Summary
On présente ici un protocole pour initier, maintenir et analyser des cultures de cellules souches hématopoïétiques de souris en utilisant une expansion ex vivo à base d’alcool polyvinylique, ainsi que des méthodes pour les manipuler génétiquement par transduction lentivirale et électroporation.
Abstract
Les cellules souches hématopoïétiques multipotentes (CSH) autorenouvelables sont un type cellulaire important en raison de leur capacité à soutenir l’hématopoïèse tout au long de la vie et à reconstituer l’ensemble du système sanguin après la transplantation. Les CSH sont utilisées cliniquement dans les thérapies de transplantation de cellules souches, qui représentent un traitement curatif pour une gamme de maladies du sang. Il existe un intérêt considérable à la fois pour la compréhension des mécanismes qui régulent l’activité des CSH et de l’hématopoïèse, et pour le développement de nouvelles thérapies basées sur les CSH. Cependant, la culture stable et l’expansion des CSH ex vivo ont été un obstacle majeur à l’étude de ces cellules souches dans un système ex vivo traitable. Nous avons récemment développé un système de culture à base d’alcool polyvinylique qui peut soutenir l’expansion à long terme et à grande échelle des CSH de souris transplantables et des méthodes pour les modifier génétiquement. Ce protocole décrit les méthodes de culture et de manipulation génétique des CSH de souris par électroporation et transduction lentivirale. Ce protocole devrait être utile à un large éventail d’hématologues expérimentaux intéressés par la biologie des CSH et l’hématopoïèse.
Introduction
Le système hématopoïétique soutient une gamme de processus essentiels chez les mammifères, de l’apport d’oxygène à la lutte contre les agents pathogènes, en passant par des types de cellules sanguines et immunitaires spécialisées. La production sanguine continue (hématopoïèse) est nécessaire pour soutenir l’homéostasie du système sanguin, qui est soutenue par les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC)1. La cellule hématopoïétique la plus primitive est la cellule souche hématopoïétique (CSH), qui possède des capacités uniques d’auto-renouvellement et de différenciation multilignée 2,3. Il s’agit d’une population de cellules rares, principalement dans la moelle osseuseadulte 4, où elles se produisent à une fréquence d’environ une toutes les 30 000 cellules. On pense que les CSH soutiennent l’hématopoïèse à vie et aident à rétablir l’hématopoïèse après un stress hématologique. Ces capacités permettent également aux CSH de reconstituer de manière stable l’ensemble du système hématopoïétique après la transplantation chez un receveur irradié5. Cela représente la définition fonctionnelle d’un CSH et constitue également la base scientifique de la thérapie de transplantation de CSH, un traitement curatif pour une gamme de maladies sanguines et immunitaires6. Pour ces raisons, les CSH sont un centre majeur de l’hématologie expérimentale.
Malgré un vaste centre de recherche, il est resté difficile d’étendre de manière stable les CSH ex vivo7. Nous avons récemment développé le premier système de culture d’expansion ex vivo à long terme pour les CSH8 de souris. L’approche peut multiplier par 234 à 899 les CSH transplantables sur une culture de 4 semaines. Par rapport aux approches alternatives, le principal changement dans le protocole a été l’élimination de l’albumine sérique et son remplacement par un polymère synthétique. L’alcool polyvinylique (PVA) a été identifié comme un polymère optimal pour les cultures HSC8 de souris, qui a maintenant également été utilisé pour la culture d’autres types de cellules hématopoïétiques9. Cependant, un autre polymère appelé Soluplus (un copolymère greffé de caprolactame-acétate-polyéthylèneglycol) a également été identifié récemment, ce qui semble améliorer l’expansion clonale du CSH10. Avant l’utilisation de polymères, on utilisait de l’albumine sérique sous forme de sérum fœtal bovin, de fraction V de l’albumine sérique bovine ou d’albumine sérique recombinante, mais ceux-ci avaient un soutien limité pour l’expansion des CSH et ne supportaient qu’une culture ex vivo à court terme (~ 1 semaine)7. Cependant, il convient de noter que les protocoles de culture de CSH qui maintiennent les CSH dans un état de repos peuvent soutenir un temps de culture ex vivo plus long11,12.
En comparaison avec d’autres méthodes de culture, un avantage majeur des cultures à base de PVA est le nombre de cellules qui peuvent être générées et la durée pendant laquelle le protocole peut être utilisé pour suivre les CSH ex vivo. Cela permet de surmonter plusieurs obstacles dans le domaine de l’hématologie expérimentale, tels que le faible nombre de CSH isolables par souris (seulement quelques milliers) et la difficulté de suivre les CSH dans le temps in vivo. Cependant, il est important de se rappeler que ces cultures stimulent la prolifération des CSH, alors que le pool de CSH in vivo est principalement au repos à l’étatd’équilibre 13. De plus, bien que les cultures soient sélectives pour les CSH, d’autres types de cellules s’accumulent avec les cultures au fil du temps, et les CSH transplantables ne représentent qu’environ une cellule sur 34 après 1 mois. Les cellules progénitrices hématopoïétiques myéloïdes semblent être le principal type de cellules contaminantes dans ces cultures de CSH8. Néanmoins, nous pouvons utiliser ces cultures pour enrichir les CSH à partir de populations cellulaires hétérogènes (par exemple, les CSSP de moelle osseuse c-Kit+ 14). Il prend également en charge la transduction ou l’électroporation des CSH pour la manipulation génétique14,15,16. Pour aider à identifier les CSH de la population hétérogène de CSHS cultivées, le CD201 (EPCR) a récemment été identifié comme un marqueur de CSH ex vivo 10,17,18 utile, avec des CSH transplantables limitées à la fraction CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lignée.
Ce protocole décrit les méthodes d’initiation, de maintenance et d’évaluation des cultures d’expansion de CSH chez souris à base de PVA, ainsi que les protocoles de manipulation génétique au sein de ces cultures par électroporation ou transduction de vecteurs lentiviraux. Ces méthodes devraient être utiles pour une gamme d’hématologues expérimentaux.
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Protocol
Toutes les procédures animales, y compris l’élevage et l’euthanasie, doivent être effectuées dans le respect des directives institutionnelles et nationales. Les expériences détaillées ci-dessous ont été approuvées par le ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni. Voir le tableau des matériaux pour une liste de tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.
1. Préparation des solutions de stock
- Solution mère PVA
- Prélever 50 ml d’eau de culture tissulaire dans une petite bouteille en verre (adaptée à l’autoclavage). Réchauffer l’eau jusqu’à ce qu’elle soit presque bouillante au micro-ondes.
- Peser 5 g de poudre de PVA et ajouter à l’eau.
REMARQUE: Il est recommandé de dissoudre seulement 1-5 g de PVA. La dissolution de plus grandes quantités peut entraîner une reconstitution incomplète. - Fermez hermétiquement le couvercle et secouez pour mélanger. Ensuite, desserrez le couvercle.
REMARQUE: Soyez prudent lors de la réouverture, car la pression peut changer en raison de la température changeante de l’eau. - Autoclave et laisser refroidir. Fermez hermétiquement le couvercle et secouez pour mélanger. Fabriquer des aliquotes dans des tubes stériles et conserver jusqu’à 3 mois à 4 °C.
- Dissoudre les cytokines lyophilisées dans le milieu F-12 contenant 1 mg/mL de PVA. Reconstituer le facteur des cellules souches à 10 μg/mL et la thrombopoïétine à 100 μg/mL pour générer 1:1 000 stocks. Fabriquer des aliquotes dans des tubes stériles et les conserver à long terme à -80 °C. Vous pouvez également conserver les aliquotes à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
REMARQUE: Évitez la reconstitution des cytokines dans l’albumine sérique bovine en raison de l’impact négatif sur l’expansion des CSH chez la souris.
2. Extraction de la moelle osseuse HSC et enrichissement c-Kit+
- Disséquer les fémurs, les tibias, les bassins et la colonne vertébrale de souris C57BL/6 fraîchement euthanasiées âgées de 8 à 12 semaines (par asphyxie au CO2 et/ou luxation cervicale) et placer les os dans du PBS sur de la glace.
REMARQUE : Assurez-vous que les surfaces et les outils sont stérilisés avec de l’éthanol à 70 %. - Nettoyez les os à l’aide de lingettes délicates non pelucheuses, en enlevant les muscles et la moelle épinière et ajoutez-les à un mortier avec ~ 3 ml de PBS.
REMARQUE: Assurez-vous que le pilon et le mortier sont stérilisés avec de l’éthanol à 70%, puis lavés une fois avec du PBS. - Écrasez les os avec le pilon sans broyer pour minimiser les forces de cisaillement. Briser les gros fragments de moelle osseuse libérés dans le PBS à l’aide d’une aiguille de 19 G fixée à une seringue de 5 mL. Transférer la suspension cellulaire à travers un filtre de 70 μm dans un tube conique de 50 mL.
- Une fois la suspension transférée, répéter avec du PBS frais jusqu’à ce que les os soient blanchis et qu’aucune moelle ne soit visible. Visez un volume final de ~30 mL par souris et de ~50 mL pour deux souris.
- Mélanger les cellules de la moelle osseuse, recueillir 10 μL de cellules et compter en utilisant la solution de Türks à une dilution de 1:10-1:20 avec un hémocytomètre.
REMARQUE: Une souris devrait produire 2-5 × 108 cellules de moelle osseuse entière. - Faire tourner à 450 × g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans du PBS froid (350 μL pour une souris ou 500 μL pour deux souris).
- Ajouter 0,2 μL d’anticorps anti-c-Kit allophycocyanine (APC) pour 10 millions de cellules et incuber pendant 30 min dans l’obscurité à 4 °C.
- Ajouter 5 mL de PBS froid aux cellules incubées pour éliminer l’excès d’anticorps et filtrer à travers un filtre de 50 μm dans un tube conique frais de 15 mL.
- Lavez le tube d’origine avec 7 ml de PBS froid et transférez-le à travers le filtre. En cas de colmatage du filtre, rayez la surface du filtre avec un embout P1000.
- Faire tourner à 450 × g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans du PBS froid (350 μL pour une souris ou 500 μL pour deux souris).
- Ajouter 0,2 μL de microbilles anti-APC pour 10 millions de cellules et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4 °C. Ajouter 12 mL de PBS stérile pour éliminer l’excès de microbilles.
- Faire tourner les cellules à 450 × g pendant 5 min à 4 °C et remettre en suspension dans 2 mL de PBS froid. Pendant que les cellules tournent à cette étape, passez à l’étape 2.13.
- Préparez-vous à l’enrichissement de la colonne en plaçant une colonne de filtration magnétique dans l’aimant d’un séparateur de colonne magnétique, avec un filtre de 50 μm sur le dessus et un tube conique de 15 ml en dessous.
- Faites passer 3 mL de PBS stérile à travers le filtre et la colonne de filtration de 50 μm. Une fois que le PBS a traversé, passez la suspension cellulaire à travers la colonne, suivie de trois lavages de 3 ml de PBS froid à chaque fois. Pour chaque lavage, attendez que la colonne cesse de s’égoutter avant d’ajouter le lavage suivant.
- Retirez la colonne de l’aimant et placez-la sur un nouveau tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de PBS froid, ajuster le piston de colonne sur la colonne et éluer les cellules en poussant le piston.
- Mélanger les cellules enrichies en c-Kit, recueillir 10 μL de cellules et compter en utilisant la solution de Türks à une dilution de 1:2 avec un hémocytomètre. Le rendement typique d’une souris est de 2 à 5 × 106 cellules c-Kit+ .
REMARQUE: À ce stade, les cellules peuvent être directement ensemencées dans des milieux HSC ou préparées pour la purification par tri cellulaire activé par fluorescence HSC (FACS).
3. Initiation de cultures cellulaires avec des HSPC enrichis en c-Kit
- Préparer le milieu frais (tableau 1) pour le nombre de cellules/puits requis. Semer 0,5 à 1 million de cellules par mL pour les HSPC enrichis en c-Kit.
- Faire tourner les cellules enrichies en c-Kit et les remettre en suspension dans un milieu HSC à la densité cellulaire souhaitée.
- Transférer les cellules sur des plaques recouvertes de fibronectine ou chargées en surface négative, à raison de 200 μL par plaque de 96 puits ou de 1 mL par plaque de 24 puits.
- Placer les cellules dans un incubateur de culture tissulaire réglé à 37 °C et 5 % de CO2.
4. Initier des cultures cellulaires avec des CSH purifiées FACS
- Préparer un volume approprié de coloration d’anticorps de la lignée biotinylée : 3 μL de mélange maître (tableau 2) pour 10 millions de cellules, dilué à 1:100 dans du PBS.
- Faire tourner les cellules enrichies en c-Kit et remettre en suspension dans la coloration d’anticorps de la lignée pendant 30 min à 4 °C.
- Laver avec 10 ml de PBS stérile et essorer à 450 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Préparer un volume approprié de coloration d’anticorps frais contre le CSH (tableau 3) : 300 μL pour 10 millions de cellules. Parallèlement à cette coloration de l’échantillon, préparer des échantillons de contrôle de coloration appropriés pour la compensation et le contrôle.
REMARQUE: Travailler dans une hotte de culture tissulaire avec la lumière éteinte lors de l’utilisation d’anticorps conjugués à un colorant. - Resuspendre les cellules dans la coloration d’anticorps HSC et incuber à 4 °C pendant 90 min. Mélanger les cellules toutes les 20-30 minutes en tapotant pour éviter la granulation cellulaire.
- Laver avec 10 ml de PBS stérile et faire tourner vers le bas à 450 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Aspirer le surnageant, agiter la pastille pour la perturber et remettre en suspension dans du PBS stérile avec 0,5 μg/mL d’iodure de propidium (IP).
- Préparer le milieu frais (tableau 1) pour le nombre de puits requis et les plaquer dans des plaques de fibronectine ou de surface négative (200 μL par plaque de 96 puits ou 1 mL par plaque de 24 puits).
- Préparez la machine FACS pour le tri et triez les CSH CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- directement dans des puits contenant des milieux (voir la figure 1 pour la stratégie de contrôle FACS standard utilisée ici). Trier jusqu’à 200 cellules par puits de plaque de 96 puits ou jusqu’à 1 000 cellules par puits de plaque de 24 puits.
REMARQUE : Les machines FACS doivent être utilisées par un scientifique qualifié. Il est recommandé aux utilisateurs de communiquer avec leur installation FACS locale pour discuter de cette stratégie de tri s’ils n’ont pas d’expérience dans l’isolement FACS des CSH de souris.
5. Effectuer des modifications de support
- Pour les cultures cellulaires initiées à partir de cellules enrichies en c-Kit, commencer les changements de milieu après 2 jours. Pour les cultures cellulaires initiées à partir de CSH isolées par FACS, commencer les changements de milieu après 5 jours.
- Préparer suffisamment de milieu de CSH frais préchauffé (~37 °C) (tableau 1) pour tous les puits.
- Retirez délicatement la plaque de l’incubateur de culture tissulaire.
REMARQUE: Comme les HSPC sur les plaques chargées en surface négative sont plus facilement perturbées que celles sur la fibronectine, des précautions supplémentaires doivent être prises lors du changement du milieu sur les plaques chargées en surface négative pour éviter de perturber les cultures cellulaires. - À l’aide d’une pipette ou d’une pompe à vide, retirez lentement ~90%-95% du milieu du ménisque du puits.
REMARQUE: Évitez de prélever le milieu à partir de la base du puits, sinon de nombreuses cellules seront enlevées. - Ajouter 200 μL (pour les plaques de 96 puits; 1 mL pour les plaques de 24 puits) de milieu frais au puits.
- Remettez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire.
- Répétez les étapes 5.1-5.6 tous les 2-3 jours jusqu’au point final expérimental.
- Pour les cultures cellulaires initiées avec des HSPC enrichis en c-kit (section 3), diviser les cultures dans un rapport de 1:2-1:3 après ~3 semaines. Pour les cultures cellulaires initiées avec des CSH purifiées FACS (section 4), diviser les cultures dans un rapport de 1:2-1:3 après ~3 semaines et lorsque les cultures sont >90% confluentes.
NOTE: Le calendrier exact dépendra des intérêts expérimentaux. Ces cultures ont été caractérisées pendant 4 à 8 semaines8, mais des longueurs de culture supplémentaires peuvent être possibles.
6. Électroporation des HSPC cultivés
REMARQUE: Ce protocole est destiné à l’électroporation de la ribonucléoprotéine Cas9 / sgRNA (RNP), mais pourrait être adapté à l’électroporation de l’ARNm ou d’autres protéines recombinantes. Initier des cultures avec un nombre suffisant de cellules afin de le faire au point temporel expérimental souhaité.
- Effectuer un changement de milieu 1 jour avant l’électroporation, comme décrit à la rubrique 5.
REMARQUE: Un minimum d’une culture de nuit avant l’électroporation est recommandé. Cependant, les cellules sont généralement cultivées pendant 1 à 3 semaines avant la transduction. - Le jour de l’électroporation, installez le nucléofector. Mettez la machine sous tension. Sur l’écran tactile, sélectionnez le module X puis la taille de la cuvette utilisée.
- Préparer une solution P3 suffisante (selon les instructions du fabricant) pour l’échelle de l’électroporation (100 μL par cuvette ou 20 μL par microcuvette) et laisser équilibrer à température ambiante.
- Préparer suffisamment de milieu frais (tableau 1) pour le nombre de puits plaqués et ajouter 500 μL de milieu pour un puits à plaques de 24 puits ou 100 μL de milieu à un puits à plaques de 96 puits.
- Décongeler l’ARNg (prédilué à 2 μg/mL dans de l’eau exempte de RNase) sur de la glace et mélanger 16 μg d’ARNg avec 30 μg d’enzyme Cas9 (à 10 μg/mL) dans un tube de PCR stérile. Inclure un tube PCR supplémentaire contenant uniquement la protéine Cas9 comme témoin. Mélanger en effleurant le tube, puis tourner brièvement vers le bas. Incuber à 25 °C pendant 10 min dans un thermocycleur pour complexer le RNP, puis garder les tubes sur la glace.
REMARQUE: Cela peut être réduit cinq fois si vous effectuez une électroporation dans des microcuvettes. - Mélanger et transférer les HSPC pour l’électroporation dans un tube; prélever 10 μL de cellules et compter en utilisant la solution de Türks à une dilution de 1:2 avec un hémocytomètre.
REMARQUE: Il est recommandé d’électroporer 1 à 5 millions de cellules par cuvette de 100 μL (réduit par cinq pour la microcuvette). - Faites tourner les cellules numériques appropriées dans un tube de 1,5 mL à 450 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Aspirer autant de surnageant que possible et remettre en suspension avec 100 μL de tampon de nucléofection.
- Transférer immédiatement la suspension cellulaire dans le tube PCR contenant le RNP complexé et pipette de haut en bas lentement pour mélanger doucement et transférer dans une cuvette d’électroporation de 100 μL. Éjecter le mélange dans la cuvette lentement et en un seul mouvement fluide pour éviter la formation de bulles d’air dans la cuvette.
- Sur l’électroporateur, sélectionnez la position des puits en cours d’électroporage. À l’aide de l’écran tactile, sélectionnez le programme de type de cellule CD34+, humain ou tapez le code d’impulsion EO100. Appuyez sur le bouton OK .
- Transférer les cuvettes dans l’électroporateur. Appuyez sur le bouton Start (Démarrer ) de l’écran tactile pour lancer l’électroporation. Directement après l’électroporation, ajouter 500 μL du milieu de culture à la cuvette (100 μL si vous utilisez une microcuvette).
- Transférer doucement les cellules dans la plaque préparée et les retourner dans l’incubateur de culture tissulaire.
- Pour les procédures utilisant un gabarit de donneur AAV6, ajouter le vecteur immédiatement après le transfert des cellules sur une plaque recouverte de fibronectine à une concentration de 5 000 vecteurs/cellule.
- Après 6-18 h, préparer un milieu frais et effectuer un changement de milieu comme décrit à la section 5. Pour ce changement de milieu, supprimez seulement 80 % à 90 % du milieu.
NOTE: Évitez de prélever le milieu à partir de la base du puits. - Analyser les cellules par cytométrie en flux après 2 jours ou plus (voir rubrique 8 pour plus de détails).
- Continuer à effectuer des changements de milieu tous les 2 jours, comme décrit à la section 5, jusqu’à ce que le point final expérimental soit atteint.
REMARQUE: Les taux d’édition de CRISPR / Cas9 à l’aide de cette méthode dépendent fortement de l’efficacité de ciblage du sgRNA conçu. Des taux d’édition allant jusqu’à 95% ont été observés avec un guide efficace15. Les lignes directrices pour la conception de l’ARNg ont déjà été détaillées ailleurs19,20.
7. Transduits de HSPC cultivés avec vecteur lentiviral
REMARQUE: Initier des cultures avec un nombre suffisant de cellules, pour effectuer cela au point de temps expérimental souhaité.
- Générer et titrer le vecteur lentiviral (en fonction des objectifs expérimentaux). Décongeler le vecteur lentiviral sur la glace.
- Effectuer un changement moyen (comme dans la section 5); Ensuite, mélangez et transférez les HSPC pour la transduction dans un tube. Prélever 10 μL de cellules et compter à l’aide de la solution de Türks à une dilution de 1:2 avec un hémocytomètre.
REMARQUE: Les cellules peuvent être transduites immédiatement après le placage. Cependant, les cellules sont généralement cultivées pendant 1 à 3 semaines avant la transduction. - Replaquer la dose requise de cellules pour la transduction (généralement 100 000 cellules par plaque de 96 puits). Séparément, plaquer des cellules témoins négatives non transduites.
REMARQUE: Si vous utilisez des plaques chargées négativement en surface, transférez les cellules sur des plaques recouvertes de fibronectine pour la transduction du vecteur lentiviral. - Ajouter un vecteur lentiviral à chaque puits de cellules: ajouter 20 unités de transduction par cellule pour atteindre ~30% d’efficacité de transduction. Cependant, déterminer la dose de vecteur lentiviral empiriquement, en fonction des exigences expérimentales.
REMARQUE : S’assurer que le vecteur lentiviral est éliminé conformément aux lignes directrices de l’établissement. - Remettez les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 6 h. Ensuite, effectuez un changement moyen comme décrit dans la section 5.
Remarque : Le surnageant contient un virus actif. Éliminer conformément aux lignes directrices de l’établissement. - Analyser les cellules par cytométrie en flux (p. ex., pour l’expression de la GFP) après 2 jours ou plus. Voir la section 8 pour plus de détails.
- Continuer à effectuer des changements de milieu tous les 2 jours, comme décrit à la section 5, jusqu’à ce que le point final expérimental soit atteint.
8. Analyse cytométrique en flux des cultures HSPC
- Préparer un mélange concentré d’anticorps anti-CSH ex vivo cultivés dans du PBS contenant 2 % de FBS (tableau 4). Conservez le mélange à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à 1 mois.
REMARQUE: Travaillez dans une hotte de culture tissulaire avec les lumières éteintes lorsque vous utilisez des anticorps conjugués à un colorant. - Ajouter 2 μL de mélange d’anticorps concentrés à 50 μL de cellules. Incuber pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. Parallèlement à cette coloration de l’échantillon, préparer des échantillons de contrôle de coloration appropriés pour la compensation et le contrôle.
- Ajouter 200 à 1 000 μL de PBS contenant 2 % de FBS et centrifuger à 450 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirer autant de surnageant que possible et remettre en suspension dans 100-500 μL de PBS contenant 2% FBS et 0,5 μg/mL PI.
- Installez le cytomètre en flux et enregistrez au moins 10 000 cellules vivantes par échantillon.
REMARQUE : Les cytomètres en flux doivent être utilisés par un scientifique qualifié. Les utilisateurs doivent communiquer avec leur établissement FACS local pour discuter de cette analyse s’ils n’ont pas d’expérience en cytométrie en flux. - Exportez les données au format FCS et analysez-les à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié. Voir la figure 2 pour la stratégie de contrôle standard utilisée ici.
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Representative Results
Pour la purification FACS des CSH, nous nous attendons à ce que dans la moelle osseuse enrichie en c-Kit, ~0,2% des cellules soient la population CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- pour les jeunes souris C57BL/6 (8-12 semaines) (Figure 1). Cependant, il est probable que les souris transgéniques ou les souris d’âges différents présentent des fréquences de CSH différentes. Après 4 semaines de culture, nous nous attendons à ce que la fraction CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- soit ~10% (Figure 2). Ces résultats sont similaires pour les cultures cellulaires initiées à partir de moelle osseuse enrichie en c-Kit ou de CSH purifiées FACS. Après transduction avec un vecteur lentiviral exprimant la GFP (à 20 unités de transduction/cellule), nous prévoyons ~30% de cellules GFP+ (Figure 3).
Lorsqu’elles sont confluentes, nous nous attendons à ce que les cultures soient à ~2 millions de cellules / mL. Dans la culture, nous nous attendons à voir principalement de petites cellules rondes, bien qu’il soit normal de voir une petite fréquence de cellules rondes plus grandes (mégacaryotes). Dans les cultures cellulaires initiées à partir de la moelle osseuse enrichie en c-Kit, une certaine mort cellulaire initiale est attendue14. Environ 50% de la mort cellulaire est attendue dans les premières 24-48 heures, avant que les premiers changements de milieu ne soient effectués. Les débris de cellules mortes initiaux dans ces cultures proviennent probablement de la mort cellulaire dans les cultures plutôt que des débris osseux (des os broyés), puisque l’étape d’enrichissement c-Kit devrait épuiser ces débris osseux. Le nombre de cellules, cependant, revient à 80% à 100% du nombre de cellules ensemencées après 1 semaine (voir le tableau 5 pour les valeurs de densité cellulaire attendues). Si des résultats médiocres sont observés, nous vous recommandons de dépanner le protocole (Tableau 6). Dans ce cas, il peut être plus simple de tester les réactifs par lots en utilisant le protocole de moelle osseuse enrichi en c-Kit (section 3), car cela évite les complications associées au tri FACS. Il est à noter que les résultats représentatifs sont basés sur l’utilisation de réactifs et d’équipements détaillés dans le tableau des matériaux; Des résultats similaires peuvent être obtenus en utilisant des réactifs de différents fournisseurs, mais la validation (et le titrage) de nouveaux réactifs est probablement nécessaire.
Figure 1 : Stratégie de contrôle pour la purification FACS des CSH de la moelle osseuse enrichie en c-Kit. Grille séquentielle utilisée pour identifier les cellules CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- de la moelle osseuse enrichie en c-Kit. Abréviations : FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; CSH = cellules souches hématopoïétiques; SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; FSC-A = aire du pic de diffusion vers l’avant; FSC-W = largeur du pic de diffusion vers l’avant; FSC-H = hauteur du pic de diffusion vers l’avant; SSC-H = hauteur du pic de diffusion latérale; PI = iodure de propidium; PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stratégie de contrôle pour l’analyse cytométrique en flux des HSPC en culture. Grille séquentielle utilisée pour identifier les cellules CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- à partir de cultures HSPC. Abréviations : HSPC = cellules souches et progénitrices hématopoïétiques; SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; FSC-A = aire du pic de diffusion vers l’avant; FSC-W = largeur du pic de diffusion vers l’avant; FSC-H = hauteur du pic de diffusion vers l’avant; SSC-H = hauteur du pic de diffusion latérale; PI = iodure de propidium; PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultats représentatifs de la transduction du vecteur lentiviral. Expression représentative de la GFP après une transduction HSPC en culture avec un vecteur lentiviral exprimant la GFP (20 unités de transduction/cellule) 48 h après la transduction. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte; HSPC = cellules souches hématopoïétiques et progénitrices; FSC-H = hauteur du pic de diffusion vers l’avant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Réactif | Concentration finale dans le F-12 | Volume (μL) |
| Milieu F-12 de Ham | N/A | 958 |
| 100x Pénicilline-Streptomycine-Glutamine | 1x | 10 |
| 1 M HEPES | 10 mM | 10 |
| 100 mg/mL de PVA | 1 mg/mL | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| 100 μg/mL de TPO stock | 100 ng/mL | 1 |
| 10 μg/mL de stock SCF | 10 ng/mL | 1 |
Tableau 1 : Composition des milieux HSC. Volumes de réactifs de milieu pour 1 mL de milieu complet. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique; SCF = facteur de cellules souches; TPO = thrombopoïétine; ITSX = insuline-transférrine-sélénium-éthanolamine.
| Anticorps | Concentration (μg/mL) | Volume (μL) |
| Ly6G/Ly6C – biotine | 0.5 | 100 |
| Ter119 – biotine | 0.5 | 100 |
| CD4 – biotine | 0.5 | 25 |
| CD8a – biotine | 0.5 | 25 |
| CD45R – biotine | 0.5 | 50 |
| CD127 – biotine | 0.5 | 50 |
| PBS stérile | N/A | 350 |
Tableau 2 : Cocktail d’anticorps biotinylés. Volumes d’anticorps pour le stock du cocktail d’anticorps biotine.
| Anticorps | Concentration (mg/mL) | Volume (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| c-Kit APC | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Streptavirdine APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| PBS stérile | N/A | 291 |
Tableau 3 : Cocktail d’anticorps frais contre le CSH. Volumes d’anticorps pour le cocktail d’anticorps frais HSC. Abréviations : PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine.
| Anticorps | Concentration (mg/mL) | Volume (μL) |
| c-Kit BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| PBS stérile | N/A | 27.5 |
Tableau 4 : Cocktail d’anticorps CSH cultivés (100x). Volumes d’anticorps pour le stock 100x du cocktail d’anticorps HSC cultivé. Abréviations : PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine.
| Culture | Densité cellulaire à 24-48 h | % KSL à 24-48 h | Densité cellulaire à 1 semaine | % KSL à 1 semaine |
| Placage de moelle osseuse c-Kit+ frais | 0,5x106 mL-1 | 25-35% | 1-2x106 mL-1 | 50-60% |
| Électroporation HSPC | 0,5x106 mL-1 | 25-35% | 0,5-1,5x106 mL-1 | 25-35% |
| Lentivirus HSPC | 1,5x106 mL-1 | 20-25% | 1-2x106 mL-1 | 45-55% |
Tableau 5 : Résultats attendus. Densités cellulaires et fréquences attendues des cellules c-Kit+Sca1+Lineage- après (1) l’ensemencement de la moelle osseuse c-Kit+, (2) l’électroporation et (3) la transduction du vecteur lentiviral basée sur l’ensemencement à 1 × 106 cellules mL-1. Abréviations : KSL = c-Kit+Sca1+Lineage-; HSPC = souche hématopoïétique et cellule progénitrice.
| Émettre | Cause(s) probable(s) | Solution(s) | |||
| Le débit de la colonne LS est inhabituellement lent. | La colonne LS est obstruée. | Retirez la colonne de l’aimant. Éluer la suspension cellulaire à l’aide du piston et répéter avec 5 mL de PBS. Répétez l’enrichissement de la colonne avec une nouvelle colonne et un nouveau filtre. | |||
| Grande quantité de mort cellulaire dans les 7 premiers jours de culture | Utilisation de réactifs périmés ou de réactifs dans des ratios incorrects. | Assurez-vous que les régents sont à la bonne concentration et stockés correctement. | |||
| Température inexacte de l’incubateur. | Entretien régulier des incubateurs et veille à ce que l’incubateur reste fermé autant que possible. | ||||
| L’effondrement de la culture après 7 jours de culture | Type de cellule incorrect trié | Demandez conseil aux experts du CSS du CSS sur les protocoles de tri. Valider les réactifs avec la moelle osseuse enrichie en c-Kit. | |||
| Modifications incomplètes des supports en cours d’exécution | Effectuez des modifications de support plus complètes. | ||||
| Mort cellulaire globale excessive (p. ex. >50 %) après la transduction | Toxicité du vecteur lentiviral. | Réduire la quantité de particules virales utilisées. | |||
| Raccourcir les temps d’incubation à 5 h. | |||||
| Mort cellulaire globale excessive (p. ex. >50 %) après la transfection | Cellules laissées trop longtemps en solution P3 | Récupérez les cellules dans le milieu dès que possible, n’électrogrez que 2 échantillons à la fois et soyez doux lors du pipetage (et utilisez des pointes de pipette de grand alésage). | |||
| Le pipetage tue trop vigoureusement les cellules | |||||
| Faible efficacité de transfection | Dégradation des RNP et/ou de l’enzyme Cas9. | Stockage incorrect, stocker Cas9 à -20 °C et ARN à -80 °C (reconstitué avec de l’eau sans RNase). | |||
| Faible efficacité de transduction | Faible activité des vecteurs lentiviraux | Titrer le vecteur lentiviral pour une population cellulaire spécifique, éviter de geler / décongeler le vecteur lentiviral | |||
Tableau 6 : Problèmes de dépannage courants. Résumé des problèmes courants et dépannage suggéré.
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Discussion
Nous espérons que ce protocole fournira une approche utile pour étudier la biologie des CSH, l’hématopoïèse et l’hématologie plus généralement. Depuis le développement initial de la méthode de culture à base de PVA pourles CSH 8 purifiés par FACS, la méthode a été étendue. Par exemple, il a été démontré que la méthode fonctionne avec c-Kit enrichi en moelle osseuse et avec des plaques chargées en surface négative14. Sa compatibilité avec la transduction et l’électroporation a également été démontrée14,15. La validation in vivo de ces cultures HSC et c-Kit+ HSPC peut être trouvée dans ces publications, tandis que les lecteurs peuvent se référer à d’autres protocoles publiés pour les protocoles de transplantation in vivo 21. Nous ne voyons pas de différences majeures dans le chimérisme de lignée entre les HSPC frais et cultivés après la transplantation, cependant, le pouvoir de reconstitution des CSH individuels après expansion ex vivo n’a pas encore été déterminé en détail. Le grand nombre de CSH générées par cette approche ouvre de nouvelles façons d’interroger les CSH à l’aide de tests moléculaires ou biochimiques qui nécessitent un grand nombre de cellules. De plus, être capable de générer des CSH génétiquement modifiées au sein de ces systèmes de culture devrait nous permettre de sonder davantage les mécanismes régulant l’activité des CSH et le système hématopoïétique. Par exemple, ces systèmes se prêtent à la réalisation de dépistages génétiques16.
Mécaniquement, nous ne comprenons pas encore complètement pourquoi le PVA et d’autres polymères peuvent remplacer l’albumine sérique et soutenir une expansion efficace des CSH; nous pensons que le PVA remplace au moins partiellement l’albumine sérique par des cytokines stabilisatrices dans le milieu9. De plus, l’absence de contaminants bioactifs mal définis trouvés dans les produits d’albumine sérique semble réduire la différenciation des CSH. L’utilisation de polymères synthétiques devrait également contribuer à réduire la variabilité d’un lot à l’autre et les effets confusionnels associés à ces contaminants bioactifs lors de l’étude des CSH ex vivo22. Il reste également encore beaucoup à apprendre sur les raisons pour lesquelles certains polymères offrent un meilleur soutien aux CSH ex vivo.
Bien que déjà puissants, une optimisation et une caractérisation supplémentaires de ces protocoles de culture devraient être possibles. En particulier, il serait utile d’améliorer la pureté des CSH au sein de ces cultures. Des marqueurs supplémentaires distinguant le compartiment HSC à long terme de ces cultures aideraient également à suivre et à isoler ces types de cellules. Il est également intéressant de voir si ce système peut éventuellement être utilisé pour quantifier l’activité des CSH ex vivo, sans avoir besoin de tests de transplantation in vivo . Nous ne comprenons pas non plus encore pendant combien de temps les CSH peuvent être étendues ex vivo, bien qu’il soit certainement plus long que 6-8 semaines si elles sont maintenues correctement8. Enfin, bien que ces cultures fournissent un modèle utile pour étudier les CSH de souris, il est également important de développer des systèmes de culture équivalents pour les CSH humaines afin de fournir un système plus facile à traiter pour étudier la biologie des CSH humaines et l’hématopoïèse et, éventuellement, de générer des CSH pour les thérapies cliniques de transplantation de cellules souches.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions le WIMM Flow Cytometry Core pour l’accès à la cytométrie en flux et le WIMM Virus Screening Core pour la génération de vecteurs lentiviraux. Ce travail a été financé par le Kay Kendall Leukaemia Fund et le Medical Research Council du Royaume-Uni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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