली को स्थिर रूप से पुनर्गठित करने की अनुमति देतीहैं। यह एक एचएससी की कार्यात्मक परिभाषा का प्रतिनिधित्व करता है और एचएससी प्रत्यारोपण चिकित्सा के लिए वैज्ञानिक आधार भी बनाता है, रक्त और प्रतिरक्षा रोगों की एक श्रृंखला के लिए एक उपचारात्मक उपचार। इन कारणों से, एचएससी प्रयोगात्मक हेमेटोलॉजी का एक प्रमुख फोकस हैं।
अनुसंधान के एक बड़े फोकस के बावजूद, एचएससी एक्स विवो7 का विस्तार करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। हमने हाल ही में माउस एचएससी 8 के लिए पहली दीर्घकालिक पूर्व विवो विस्तार संस्कृति प्रणाली विकसितकी है। यह दृष्टिकोण 4 सप्ताह की संस्कृति में प्रत्यारोपण योग्य एचएससी को 234-899 गुना तक बढ़ा सकता है। वैकल्पिक दृष्टिकोणों की तुलना में, प्रोटोकॉल में प्रमुख परिवर्तन सीरम एल्बुमिन को हटाना और सिंथेटिक बहुलक के साथ इसका प्रतिस्थापन था। पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) को माउस एचएससी संस्कृतियों8 के लिए एक इष्टतम बहुलक के रूप में पहचाना गया था, जिसका उपयोग अब अन्य हेमटोपोइएटिक सेल प्रकार9 को कल्चर करने के लिए भी किया गया है। हालांकि, सोलुप्लस नामक एक अन्य बहुलक (एक पॉलीविनाइल कैप्रोलैक्टम-एसीटेट-पॉलीइथिलीन ग्लाइकोल ग्राफ्ट कॉपोलीमर) की भी हाल ही में पहचान की गई है, जो क्लोनल एचएससी विस्तार10 में सुधार करता प्रतीत होता है। पॉलिमर के उपयोग से पहले, भ्रूण गोजातीय सीरम, गोजातीय सीरम एल्बुमिन अंश वी, या पुनः संयोजक सीरम एल्ब्यूमिन के रूप में सीरम एल्ब्यूमिन का उपयोग किया गया था, लेकिन इनमें एचएससी विस्तार के लिए सीमित समर्थन था और केवल अल्पकालिक (~ 1 सप्ताह) एक्स विवो कल्चर 7 का समर्थनकिया गया था। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एचएससी संस्कृति प्रोटोकॉल जो एचएससी को एक क्वीसेंट स्थिति में बनाए रखते हैं, लंबे समय तक विवो संस्कृति समय11,12 का समर्थन कर सकते हैं।
अन्य संस्कृति विधियों की तुलना में, पीवीए-आधारित संस्कृतियों का एक प्रमुख लाभ उन कोशिकाओं की संख्या है जो उत्पन्न हो सकती हैं और प्रोटोकॉल की लंबाई एचएससी एक्स विवो को ट्रैक करने के लिए उपयोग की जा सकती है। यह प्रयोगात्मक हेमेटोलॉजी के क्षेत्र में कई बाधाओं को दूर करता है, जैसे कि एचएससी की कम संख्या प्रति माउस (केवल कुछ हजार) और विवो में समय के साथ एचएससी को ट्रैक करने में कठिनाई। हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि ये संस्कृतियां एचएससी प्रसार को प्रोत्साहित करती हैं, जबकि विवो एचएससी पूल मुख्य रूप से स्थिर अवस्था13 पर होता है। इसके अतिरिक्त, हालांकि संस्कृतियां एचएससी के लिए चयनात्मक हैं, अतिरिक्त सेल प्रकार समय के साथ संस्कृतियों के साथ जमा होते हैं, और प्रत्यारोपण योग्य एचएससी केवल 1 महीने के बाद 34 कोशिकाओं में से लगभग एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। माइलॉयड हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाएं इन एचएससी संस्कृतियों में प्रमुख दूषित सेल प्रकार प्रतीत होतीहैं। फिर भी, हम इन संस्कृतियों का उपयोग विषम सेल आबादी (जैसे, सी-किट + अस्थि मज्जा एचएसपीसी14) से एचएससी के लिए समृद्ध करने के लिए कर सकते हैं। यह आनुवंशिक हेरफेर14,15,16 के लिए एचएससी के पारगमन या इलेक्ट्रोपोरेशन का भी समर्थन करता है। विषम सुसंस्कृत एचएसपीसी आबादी से एचएससी की पहचान करने में मदद करने के लिए, सीडी 201 (ईपीसीआर) को हाल ही में एक उपयोगी पूर्व विवो एचएससी मार्कर10,17,18 के रूप में पहचाना गया है, जिसमें प्रत्यारोपण योग्य एचएससी सीडी 201 + सीडी 150 + सी-किट + एससीए 1 + वंशावली-अंश तक सीमित है।
यह प्रोटोकॉल पीवीए-आधारित माउस एचएससी विस्तार संस्कृतियों को शुरू करने, बनाए रखने और मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन करता है, साथ ही इलेक्ट्रोपोरेशन या लेंटिवायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन का उपयोग करके इन संस्कृतियों के भीतर आनुवंशिक हेरफेर के लिए प्रोटोकॉल भी बताता है। इन विधियों को प्रयोगात्मक हेमेटोलॉजिस्ट की एक श्रृंखला के लिए उपयोगी होने की उम्मीद है।
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Protocol
प्रजनन और इच्छामृत्यु सहित सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों के भीतर किया जाना चाहिए। नीचे दिए गए प्रयोगों को यूके होम ऑफिस द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. स्टॉक समाधान तैयार करना
- पीवीए स्टॉक समाधान
- एक छोटी कांच की बोतल (आटोक्लेविंग के लिए उपयुक्त) में 50 एमएल ऊतक संवर्धन गुणवत्ता वाला पानी लें। माइक्रोवेव में उबलने के लिए पानी को गर्म करें।
- 5 ग्राम पीवीए पाउडर का वजन करें और पानी में जोड़ें।
नोट: केवल 1-5 ग्राम पीवीए को भंग करने की सिफारिश की जाती है। बड़ी मात्रा में घुलने से अपूर्ण पुनर्गठन हो सकता है। - ढक्कन को कसकर बंद करें और मिश्रण करने के लिए हिलाएं। फिर, ढक्कन ढीला करें।
नोट: फिर से खोलते समय सावधान रहें, क्योंकि बदलते पानी के तापमान के कारण दबाव बदल सकता है। - आटोक्लेव करें और ठंडा होने दें। ढक्कन को कसकर बंद करें और मिश्रण करने के लिए हिलाएं। बाँझ ट्यूबों में एलिकोट बनाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने तक स्टोर करें।
- 1 मिलीग्राम / एमएल पीवीए युक्त एफ -12 माध्यम में लियोफिलाइज्ड साइटोकिन्स को भंग करें। 1:1,000 स्टॉक उत्पन्न करने के लिए स्टेम सेल फैक्टर को 10 μg / mL और थ्रोम्बोपोइटिन को 100 μg / mL तक पुनर्गठित करें। बाँझ ट्यूबों में एलिकोट बनाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट स्टोर करें।
नोट: माउस एचएससी विस्तार पर नकारात्मक प्रभाव के कारण गोजातीय सीरम एल्बुमिन में साइटोकिन्स के पुनर्गठन से बचें।
2. एचएससी अस्थि मज्जा निष्कर्षण और सी-किट + संवर्धन
- ताजा इच्छामृत्यु वाले 8-12 सप्ताह के सी 57बीएल/6 चूहों (सीओ 2 श्वासावरोध और / या ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से) से फीमर, टिबियास,पेल्विस और रीढ़ की हड्डी को विच्छेदित करें और हड्डियों को बर्फ पर पीबीएस में रखें।
नोट: सुनिश्चित करें कि सतहों और उपकरणों को 70% इथेनॉल के साथ निष्फल किया गया है। - लिंट-फ्री नाजुक टास्क वाइप्स का उपयोग करके हड्डियों को साफ करें, मांसपेशियों और रीढ़ की हड्डी को हटा दें, और ~ 3 एमएल पीबीएस के साथ मोर्टार में जोड़ें।
नोट: सुनिश्चित करें कि मूसल और मोर्टार को 70% इथेनॉल के साथ निष्फल किया जाता है और फिर पीबीएस के साथ एक बार धोया जाता है। - कतरन बलों को कम करने के लिए पीसे बिना पेस्टल के साथ हड्डियों को कुचल दें। 5 एमएल सिरिंज से जुड़ी 19 ग्राम सुई का उपयोग करके पीबीएस में जारी बड़े अस्थि मज्जा के टुकड़ों को तोड़ दें। सेल निलंबन को 70 μm फ़िल्टर के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- एक बार निलंबन स्थानांतरित हो जाने के बाद, ताजा पीबीएस के साथ दोहराएं जब तक कि हड्डियां ब्लीच न हो जाएं और कोई मज्जा दिखाई न दे। प्रति माउस ~ 30 एमएल और दो चूहों के लिए ~ 50 एमएल की अंतिम मात्रा का लक्ष्य रखें।
- अस्थि मज्जा कोशिकाओं को मिलाएं, कोशिकाओं के 10 μL एकत्र करें, और हेमोसाइटोमीटर के साथ 1: 10-1: 20 के कमजोर पड़ने पर तुर्क्स के समाधान का उपयोग करके गिनती करें।
नोट: एक माउस से 2-5 × 108 पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं का उत्पादन होने की उम्मीद है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर स्पिन करें, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और गोली को ठंडे पीबीएस (एक माउस के लिए 350 μL या दो चूहों के लिए 500 μL) में फिर से निलंबित करें।
- प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में 0.2 μL एलोफाइटिकोसायनिन (एपीसी) एंटी-सी-किट एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- अतिरिक्त एंटीबॉडी को धोने के लिए इनक्यूबेटेड कोशिकाओं में 5 एमएल ठंडा पीबीएस जोड़ें और एक ताजा 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 50 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
- मूल ट्यूब को 7 एमएल ठंडे पीबीएस के साथ धोएं और फ़िल्टर के माध्यम से स्थानांतरित करें। यदि फ़िल्टर क्लॉगिंग होती है, तो फ़िल्टर की सतह को P1000 टिप से स्क्रैच करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर स्पिन करें, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और गोली को ठंडे पीबीएस (एक माउस के लिए 350 μL या दो चूहों के लिए 500 μL) में फिर से निलंबित करें।
- प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में 0.2 μL एंटी-एपीसी माइक्रोबीड्स जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अतिरिक्त माइक्रोबीड्स को धोने के लिए बाँझ पीबीएस के 12 एमएल जोड़ें।
- कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर घुमाएं और 2 एमएल ठंडे पीबीएस में फिर से निलंबित करें। जबकि कोशिकाएं इस चरण में घूम रही हैं, चरण 2.13 पर आगे बढ़ें।
- चुंबकीय स्तंभ विभाजक के चुंबक में एक चुंबकीय निस्पंदन स्तंभ रखकर स्तंभ संवर्धन के लिए तैयार करें, जिसमें शीर्ष पर 50 μm फ़िल्टर और नीचे 15 mL शंक्वाकार ट्यूब हो।
- 50 μm फ़िल्टर और निस्पंदन स्तंभ के माध्यम से बाँझ PBS के 3 mL चलाएं। एक बार पीबीएस के गुजरने के बाद, कॉलम के माध्यम से सेल निलंबन पास करें, इसके बाद हर बार 3 एमएल ठंडे पीबीएस के तीन वॉश करें। प्रत्येक धोने के लिए, अगले धोने को जोड़ने से पहले कॉलम टपकना बंद होने की प्रतीक्षा करें।
- चुंबक से स्तंभ निकालें और इसे एक ताजा 15 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर रखें। ठंडा पीबीएस के 5 एमएल जोड़ें, कॉलम प्लंजर को कॉलम पर फिट करें, और प्लंजर को धक्का देकर कोशिकाओं को अलग करें।
- सी-किट-समृद्ध कोशिकाओं को मिलाएं, 10 μL कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और हेमोसाइटोमीटर के साथ 1: 2 के कमजोर पड़ने पर तुर्क्स के समाधान का उपयोग करके गिनती करें। एक माउस से विशिष्ट उपज 2-5 × 106 सी-किट + कोशिकाएं हैं।
नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं को सीधे एचएससी मीडिया में बीज दिया जा सकता है या एचएससी फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) शुद्धिकरण के लिए तैयार किया जा सकता है।
3. सी-किट-समृद्ध एचएसपीसी के साथ सेल संस्कृतियों की शुरुआत
- आवश्यक कोशिकाओं/कुओं की संख्या के लिए ताजा माध्यम (तालिका 1) तैयार करें। सी-किट-समृद्ध एचएसपीसी के लिए बीज 0.5-1 मिलियन कोशिकाएं प्रति एमएल।
- सी-किट-समृद्ध कोशिकाओं को स्पिन करें और वांछित सेल घनत्व पर एचएससी माध्यम में पुन: निलंबित करें।
- कोशिकाओं को फाइब्रोनेक्टिन-लेपित या नकारात्मक सतह चार्ज प्लेटों में स्थानांतरित करें, 200 μL प्रति 96-वेल प्लेट या 1 एमएल प्रति 24-वेल प्लेट पर।
- कोशिकाओं को एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें जो 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेट है।
4. एफएसीएस शुद्ध एचएससी के साथ सेल संस्कृतियों की शुरुआत
- बायोटिनिलेटेड वंश एंटीबॉडी दाग की एक उपयुक्त मात्रा तैयार करें: प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में मास्टर मिश्रण (तालिका 2) का 3 μL, पीबीएस में 1: 100 पतला।
- सी-किट-समृद्ध कोशिकाओं को स्पिन करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए वंश एंटीबॉडी दाग में फिर से निलंबित करें।
- बाँझ पीबीएस के 10 एमएल से धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर घुमाएं।
- ताजा एचएससी एंटीबॉडी दाग की एक उपयुक्त मात्रा तैयार करें (तालिका 3): प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में 300 μL। इस नमूना धुंधला होने के साथ, मुआवजे और गेटिंग के लिए उपयुक्त धुंधला नियंत्रण नमूने तैयार करें।
नोट: डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते समय प्रकाश के साथ एक ऊतक संस्कृति हुड में काम करें। - एचएससी एंटीबॉडी दाग में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 90 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सेल पेलेटिंग को रोकने के लिए टैप करके हर 20-30 मिनट में कोशिकाओं को मिलाएं।
- बाँझ पीबीएस के 10 एमएल से धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर घुमाएं।
- सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, गोली को बाधित करने के लिए फ्लिक करें, और बाँझ पीबीएस में 0.5 μg / mL प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ पुन: निलंबित करें।
- आवश्यक कुओं की संख्या के लिए ताजा माध्यम (तालिका 1) तैयार करें, और फाइब्रोनेक्टिन या नकारात्मक सतह चार्ज प्लेटों में प्लेट करें (200 μL प्रति 96-वेल प्लेट या 1 एमएल प्रति 24-वेल प्लेट)।
- सीडी 150 + सीडी 34-सी-किट + एससीए 1 + वंशावली- एचएससी को सीधे मीडिया युक्त कुओं में सॉर्ट करने और सॉर्ट करने के लिए एफएसीएस मशीन तैयार करें (यहां उपयोग की जाने वाली मानक एफएसीएस गेटिंग रणनीति के लिए चित्रा 1 देखें)। प्रति 96-वेल प्लेट वेल में 200 कोशिकाओं तक या प्रति 24-वेल प्लेट वेल वेल में 1,000 कोशिकाओं तक क्रमबद्ध करें।
नोट: एफएसीएस मशीनों को एक प्रशिक्षित वैज्ञानिक द्वारा संचालित किया जाना चाहिए। यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता इस सॉर्टिंग रणनीति पर चर्चा करने के लिए अपनी स्थानीय एफएसीएस सुविधा से संपर्क करें यदि वे माउस एचएससी के एफएसीएस अलगाव में अनुभवी नहीं हैं।
5. मीडिया परिवर्तन करना
- सी-किट-समृद्ध कोशिकाओं से शुरू की गई सेल संस्कृतियों के लिए, 2 दिनों के बाद मीडिया परिवर्तन शुरू करें। एफएसीएस-पृथक एचएससी से शुरू की गई सेल संस्कृतियों के लिए, 5 दिनों के बाद मीडिया परिवर्तन शुरू करें।
- सभी कुओं के लिए पर्याप्त ताजा पूर्वनिर्मित (~ 37 डिग्री सेल्सियस) एचएससी माध्यम (तालिका 1) तैयार करें।
- धीरे से ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें।
नोट: चूंकि नकारात्मक सतह चार्ज प्लेटों पर एचएसपीसी फाइब्रोनेक्टिन की तुलना में अधिक आसानी से परेशान होते हैं, इसलिए सेल संस्कृतियों को परेशान करने से बचने के लिए नकारात्मक सतह चार्ज प्लेटों पर माध्यम को बदलते समय अतिरिक्त सावधानी बरतनी चाहिए। - पिपेट या वैक्यूम पंप का उपयोग करके, धीरे-धीरे कुएं के मेनिस्कस से ~ 90% -95% माध्यम को हटा दें।
नोट: कुएं के आधार से माध्यम को खींचने से बचें, अन्यथा कई कोशिकाओं को हटा दिया जाएगा। - कुएं में ताजा माध्यम के 200 μL (96-वेल प्लेटों के लिए; 24-वेल प्लेटों के लिए 1 एमएल) जोड़ें।
- प्लेट को टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें।
- प्रयोगात्मक अंत बिंदु तक हर 2-3 दिनों में चरण 5.1-5.6 दोहराएं।
- सी-किट-समृद्ध एचएसपीसी (धारा 3) के साथ शुरू की गई सेल संस्कृतियों के लिए, ~ 3 सप्ताह के बाद संस्कृतियों को 1: 2-1: 3 के अनुपात में विभाजित करें। एफएसीएस शुद्ध एचएससी (धारा 4) के साथ शुरू की गई सेल संस्कृतियों के लिए, संस्कृतियों को ~ 3 सप्ताह के बाद 1: 2-1: 3 के अनुपात में विभाजित करें और जब संस्कृतियां >90% कॉन्फ्लुएंट हों।
नोट: सटीक समयरेखा प्रयोगात्मक हितों पर निर्भर करेगी। इन संस्कृतियों को 4-8 सप्ताह8 के लिए विशेषता दी गई है, लेकिन अतिरिक्त संस्कृति लंबाई संभव हो सकती है।
6. इलेक्ट्रोपोरेटिंग सुसंस्कृत एचएसपीसी
नोट: यह प्रोटोकॉल कैस 9 / एसजीआरएनए राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए है, लेकिन एमआरएनए या अन्य पुनः संयोजक प्रोटीन के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वांछित प्रयोगात्मक समय बिंदु पर इसे करने के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं के साथ संस्कृतियों को शुरू करें।
- धारा 5 में वर्णित इलेक्ट्रोपोरेशन से 1 दिन पहले एक मध्यम परिवर्तन करें।
नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले एक रात भर की संस्कृति की सिफारिश की जाती है। हालांकि, कोशिकाओं को आमतौर पर पारगमन से पहले 1-3 सप्ताह तक सुसंस्कृत किया जाता है। - इलेक्ट्रोपोरेशन के दिन, न्यूक्लियोफेक्टर स्थापित करें। मशीन चालू करें। टचस्क्रीन पर, एक्स मॉड्यूल का चयन करें और फिर उपयोग किए गए क्यूवेट आकार का चयन करें।
- इलेक्ट्रोपोरेशन के पैमाने के लिए पर्याप्त पी 3 समाधान (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) तैयार करें (100 μL प्रति क्यूवेट या 20 μL प्रति माइक्रोक्यूवेट) और कमरे के तापमान के बराबर होने की अनुमति दें।
- चढ़ाए जा रहे कुओं की संख्या के लिए पर्याप्त ताजा माध्यम (तालिका 1) तैयार करें और 24-वेल प्लेट वेल के लिए 500 μL माध्यम जोड़ें या 96-वेल प्लेट वेल में 100 μL मीडिया जोड़ें।
- बर्फ पर एसजीआरएनए (2 μg/mL तक प्रीडिल्यूटेड) को बर्फ पर पिघलाएं और एक बाँझ पीसीआर ट्यूब में 30 μg Cas9 एंजाइम (10 μg/mL पर) के साथ 16 μg sgRNA मिलाएं। नियंत्रण के रूप में केवल कैस 9 प्रोटीन युक्त एक अतिरिक्त पीसीआर ट्यूब शामिल करें। ट्यूब को फ्लिक करके मिलाएं, फिर संक्षेप में नीचे घूमें। आरएनपी को जटिल बनाने के लिए थर्मोसाइक्लर में 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
नोट: माइक्रोक्यूवेट में इलेक्ट्रोपोरेशन करने पर इसे पांच गुना कम किया जा सकता है। - इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए एचएसपीसी को एक ट्यूब में मिलाएं और स्थानांतरित करें; कोशिकाओं के 10 μL एकत्र करें और हेमोसाइटोमीटर के साथ 1: 2 के कमजोर पड़ने पर तुर्क्स के समाधान का उपयोग करके गिनती करें।
नोट: प्रति 100 μL क्यूवेट (माइक्रोक्यूवेट के लिए पांच गुना कम) 1-5 मिलियन कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करने की सिफारिश की जाती है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर 1.5 एमएल ट्यूब में उपयुक्त संख्या कोशिकाओं को स्पिन करें। जितना संभव हो उतना सतह पर तैरने वाला और न्यूक्लियोफेक्शन बफर के 100 μL के साथ पुन: निलंबित करें।
- सेल सस्पेंशन को तुरंत पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें जटिल आरएनपी और पिपेट धीरे-धीरे ऊपर और नीचे होते हैं ताकि धीरे से मिश्रण किया जा सके और 100 μL इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित किया जा सके। क्यूवेट में हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए मिश्रण को धीरे-धीरे और एक द्रव गति में क्यूवेट में इंजेक्ट करें।
- इलेक्ट्रोपोरेटर पर, इलेक्ट्रोपोरेट किए जा रहे कुओं की स्थिति का चयन करें। टचस्क्रीन का उपयोग करते हुए, पल्स कोड EO100 में सेल प्रकार प्रोग्राम CD34+, मानव, या प्रकार का चयन करें। OK बटन दबाएँ.
- क्यूवेट को इलेक्ट्रोपोरेटर में स्थानांतरित करें। इलेक्ट्रोपोरेशन शुरू करने के लिए टचस्क्रीन पर स्टार्ट बटन दबाएं। इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद, कल्चर माध्यम के 500 μL को क्यूवेट में जोड़ें (माइक्रोक्यूवेट का उपयोग करते समय 100 μL)।
- धीरे से कोशिकाओं को तैयार प्लेट में स्थानांतरित करें और ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में लौटें।
- एएवी 6 दाता टेम्पलेट को नियोजित करने वाली प्रक्रियाओं के लिए, कोशिकाओं को 5,000 वैक्टर / सेल की एकाग्रता पर फाइब्रोनेक्टिन-लेपित प्लेट में स्थानांतरित करने के तुरंत बाद वेक्टर जोड़ें।
- 6-18 घंटे के बाद, ताजा माध्यम तैयार करें और धारा 5 में वर्णित मध्यम परिवर्तन करें। इस मध्यम परिवर्तन के लिए, केवल 80% -90% माध्यम को हटा दें।
नोट: कुएं के आधार से माध्यम खींचने से बचें। - 2 या अधिक दिनों के बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करें (विवरण के लिए अनुभाग 8 देखें)।
- हर 2 दिनों में मध्यम परिवर्तन करना जारी रखें, जैसा कि अनुभाग 5 में वर्णित है, जब तक कि प्रयोगात्मक अंत बिंदु तक नहीं पहुंच जाता।
नोट: इस विधि का उपयोग करके CRISPR / Cas9 की संपादन दर डिज़ाइन किए गए एसजीआरएनए की लक्ष्यीकरण दक्षता पर अत्यधिक निर्भर करती है। एक कुशल गाइड15 के साथ 95% तक संपादन दर देखी गई है। एसजीआरएनए डिजाइन के लिए दिशानिर्देश पहलेकहीं और विस्तृत किए गए हैं 19,20.
7. लेंटिवायरल वेक्टर के साथ सुसंस्कृत एचएसपीसी को ट्रांसड्यूस करना
नोट: वांछित प्रयोगात्मक समय बिंदु पर इसे करने के लिए, कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या के साथ संस्कृतियों को शुरू करें।
- उत्पन्न और टिटर लेंटिवायरल वेक्टर (प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर)। बर्फ पर लेंटिवायरल वेक्टर पिघलें।
- एक मध्यम परिवर्तन करें (जैसा कि अनुभाग 5 में है); फिर, एक ट्यूब में पारगमन के लिए एचएसपीसी को मिलाएं और स्थानांतरित करें। कोशिकाओं के 10 μL एकत्र करें और एक हेमोसाइटोमीटर के साथ 1: 2 के कमजोर पड़ने पर तुर्क्स के समाधान का उपयोग करके गिनती करें।
नोट: प्लेटिंग के तुरंत बाद कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं को आमतौर पर पारगमन से पहले 1-3 सप्ताह तक सुसंस्कृत किया जाता है। - ट्रांसडक्शन के लिए कोशिकाओं की आवश्यक खुराक को पुन: प्राप्त करें (आमतौर पर प्रति 96-वेल प्लेट में 100,000 कोशिकाएं)। अलग से, प्लेट अन-ट्रांसड्यूस्ड नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाएं।
नोट: यदि नकारात्मक सतह चार्ज प्लेटों का उपयोग कर रहे हैं, तो कोशिकाओं को लेंटिवायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन के लिए फाइब्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों में स्थानांतरित करें। - कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में लेंटिवायरल वेक्टर जोड़ें: ~ 30% पारगमन दक्षता प्राप्त करने के लिए प्रति सेल 20 पारगमन इकाइयों को जोड़ें। हालांकि, प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर लेंटिवायरल वेक्टर खुराक को अनुभवपूर्वक निर्धारित करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार लेंटिवायरल वेक्टर का निपटान किया जाता है। - कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में वापस करें। इसके बाद, अनुभाग 5 में वर्णित एक मध्यम परिवर्तन करें।
नोट: सतह पर तैरने वाले में जीवित वायरस होता है। संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार निपटान करें। - 2 दिनों या उससे अधिक के बाद प्रवाह साइटोमेट्री (जैसे, जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए) द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करें। विवरण के लिए अनुभाग 8 देखें।
- हर 2 दिनों में मध्यम परिवर्तन करना जारी रखें, जैसा कि अनुभाग 5 में वर्णित है, जब तक कि प्रयोगात्मक अंत बिंदु तक नहीं पहुंच जाता।
8. एचएसपीसी संस्कृतियों का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण
- पीबीएस में 2% एफबीएस युक्त एक केंद्रित सुसंस्कृत पूर्व विवो एचएससी एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें (तालिका 4)। मिश्रण को 1 महीने तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते समय रोशनी बंद करके एक ऊतक संस्कृति हुड में काम करें। - कोशिकाओं के 50 μL में केंद्रित एंटीबॉडी मिश्रण का 2 μL जोड़ें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस नमूना धुंधला होने के साथ, मुआवजे और गेटिंग के लिए उपयुक्त धुंधला नियंत्रण नमूने तैयार करें।
- 200-1,000 μL PBS जोड़ें जिसमें 2% FBS और सेंट्रीफ्यूज 450 × ग्राम पर 4 °C पर 5 मिनट के लिए है। जितना संभव हो उतना सतह पर तैरने वाला निकालें और 2% एफबीएस और 0.5 μg / mL PI वाले PBS के 100-500 μL में पुन: निलंबित करें।
- प्रवाह साइटोमीटर सेट करें और प्रति नमूने कम से कम 10,000 जीवित कोशिकाओं को रिकॉर्ड करें।
नोट: फ्लो साइटोमीटर एक प्रशिक्षित वैज्ञानिक द्वारा संचालित किया जाना चाहिए। उपयोगकर्ताओं को इस विश्लेषण पर चर्चा करने के लिए अपनी स्थानीय एफएसीएस सुविधा से संपर्क करना चाहिए यदि वे फ्लो साइटोमेट्री में अनुभवी नहीं हैं। - एफसीएस प्रारूप में डेटा निर्यात करें और उपयुक्त प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें। यहां उपयोग की जाने वाली मानक गेटिंग रणनीति के लिए चित्रा 2 देखें।
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Representative Results
एचएससी के एफएसीएस शुद्धिकरण के लिए, हम उम्मीद करते हैं कि सी-किट-समृद्ध अस्थि मज्जा के भीतर, ~ 0.2% कोशिकाएं सीडी 150 + सीडी 34-सी-किट + एससीए 1 + वंश- युवा (8-12 सप्ताह के) सी 57बीएल / 6 चूहों के लिए आबादी हैं (चित्रा 1)। हालांकि, यह संभावना है कि ट्रांसजेनिक चूहे या विभिन्न उम्र के चूहे अलग-अलग एचएससी आवृत्तियों को प्रदर्शित करते हैं। संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद, हम उम्मीद करते हैं कि सीडी 201 + सीडी 150 + सी-किट + एससीए 1 + वंश- अंश ~ 10% होगा (चित्रा 2)। ये परिणाम सी-किट समृद्ध अस्थि मज्जा या एफएसीएस शुद्ध एचएससी से शुरू किए गए सेल संस्कृतियों के लिए समान हैं। जीएफपी-व्यक्त लेंटिवायरल वेक्टर (20 ट्रांसडक्शन यूनिट / सेल पर) के साथ पारगमन के बाद, हम ~ 30% जीएफपी + कोशिकाओं की उम्मीद करते हैं (चित्रा 3)।
जब हम प्रतिस्पर्धा करते हैं, तो हम संस्कृतियों को ~ 2 मिलियन कोशिकाओं / एमएल पर होने की उम्मीद करते हैं। संस्कृति के भीतर, हम मुख्य रूप से छोटे गोल कोशिकाओं को देखने की उम्मीद करते हैं, हालांकि बड़े गोल (मेगाकैरियोसाइट जैसी) कोशिकाओं की एक छोटी आवृत्ति देखना सामान्य है। सी-किट-समृद्ध अस्थि मज्जा से शुरू की गई कोशिका संस्कृतियों के भीतर, कुछ प्रारंभिक कोशिकामृत्यु की उम्मीद है। पहले मध्यम परिवर्तन ों से पहले पहले 24-48 घंटे के भीतर लगभग 50% कोशिका मृत्यु की उम्मीद है। इन संस्कृतियों में प्रारंभिक मृत कोशिका मलबे संभवतः हड्डी के मलबे (कुचल हड्डियों से) के बजाय संस्कृतियों के भीतर कोशिका मृत्यु से आता है, क्योंकि सी-किट-संवर्धन चरण को इस तरह की हड्डी के मलबे को कम करना चाहिए। सेल नंबर, हालांकि, 1 सप्ताह के बाद बीज वाले सेल नंबरों के 80% -100% पर वापस आ जाते हैं (अपेक्षित सेल घनत्व मूल्यों के लिए तालिका 5 देखें)। यदि खराब परिणाम दिखाई देते हैं, तो हम प्रोटोकॉल (तालिका 6) की समस्या निवारण की सलाह देते हैं। इस मामले में, सी-किट-समृद्ध अस्थि मज्जा प्रोटोकॉल (धारा 3) का उपयोग करके बैच-टेस्ट अभिकर्मकों के लिए यह सबसे सरल हो सकता है, क्योंकि यह एफएसीएस-सॉर्टिंग से जुड़ी जटिलताओं से बचाता है। ध्यान दें कि प्रतिनिधि परिणाम सामग्री की तालिका में विस्तृत अभिकर्मकों और उपकरणों के उपयोग पर आधारित हैं; विभिन्न विक्रेताओं से अभिकर्मकों का उपयोग करके समान परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं, हालांकि, नए अभिकर्मकों का सत्यापन (और अनुमापन) आवश्यक होने की संभावना है।
चित्रा 1: सी-किट-समृद्ध अस्थि मज्जा से एचएससी के एफएसीएस शुद्धिकरण के लिए गेटिंग रणनीति। सी-किट-समृद्ध अस्थि मज्जा से सीडी 150 + सीडी 34-सी-किट + एससीए 1 + वंशावली- कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली अनुक्रमिक गेटिंग। संक्षेप: एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; एचएससी = हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-डब्ल्यू = आगे स्कैटर-पीक चौड़ाई; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एसएससी-एच = साइड स्कैटर-पीक ऊंचाई; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफीकोसायनिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सुसंस्कृत एचएसपीसी के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति। एचएसपीसी संस्कृतियों से सीडी 201 + सीडी 150 + सी-किट + एससीए 1 + वंशावली- कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली अनुक्रमिक गेटिंग। संक्षेप: एचएसपीसी = हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-डब्ल्यू = आगे स्कैटर-पीक चौड़ाई; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एसएससी-एच = साइड स्कैटर-पीक ऊंचाई; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफिकोसायनिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: लेंटिवायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन से प्रतिनिधि परिणाम। ट्रांसडक्शन के बाद 48 घंटे में जीएफपी-व्यक्त लेंटिवायरल वेक्टर (20 ट्रांसडक्शन यूनिट / सेल) के साथ सुसंस्कृत एचएसपीसी ट्रांसडक्शन के बाद प्रतिनिधि जीएफपी अभिव्यक्ति। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एचएसपीसी = हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | F-12 में अंतिम एकाग्रता | Volume (μL) |
| हैम का एफ -12 माध्यम | N/A | 958 |
| 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन | 1x | 10 |
| 1 एम एचईपीईएस | 10 mM | 10 |
| 100 मिलीग्राम / एमएल पीवीए स्टॉक | 1 mg/mL | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| 100 μg/mL TPO स्टॉक | 100 ng/ | 1 |
| 10 μg/mL SCF स्टॉक | 10 ng/ | 1 |
तालिका 1: एचएससी मीडिया संरचना। पूर्ण माध्यम के 1 एमएल के लिए मीडिया अभिकर्मक वॉल्यूम। संक्षेप: पीवीए = पॉलीविनाइल अल्कोहल; एससीएफ = स्टेम सेल कारक; टीपीओ = थ्रोम्बोपोइटिन; ITSX = इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम-इथेनॉलमाइन।
| रोग-प्रतिकारक | एकाग्रता (μg/mL) | Volume (μL) |
| Ly6G/ Ly6C - बायोटिन | 0.5 | 100 |
| टेर 119 - बायोटिन | 0.5 | 100 |
| CD4 - बायोटिन | 0.5 | 25 |
| CD8a - बायोटिन | 0.5 | 25 |
| CD45R - बायोटिन | 0.5 | 50 |
| CD127 – बायोटिन | 0.5 | 50 |
| बाँझ पीबीएस | N/A | 350 |
तालिका 2: बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी कॉकटेल। बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के स्टॉक के लिए एंटीबॉडी वॉल्यूम।
| रोग-प्रतिकारक | सांद्रता (mg/mL) | Volume (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| सी-किट एपीसी | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Streptavidin APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| बाँझ पीबीएस | N/A | 291 |
तालिका 3: ताजा एचएससी एंटीबॉडी कॉकटेल। ताजा एचएससी एंटीबॉडी कॉकटेल के लिए एंटीबॉडी वॉल्यूम। संक्षेप: पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफीकोसायनिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट।
| रोग-प्रतिकारक | सांद्रता (mg/mL) | Volume (μL) |
| c-किट BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/ | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| बाँझ पीबीएस | N/A | 27.5 |
तालिका 4: सुसंस्कृत एचएससी एंटीबॉडी कॉकटेल (100x)। सुसंस्कृत एचएससी एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 एक्स स्टॉक के लिए एंटीबॉडी वॉल्यूम। संक्षेप: पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफीकोसायनिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट।
| संस्कृति | 24-48 घंटे पर सेल घनत्व | 24-48 घंटे पर % KSL | 1 सप्ताह में सेल घनत्व | 1 सप्ताह में % KSL |
| ताजा सी-किट + अस्थि मज्जा चढ़ाना | 0.5x106 mL-1 | 25-35% | 1-2x106 mL-1 | 50-60% |
| एचएसपीसी इलेक्ट्रोपोरेशन | 0.5x106 mL-1 | 25-35% | 0.5-1.5x106 mL-1 | 25-35% |
| एचएसपीसी लेंटीवायरस | 1.5x106 mL-1 | 20-25% | 1-2x106 mL-1 | 45-55% |
तालिका 5: अपेक्षित परिणाम। सी-किट + एससीए 1 + वंश- कोशिकाओं की अपेक्षित कोशिका घनत्व और आवृत्तियों (1) सी-किट + अस्थि मज्जा की सीडिंग, (2) इलेक्ट्रोपोरेशन, और (3) 1 × 106 कोशिकाओं एमएल -1 पर सीडिंग के आधार पर लेंटिवायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन। संक्षिप्तरूप: केएसएल = सी-किट + एससीए 1 + वंश-; एचएसपीसी = हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिका।
| समस्या | संभावित कारण / | समाधान/s | |||
| एलएस कॉलम की प्रवाह दर असामान्य रूप से धीमी है। | एलएस कॉलम भरा हुआ है। | चुंबक से स्तंभ निकालें। प्लंजर का उपयोग करके सेल सस्पेंशन को हटा दें और पीबीएस के एक और 5 एमएल के साथ दोहराएं। एक ताजा कॉलम और ताजा फ़िल्टर के साथ कॉलम संवर्धन दोहराएं। | |||
| संस्कृति के पहले 7 दिनों के भीतर बड़ी मात्रा में कोशिका मृत्यु | गलत अनुपात में समाप्त अभिकर्मकों या अभिकर्मकों का उपयोग करना। | सुनिश्चित करें कि रीजेंट उचित एकाग्रता पर हैं और सही ढंग से संग्रहीत हैं। | |||
| गलत इनक्यूबेटर तापमान। | इनक्यूबेटरों की नियमित सर्विसिंग और यह सुनिश्चित करना कि इनक्यूबेटर को यथासंभव बंद रखा जाए। | ||||
| 7 दिनों की संस्कृति के बाद संस्कृति का पतन | गलत सेल प्रकार क्रमबद्ध किया गया | सॉर्टिंग प्रोटोकॉल पर एचएससी एफएसीएस विशेषज्ञों से सलाह लें। सी-किट-समृद्ध अस्थि मज्जा के साथ अभिकर्मकों को मान्य करें। | |||
| अपूर्ण मीडिया परिवर्तन किए जा रहे हैं | अधिक पूर्ण मीडिया परिवर्तन करें. | ||||
| पारगमन के बाद अत्यधिक (उदाहरण के लिए, >50%) समग्र कोशिका मृत्यु | लेंटिवायरल वेक्टर विषाक्तता। | उपयोग किए गए वायरस कणों की मात्रा को कम करें। | |||
| इनक्यूबेशन बार 5 घंटे तक छोटा करें। | |||||
| अभिकर्मक के बाद अत्यधिक (उदाहरण के लिए, >50%) समग्र कोशिका मृत्यु | P3 घोल में बहुत लंबे समय तक छोड़ी गई कोशिकाएँ | जितनी जल्दी हो सके मीडिया में कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें, एक समय में केवल 2 नमूने इलेक्ट्रोपोरेट करें और पिपेटिंग करते समय सौम्य रहें (और वाइड-बोर पिपेट टिप्स का उपयोग करें)। | |||
| पाइपिंग बहुत सख्ती से कोशिकाओं को मारता है | |||||
| कम अभिकर्मक दक्षता | आरएनपी और / या सीएएस 9 एंजाइम का क्षरण। | गलत भंडारण, Cas9 को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर (RNase-मुक्त पानी के साथ पुनर्गठित)। | |||
| कम पारगमन दक्षता | कम लेंटिवायरल वेक्टर गतिविधि | विशिष्ट सेल आबादी के लिए टिट्रेट लेंटिवायरल वेक्टर, फ्रीज / पिघलने वाले लेंटिवायरल वेक्टर से बचें | |||
तालिका 6: सामान्य समस्या निवारण समस्याएँ. सामान्य समस्याओं का सारांश और सुझाए गए समस्या निवारण.
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Discussion
हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल एचएससी जीव विज्ञान, हेमटोपोइजिस और हेमेटोलॉजी की जांच के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करता है। एफएसीएस-शुद्ध एचएससी8 के लिए पीवीए-आधारित संस्कृति विधि के प्रारंभिक विकास के बाद से, विधि का विस्तार किया गया है। उदाहरण के लिए, विधि को अस्थि मज्जा से समृद्ध सी-किट और नकारात्मक सतह चार्जप्लेटों 14 के साथ काम करने के लिए दिखाया गया है। पारगमन और इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ इसकी संगतता भी14,15 प्रदर्शित की गई है। इन एचएससी और सी-किट + एचएसपीसी संस्कृतियों के विवो सत्यापन में इन प्रकाशनों में पाया जा सकता है, जबकि पाठक विवो प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल21 में अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख कर सकते हैं। हम प्रत्यारोपण के बाद ताजा और सुसंस्कृत एचएसपीसी के बीच वंश चिमेरिज्म में बड़ा अंतर नहीं देखते हैं, हालांकि, पूर्व विवो विस्तार के बाद व्यक्तिगत एचएससी की पुनर्गठन क्षमता अभी तक विस्तार से निर्धारित नहीं की गई है। इस दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न एचएससी की बड़ी संख्या आणविक या जैव रासायनिक परख का उपयोग करके एचएससी से पूछताछ करने के नए तरीके खोलती है जिनके लिए बड़ी सेल संख्या की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, इन संस्कृति प्रणालियों के भीतर आनुवंशिक रूप से संशोधित एचएससी उत्पन्न करने में सक्षम होने से हमें एचएससी गतिविधि और हेमटोपोइएटिक प्रणाली को विनियमित करने वाले तंत्र की जांच करने की अनुमति मिलनी चाहिए। उदाहरण के लिए, ये प्रणालियां आनुवंशिक स्क्रीन16 करने के लिए उत्तरदायी हैं।
यंत्रवत रूप से, हम अभी तक पूरी तरह से समझ नहीं पाए हैं कि पीवीए और अन्य पॉलिमर सीरम एल्बुमिन को प्रतिस्थापित कर सकते हैं और कुशल एचएससी विस्तार का समर्थन कर सकते हैं; हमारा मानना है कि पीवीए कम से कम आंशिक रूप से मीडिया 9 के भीतर साइटोकिन्स को स्थिर करने के माध्यम से सीरम एल्बुमिन को प्रतिस्थापित करताहै। इसके अतिरिक्त, सीरम एल्बुमिन उत्पादों में पाए जाने वाले खराब परिभाषित बायोएक्टिव संदूषकों की कमी एचएससी भेदभाव को कम करती प्रतीत होती है। सिंथेटिक पॉलिमर के उपयोग से एचएससी एक्स विवो22 का अध्ययन करते समय बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता और इन बायोएक्टिव दूषित पदार्थों से जुड़े भ्रामक प्रभावों को कम करने में भी मदद मिलनी चाहिए। इस बारे में भी अभी और अधिक सीखा जाना बाकी है कि कुछ पॉलिमर एचएससी एक्स विवो के लिए बेहतर समर्थन क्यों प्रदान करते हैं।
जबकि पहले से ही शक्तिशाली है, इन संस्कृति प्रोटोकॉल का आगे अनुकूलन और लक्षण वर्णन संभव होना चाहिए। विशेष रूप से, इन संस्कृतियों के भीतर एचएससी की शुद्धता में सुधार करना उपयोगी होगा। इन संस्कृतियों से दीर्घकालिक एचएससी डिब्बे को अलग करने वाले अतिरिक्त मार्कर भी इन सेल प्रकारों को ट्रैक करने और अलग करने में मदद करेंगे। यह देखना भी दिलचस्प है कि क्या इस प्रणाली का उपयोग अंततः एचएससी गतिविधि को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, बिना विवो प्रत्यारोपण परख की आवश्यकता के। हम अभी तक यह भी नहीं समझते हैं कि एचएससी को विवो में कितने समय तक विस्तारित किया जा सकता है, हालांकि यह निश्चित रूप से 6-8 सप्ताह से अधिक है यदि ठीक से बनाए रखाजाता है। अंत में, जबकि ये संस्कृतियां माउस एचएससी का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान करती हैं, मानव एचएससी जीव विज्ञान और हेमटोपोइजिस का अध्ययन करने के लिए एक अधिक ट्रैक्टेबल सिस्टम प्रदान करने के लिए मानव एचएससी के लिए समकक्ष संस्कृति प्रणाली विकसित करना भी महत्वपूर्ण है, और अंततः, नैदानिक स्टेम सेल प्रत्यारोपण उपचारों के लिए एचएससी उत्पन्न करने के लिए।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम फ्लो साइटोमेट्री एक्सेस के लिए डब्ल्यूआईएमएम फ्लो साइटोमेट्री कोर और लेंटिवायरल वेक्टर पीढ़ी के लिए डब्ल्यूआईएमएम वायरस स्क्रीनिंग कोर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को के केंडल ल्यूकेमिया फंड और यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
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