Summary
Aquí se presenta un protocolo para iniciar, mantener y analizar cultivos de células madre hematopoyéticas de ratón utilizando expansión ex vivo a base de alcohol polivinílico, así como métodos para manipularlos genéticamente mediante transducción lentiviral y electroporación.
Abstract
Las células madre hematopoyéticas multipotentes (HSC) autorrenovadoras son un tipo de célula importante debido a su capacidad para apoyar la hematopoyesis durante toda la vida y reconstituir todo el sistema sanguíneo después del trasplante. Las HSC se utilizan clínicamente en terapias de trasplante de células madre, que representan un tratamiento curativo para una variedad de enfermedades de la sangre. Existe un interés sustancial tanto en comprender los mecanismos que regulan la actividad de HSC y la hematopoyesis, como en desarrollar nuevas terapias basadas en HSC. Sin embargo, el cultivo estable y la expansión de HSC ex vivo ha sido una barrera importante en el estudio de estas células madre en un sistema ex vivo tratable. Recientemente desarrollamos un sistema de cultivo a base de alcohol polivinílico que puede apoyar la expansión a largo plazo y a gran escala de HSC de ratón trasplantables y métodos para editarlas genéticamente. Este protocolo describe métodos para cultivar y manipular genéticamente HSC de ratón a través de electroporación y transducción lentiviral. Se espera que este protocolo sea útil para una amplia gama de hematólogos experimentales interesados en la biología de HSC y la hematopoyesis.
Introduction
El sistema hematopoyético apoya una serie de procesos esenciales en mamíferos, desde el suministro de oxígeno hasta la lucha contra patógenos, pasando por la sangre especializada y los tipos de células inmunes. La producción continua de sangre (hematopoyesis) es necesaria para apoyar la homeostasis del sistema sanguíneo, que es sostenida por células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC)1. La célula hematopoyética más primitiva es la célula madre hematopoyética (HSC), que tiene capacidades únicas para la autorrenovación y la diferenciación multilinaje 2,3. Esta es una población celular rara, que se encuentra principalmente en la médula ósea adulta4, donde ocurren con una frecuencia de aproximadamente una cada 30,000 células. Se cree que las HSC apoyan la hematopoyesis de por vida y ayudan a restablecer la hematopoyesis después del estrés hematológico. Estas capacidades también permiten a las HSC reconstituir de manera estable todo el sistema hematopoyético después del trasplante en un receptor irradiado5. Esto representa la definición funcional de un HSC y también constituye la base científica para la terapia de trasplante de HSC, un tratamiento curativo para una variedad de enfermedades sanguíneas e inmunes6. Por estas razones, las HSC son un foco importante de la hematología experimental.
A pesar de un gran enfoque de investigación, ha seguido siendo un desafío expandir de manera estable las HSC ex vivo7. Recientemente hemos desarrollado el primer sistema de cultivo de expansión ex vivo a largo plazo para HSC de ratón8. El enfoque puede ampliar las HSC trasplantables en 234-899 veces durante un cultivo de 4 semanas. En comparación con los enfoques alternativos, el cambio importante en el protocolo fue la eliminación de la albúmina sérica y su reemplazo por un polímero sintético. El alcohol polivinílico (PVA) se identificó como un polímero óptimo para los cultivos HSC de ratón8, que ahora también se ha utilizado para cultivar otros tipos de células hematopoyéticas9. Sin embargo, también se ha identificado recientemente otro polímero llamado Soluplus (un copolímero de injerto de polivinilo caprolactama-acetato-polietilenglicol), que parece mejorar la expansión clonal de HSC10. Antes del uso de polímeros, se usaba albúmina sérica en forma de suero bovino fetal, fracción V de albúmina sérica bovina o albúmina sérica recombinante, pero estos tenían un apoyo limitado para la expansión de HSC y solo apoyaban cultivo ex vivo a corto plazo (~ 1 semana)7. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los protocolos de cultivo de HSC que retienen las HSC en estado de reposo pueden soportar un tiempo de cultivo ex vivo más largo11,12.
En comparación con otros métodos de cultivo, una ventaja importante de los cultivos basados en PVA es el número de células que se pueden generar y el tiempo que el protocolo se puede utilizar para rastrear HSC ex vivo. Esto supera varias barreras en el campo de la hematología experimental, como el bajo número de HSC aislables por ratón (solo unos pocos miles) y la dificultad de rastrear HSC a lo largo del tiempo in vivo. Sin embargo, es importante recordar que estos cultivos estimulan la proliferación de HSC, mientras que el pool de HSC in vivo es predominantemente inactivo en estado estacionario13. Además, aunque los cultivos son selectivos para las HSC, los tipos de células adicionales se acumulan con los cultivos con el tiempo, y las HSC trasplantables solo representan aproximadamente una de cada 34 células después de 1 mes. Las células progenitoras hematopoyéticas mieloides parecen ser el principal tipo de célula contaminante en estos cultivos de HSC8. Sin embargo, podemos usar estos cultivos para enriquecer las HSC de poblaciones celulares heterogéneas (por ejemplo, c-Kit+ HSPC de médula ósea14). También apoya la transducción o electroporación de HSCs para manipulación genética14,15,16. Para ayudar a identificar las HSC de la población heterogénea cultivada de HSPC, CD201 (EPCR) se ha identificado recientemente como un marcador útil ex vivo HSC 10,17,18, con HSC trasplantables restringidas a la fracción CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Linaje-.
Este protocolo describe métodos para iniciar, mantener y evaluar cultivos de expansión de HSC de ratón basados en PVA, así como protocolos para la manipulación genética dentro de estos cultivos mediante electroporación o transducción de vectores lentivirales. Se espera que estos métodos sean útiles para una variedad de hematólogos experimentales.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales, incluida la cría y la eutanasia, deben realizarse dentro de las pautas institucionales y nacionales. Los experimentos detallados a continuación fueron aprobados por el Ministerio del Interior del Reino Unido. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.
1. Preparación de soluciones madre
- Solución de stock de PVA
- Tome 50 ml de agua de calidad de cultivo de tejidos en una botella de vidrio pequeña (adecuada para esterilización en autoclave). Caliente el agua hasta casi hervir en un microondas.
- Pesar 5 g de polvo de PVA y añadir al agua.
NOTA: Se recomienda disolver sólo 1-5 g de PVA. La disolución de cantidades mayores puede resultar en una reconstitución incompleta. - Cierre la tapa herméticamente y agite para mezclar. Luego, afloje la tapa.
NOTA: Tenga cuidado al volver a abrir, ya que la presión puede cambiar debido a la temperatura cambiante del agua. - Autoclave y dejar enfriar. Cierre la tapa herméticamente y agite para mezclar. Hacer alícuotas en tubos estériles y almacenar durante un máximo de 3 meses a 4 °C.
- Disolver citoquinas liofilizadas en medio F-12 que contiene 1 mg/ml de PVA. Reconstituir el factor de células madre a 10 μg/ml y la trombopoyetina a 100 μg/ml para generar 1:1.000 cepas. Hacer alícuotas en tubos estériles y almacenar a largo plazo a -80 °C. Alternativamente, conservar las alícuotas a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
NOTA: Evitar la reconstitución de citoquinas en la albúmina sérica bovina debido al impacto negativo en la expansión de HSC en ratones.
2. Extracción de médula ósea HSC y enriquecimiento c-Kit+
- Diseccionar los fémures, tibias, pelvis y columna vertebral de ratones C57BL / 6 recién sacrificados de 8 a 12 semanas de edad (a través de asfixia de CO2 y / o dislocación cervical) y colocar los huesos en PBS en hielo.
NOTA: Asegúrese de que las superficies y herramientas estén esterilizadas con etanol al 70%. - Limpie los huesos con toallitas delicadas sin pelusa, eliminando el músculo y la médula espinal, y agréguelos a un mortero con ~ 3 ml de PBS.
NOTA: Asegúrese de que el mortero y el mortero se esterilicen con etanol al 70% y luego se laven una vez con PBS. - Aplaste los huesos con el mortero sin moler para minimizar las fuerzas de cizallamiento. Rompa los fragmentos grandes de médula ósea liberados en el PBS con una aguja de 19 G conectada a una jeringa de 5 ml. Transfiera la suspensión celular a través de un filtro de 70 μm a un tubo cónico de 50 ml.
- Una vez que se haya transferido la suspensión, repita con PBS fresco hasta que los huesos estén blanqueados y no se vea la médula. Apunte a un volumen final de ~ 30 ml por ratón y ~ 50 ml para dos ratones.
- Mezclar las células de la médula ósea, recoger 10 μL de células y contar utilizando la solución de Türks en una dilución de 1:10-1:20 con un hemocitómetro.
NOTA: Se espera que un ratón produzca 2-5 × 108 células enteras de médula ósea. - Girar a 450 × g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en PBS frío (350 μL para un ratón o 500 μL para dos ratones).
- Añadir 0,2 μL de anticuerpo anti-c-Kit de aloficocianina (APC) por cada 10 millones de células e incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C.
- Agregue 5 ml de PBS frío a las células incubadas para eliminar el exceso de anticuerpos y filtre a través de un filtro de 50 μm en un tubo cónico fresco de 15 ml.
- Lave el tubo original con 7 ml de PBS frío y transfiéralo a través del filtro. Si se produce una obstrucción del filtro, raye la superficie del filtro con una punta P1000.
- Girar a 450 × g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en PBS frío (350 μL para un ratón o 500 μL para dos ratones).
- Añadir 0,2 μL de microperlas anti-APC por cada 10 millones de células e incubar durante 15 min en la oscuridad a 4 °C. Agregue 12 ml de PBS estéril para lavar el exceso de microperlas.
- Girar las células a 450 × g durante 5 min a 4 °C y resuspender en 2 ml de PBS frío. Mientras las celdas giran en este paso, continúe con el paso 2.13.
- Prepárese para el enriquecimiento de la columna colocando una columna de filtración magnética en el imán de un separador de columna magnética, con un filtro de 50 μm en la parte superior y un tubo cónico de 15 ml debajo.
- Pase 3 ml de PBS estéril a través del filtro de 50 μm y la columna de filtración. Una vez que el PBS haya pasado, pase la suspensión celular a través de la columna, seguido de tres lavados de 3 ml de PBS frío cada vez. Para cada lavado, espere a que la columna deje de gotear antes de agregar el siguiente lavado.
- Retire la columna del imán y colóquela encima de un tubo fresco de 15 ml. Agregue 5 ml de PBS frío, coloque el émbolo de la columna en la columna y eluya las celdas empujando el émbolo.
- Mezclar las células enriquecidas con c-Kit, recoger 10 μL de células y contar con la solución de Türks en una dilución de 1:2 con un hemocitómetro. El rendimiento típico de un ratón es de 2-5 × 106 células c-Kit+ .
NOTA: En este punto, las células pueden sembrarse directamente en medios HSC o prepararse para la purificación de clasificación celular activada por fluorescencia HSC (FACS).
3. Inicio de cultivos celulares con HSPC enriquecidas con c-Kit
- Prepare un medio fresco (Tabla 1) para el número de células/pocillos necesarios. Semilla 0.5-1 millón de células por ml para HSPC enriquecidas con c-Kit.
- Haga girar las células enriquecidas con c-Kit y resuspenda en medio HSC a la densidad celular deseada.
- Transfiera las células a placas recubiertas de fibronectina o cargadas superficialmente negativas, a 200 μL por placa de 96 pocillos o 1 ml por placa de 24 pocillos.
- Colocar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% deCO2.
4. Inicio de cultivos celulares con HSC purificadas con FACS purificadas
- Preparar un volumen apropiado de la tinción de anticuerpos de linaje biotinilados: 3 μL de mezcla maestra (Tabla 2) por 10 millones de células, diluido 1:100 en PBS.
- Girar las células enriquecidas con c-Kit y resuspender en la tinción de anticuerpos de linaje durante 30 minutos a 4 °C.
- Lavar con 10 ml de PBS estéril y girar a 450 × g durante 5 min a 4 °C.
- Preparar un volumen adecuado de la tinción de anticuerpos HSC fresca (Tabla 3): 300 μL por 10 millones de células. Junto con esta tinción de muestras, prepare muestras de control de tinción apropiadas para compensación y gating.
NOTA: Trabaje en una campana de cultivo de tejidos con la luz apagada cuando se usan anticuerpos conjugados con colorante. - Resuspender las células en la tinción de anticuerpos HSC e incubar a 4 °C durante 90 min. Mezcle las células cada 20-30 minutos golpeando para evitar la granulación celular.
- Lavar con 10 ml de PBS estéril y girar a 450 × g durante 5 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante, mueva el gránulo para interrumpirlo y vuelva a suspenderlo en PBS estéril con yoduro de propidio (PI) de 0,5 μg/ml.
- Preparar medio fresco (Tabla 1) para el número de pocillos requeridos, y colocar en placa de fibronectina o placas con carga superficial negativa (200 μL por placa de 96 pocillos o 1 ml por placa de 24 pocillos).
- Prepare la máquina FACS para clasificar y clasificar las HSC CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- directamente en pozos que contienen medios (consulte la Figura 1 para conocer la estrategia estándar de compuerta FACS utilizada aquí). Ordenar hasta 200 celdas por pozo de placa de 96 pocillos o hasta 1.000 células por pozo de placa de 24 pocillos.
NOTA: Las máquinas FACS deben ser operadas por un científico capacitado. Se recomienda que los usuarios se pongan en contacto con su centro local de FACS para discutir esta estrategia de clasificación si no tienen experiencia en el aislamiento de FACS de ratones HSC.
5. Realizar cambios de medios
- Para cultivos celulares iniciados a partir de células enriquecidas con c-Kit, comience los cambios de medios después de 2 días. Para cultivos celulares iniciados a partir de HSC aisladas de FACS, comience los cambios de medios después de 5 días.
- Preparar suficiente medio HSC fresco precalentado (~37 °C) (Tabla 1) para todos los pozos.
- Retire suavemente la placa de la incubadora de cultivo de tejidos.
NOTA: Como las HSPC en placas cargadas superficialmente negativas se alteran más fácilmente que las de fibronectina, se debe tener especial cuidado al cambiar el medio en placas cargadas superficialmente negativas para evitar perturbar los cultivos celulares. - Usando una pipeta o bomba de vacío, retire lentamente ~ 90% -95% del medio del menisco del pozo.
NOTA: Evite extraer el medio de la base del pozo, de lo contrario se eliminarán muchas células. - Agregue 200 μL (para placas de 96 pocillos; 1 ml para placas de 24 pocillos) de medio fresco al pocillo.
- Devuelva la placa a la incubadora de cultivo de tejidos.
- Repita los pasos 5.1-5.6 cada 2-3 días hasta el punto final experimental.
- Para cultivos celulares iniciados con HSPC enriquecidos con c-Kit (sección 3), dividir los cultivos en una proporción de 1:2-1:3 después de ~3 semanas. Para cultivos celulares iniciados con HSC purificadas con FACS (sección 4), dividir los cultivos en una proporción de 1:2-1:3 después de ~3 semanas y cuando los cultivos sean >90% confluentes.
NOTA: La línea de tiempo exacta dependerá de los intereses experimentales. Estos cultivos se han caracterizado durante 4-8 semanas8, pero puede ser posible una duración adicional del cultivo.
6. HSPC cultivados electroporados
NOTA: Este protocolo es para la electroporación de la ribonucleoproteína Cas9/sgRNA (RNP), pero podría adaptarse para la electroporación de ARNm u otras proteínas recombinantes. Iniciar cultivos con un número suficiente de células para realizar esto en el punto de tiempo experimental deseado.
- Realizar un cambio medio 1 día antes de la electroporación, como se describe en la sección 5.
NOTA: Se recomienda un cultivo mínimo durante la noche antes de la electroporación. Sin embargo, las células generalmente se cultivan durante 1-3 semanas antes de la transducción. - El día de la electroporación, configure el nucleofector. Encienda el equipo. En la pantalla táctil, seleccione el módulo X y luego el tamaño de la cubeta utilizado.
- Preparar suficiente solución P3 (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para la escala de la electroporación (100 μL por cubeta o 20 μL por microcubeta) y dejar equilibrar a temperatura ambiente.
- Prepare suficiente medio fresco (Tabla 1) para el número de pocillos que se están chapando y agregue 500 μL de medio para un pozo de placa de 24 pocillos o 100 μL de medio a un pocillo de placa de 96 pocillos.
- Descongele el ARNg (prediluido a 2 μg/ml en agua libre de RNasa) en hielo y mezcle 16 μg de ARNg con 30 μg de enzima Cas9 (a 10 μg/ml) en un tubo de PCR estéril. Incluya un tubo de PCR adicional que contenga solo proteína Cas9 como control. Mezclar moviendo el tubo, luego girar brevemente hacia abajo. Incubar a 25 °C durante 10 minutos en un termociclador para complejar el RNP, y luego mantener los tubos en hielo.
NOTA: Esto se puede reducir cinco veces si se realiza electroporación en microcubetas. - Mezclar y transferir los HSPC para electroporación en un tubo; recoger 10 μL de las células y contar utilizando la solución de Türks en una dilución de 1:2 con un hemocitómetro.
NOTA: Se recomienda electroporar 1-5 millones de células por cubeta de 100 μL (reducida cinco veces para la microcubeta). - Girar las células numéricas apropiadas en un tubo de 1,5 ml a 450 × g durante 5 min a 4 °C. Aspirar la mayor cantidad posible de sobrenadante y resuspender con 100 μL de tampón nucleofectivo.
- Transfiera la suspensión celular inmediatamente al tubo de PCR que contiene el RNP complejado y la pipeta hacia arriba y hacia abajo lentamente para mezclar suavemente y transferir a una cubeta de electroporación de 100 μL. Expulse la mezcla en la cubeta lentamente y con un movimiento fluido para evitar la formación de burbujas de aire en la cubeta.
- En el electroporador, seleccione la posición de los pocillos que se están electroporando. Usando la pantalla táctil, seleccione el tipo de celular programa CD34+, humano, o escriba el código de pulso EO100. Pulse el botón OK .
- Transfiera las cubetas al electroporator. Pulse el botón Inicio de la pantalla táctil para iniciar la electroporación. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 500 μL del medio de cultivo a la cubeta (100 μL si se utiliza una microcubeta).
- Transfiera suavemente las células a la placa preparada y devuélvalas a la incubadora de cultivo de tejidos.
- Para los procedimientos que emplean una plantilla de donante AAV6, agregue el vector inmediatamente después de que las células se hayan transferido a una placa recubierta de fibronectina a una concentración de 5,000 vectores / célula.
- Después de 6-18 h, preparar medio fresco y realizar un cambio de medio como se describe en la sección 5. Para este cambio de medio, elimine solo el 80% -90% del medio.
NOTA: Evite extraer el medio desde la base del pozo. - Analizar las células por citometría de flujo después de 2 o más días (ver Sección 8 para más detalles).
- Continuar realizando cambios medios cada 2 días, como se describe en la sección 5, hasta que se alcance el punto final experimental.
NOTA: Las tasas de edición de CRISPR/Cas9 utilizando este método dependen en gran medida de la eficiencia de focalización del sgRNA diseñado. Se han observado tasas de edición de hasta el 95% con una guía eficiente15. Las directrices para el diseño de sgRNA se han detallado previamente en otra parte19,20.
7. Transducción de HSPC cultivadas con vector lentiviral
NOTA: Iniciar cultivos con un número suficiente de células, para realizar esto en el punto de tiempo experimental deseado.
- Generar y valorar vectores lentivirales (dependiendo de los objetivos experimentales). Descongelar vector lentiviral en hielo.
- Realizar un cambio medio (como en la sección 5); luego, mezcle y transfiera las HSPC para la transducción en un tubo. Recoger 10 μL de las células y contar utilizando la solución de Türks en una dilución de 1:2 con un hemocitómetro.
NOTA: Las células se pueden transducir inmediatamente después del recubrimiento. Sin embargo, las células generalmente se cultivan durante 1-3 semanas antes de la transducción. - Replatear la dosis requerida de células para la transducción (típicamente 100,000 células por placa de 96 pocillos). Por separado, placas de control negativo no transducidas.
NOTA: Si utiliza placas cargadas superficialmente negativas, transfiera las células a placas recubiertas de fibronectina para la transducción del vector lentiviral. - Agregue un vector lentiviral a cada pocillo de células: agregue 20 unidades de transducción por célula para lograr una eficiencia de transducción de ~ 30%. Sin embargo, determinar la dosis del vector lentiviral empíricamente, dependiendo de los requisitos experimentales.
NOTA: Asegúrese de que el vector lentiviral se elimine de acuerdo con las pautas institucionales. - Devuelva las células a la incubadora de cultivo de tejidos durante 6 h. Después, realice un cambio medio como se describe en la sección 5.
NOTA: El sobrenadante contiene virus vivos. Desechar de acuerdo con las directrices institucionales. - Analizar las células por citometría de flujo (por ejemplo, para la expresión de GFP) después de 2 días o más. Consulte la sección 8 para obtener más información.
- Continuar realizando cambios medios cada 2 días, como se describe en la sección 5, hasta que se alcance el punto final experimental.
8. Análisis citométrico de flujo de cultivos HSPC
- Preparar una mezcla concentrada de anticuerpos HSC ex vivo cultivados en PBS que contenga 2% de FBS (Tabla 4). Conservar la mezcla a 4 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 mes.
NOTA: Trabaje en una campana de cultivo de tejidos con las luces apagadas cuando se usan anticuerpos conjugados con colorante. - Agregue 2 μL de mezcla concentrada de anticuerpos a 50 μL de células. Incubar durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Junto con esta tinción de muestras, prepare muestras de control de tinción apropiadas para compensación y gating.
- Añadir 200-1.000 μL de PBS que contenga 2% de FBS y centrifugar a 450 × g durante 5 min a 4 °C. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante y vuelva a suspender en 100-500 μL de PBS que contenga 2% de FBS y 0,5 μg/ml de PI.
- Configure el citómetro de flujo y registre al menos 10,000 células vivas por muestra.
NOTA: Los citómetros de flujo deben ser operados por un científico capacitado. Los usuarios deben ponerse en contacto con su centro local de FACS para discutir este análisis si no tienen experiencia en citometría de flujo. - Exporte los datos en formato FCS y analice los datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo adecuado. Consulte la Figura 2 para conocer la estrategia de acceso estándar utilizada aquí.
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Representative Results
Para la purificación FACS de HSC, esperamos que dentro de la médula ósea enriquecida con c-Kit, ~ 0.2% de las células sean la población CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Linaje- para ratones jóvenes (8-12 semanas de edad) C57BL / 6 (Figura 1). Sin embargo, es probable que los ratones transgénicos o los ratones de diferentes edades muestren diferentes frecuencias de HSC. Después de 4 semanas de cultivo, esperamos que la fracción CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Linaje- sea ~10% (Figura 2). Estos resultados son similares para los cultivos celulares iniciados a partir de médula ósea enriquecida con c-Kit o HSC purificadas con FACS. Después de la transducción con un vector lentiviral que expresa GFP (a 20 unidades de transducción / célula), esperamos ~ 30% de células GFP + (Figura 3).
Cuando son confluentes, esperamos que los cultivos estén en ~ 2 millones de células / ml. Dentro del cultivo, esperamos ver principalmente células redondas pequeñas, aunque es normal ver una pequeña frecuencia de células redondas más grandes (similares a megacariocitos). Dentro de los cultivos celulares iniciados a partir de médula ósea enriquecida con c-Kit, se espera cierta muerte celular inicial14. Se espera aproximadamente un 50% de muerte celular dentro de las primeras 24-48 h, antes de que se realicen los primeros cambios en el medio. Los restos iniciales de células muertas en estos cultivos probablemente provienen de la muerte celular dentro de los cultivos en lugar de restos óseos (de los huesos triturados), ya que el paso de enriquecimiento de c-Kit debería agotar dichos desechos óseos. Los números de células, sin embargo, vuelven al 80%-100% de los números de células sembradas después de 1 semana (ver Tabla 5 para los valores de densidad celular esperados). Si se observan resultados deficientes, recomendamos solucionar problemas del protocolo (Tabla 6). En este caso, puede ser más sencillo probar por lotes los reactivos utilizando el protocolo de médula ósea enriquecido con c-Kit (Sección 3), ya que esto evita las complicaciones asociadas con la clasificación de FACS. Tenga en cuenta que los resultados representativos se basan en el uso de reactivos y equipos detallados en la Tabla de materiales; Se pueden lograr resultados similares utilizando reactivos de diferentes proveedores, sin embargo, es probable que sea necesaria la validación (y titulación) de nuevos reactivos.
Figura 1: Estrategia de acceso para la purificación por FACS de HSC a partir de médula ósea enriquecida con c-Kit. Activación secuencial utilizada para identificar células CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Linaje- de médula ósea enriquecida con c-Kit. Abreviaturas: FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; HSC = células madre hematopoyéticas; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; FSC-A = área de pico de dispersión hacia adelante; FSC-W = ancho de pico de dispersión hacia adelante; FSC-H = altura del pico de dispersión hacia adelante; SSC-H = altura del pico de dispersión lateral; IP = yoduro de propidio; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de gating para el análisis citométrico de flujo de HSPC cultivadas. Activación secuencial utilizada para identificar células CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Linaje- de cultivos HSPC. Abreviaturas: HSPCs = células madre y progenitoras hematopoyéticas; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; FSC-A = área de pico de dispersión hacia adelante; FSC-W = ancho de pico de dispersión hacia adelante; FSC-H = altura del pico de dispersión hacia adelante; SSC-H = altura del pico de dispersión lateral; IP = yoduro de propidio; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de la transducción de vectores lentivirales. Expresión representativa de GFP después de la transducción de HSPC cultivada con un vector lentiviral que expresa GFP (20 unidades de transducción/célula) a las 48 h después de la transducción. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; HSPC = células madre y progenitoras hematopoyéticas; FSC-H = altura pico de dispersión hacia adelante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Concentración final en F-12 | Volumen (μL) |
| Mediano F-12 de Ham | N/A | 958 |
| 100x Penicilina-Estreptomicina-Glutamina | 1x | 10 |
| 1 M HEPES | 10 mM | 10 |
| Stock de PVA de 100 mg/ml | 1 mg/ml | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| Stock de TPO de 100 μg/ml | 100 ng/ml | 1 |
| 10 μg/ml de stock de SCF | 10 ng/ml | 1 |
Tabla 1: Composición de medios HSC. Volúmenes de reactivos de medios para 1 ml de medio completo. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; SCF = factor de células madre; TPO = trombopoyetina; ITSX = insulina-transferrina-selenio-etanolamina.
| Anticuerpo | Concentración (μg/mL) | Volumen (μL) |
| Ly6G/Ly6C – biotina | 0.5 | 100 |
| Ter119 – biotina | 0.5 | 100 |
| CD4 – biotina | 0.5 | 25 |
| CD8a – biotina | 0.5 | 25 |
| CD45R – biotina | 0.5 | 50 |
| CD127 – biotina | 0.5 | 50 |
| PBS estéril | N/A | 350 |
Tabla 2: Cóctel de anticuerpos biotinilados. Volúmenes de anticuerpos para el stock del cóctel de anticuerpos de biotina.
| Anticuerpo | Concentración (mg/ml) | Volumen (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| c-Kit APC | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Estreptavidina APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| PBS estéril | N/A | 291 |
Tabla 3: Cóctel de anticuerpos HSC frescos. Volúmenes de anticuerpos para el cóctel de anticuerpos HSC fresco. Abreviaturas: PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína.
| Anticuerpo | Concentración (mg/ml) | Volumen (μL) |
| c-Kit BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| PBS estéril | N/A | 27.5 |
Tabla 4: Cóctel de anticuerpos HSC cultivados (100x). Volúmenes de anticuerpos para el stock 100x del cóctel de anticuerpos HSC cultivados. Abreviaturas: PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína.
| Cultura | Densidad celular a las 24-48 h | % KSL a las 24-48 h | Densidad celular a 1 semana | % KSL a 1 semana |
| Placa de médula ósea fresca c-Kit+ | 0,5x106 mL-1 | 25-35% | 1-2x106 mL-1 | 50-60% |
| Electroporación HSPC | 0,5x106 mL-1 | 25-35% | 0.5-1.5x106 mL-1 | 25-35% |
| HSPC lentivirus | 1,5x106 mL-1 | 20-25% | 1-2x106 mL-1 | 45-55% |
Cuadro 5: Resultados previstos. Densidades celulares esperadas y frecuencias de células c-Kit+Sca1+Linaje- después de (1) siembra de médula ósea c-Kit+, (2) electroporación, y (3) transducción de vectores lentivirales basada en siembra a 1 × 106 células mL-1. Abreviaturas: KSL = c-Kit+Sca1+Linaje-; HSPC = células madre hematopoyéticas y progenitoras.
| Emitir | Causa(s) probable(s) | Solución/es | |||
| El caudal de la columna LS es inusualmente lento. | La columna LS está obstruida. | Retire la columna del imán. Eluya la suspensión celular usando el émbolo y repita con otros 5 ml de PBS. Repita el enriquecimiento de la columna con una columna nueva y un filtro nuevo. | |||
| Gran cantidad de muerte celular dentro de los primeros 7 días de cultivo | Usar reactivos caducados o reactivos en proporciones incorrectas. | Asegúrese de que los regentes estén en la concentración adecuada y almacenados correctamente. | |||
| Temperatura incubadora inexacta. | Mantenimiento regular de las incubadoras y garantizar que la incubadora se mantenga cerrada tanto como sea posible. | ||||
| Colapso cultural después de 7 días de cultura | Tipo de celda incorrecto ordenado | Busque asesoramiento de los expertos de HSC FACS sobre los protocolos de clasificación. Validar reactivos con médula ósea enriquecida con c-Kit. | |||
| Se están realizando cambios de medios incompletos | Realice cambios de medios más completos. | ||||
| Muerte celular general excesiva (p. ej., >50%) después de la transducción | Toxicidad del vector lentiviral. | Reducir la cantidad de partículas de virus utilizadas. | |||
| Acortar los tiempos de incubación a 5 h. | |||||
| Muerte celular general excesiva (p. ej., >50%) después de la transfección | Células dejadas en la solución de P3 demasiado tiempo | Recupere las células en medios lo antes posible, electropolara solo 2 muestras a la vez y sea suave al pipetear (y use puntas de pipeta de gran calibre). | |||
| Las pipetas matan demasiado vigorosamente las células | |||||
| Baja eficiencia de transfección | Degradación de RNPs y/o enzima Cas9. | Almacenamiento incorrecto, almacenar Cas9 a -20 °C y ARN a -80 °C (reconstituido con agua libre de RNasa). | |||
| Baja eficiencia de transducción | Baja actividad vectorial lentiviral | Valorar el vector lentiviral para una población celular específica, evitar congelar/descongelar el vector lentiviral | |||
Tabla 6: Problemas comunes de solución de problemas. Resumen de problemas comunes y solución de problemas sugerida.
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Discussion
Esperamos que este protocolo proporcione un enfoque útil para investigar la biología de HSC, la hematopoyesis y la hematología en general. Desde el desarrollo inicial del método de cultivo basado en PVA para HSC purificadas con FACS8, el método se ha ampliado. Por ejemplo, se ha demostrado que el método funciona con c-Kit enriquecido con médula ósea y con placas cargadas superficialmente negativas14. También se ha demostrado su compatibilidad con transducción y electroporación14,15. La validación in vivo de estos cultivos HSC y c-Kit+ HSPC se puede encontrar en estas publicaciones, mientras que los lectores pueden consultar otros protocolos publicados para protocolos de trasplante in vivo 21. No vemos grandes diferencias en la quimería de linaje entre las HSPC frescas y cultivadas después del trasplante, sin embargo, la potencia de reconstitución de las HSC individuales después de la expansión ex vivo aún no se ha determinado en detalle. El gran número de HSC generadas por este enfoque abre nuevas formas de interrogar HSC utilizando ensayos moleculares o bioquímicos que requieren grandes números de células. Además, ser capaces de generar HSC genéticamente modificadas dentro de estos sistemas de cultivo debería permitirnos investigar más a fondo los mecanismos que regulan la actividad de HSC y el sistema hematopoyético. Por ejemplo, estos sistemas son susceptibles de realizar exámenes genéticos16.
Mecánicamente, todavía no entendemos completamente por qué el PVA y otros polímeros pueden reemplazar la albúmina sérica y apoyar la expansión eficiente de HSC; creemos que el PVA reemplaza al menos parcialmente la albúmina sérica a través de citoquinas estabilizadoras dentro de los medios9. Además, la falta de contaminantes bioactivos mal definidos que se encuentran en los productos de albúmina sérica parece reducir la diferenciación de HSC. El uso de polímeros sintéticos también debería ayudar a reducir la variabilidad de lote a lote y los efectos de confusión asociados con estos contaminantes bioactivos cuando se estudian HSC ex vivo22. También hay aún más por aprender sobre por qué ciertos polímeros proporcionan un mejor soporte para las HSC ex vivo.
Si bien ya es potente, debería ser posible una mayor optimización y caracterización de estos protocolos de cultivo. En particular, sería útil mejorar la pureza de las HSC dentro de estas culturas. Los marcadores adicionales que distinguen el compartimiento HSC a largo plazo de estos cultivos también ayudarían a rastrear y aislar estos tipos de células. También es interesante ver si este sistema puede ser utilizado eventualmente para cuantificar la actividad de HSC ex vivo, sin la necesidad de ensayos de trasplante in vivo . Tampoco entendemos todavía por cuánto tiempo las HSC pueden expandirse ex vivo, aunque ciertamente es más largo que 6-8 semanas si se mantiene adecuadamente8. Finalmente, si bien estos cultivos proporcionan un modelo útil para estudiar HSC de ratón, también es importante desarrollar sistemas de cultivo equivalentes para HSC humanas para proporcionar un sistema más manejable para estudiar la biología de HSC humana y la hematopoyesis, y eventualmente, generar HSC para terapias clínicas de trasplante de células madre.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al WIMM Flow Cytometry Core por el acceso a la citometría de flujo, y al WIMM Virus Screening Core por la generación de vectores lentivirales. Este trabajo fue financiado por el Fondo contra la Leucemia Kay Kendall y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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