Summary
我们描述了一个协议，详细说明了小鼠结肠隐窝的分离以开发三维结肠。然后，可以在接受炎症激发或被引导建立上皮单层之前对已建立的结肠样蛋白进行终末分化以反映宿主上皮的细胞组成。
Abstract
肠上皮在人体健康中起着至关重要的作用，在宿主和外部环境之间提供了屏障。这种高度动态的细胞层提供了微生物和免疫群体之间的第一道防线，并有助于调节肠道免疫反应。上皮屏障的破坏是炎症性肠病（IBD）的标志，对于治疗靶向具有重要意义。三维结肠培养系统是研究IBD发病机制中肠道干细胞动力学和上皮细胞生理学的非常有用的 体外 模型。理想情况下，从动物发炎的上皮组织中建立结肠样体对于评估遗传和分子对疾病的影响最有益。然而，我们已经表明， 体内 上皮变化不一定保留在由急性炎症小鼠建立的结肠样中。为了解决这一限制，我们开发了一种方案，用通常在IBD期间升高的炎症介质混合物来治疗结肠样。虽然该系统可以普遍应用于各种培养条件，但该方案强调对分化结肠和源自已建立的结肠的二维单层的治疗。在传统培养环境中，结肠富含肠道干细胞，为研究干细胞生态位提供了理想的环境。然而，该系统不允许分析肠道生理学的特征，例如屏障功能。此外，传统的结肠样不能提供研究终末分化上皮细胞对促炎刺激的细胞反应的机会。这里介绍的方法提供了一个替代的实验框架来解决这些限制。二维单层培养系统也为 离体治疗药物筛选提供了机会。这种极化细胞层可以用细胞基底侧的炎症介质处理，并伴有假定的治疗方法，以确定它们在IBD治疗中的效用。
Introduction
炎症性肠病 （IBD） 是一种慢性、缓解和复发性疾病，其特征是炎症发作和临床静止。IBD 的病因是多因素的，但该疾病的关键特征包括屏障功能缺陷和肠上皮通透性增加，此外还有上皮区间内激活的促炎信号级联反应 1,2。几种体外和体内模型已被用于概括IBD期间的上皮反应，包括炎症的细胞培养和小鼠模型3。然而，所有这些系统都有重要的缺点，限制了它们在IBD4期间概括上皮变化的能力。大多数用于研究IBD的细胞系都是转化的，具有形成单层的能力，并且可以分化3种，但本质上的繁殖方式与宿主中未转化的肠上皮细胞不同。几种不同的小鼠炎症模型用于研究IBD，其中一些包括敲除模型，感染模型，化学炎症模型和T细胞转移模型5,6,7,8。虽然每个人都可以研究IBD的某些病因方面，例如遗传易感性，屏障功能障碍，免疫失调和微生物组，但他们研究疾病的多因素性质的能力有限。
肠道类器官，包括类肠类和结肠类，在过去十年中已被建立为一种有用的体外模型，不仅可以研究肠道干细胞的动力学，还可以研究它们在肠道稳态和疾病中的屏障完整性和功能的作用。这些实体为我们理解IBD9的发病机制做出了重大贡献，并为个性化医疗开辟了新的机会。结肠样或干细胞衍生的自组织组织培养物已经从小鼠和人体组织发展而来，其过程允许位于肠隐窝内的干细胞繁殖并无限期维持10。体内干细胞生态位依赖于细胞外因子来支持其生长，特别是典型的Wnt信号传导和骨形态发生蛋白信号通路11。这些因素的添加促进了结肠样细胞的健康和寿命，但也推动培养物走向干细胞样状态，这种状态不反映体内上皮细胞结构，该结构由自我更新和终末分化的细胞组成12,13。虽然肠上皮的功能取决于干细胞区室和分化细胞之间的持续串扰，但在结肠样培养系统中同时具有两者的能力相当有限。尽管存在这些限制，类器官培养系统仍然是研究体外上皮内在特性的金标准。尽管如此，可能需要考虑替代文化策略来回答手头的科学问题。
已经表明，连续7天葡聚糖硫酸钠（DSS）方案的小鼠发生上皮炎症和屏障功能障碍14。此外，线粒体生物发生失败和肠上皮内的代谢重编程，已被证明在人类IBD中很明显，也已捕获在结肠炎15的DSS模型中。然而，我们的初步数据表明，线粒体生物发生失败的特征并未保留在源自DSS处理动物隐窝的结肠中（补充图1）。因此，在检查小鼠肠道炎症期间炎症如何驱动上皮变化时，必须使用替代培养方法。在这里，我们概述了我们开发的一个协议，该协议描述了1）如何从整个结肠组织中分离隐窝以建立鼠结肠样，2）如何最终分化该细胞群以反映 体内的细胞群，以及3）如何在此 体外 模型中诱导炎症。为了研究发炎上皮内的药物相互作用，我们开发了一种方案，从鼠结肠样体中建立2-二脉（2D）单层，可以用炎症介质进行基础治疗，并用药物治疗进行顶端治疗。
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Protocol
本文描述的所有使用小鼠组织的实验均已获得匹兹堡大学机构审查委员会的批准，并根据匹兹堡大学动物研究和护理委员会和 UPMC 制定的指导方针进行。
1. 培养准备
注意：所有试剂都列在 材料 表部分，所有溶液组成都可以在溶液成分表中找到（表1）。
- 如 表1所述制备小鼠洗涤培养基。在 4°C 下储存长达 2 个月。
- 如表1所述制备加密隔离缓冲液 1（CIB1）。在 4°C 下储存长达 2 个月。
注意：二硫苏糖醇 （DTT） 被 OSHA 危害沟通标准认为是危险的，因为摄入可能会产生急性毒性，如果这些区域暴露在它面前，会损害皮肤和眼睛。处理这种化学品时，应使用防护手套、护目镜和面部防护装置。 - 如 表1中所述制备加密隔离缓冲液2（CIB2）。在 4°C 下储存长达 2 个月。
- 根据先前发表的方案制备L-WRN条件培养基16。
- 如 表1所述制备完整的结肠培养基。完整的结肠样生长培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。
- 制备分化培养基，如 表1所述。该协议是从先前发表的论文17修改而来的。分化培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。
- 制备如 表1中所述的炎症介质培养基。该协议是从先前发表的论文18修改而来的。炎症介质培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。
- 准备小鼠单层培养基。用炎症因子和/或药物攻击单层时省略Y-27632。小鼠单层培养基可在4°C下储存长达5天而不会损失活性。
- 制备炎症介质单层培养基。炎症介质单层培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。
2. 从小鼠结肠组织中分离隐窝
注意：将组织转移到冰上。从-20°C储存中取出适量的基底膜基质，并在冰上解冻。每个 24 孔接种 15 μL 基底膜基质。如第 1 节所述制备 CIB1、CIB2 和完整的结肠样生长培养基。
- 根据机构动物护理和使用委员会批准的方案对C57BL / 6J小鼠（6-8周龄）实施安乐死，并使用干净的镊子和剪刀提取结肠的远端（约5-7厘米）。
注意：在这项研究中，受试者使用二氧化碳室孵育2-3分钟进行安乐死，然后进行颈椎脱位。- 为此，将鼠标放在其背上，在胸腔下方做一个水平切口，然后从水平切口的中间向尾巴底部垂直切口以露出腹腔。
- 用镊子将小肠移出视野，识别结肠，然后沿着它向下移动到尾巴的底部。如果需要，用剪刀折断骨盆，以完全暴露远端结肠。用剪刀剪掉结肠最远端的5-7厘米。
- 将结肠组织放在干净的表面上。去除结肠周围多余的浆膜脂肪。使用连接到 18 G 1 1/2 针头的注射器，用 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 冲洗结肠的腔内内容物，从而去除粪便。然后，将结肠放入含有 10 mL 冰冷 DPBS 的 50 mL 锥形管中，并将其放在冰上。
注意：如果将结肠与多只动物分离，请将组织放在冰上，然后再继续下一只动物。 - 将结肠组织转移到装有 10 mL 冰冷 DPBS 的培养皿中，并使用 P1,000 移液管用 DPBS 冲洗管腔两次。
- 用剪刀纵向打开结肠，用镊子在DPBS中轻轻摇晃~30秒，以去除任何残留的粪便内容物。
- 将组织转移到装有 10 mL 冰冷 DPBS 的新培养皿中，然后再次用镊子轻轻摇动，然后用剪刀将结肠切成 2 cm 的碎片，并将它们放入含有 7 mL 冰冷 CIB1 的 50 mL 锥形管中。将组织在CIB1中在冰上孵育20分钟。
注意：其余步骤在生物安全柜内执行。 - 使用镊子将组织转移到含有 7 mL CIB2 的预热 50 mL 锥形管中，并在 37°C 的水浴中孵育 5 分钟。
- 让组织沉淀在锥形管底部，然后移取 CIB2，从 50 mL 锥形管中取出 CIB2。然后，将 10 mL 冰冷的小鼠洗涤培养基加入同一锥形管中。
- 获得一个新的 50 mL 锥形管，并将 70 μm 过滤器放在开管的顶部。
- 在握住装有结肠内容物的试管的同时，将手旋转约 45°。以摇晃和剧烈的方式摇动管子45秒以释放隐窝。然后，通过 70 μm 细胞过滤器将隐窝悬浮液倒入新的 50 mL 锥形管中。
- 使用镊子将结肠组织放回空的 50 mL 锥形管中，并加入 10 mL 冰冷的小鼠清洗培养基。获得一个新的70μm细胞过滤器，并将其放置在含有先前过滤溶液的50 mL锥形管的顶部。
- 再次，拿起含有隐窝碎片的 50 mL 管，并以与步骤 2.9 中相同的方式摇动它。通过70 μm细胞过滤器将培养基过滤到50 mL锥形管中，以与先前过滤的隐窝结合。
注意：如果隐窝产量低，请将组织放入装有 10 mL 小鼠洗涤培养基的空 50 mL 锥形管中，再摇动结肠组织一次。摇动组织45-50秒以释放隐窝。另外，如果地穴产量低，则增加震动的力度。最后，如果整体隐窝产量较低，则可以用胎牛血清（FBS）涂覆移液管和管子，以防止组织粘附在塑料上。 - 将含有过滤隐窝的 50 mL 锥形管在 300 x g 下在 4°C 下离心 5 分钟。
注意：应在 50 mL 锥形管底部观察颗粒。 - 通过移液倒出培养基，用 10 mL 冰冷的小鼠洗涤培养基上下移液重悬隐窝，然后转移到 15 mL 锥形管中。在 4°C 下以 300 x g 离心 5 分钟。
- 为了获得更清洁的制剂，用额外的 10 mL 小鼠洗涤培养基清洗隐窝。倒出先前的培养基，并通过在 10 mL 小鼠洗涤培养基中上下移液来重悬隐窝。使用 15 mL 锥形管在 4°C 下以 300 x g 离心 5 分钟。
注意：移出培养基时应小心，因为有时沉淀没有紧密离心。如果沉淀不紧，请移取大部分培养基，留下 500 μL 至 1 mL。然后，通过将移液到10 mL小鼠洗涤培养基中重悬沉淀，并将溶液转移到15 mL锥形管中。在较小的锥形管中离心可以提高颗粒的密封性。 - 倒出培养基，并用 10 mL 冰冷的小鼠洗涤培养基上下移液重新悬浮隐窝。重悬后，立即将 10 μL 培养基移液到载玻片上，在明场显微镜下计数隐窝。
- 将两个 10 μL 滴滴放在载玻片的不同末端，并计算每个液滴中的隐窝数量。平均两滴之间的数字以确定每 10 μL 的隐窝数量。将此数字乘以 100 得到 1 mL 中的隐窝数量。
注意：为了准确计数，重悬后必须立即去除 10 μL 的隐窝悬浮液。否则，地穴将落到管子底部，这将导致计数不准确。
- 将两个 10 μL 滴滴放在载玻片的不同末端，并计算每个液滴中的隐窝数量。平均两滴之间的数字以确定每 10 μL 的隐窝数量。将此数字乘以 100 得到 1 mL 中的隐窝数量。
- 目标是每孔电镀 300-500 个隐窝，将重悬于小鼠洗涤培养基中的适当体积的隐窝转移到新的 15 mL 锥形管中，并用冰冷的小鼠洗涤培养基加热至 10 mL。在 4°C 下以 300 x g 离心管 5 分钟。 在管子底部应该可以看到一个小颗粒。
- 用电动移液管除去上清液。使用 P200 移液管小心地去除任何残留介质，只留下沉淀。
- 通过缓慢上下移液，将沉淀重悬于适量的冰冷基底膜基质中。重悬隐窝颗粒时注意不要引入气泡。在板的每个孔中板 300-500 个隐窝/15 μL 基底膜基质。铺板后，倒置组织培养板，并将其置于37°C培养箱中10-20分钟。
- 恢复板，并向每个孔中加入 500 μL 完整的小鼠结肠样培养基。每隔一天更换一次培养基，直到它们准备好传代。每3-5天传代一次结肠。
3. 传代结肠
注：根据原井的密度，每口井一般可以1：4至1：6通过。取适量的基底膜基质从-20°C中取出，并将其放在冰上解冻。结肠类化合物可用于两次传代后的实验。传代结肠时，这些步骤在生物安全柜中进行以防止污染。
- 从要传代的孔中取出培养基。
- 如果基底膜基质内有碎片，这在初始隔离期间可能发生，则可以使用以下方案来清理碎片：
- 在每个孔中加入 1 mL 冰冷的 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 在 DPBS 中不含 Ca 2+ 或 Mg2+。让它在生物安全柜中静置5分钟。
- 使用 P1000 移液器上下移液三到七次，以破坏基底膜基质，并将孔的内容物收集在 15 mL 锥形管中。在不含Ca 2+或Mg2+的DPBS中以总共5-10mL的0.1%BSA离心结肠。用0.1%BSA补足适当的体积。
- 在 4°C 下以 150 x g 离心 5 分钟以沉淀结肠而不是碎片。
- 通过移液倒出DPBS，留下沉淀。加入 1 mL 室温 （RT） 酶解离试剂，移液 3 至 5 次。
- 将装有酶解离试剂和破坏结肠的 15 mL 锥形管置于 37°C 水浴中 3-4 分钟。
- 从水浴中取出试管，移液3-5次，然后用小鼠洗涤介质至10mL。继续执行步骤 3.6。
- 如果基底膜基质内有碎片，这在初始隔离期间可能发生，则可以使用以下方案来清理碎片：
- 在每个孔中放置 500 μL RT 酶解离试剂，静置约 1 分钟，然后上下移液 3 至 7 次以破坏基底膜基质。
- 将板置于37°C培养箱中3-4分钟。
- 从培养箱中取出板，并使用 P1000 移液器上下移液 3 到 7 次以解离结肠样蛋白。
- 将内容物转移到 15 mL 锥形管中，并用冰冷的小鼠清洗介质补足多达 10 mL。
- 将样品在 300 x g 在 4°C 下离心 5 分钟。
- 根据需要使用电动移液器和P200移液器取出培养基，使锥形管中仅剩下颗粒。
- 根据要接种的孔数轻轻上下移液，重悬于适量的冰冷基底膜基质中。移液时不要引入气泡。将结肠样片段置于每孔 15 μL 基底膜基质滴液中。
- 将隐窝铺板，倒置组织培养板，然后将板置于37°C培养箱中10-20分钟。
- 最后，恢复板，并向每个孔中加入 500 μL 完整的小鼠结肠样培养基。每隔一天更换一次培养基，直到它们长到足够大，可以在大约 3-5 天内再次传代。
4.结肠样细胞终末分化
- 如上所述传代结肠样，并向每个孔中加入 500 μL 完整的小鼠结肠样培养基。
- 传代后至少48小时，取出完整的小鼠结肠培养基，并向每个孔中加入500μL分化培养基（参见第1节）。
- 将结肠样蛋白与分化培养基孵育48小时，之后可用于实验，包括RNA和蛋白质的收集。
注意：可以通过收集RNA并通过定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）分别评估Lgr5和Ki67（干细胞标志物和细胞增殖标志物）的表达来评估结肠的分化。与在传统结肠培养基中生长的结肠相比，终末分化的细胞应具有相对较低的Lgr5和Ki67表达，其中细胞更像茎样。结肠体需要在分化培养基中孵育的时间可能需要针对每个单独的实验室进行优化。引物列表参见补充表1。
5. 用炎症介质诱导分化结肠炎症
- 将结肠样与分化培养基孵育2-3天后，除去现有培养基，并向每个孔中加入500μL炎症介质培养基。
- 在收集RNA和蛋白质（或评估其他下游参数）之前，让孔孵育24-72小时。每天更换培养基。
6. 源自已建立的鼠结肠样的肠上皮单层
注意：小鼠肠上皮单层来源于至少传代两次的鼠结肠。为了在3-5天内成功形成单层，必须不要将结肠样分离成单细胞。经过酶促解离成细胞簇的碎片化类器官是生长的理想选择。
- 在开始实验之前准备所有试剂。在冰上解冻基底膜基质。如第1节所述制备小鼠单层培养基。用冷鼠单层培养基1：20稀释解冻的基底膜。继续在冰上。
- 使用无菌镊子将0.4μm透明细胞培养插入物放入24孔组织培养板的单个孔中（材料表）。抓住刀片的角爪，然后将其转移到孔中。重复上述步骤，直到有适当数量的细胞培养插入物可用于培养。
注意：确保仅用基底膜基质涂覆额外的对照孔。该细胞培养插入片段将用于测量没有细胞的细胞培养插入物的背景电阻，如后续步骤（步骤6.3）所述。 - 使用 P200 移液管，用 150 μL 稀释的基底膜基质覆盖每个细胞培养插入物的顶端（顶部）表面。将移液器尖端放在插入物的中心，不要接触插入物的膜，然后轻轻排出溶液。将板置于含有5%CO2 的无菌37°C培养箱中至少1小时。
- 使用前轻轻除去基底膜基质，让细胞培养插入物在生物安全柜中干燥至少10分钟。
- 要去除基底膜基质，请将 24 孔板以 45° 角旋转。将一根手指放在插脚的一角以稳定插入物，并使用P200移液器将移液器尖端沿着插入物的底部轻轻放置并取出基质。
- 用不含Ca 2 +或Mg2+的150μL无菌DPBS洗涤每个细胞培养插入物，去除任何多余的残留物。
- 干燥 10 分钟后，将 400 μL 小鼠单层培养基加入细胞培养插入物底部，在顶部加入 75 μL。重复直到所有细胞培养插入物浸入。将板留在生物安全柜中，或将其放回培养箱中，直到需要为止。
- 从 37°C、5% CO2 培养箱中取出成熟（生长第 3-5 天的类器官）肠结肠样的 24 孔板，并将其置于生物安全柜下。使用无菌吸头取出培养基，并用 1 mL RT 无菌 DPBS（不含 Ca 2+ 或 Mg2+）洗涤每个孔。
注意：75-125个成熟结肠的单个孔以1：4的比例分裂。 - 使用无菌吸头去除不含Ca 2+或Mg2+的DPBS，并通过在每个待传代孔中放置500μLRT酶解离试剂来消化基底膜基质的每个塞子。
- 上下移液每个孔约 6-10 次以打破塞子。不要刮擦板的底部以取下插头。相反，以 45° 角旋转 24 孔板，将移液器的尖端放在塞子的边缘，然后轻轻地将其移开。
- 将 24 孔板放回无菌 37°C、5% CO2 培养箱中 3-4 分钟。
- 取出板，并在生物安全柜下为每个孔上下移液酶解离试剂五到七次。将每个孔中的分离结肠转移到无菌的 15 mL 锥形管中。用冰冷的小鼠清洗介质加热至 10 mL 的体积。
- 在4°C下以300× g 离心部分消化的结肠样蛋白5分钟。
- 在生物安全柜下，使用 10 mL 移液管从沉淀中取出上清液。使用 P200 移液管去除任何剩余的培养基。将结肠样沉淀重悬于小鼠单层培养基中。每个要铺板的片段化结肠样蛋白的细胞培养插入物中加入 75 μL 培养基。
- 在每个细胞培养插入物的中心加入 75 μL 结肠样悬浮液。在将结肠悬浮液添加到每个孔中之前，在取出 75 μL 之前轻轻上下移液一次或两次，这样可以使铺板更均匀。
- 将带有细胞培养插入物的24孔板放在旋转平台上10分钟，以进一步均匀分散在细胞培养物上。
- 将板置于无菌 37°C、5% CO2 培养箱中。
- 第二天（第 1 天），用 P200 移液管上下移液培养基三到五次，以去除未附着的结肠碎片。轻轻地将尖端放在细胞培养插入物的内部，以免破坏附着的肠细胞。不要将气泡引入介质中，因为这会阻止去除所有未附着的碎片。
- 立即取出培养基和结肠混合物。重复上述步骤，直到清洁完所有细胞培养插入物。
- 将 150 μL 预热的鼠单层培养基轻轻添加到每个细胞培养插页的顶端侧。向新的 24 孔板的每个孔中加入 400 μL 加热的鼠单层培养基。使用无菌镊子抓住细胞培养物的插脚，将细胞培养插入物转移到新板上。每隔一天更换培养基，直到汇合。
注意：结肠样碎片应在接种后3-5天形成融合的单层。
7.在单层培养的第3-5天使用伏欧表测量上皮单层的净电阻
注意：筷子电极类似于镊子，长度不对称。探针的较长臂是基底外侧电极，较短的臂是顶端电极。探针可能难以插入细胞培养插入物的内部和外部之间。插入时将探头以轻微的角度放置，然后垂直拉直探头，将防止探头卡住。确保以相似的角度读取每个细胞培养插入片段的净电阻，因为这会影响值。
- 将伏欧表和所有试剂放在生物安全柜内。
- 将伏欧表插入最近的交流电源插座，然后将电极探头的塑料模块化连接器插入前面板显示屏上的 输入 插孔。
- 要将伏欧表以 45° 角放置，请将设备背面的金属臂向外摆动，直到其锁定到位。
- 现在，通过向上翻转前面板显示屏上的电源开关来打开伏特表。最后，将开关向上翻转至欧姆以显示此指标中的读数。
- 从 37°C、5% CO2 培养箱中取出 24 孔板，并将板平放在生物安全柜中。跨上皮电阻 （TEER） 对温度敏感。仅在读取 TEER 之前立即取下板。
- 在预热的70%乙醇中对电极探针灭菌30秒至1分钟。取下探针，倒置并轻弹一到两次以去除多余的乙醇。让探头风干约30秒。
- 用预热的小鼠洗涤介质洗涤探针上残留的任何乙醇。
注意：不要让探针上任何剩余的乙醇液滴落入细胞培养插入物中。用培养基洗掉乙醇时，不要让培养基高于无菌乙醇场。这可能导致受污染的培养基进入细胞培养插入物。 - 将探针垂直于细胞培养插入物。将基底外侧电极（探针的较长端）插入细胞培养插入物的外部，直到它接触 24 孔板的底部。将顶端电极（探针的较短端）滑入细胞培养插入物中。不要改变两个电极在孔之间的距离。这将影响TEER测量。
- 在读取TEER之前，验证顶端电极没有接触细胞培养插入物的底部。从背景对照细胞培养插入片段开始，并记录值。该值将自动以数字方式显示在伏欧表的正面。
- 对每个细胞培养插入片段重复步骤7.5-7.6。
注意：如果细胞培养插入物之间存在不同的实验条件，请在每个新条件之间对探针进行灭菌。从步骤 7.1 开始，然后按数字方式完成这些步骤。 - 记录所有TEER测量值后，将24孔板放回培养箱中。
- 350 Ω或更高的净值表明单层形成。在接下来的几天里再次重复，直到形成单层。
注意：通常，第 3 天可以捕获 1,000 Ω或更大的值，但随着时间的推移，它们都将收敛在 350 Ω左右的较低数字上。
8. 使用伏欧表的净电阻测量值计算TEER
注意：结肠体的成功单层形成将使TEER测量值大于115 Ω·cm2。
- 取单个净电阻值，并从背景孔中减去净电阻。涂有基底基质膜的细胞培养插入物的净读数约为100 Ω。
- 进行背景减去的净电阻测量值，并将其乘以细胞培养插入物的表面积。24孔细胞培养插入物的表面积为0.33cm2。
- 如果值为115 Ω·cm2 或更大，则进行下游实验测定。
9.用炎症介质诱导上皮单层炎症
- 一旦形成成功的单层，在培养物的基底侧向培养物中添加炎症介质。如步骤1.9中所述制备炎症介质单层培养基，并在新的24孔板中向每个孔中加入400μL。
- 从细胞培养插入物的顶端取出培养基，加入150μL不含Y-27632的鼠单层培养基。不要用炎症介质补充这一侧。但是，如果细胞死亡似乎过多，请将Y-27632留在培养基中。这必须由最终用户确定。
- 将细胞培养插入物转移到新的24孔板中，并将它们放入补充有炎症介质单层培养基的孔中。
- 用炎症介质刺激单层24-72小时，具体取决于实验。
- 为了使用该炎症模型测试药物反应，请用所选药物补充细胞培养插入物顶端侧的单层培养基。药物可以在实验中的任何一点添加，具体取决于药物的作用机制和要评估的下游参数。
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Representative Results
3D肠结肠样培养系统是研究上皮对肠粘膜稳态的内在贡献的宝贵工具。所描述的协议提供了有关如何在8周龄时从C57BL / 6J（WT）小鼠中分离隐窝并建立可用于多个下游应用的长期结肠样培养系统的详细说明。在基底膜基质中分离和电镀隐窝后，当通过明场显微镜观察时，隐窝在结构上显得致密和多细胞。它们可以是球形的，也可以是细长的圆柱形，类似于通常在 体内 肠道结构中观察到的单一的隐窝状结构（图1A）。到第1天，大多数隐窝形成紧凑的球形结构，少数结肠开始形成没有上皮细胞的内部腔（空白空间）（图1B）。随着它们在接下来的几天内继续生长，结肠的直径继续增加，结肠的管腔变得更加清晰（图1C）。到第5天，每个结肠的直径约为100-250μm，形成一个大的，突出的腔，周围环绕着一层薄薄的上皮干细胞（图1D）。在这一点上，结肠在酶和机械上都被破坏以进行传代。经过两次传代后，它们可用于下游实验。
为了评估在DSS处理的小鼠的结肠刮片中观察到的代谢变化是否保留在来自相同DSS方案的小鼠的结肠样物中，8周龄的WT小鼠在饮用水中随意用2%DSS 处理。年龄匹配和性别匹配的WT对照动物随意给予 饮用水，没有 DSS。7天后，处死小鼠，并从对照（n = 3，雄性）和DSS处理的动物（n = 3，雄性）的结肠中分离隐窝以建立结肠样。两次传代后，从每组结肠中分离蛋白质，并通过蛋白质印迹分析 评估 线粒体生物发生的主要调节蛋白过氧化物酶体增殖物 - 激活剂受体 - γ共激活物-1α（PGC1α）的表达（补充图1）。当比较从DSS处理的小鼠建立的结肠与从对照小鼠建立的结肠时，PGC1α表达没有显着差异，这表明这种结肠培养方法不能适当地反映在小鼠中观察到 的体内 代谢变化15。
PGC1α在肠道炎症损伤期间未能启动线粒体生物发生主要局限于分化的结肠上皮15,19。为了反映体内观察到的变化，我们决定将结肠引导到更分化的状态。为了诱导这种转变，结肠最初与传统的结肠培养基一起孵育。24小时至48小时后，将结肠样转移到分化培养基中再48小时。在分化过程中，一小部分结肠样体从球形结构转变为富含杯状细胞和结肠细胞的芽状结构17（图2A，B）。在补充WRN的培养基中生长的结肠富含快速分裂的Lgr5+干细胞。为了确认Lgr5+干细胞和其他增殖细胞在分化过程中都退出了细胞周期，通过qPCR分析了mRNA水平。与传统培养环境中生长的结肠（n = 6; 补充图2A，B）。人们还期望分化的结肠主要由分泌粘液的杯状细胞组成。此外，事实上，与传统生长的对应物相比，MUC2在分化结肠中上调了近两倍（n = 3，p = 0.0433，补充图3）。当综合起来时，这些数据表明结肠类化合物已成功分化并准备好进行下游实验。接下来，将炎症介质添加到分化培养基中，如协议第5节所述。在引入炎症介质后72小时内收集蛋白质和RNA进行分析。然而，在72小时，偶尔观察到细胞死亡增加。
为了评估将炎症介质引入分化结肠是否可能模拟在人类IBD和小鼠结肠炎急性模型中观察到的线粒体生物发生失败，PGC1α和转录因子A线粒体（TFAM）的蛋白表达通过蛋白质印迹分析在用炎症介质处理的分化结肠（n = 5）中评估超过72小时。 PGC1α在结肠炎小鼠模型中已被证明降低， 以及人类IBD15。TFAM是一种驱动线粒体基因组转录和复制的蛋白质，在结肠炎的小鼠模型中也被证明降低，并且在人类IBD中已被证明其基因表达降低15,20。我们观察到，在暴露于这些炎症介质72小时后，分化结肠体中的PGC1α（50.4%，p = 0.0442） 和TFAM（88.9%，p = 0.004）表达也有类似的下调（图3）。总的来说，这表明用细胞因子治疗分化的结肠是体外研究线粒体动力学的理想模型。
虽然可以在 3D 结肠样培养环境中检查各种细胞和分子功能，但在评估屏障功能、宿主-病原体相互作用以及口服吸收疗法对炎症的影响时，2D 单层培养系统更胜一筹21,22。具有完整屏障的连续融合细胞层的形成允许不同的生物或化学试剂轻松放置在细胞的顶端和/或基底侧。该协议允许从已经传代两次的预先存在的WT结肠样中建立2D单层培养物。将经过酶和机械破坏的结肠接种在涂有基底膜基质的细胞培养插入物上。初始接种时，片段化的结肠样出现在15至150个细胞的细胞簇中（图4A）。到第3天，细胞开始变平并缓慢覆盖细胞培养插入物，通常达到汇合（图4B）。在接下来的几天里，单层继续生长并形成可以通过TEER定量测量的连续屏障（图4C，D）。有趣的是，TEER 测量值在第 3 天到第 5 天之间波动。单层在较宽的范围内具有较高的值（200-800 Ω·cm 2），但到第5天（115-150 Ω·cm2，图5A）时，这些值会慢慢收敛在较低的数字上。当单层达到稳定状态时，它们可用于下游实验。
为了表征结肠衍生单层对炎症的上皮反应，将炎症介质放置在细胞的基底侧（插入物的外部）48小时。提取RNA，并通过qPCR分析各种干细胞和细胞分化标记物以及连接蛋白的mRNA水平。在这两种情况下均未检测到Lgr5，但与未处理的对照相比，另一种干细胞标志物mTERT在发炎的单层中减少了近60%（补充图4A）。接下来，我们分析了两种分化细胞类型的标记Muc2和碱性磷酸酶（Alpi）的表达。与对照细胞相比，两种mRNA转录本在发炎的单层中都较低（补充图4A）。在结肠炎症期间，干细胞和有丝分裂后细胞通常都会减少23,24,25，并且在本研究获得的单层模型中观察到类似的反应。
单层系统的一个优点是能够评估屏障响应。为了确定屏障在免疫刺激条件下是否受到损害，我们在48小时后测量了TEER值。对照单层的TEER值（n = 2）平均为129.16 Ω·cm 2，但在发炎的单层中显着下降（p = 0.0087）至平均98.54 Ω·cm2（图5B）。为了进一步确认屏障在炎症条件下受到损害，我们评估了三种不同的紧密连接标志物Zo-1，Occludin和Claudin的mRNA水平。 与未发炎的标记物相比，所有三种标记物在发炎状态下的水平都降低了（补充图4B）。总的来说，这些数据表明屏障功能障碍存在于发炎的单层中，并模仿在IBD发病过程中观察到的屏障功能障碍。
图1：小鼠隐窝的初始分离，用于建立长期结肠样培养 。 （A）在第0天，将300-500个隐窝接种在基底膜基质中（电镀后5小时获得的图像），并在（B）第1天，（C）第3天和（D）第5天捕获结肠样的生长。在第5天，结肠体准备传代。放大倍率 = 10x;比例尺 = 400 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图2：传统结肠培养中终末分化结肠的建立。 分化培养基在小鼠结肠样传代后48小时放置在结肠上。在（A）24小时和（B）48小时后，结肠样体富含终末分化的细胞。放大倍率 = 10x;比例尺 = 400 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：用炎症介质处理的小鼠分化结肠样中的 PGC1α 和 TFAM 蛋白表达。将补充有炎症介质的培养基置于分化的结肠上，并在暴露后0 h，24 h，48 h和72 h收集蛋白质。（A）PGC1α的蛋白表达在72小时内总体显着降低（p = 0.0442），TFAM在72小时暴露于炎症介质后显着下调（p = 0.004），（B）当通过方差分析分析时，蛋白质表达在24小时，48小时和72小时有下降趋势。数据以平均值±标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.005。请点击此处查看此图的大图。
图4：来自预先存在的结肠的单层的建立和生长。 将经过酶和机械破坏的结肠蛋白接种在涂有基底膜基质的细胞培养插入物上。在初始接种时，片段化的结肠样体现在（A）细胞簇中，到（B）第3天，它们开始变平并缓慢覆盖细胞培养插入物。（C）在第5天和（D）第7天，单层继续生长以形成可以通过TEER定量测量的连续屏障。放大倍率 = 10x;比例尺 = 400 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：用于建立结肠衍生单层和发炎单层的 TEER 值。 （A）从第3天到第5天使用伏欧表测量TEER值。单层在较早的范围内具有较高的值，但到第5天缓慢收敛在较低的数字上。一旦单层达到稳定状态，它们就可以用于下游实验。（B）与未发炎对照（n = 2）相比，发炎单层（n = 2）的TEER值较低。t检验分析，对照单分子膜的平均TEER为129.16 ohms·cm 2，发炎单分子膜的TEER显著降低（p = 0.0087），平均为98.54 Ω·cm2。**p < 0.01。请点击此处查看此图的大图。
表1：溶液组成表。请按此下载此表格。
补充图1：在从WT对照和2%DSS处理的小鼠分离的传统结肠培养基中生长的小鼠结肠样中PGC1α蛋白表达。 结肠样来自8周龄的WT对照小鼠和7天后2%DSS处理的小鼠。从传代两次的结肠样蛋白中分离蛋白质，并在接种后第4天。当通过非配对t检验分析时，与暴露于2%DSS7天的小鼠相比，来自对照小鼠的结肠中的PGC1α蛋白表达（p = 0.9996）没有差异。数据以平均值±标准差表示。 请点击此处下载此文件。
补充图2：分化结肠中Lgr5和Ki67 mRNA表达降低。在分离RNA和cDNA合成之前，将48小时前传代的小鼠结肠样暴露在分化培养基中48小时。通过qPCR测定mRNA水平，并通过比较CT方法进行分析。（A） 当使用t检验进行统计分析时，分化结肠中的Lgr5和（B）Ki67显着降低（p = 0.0023，p = 0.0007）。 数据以平均±标准差表示<。请点击此处下载此文件。
补充图3：分化鼠结肠样中分泌粘蛋白的杯状细胞增加。 前48小时传代的小鼠结肠样暴露在分化培养基中48小时。将细胞在RIPA缓冲液中裂解，并通过蛋白质印迹分析可视化蛋白质。（A）与未分化结肠相比，每组分化结肠的MUC2表达增加。（B）在分化条件下观察到MUC2蛋白近两倍的变化，当使用t检验（p = 0.0433）进行分析时，这是显着的。 数据以平均值±标准差表示。*p < 0.05。 请点击此处下载此文件。
补充图4：用炎症介质处理的单层中茎和分化标志物以及紧密连接标志物的表达减少。将小鼠结肠衍生的单层（第5天）暴露于炎症介质48小时，随后收集RNA，并合成cDNA（n = 2）。通过qPCR测定茎、分化和连接标志物的mRNA水平，并采用比较CT方法进行分析。（A）在这两种情况下均未检测到干细胞标志物Lgr5，但在炎症条件下mTERT显着降低。与未处理的单层相比，杯状细胞标志物Muc2和结肠细胞标志物Alpi在发炎的单层中均降低。（B）与对照组相比，紧密连接标志物Zo-1，Occludin和Claudin在炎症处理的单层中均较低。 数据以平均值±标准差表示。请点击此处下载此文件。
补充表1：引物列表。请点击此处下载此文件。
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Discussion
类器官的发展彻底改变了科学界在 体外 研究器官系统的方式，能够在培养皿中部分概括动物或人类的细胞结构和功能。此外，源自患有疾病的人类的类器官系统为个性化医疗提供了一种有前途的工具，可以指导治疗决策。在这里，我们描述了一种运行良好的加密隔离协议，并介绍了允许在电镀前清理隔离中多余碎屑的关键步骤。此外，我们还解释了一个在这个过程中经常被忽视的关键细节——准确计算电镀地穴的能力。一旦结肠建立，我们概述了允许其细胞分化或单层形成的关键操作，这可以增强研究IBD期间肠上皮变化的能力。
哺乳动物结肠上皮中的隐绒轴是由具有不同功能的不同细胞类型组成的复杂结构。该轴的维持取决于内在和外在细胞因素，它们共同有助于维持上皮稳态18。我们已经注意到，在传统培养基中生长的鼠结肠类化合物主要反映干细胞，而不是 体内看到的干细胞和终末分化细胞的聚集。此外，以这种方式生长和维持的小鼠结肠是圆形结构，而不是扁平的单层。这些差异对我们尝试在 体外研究肠道疾病具有潜在的意义。具体来说，我们使用类器官研究屏障功能变化的能力有限，以及炎症对终末分化的肠上皮细胞的影响。
在这里，我们不仅描述了分离小鼠隐窝以生长结肠的方案，而且还描述了操纵这些结肠样以研究肠上皮生理学和上皮对炎症的反应的方案。在促进多能干细胞和终末分化细胞梯度的几个外在因素中，Wnt规范途径富含隐窝并促进干细胞健康。Wnt信号在隐窝轴的顶端减弱，与干细胞进化为终末分化细胞相吻合26。我们已经描述了一种允许结肠样细胞终末分化的协议。像其他人一样，我们通过从生长培养基中去除Wnt来区分，但我们使用较低浓度的R-斯宾丁（500 ng/mL 与1 μg/mL R-斯宾丁）17。令人惊讶的是，R-spondin减少50%不会影响类器官的成功分化。以较低浓度分化的能力有助于建立一个不太人工的系统，该系统可能更接近体内的生理环境。尽管该协议导致有限的终末分化（补充图2和补充图3）和无法维持细胞永生，但它仍然是更好地了解终末分化上皮（包括结肠细胞，肠内分泌细胞和杯状细胞）对IBD和其他疾病状态的生理贡献的有用方法。此外，我们表明，将特定的细胞因子补充到这种培养基中，传统上在IBD患者中升高，将分化的类器官系统引导到炎症状态。在72小时内，用炎性细胞因子处理的分化结肠更密切地反映了其他已建立的结肠炎和人类IBD模型中显示的一些代谢发现（图3）。此外，以这种方式治疗的分化结肠样体可能更能反映炎症对分化上皮细胞稳态的影响。我们还概述了开发单层的协议，该协议能够形成上皮的顶端和基底侧，从而可以分析体内的屏障功能。该系统可用于研究屏障功能障碍的机制，而无需区分和培养新的治疗靶点进行治疗。
必须注意有关上述协议的几个限制和潜在陷阱。隐窝的成功分离和结肠样的发育可能受到每只动物的隐窝产量、穴穴计数的准确性和制备的清洁度的限制。重悬后分离的隐窝计数速度、隐窝与下层肌肉的机械解离变化以及洗涤和离心旋转的次数有助于成功的结肠样培养。此外，在传代或接种2D单层培养过程中，不要将类器官完全解离成单个细胞，这一点至关重要。30至50个细胞的簇是允许培养物繁殖以进行长期培养的理想选择。上述协议指出了潜在陷阱的领域以及解决这些问题的可选附加步骤。最终，由于技能和动作（即摇晃）的固有可变性以及每只动物的变化，该方案可能需要由执行隔离的个体进行优化。最终用户可能需要额外的优化来捕获IBD中发现的遗传和分子多样性。
最终，虽然结肠系统是重述 体内人类生理学和疾病关键方面的非常有用的工具，但该系统最终在研究人类疾病的各个方面的能力方面受到限制。传统的结肠样发育方法阐明了干细胞动力学的关键方面;然而，这些发现通常不能充分反映宿主上皮内终末分化细胞的发现。本研究中概述的策略为研究人员提供了一种相对快速，廉价的类器官操作模型，如果使用得当，可以揭示炎症期间肠上皮结构和功能的关键方面。
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Disclosures
贡献作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01DK120986（KPM）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
References
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