Summary
Presentert her er en protokoll for å initiere, vedlikeholde og analysere mushematopoietiske stamcellekulturer ved hjelp av ex vivo polyvinylalkoholbasert ekspansjon, samt metoder for å genetisk manipulere dem ved lentiviral transduksjon og elektroporering.
Abstract
Selvfornyende multipotente hematopoietiske stamceller (HSC) er en viktig celletype på grunn av deres evne til å støtte hematopoiesis gjennom livet og rekonstituere hele blodsystemet etter transplantasjon. HSC brukes klinisk i stamcelletransplantasjonsterapier, som representerer kurativ behandling for en rekke blodsykdommer. Det er stor interesse for både å forstå mekanismene som regulerer HSC-aktivitet og hematopoiesis, og å utvikle nye HSC-baserte terapier. Imidlertid har den stabile kulturen og utvidelsen av HSCs ex vivo vært en stor barriere for å studere disse stamcellene i et håndterbart ex vivo-system. Vi har nylig utviklet et polyvinylalkoholbasert kultursystem som kan støtte langsiktig og storskala utvidelse av transplanterbare muse-HSC-er og metoder for å genetisk redigere dem. Denne protokollen beskriver metoder for å dyrke og genetisk manipulere muse-HSC via elektroporering og lentiviral transduksjon. Denne protokollen forventes å være nyttig for et bredt spekter av eksperimentelle hematologer som er interessert i HSC-biologi og hematopoiesis.
Introduction
Det hematopoietiske systemet støtter en rekke viktige prosesser hos pattedyr, fra oksygenforsyning til bekjempelse av patogener, gjennom spesialiserte blod- og immuncelletyper. Kontinuerlig blodproduksjon (hematopoiesis) er nødvendig for å støtte blodsystemets homeostase, som opprettholdes av hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs)1. Den mest primitive hematopoietiske cellen er den hematopoietiske stamcellen (HSC), som har unike kapasiteter for selvfornyelse og multilineær differensiering 2,3. Dette er en sjelden cellepopulasjon, hovedsakelig funnet i den voksne benmarg4, hvor de forekommer med en frekvens på bare omtrent en hver 30.000 celler. HSCs antas å støtte livslang hematopoiesis og bidra til å gjenopprette hematopoiesis etter hematologisk stress. Disse kapasitetene gjør det også mulig for HSC å stabilt rekonstituere hele det hematopoietiske systemet etter transplantasjon til en bestrålt mottaker5. Dette representerer den funksjonelle definisjonen av en HSC og danner også det vitenskapelige grunnlaget for HSC-transplantasjonsterapi, en kurativ behandling for en rekke blod- og immunsykdommer6. Av disse grunner er HSC et hovedfokus for eksperimentell hematologi.
Til tross for et stort fokus på forskning, har det vært utfordrende å stabilt utvide HSCs ex vivo7. Vi har nylig utviklet det første langsiktige ex vivo ekspansjonskultursystemet for mus HSCs8. Tilnærmingen kan utvide transplanterbare HSCs med 234-899 ganger over en 4 ukers kultur. Sammenlignet med alternative tilnærminger var den store endringen i protokollen fjerning av serumalbumin og erstatning med en syntetisk polymer. Polyvinylalkohol (PVA) ble identifisert som en optimal polymer for musens HSC-kulturer8, som nå også har blitt brukt til å dyrke andre hematopoietiske celletyper9. Imidlertid har en annen polymer kalt Soluplus (en polyvinyl kaprolaktam-acetat-polyetylenglykolgraft-kopolymer) også nylig blitt identifisert, noe som ser ut til å forbedre klonal HSC-ekspansjon10. Før bruk av polymerer ble serumalbumin i form av føtalt bovint serum, bovint serumalbumin fraksjon V eller rekombinant serumalbumin brukt, men disse hadde begrenset støtte for HSC-ekspansjon og støttet kun kortvarig (~1 uke) ex vivo dyrkning7. Det skal imidlertid bemerkes at HSC-kulturprotokoller som beholder HSC-er i hviletilstand, kan støtte en lengre ex vivo-kulturtid 11,12.
Sammenlignet med andre dyrkningsmetoder er en stor fordel med PVA-baserte kulturer antall celler som kan genereres og hvor lang tid protokollen kan brukes til å spore HSCs ex vivo. Dette overvinner flere barrierer innen eksperimentell hematologi, for eksempel det lave antallet HSC-er som kan isoleres per mus (bare noen få tusen) og vanskeligheten med å spore HSC-er over tid in vivo. Det er imidlertid viktig å huske at disse kulturene stimulerer HSC-spredning, mens in vivo HSC-bassenget hovedsakelig hviler ved en jevn tilstand13. I tillegg, selv om kulturene er selektive for HSC, akkumuleres ytterligere celletyper med kulturene over tid, og transplanterbare HSCer representerer bare omtrent en av 34 celler etter 1 måned. Myeloid hematopoietiske stamceller ser ut til å være den viktigste forurensende celletypen i disse HSC-kulturene8. Likevel kan vi bruke disse kulturene til å berike HSCs fra heterogene cellepopulasjoner (f.eks. c-Kit + benmarg HSPCs14). Den støtter også transduksjon eller elektroporering av HSC for genetisk manipulering14,15,16. For å bidra til å identifisere HSC fra den heterogene dyrkede HSPC-populasjonen, har CD201 (EPCR) nylig blitt identifisert som en nyttig ex vivo HSC-markør 10,17,18, med transplanterbare HSCer begrenset til CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-fraksjonen.
Denne protokollen beskriver metoder for å initiere, vedlikeholde og vurdere PVA-baserte HSC-ekspansjonskulturer for mus, samt protokoller for genetisk manipulering innenfor disse kulturene ved bruk av elektroporering eller lentiviral vektortransduksjon. Disse metodene forventes å være nyttige for en rekke eksperimentelle hematologer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer, inkludert avl og avlivning, skal utføres innenfor institusjonelle og nasjonale retningslinjer. Eksperimentene beskrevet nedenfor ble godkjent av det britiske innenriksdepartementet. Se materialfortegnelsen for en liste over alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Utarbeide lagerløsninger
- PVA-lagerløsning
- Ta 50 ml vann av vevskulturkvalitet i en liten glassflaske (egnet for autoklavering). Varm vannet til nesten kokende i mikrobølgeovn.
- Vei ut 5 g PVA-pulver og tilsett vannet.
MERK: Det anbefales kun å oppløse 1-5 g PVA. Oppløsning av større mengder kan føre til ufullstendig rekonstituering. - Lukk lokket tett og rist for å blande. Løsne deretter lokket.
MERK: Vær forsiktig når du åpner igjen, da trykket kan endres på grunn av den endrede vanntemperaturen. - Autoklav og la avkjøles. Lukk lokket tett og rist for å blande. Lag alikoter i sterile rør og oppbevar i opptil 3 måneder ved 4 °C.
- Oppløs lyofiliserte cytokiner i F-12 medium inneholdende 1 mg/ml PVA. Rekonstituer stamcellefaktoren til 10 μg/ml og trombopoietin til 100 μg/ml for å generere 1:1000 lagre. Lag alikoter i sterile rør og oppbevar lenge ved -80 °C. Alternativt kan alikotene oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
MERK: Unngå rekonstituering av cytokiner i bovint serumalbumin på grunn av den negative innvirkningen på HSC-ekspansjon hos mus.
2. HSC benmargsekstraksjon og c-Kit + anrikning
- Dissekere lårben, tibias, bekken og ryggrad fra nyavlivet 8-12 uker gamle C57BL/6 mus (via CO2 kvelning og / eller cervical dislokasjon) og legg beinene i PBS på is.
MERK: Forsikre deg om at overflatene og verktøyene er sterilisert med 70% etanol. - Rengjør beinene med lofrie delikate arbeidsservietter, fjern muskler og ryggmarg, og legg til en mørtel med ~ 3 ml PBS.
MERK: Forsikre deg om at støtet og mørtelen er sterilisert med 70% etanol og deretter vasket ut en gang med PBS. - Knus beinene med stammen uten sliping for å minimere skjærekrefter. Bryt opp store benmargsfragmenter som slippes ut i PBS ved hjelp av en 19 G nål festet til en 5 ml sprøyte. Overfør cellesuspensjonen gjennom et 70 μm filter til et 50 ml konisk rør.
- Når suspensjonen er overført, gjenta med fersk PBS til beinene er bleket og ingen marg er synlig. Sikt på et sluttvolum på ~ 30 ml per mus og ~ 50 ml for to mus.
- Bland benmargscellene, samle 10 μL celler, og telle ved hjelp av Türks 'løsning ved en fortynning på 1: 10-1: 20 med et hemocytometer.
MERK: En mus forventes å gi 2-5 × 108 hele benmargceller. - Sentrifugerer 450 × g i 5 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og resuspender pelleten i kald PBS (350 μL for én mus eller 500 μL for to mus).
- Tilsett 0,2 μl allophycocyanin (APC) anti-c-Kit antistoff per 10 millioner celler og inkuber i 30 minutter i mørket ved 4 °C.
- Tilsett 5 ml kald PBS til de inkuberte cellene for å vaske av overflødig antistoff og filtrer gjennom et 50 μm filter i et friskt 15 ml konisk rør.
- Vask originaltuben med 7 ml kald PBS og overfør gjennom filteret. Hvis det oppstår tilstopping av filteret, skrap filteroverflaten med en P1000-spiss.
- Sentrifugerer 450 × g i 5 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og resuspender pelleten i kald PBS (350 μL for én mus eller 500 μL for to mus).
- Tilsett 0,2 μL anti-APC-mikroperler per 10 millioner celler og inkuber i 15 minutter i mørket ved 4 °C. Tilsett 12 ml steril PBS for å vaske av overflødige mikroperler.
- Spinn ned cellene ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C og resuspender i 2 ml kald PBS. Mens cellene spinner i dette trinnet, fortsett til trinn 2.13.
- Forbered deg på kolonneberikelse ved å plassere en magnetisk filtreringskolonne i magneten til en magnetisk kolonneseparator, med et 50 μm filter på toppen og et 15 ml konisk rør under.
- Kjør 3 ml steril PBS gjennom filter- og filtreringskolonnen på 50 μm. Når PBS har løpt gjennom, pass cellesuspensjonen gjennom kolonnen, etterfulgt av tre vasker med 3 ml kald PBS hver gang. For hver vask, vent til kolonnen slutter å dryppe før du legger til neste vask.
- Fjern kolonnen fra magneten og legg den på toppen av et nytt 15 ml rør. Tilsett 5 ml kald PBS, fest søylestempelet på kolonnen, og eluer cellene ved å skyve stempelet.
- Bland de c-Kit-berikede cellene, samle 10 μL celler og telle ved hjelp av Türks 'løsning ved en fortynning på 1: 2 med et hemocytometer. Det typiske utbyttet fra en mus er 2-5 × 106 c-Kit + celler.
MERK: På dette tidspunktet kan cellene sås direkte i HSC-medier eller fremstilles for HSC-fluorescensaktivert cellesortering (FACS) rensing.
3. Initiere cellekulturer med c-Kit-berikede HSPCer
- Tilbered ferskt medium (tabell 1) for det antall celler/brønner som kreves. Frø 0,5-1 million celler per ml for c-Kit-berikede HSPCer.
- Spinn ned de c-Kit-berikede cellene og resuspender i HSC-medium ved ønsket celletetthet.
- Overfør cellene til fibronektinbelagte eller negative overflateladede plater, ved 200 μL per 96-brønnplate eller 1 ml per 24-brønnplate.
- Plasser cellene i en vevskulturinkubator satt til 37 ° C og 5% CO2.
4. Initiere cellekulturer med FACS-rensede HSC-er
- Forbered et passende volum av den biotinylerte avstamningsantistoffflekken: 3 μL masterblanding (tabell 2) per 10 millioner celler, fortynnet 1:100 i PBS.
- Spinn ned de c-Kit-berikede cellene og resuspender i avstamningsantistoffflekken i 30 minutter ved 4 °C.
- Vask med 10 ml steril PBS og senker den ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Forbered et passende volum av den ferske HSC-antistoffflekken (tabell 3): 300 μL per 10 millioner celler. Ved siden av denne prøvefargingen, forbered passende fargekontrollprøver for kompensasjon og gating.
MERK: Arbeid i en vevskulturhette med lyset av når du bruker fargekonjugerte antistoffer. - Resuspender cellene i HSC-antistoffflekken og inkuber ved 4 °C i 90 minutter. Bland cellene hvert 20-30 minutt ved å trykke for å forhindre cellepelletering.
- Vask med 10 ml steril PBS og senker den ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten, knips pelleten for å forstyrre, og resuspender i steril PBS med 0,5 μg/ml propidiumjodid (PI).
- Forbered ferskt medium (tabell 1) for antall brønner som kreves, og plate i fibronektin eller negative overflateladede plater (200 μL per 96-brønnplate eller 1 ml per 24-brønnsplate).
- Forbered FACS-maskinen for sortering og sortering CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage-HSCs direkte i medieholdige brønner (se figur 1 for standard FACS gating-strategi brukt her). Sorter opptil 200 celler per platebrønn med 96 brønner eller opptil 1000 celler per 24-brønns platebrønn.
MERK: FACS-maskiner skal betjenes av en utdannet forsker. Det anbefales at brukere kontakter sitt lokale FACS-anlegg for å diskutere denne sorteringsstrategien hvis de ikke har erfaring med FACS-isolering av HSC-er for mus.
5. Utføre medieendringer
- For cellekulturer initiert fra c-Kit-berikede celler, begynner medieendringer etter 2 dager. For cellekulturer initiert fra FACS-isolerte HSC, begynner medieendringer etter 5 dager.
- Tilbered tilstrekkelig fersk, forvarmet (~37 °C) HSC-medium (tabell 1) for alle brønner.
- Fjern forsiktig platen fra vevskulturinkubatoren.
MERK: Siden HSPCer på negative overflateladede plater lettere forstyrres enn de på fibronektin, bør det utvises ekstra forsiktighet når du bytter medium på negative overflateladede plater for å unngå å forstyrre cellekulturene. - Bruk en pipette eller vakuumpumpe, fjern sakte ~ 90% -95% av mediet fra brønnmenisken.
MERK: Unngå å trekke opp mediet fra bunnen av brønnen, ellers vil mange celler bli fjernet. - Tilsett 200 μL (for 96-brønnplater; 1 ml for 24-brønnsplater) friskt medium til brønnen.
- Sett platen tilbake til vevskulturinkubatoren.
- Gjenta trinn 5.1-5.6 hver 2-3 dag til det eksperimentelle sluttpunktet.
- For cellekulturer initiert med c-Kit-berikede HSPCer (seksjon 3), splitt kulturene i forholdet 1: 2-1: 3 etter ~ 3 uker. For cellekulturer initiert med FACS renset HSC (seksjon 4), splitt kulturene i forholdet 1: 2-1: 3 etter ~ 3 uker og når kulturene er >90% sammenflytende.
MERK: Den nøyaktige tidslinjen vil avhenge av eksperimentelle interesser. Disse kulturene har blitt karakterisert i 4-8 uker8, men ytterligere kulturlengder kan være mulig.
6. Elektroporering av kultiverte HSPC-er
MERK: Denne protokollen er for elektroporering av Cas9 / sgRNA ribonukleoprotein (RNP), men kan tilpasses for elektroporering av mRNA eller andre rekombinante proteiner. Initiere kulturer med tilstrekkelig antall celler for å utføre dette på ønsket eksperimentelt tidspunkt.
- Utfør middels endring 1 dag før elektroporering, som beskrevet i avsnitt 5.
MERK: Minst en overnattingskultur før elektroporering anbefales. Imidlertid dyrkes celler vanligvis i 1-3 uker før transduksjon. - På dagen for elektroporering, sett opp nukleofektoren. Slå på maskinen. På berøringsskjermen velger du X-modulen og deretter kyvettestørrelsen som brukes.
- Forbered tilstrekkelig P3-løsning (i henhold til produsentens instruksjoner) for skalaen av elektroporasjonen (100 μL per kyvette eller 20 μL per mikrokuvett) og la den balansere til romtemperatur.
- Klargjør tilstrekkelig ferskt medium (tabell 1) for antall brønner som belagt, og tilsett 500 μL medium for en 24-brønns platebrønn eller 100 μL media til en platebrønn med 96 brønner.
- Tine ut sgRNA (forfortynnet til 2 μg/ml i RNase-fritt vann) på is og bland 16 μg sgRNA med 30 μg Cas9-enzym (ved 10 μg/ml) i et sterilt PCR-rør. Inkluder et ekstra PCR-rør som bare inneholder Cas9-protein som en kontroll. Bland ved å knipse røret, og spinn deretter kort ned. Inkuber ved 25 ° C i 10 minutter i en termosyklist for å komplekse RNP, og hold deretter rørene på is.
MERK: Dette kan nedskaleres fem ganger hvis du utfører elektroporering i mikrokuvetter. - Bland og overfør HSPCene for elektroporering til et rør; samle 10 μL av cellene og telle ved hjelp av Türks 'løsning ved en fortynning på 1: 2 med et hemocytometer.
MERK: Det anbefales å elektroporere 1-5 millioner celler per 100 μL kyvette (nedskalert fem ganger for mikrokuvetten). - Spinn ned riktig antall celler i et 1,5 ml rør ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer så mye av supernatanten som mulig og resuspender med 100 μL nukleofeksjonsbuffer.
- Overfør cellesuspensjonen umiddelbart til PCR-røret som inneholder den komplekse RNP og pipetten sakte opp og ned for å blande forsiktig og overføre til en 100 μL elektroporasjonskuvett. Støt blandingen sakte ut i kyvetten og i én flytende bevegelse for å unngå dannelse av luftbobler i kyvetten.
- På elektroporatoren velger du posisjonen til brønnene som blir elektroporert. Bruk berøringsskjermen til å velge celletypeprogrammet CD34+, menneske, eller skriv inn pulskoden EO100. Trykk på OK-knappen .
- Overfør kyvettene til elektroporatoren. Trykk på Start-knappen på berøringsskjermen for å starte elektroporering. Rett etter elektroporering, tilsett 500 μL av kulturmediet til kyvetten (100 μL hvis du bruker en mikrokuvett).
- Overfør forsiktig cellene til den forberedte platen og gå tilbake til vevskulturinkubatoren.
- For prosedyrer med en AAV6-donormal, legg til vektoren umiddelbart etter at cellene er overført til en fibronektinbelagt plate i en konsentrasjon på 5000 vektorer/celle.
- Etter 6-18 timer tilberedes ferskt medium og utfører en middels forandring som beskrevet i avsnitt 5. For denne middels endringen, fjern bare 80% -90% av mediet.
MERK: Unngå å trekke opp mediet fra bunnen av brønnen. - Analyser cellene ved hjelp av flowcytometri etter 2 dager eller mer (se avsnitt 8 for detaljer).
- Fortsett å utføre middels endringer hver 2. dag, som beskrevet i avsnitt 5, inntil det eksperimentelle sluttpunktet er nådd.
MERK: Redigeringsfrekvenser for CRISPR / Cas9 ved hjelp av denne metoden er avhengige av målrettingseffektiviteten til det designede sgRNA. Redigeringsfrekvenser på opptil 95% har blitt observert med en effektiv guide15. Retningslinjer for sgRNA-design er tidligere beskrevet andre steder19,20.
7. Transdusere dyrkede HSPCer med lentiviral vektor
MERK: Start kulturer med tilstrekkelig antall celler, for å utføre dette på ønsket eksperimentelt tidspunkt.
- Generer og titer lentiviral vektor (avhengig av eksperimentelle mål). Tine lentiviral vektor på is.
- Utfør en middels endring (som i avsnitt 5); deretter blande og overføre HSPCs for transduksjon i et rør. Samle 10 μL av cellene og telle ved hjelp av Türks 'løsning ved en fortynning på 1: 2 med et hemocytometer.
MERK: Celler kan transduseres umiddelbart etter plating. Imidlertid dyrkes celler vanligvis i 1-3 uker før transduksjon. - Replate den nødvendige dosen av celler for transduksjon (vanligvis 100.000 celler per 96-brønnplate). Separat, plate un-transduced negative kontrollceller.
MERK: Hvis du bruker negative overflateladede plater, overfør cellene til fibronektinbelagte plater for lentiviral vektortransduksjon. - Legg lentiviral vektor til hver cellebrønn: legg til 20 transduksjonsenheter per celle for å oppnå ~ 30% transduksjonseffektivitet. Bestem imidlertid den lentivirale vektordosen empirisk, avhengig av eksperimentelle krav.
MERK: Sørg for at lentivirale vektorer avhendes i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Returner cellene til vevskulturinkubatoren i 6 timer. Utfør deretter en middels endring som beskrevet i avsnitt 5.
MERK: Supernatanten inneholder levende virus. Kastes i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Analyser cellene ved flowcytometri (f.eks. for GFP-ekspresjon) etter 2 dager eller mer. Se avsnitt 8 for detaljer.
- Fortsett å utføre middels endringer hver 2. dag, som beskrevet i avsnitt 5, inntil det eksperimentelle sluttpunktet er nådd.
8. Flowcytometrisk analyse av HSPC-kulturer
- Tilbered en konsentrert dyrket ex vivo HSC antistoffblanding i PBS inneholdende 2% FBS (tabell 4). Oppbevar blandingen ved 4 °C i mørket i opptil 1 måned.
MERK: Arbeid i en vevskulturhette med lysene av når du bruker fargekonjugerte antistoffer. - Tilsett 2 μL konsentrert antistoffblanding til 50 μL celler. Rug i 30 minutter ved 4 °C i mørket. Ved siden av denne prøvefargingen, forbered passende fargekontrollprøver for kompensasjon og gating.
- Tilsett 200-1000 μL PBS inneholdende 2% FBS og sentrifuge ved 450 × g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern så mye supernatant som mulig og resuspender i 100-500 mikrol PBS inneholdende 2% FBS og 0,5 mikrogram / ml PI.
- Sett opp flowcytometeret og registrer minst 10 000 levende celler per prøve.
MERK: Flowcytometre skal drives av en utdannet forsker. Brukere må kontakte sitt lokale FACS-anlegg for å diskutere denne analysen hvis de ikke har erfaring med flowcytometri. - Eksporter dataene i FCS-format og analyser dataene ved hjelp av passende programvare for flowcytometrianalyse. Se figur 2 for standard gating-strategi brukt her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For FACS-rensing av HSC-er forventer vi at i den c-Kit-berikede benmargen er ~0,2% av cellene CD150+CD34-c-Kit + Sca1+Lineage- populasjonen for unge (8-12 uker gamle) C57BL/6-mus (figur 1). Imidlertid er det sannsynlig at transgene mus eller mus i forskjellige aldre viser forskjellige HSC-frekvenser. Etter 4 ukers kultur forventer vi at CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-fraksjonen vil være ~10% (figur 2). Disse resultatene ligner for cellekulturer initiert fra c-Kit beriket benmarg eller FACS renset HSCs. Etter transduksjon med en GFP-uttrykkende lentiviral vektor (ved 20 transduksjonsenheter/celle) forventer vi ~30 % GFP+-celler (figur 3).
Når de er sammenflytende, forventer vi at kulturene skal være på ~ 2 millioner celler / ml. Innenfor kulturen forventer vi å se hovedsakelig små runde celler, selv om det er normalt å se en liten frekvens av større runde (megakaryocyttlignende) celler. Innenfor cellekulturene initiert fra c-Kit-beriket benmarg, forventes noe initial celledød14. Omtrent 50% celledød forventes innen de første 24-48 timene, før de første mediumendringene utføres. Innledende døde cellerester i disse kulturene kommer sannsynligvis fra celledød i kulturen i stedet for beinrester (fra knuste bein), siden c-Kit-anrikningstrinnet skal tømme slike beinrester. Celletall går imidlertid tilbake til 80%-100% av de sådde cellenumrene etter 1 uke (se tabell 5 for forventede celletetthetsverdier). Hvis man ser dårlige resultater, anbefaler vi å feilsøke protokollen (tabell 6). I dette tilfellet kan det være enklest å batch-teste reagenser ved hjelp av c-Kit-beriket benmargsprotokoll (avsnitt 3), da dette unngår komplikasjoner forbundet med FACS-sortering. Merk at de representative resultatene er basert på bruk av reagenser og utstyr som er beskrevet i materialfortegnelsen. Lignende resultater kan oppnås ved bruk av reagenser fra forskjellige leverandører, men validering (og titrering) av nye reagenser vil sannsynligvis være nødvendig.
Figur 1: Gating strategi for FACS rensing av HSCs fra c-Kit-beriket benmarg. Sekvensiell gating brukes til å identifisere CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage-celler fra c-Kit-beriket benmarg. Forkortelser: FACS = fluorescensaktivert cellesortering; HSCs = hematopoietiske stamceller; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremover scatter-peak område; FSC-W = fremover scatter-peak bredde; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; SSC-H = side scatter-peak høyde; PI = propidiumjodid; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gating strategi for flowcytometrisk analyse av dyrkede HSPCer. Sekvensiell gating brukes til å identifisere CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-celler fra HSPC kulturer. Forkortelser: HSPCs = hematopoietiske stam- og stamceller; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremover scatter-peak område; FSC-W = fremover scatter-peak bredde; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; SSC-H = side scatter-peak høyde; PI = propidiumjodid; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater fra lentiviral vektortransduksjon. Representativt GFP-uttrykk etter dyrket HSPC-transduksjon med en GFP-uttrykkende lentiviral vektor (20 transduksjonsenheter/celle) ved 48 timer etter transduksjon. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; HSPCs = hematopoietiske stam- og stamceller; FSC-H = fremover scatter-peak høyde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Endelig konsentrasjon i F-12 | Volum (μL) |
| Hams F-12 medium | N/A | 958 |
| 100x penicillin-streptomycin-glutamin | 1x | 10 |
| 1 M HEPES | 10 mM | 10 |
| 100 mg/ml PVA lager | 1 mg/ml | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| 100 μg/ml TPO-lager | 100 ng/ml | 1 |
| 10 μg/ml SCF-lager | 10 ng/ml | 1 |
Tabell 1: HSC-mediesammensetning. Mediereagensvolum for 1 ml komplett medium. Forkortelser: PVA = polyvinylalkohol; SCF = stamcellefaktor; TPO = trombopoietin; ITSX = insulin-transferrin-selen-etanolamin.
| Antistoff | Konsentrasjon (μg/ml) | Volum (μL) |
| Ly6G/Ly6C – biotin | 0.5 | 100 |
| Ter119 – biotin | 0.5 | 100 |
| CD4 – biotin | 0.5 | 25 |
| CD8a – biotin | 0.5 | 25 |
| CD45R – biotin | 0.5 | 50 |
| CD127 – biotin | 0.5 | 50 |
| Steril PBS | N/A | 350 |
Tabell 2: Biotinylert antistoffcocktail. Antistoffvolumer for bestanden av biotinantistoffcocktailen.
| Antistoff | Konsentrasjon (mg/ml) | Volum (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| c-Kit APC | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Streptavidin APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| Steril PBS | N/A | 291 |
Tabell 3: Fersk HSC antistoffcocktail. Antistoffvolum for den ferske HSC-antistoffcocktailen. Forkortelser: PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat.
| Antistoff | Konsentrasjon (mg/ml) | Volum (μL) |
| c-sett BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| Steril PBS | N/A | 27.5 |
Tabell 4: Dyrket HSC antistoffcocktail (100x). Antistoffvolumer for 100x lager av dyrket HSC antistoff cocktail. Forkortelser: PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat.
| Kultur | Celletetthet ved 24-48 timer | % KSL ved 24-48 timer | Celletetthet ved 1 uke | % KSL ved 1 uke |
| Fersk c-Kit+ benmargsbelegg | 0,5x106 ml-1 | 25-35% | 1-2x106 ml-1 | 50-60% |
| HSPC elektroporering | 0,5x106 ml-1 | 25-35% | 0,5-1,5x106 ml-1 | 25-35% |
| HSPC lentivirus | 1,5x106 ml-1 | 20-25% | 1-2x106 ml-1 | 45-55% |
Tabell 5: Forventede resultater. Forventede celletettheter og frekvenser av c-Kit + Sca1 + Lineage-celler etter (1) såing av c-Kit + benmarg, (2) elektroporering og (3) lentiviral vektortransduksjon basert på såing ved 1 × 106 celler mL-1. Forkortelser: KSL = c-Kit + Sca1 + Lineage-; HSPC = hematopoietisk stamme og stamcelle.
| Utstede | Sannsynlig årsak/er | Løsning(er) | |||
| Strømningshastigheten til LS-kolonnen er uvanlig langsom. | LS-kolonnen er tilstoppet. | Fjern kolonnen fra magneten. Elute cellesuspensjonen med stempelet og gjenta med ytterligere 5 ml PBS. Gjenta kolonneberikelsen med en ny kolonne og et nytt filter. | |||
| Stor mengde celledød i løpet av de første 7 dagene av kulturen | Bruk av utgåtte reagenser eller reagenser i feil forhold. | Sørg for at regentene har riktig konsentrasjon og oppbevares riktig. | |||
| Unøyaktig inkubator temperatur. | Regelmessig service av inkubatorer og sikre at inkubatoren holdes lukket så mye som mulig. | ||||
| Kulturkollaps etter 7 dager med kultur | Feil celletype sortert | Søk råd fra HSC FACS-eksperter om sorteringsprotokoller. Valider reagenser med c-Kit-beriket benmarg. | |||
| Ufullstendige medieendringer som utføres | Utfør mer fullstendige medieendringer. | ||||
| Overdreven (f.eks. >50%) total celledød etter transduksjon | Lentiviral vektor toksisitet. | Reduser mengden viruspartikler som brukes. | |||
| Forkort inkubasjonstiden til 5 timer. | |||||
| Overdreven (f.eks. >50 %) total celledød etter transfeksjon | Celler igjen i P3-oppløsning for lenge | Gjenopprett celler i media så snart som mulig, elektroporer bare 2 prøver om gangen og vær forsiktig når du pipetterer (og bruk pipettespisser med bred boring). | |||
| Pipettering dreper for kraftig celler | |||||
| Lav transfeksjonseffektivitet | Nedbrytning av RNP og/eller Cas9 enzym. | Feil oppbevaring, oppbevar Cas9 ved -20 °C og RNA ved -80 °C (rekonstituert med RNasefritt vann). | |||
| Lav transduksjonseffektivitet | Lav lentiviral vektoraktivitet | Titrat lentiviral vektor for spesifikk cellepopulasjon, unngå frysing/tining av lentiviral vektor | |||
Tabell 6: Vanlige feilsøkingsproblemer. Sammendrag av vanlige problemer og foreslått feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi håper at denne protokollen gir en nyttig tilnærming til å undersøke HSC-biologi, hematopoiesis og hematologi mer generelt. Siden den første utviklingen av den PVA-baserte dyrkningsmetoden for FACS-rensede HSCs8, har metoden blitt utvidet. For eksempel har metoden vist seg å fungere med c-Kit beriket med benmarg og med negative overflateladede plater14. Dens kompatibilitet med transduksjon og elektroporering har også blitt demonstrert14,15. In vivo-valideringen av disse HSC- og c-Kit+ HSPC-kulturene finnes i disse publikasjonene, mens leserne kan referere til andre publiserte protokoller for in vivo-transplantasjonsprotokoller 21. Vi ser ikke store forskjeller i avstamningskimerisme mellom ferske og dyrkede HSPCer etter transplantasjon, men rekonstitueringsstyrken til individuelle HSC etter ex vivo-ekspansjon er ennå ikke bestemt i detalj. Det store antallet HSC-er som genereres av denne tilnærmingen, åpner for nye måter å undersøke HSC-er ved hjelp av molekylære eller biokjemiske analyser som krever store celletall. I tillegg bør det å kunne generere genetisk modifiserte HSCer innenfor disse kultursystemene tillate oss å undersøke mekanismene som regulerer HSC-aktivitet og det hematopoietiske systemet. For eksempel er disse systemene mottagelige for å utføre genetiske skjermer16.
Mekanistisk forstår vi ennå ikke helt hvorfor PVA og andre polymerer kan erstatte serumalbumin og støtte effektiv HSC-ekspansjon; Vi tror PVA i det minste delvis erstatter serumalbumin gjennom stabiliserende cytokiner i mediet9. I tillegg synes mangelen på dårlig definerte bioaktive forurensninger funnet i serumalbuminprodukter å redusere HSC-differensiering. Bruk av syntetiske polymerer bør også bidra til å redusere batch-til-batch-variabilitet og konfunderende effekter forbundet med disse bioaktive forurensningene når man studerer HSCs ex vivo22. Det er også fortsatt mer å lære om hvorfor visse polymerer gir bedre støtte til HSCs ex vivo.
Selv om det allerede er kraftig, bør ytterligere optimalisering og karakterisering av disse kulturprotokollene være mulig. Spesielt vil det være nyttig å forbedre renheten til HSC i disse kulturene. Ytterligere markører som skiller det langsiktige HSC-rommet fra disse kulturene, vil også bidra til å spore og isolere disse celletypene. Det er også av interesse å se om dette systemet på sikt kan brukes til å kvantifisere HSC-aktivitet ex vivo, uten behov for in vivo transplantasjonsanalyser. Vi forstår heller ikke ennå hvor lenge HSC kan utvides ex vivo, selv om det sikkert er lengre enn 6-8 uker hvis det vedlikeholdes riktig8. Til slutt, mens disse kulturene gir en nyttig modell for å studere muse-HSC-er, er det også viktig å utvikle ekvivalente kultursystemer for humane HSC-er for å gi et mer håndterbart system for å studere menneskelig HSC-biologi og hematopoiesis, og til slutt å generere HSC-er for kliniske stamcelletransplantasjonsterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker WIMM Flow Cytometry Core for tilgang til flowcytometri, og WIMM Virus Screening Core for lentiviral vektorgenerering. Dette arbeidet ble finansiert av Kay Kendall Leukemia Fund og UK Medical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
