Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Isolierung von murinen Kolonkrypten für die Entwicklung von 3-dimensionalen Kolonoiden beschreibt. Die etablierten Kolonoide können dann terminalisiert werden, um die zelluläre Zusammensetzung des Wirtsepithels widerzuspiegeln, bevor sie eine entzündliche Herausforderung erhalten oder angewiesen werden, eine epitheliale Monoschicht zu bilden.

Abstract

Das Darmepithel spielt eine wesentliche Rolle für die menschliche Gesundheit, da es eine Barriere zwischen dem Wirt und der äußeren Umgebung darstellt. Diese hochdynamische Zellschicht stellt die erste Verteidigungslinie zwischen mikrobiellen und immunen Populationen dar und hilft, die Immunantwort des Darms zu modulieren. Die Störung der Epithelbarriere ist ein Kennzeichen der chronisch entzündlichen Darmerkrankung (CED) und für das therapeutische Targeting von Interesse. Das 3-dimensionale Kolonoidkultursystem ist ein äußerst nützliches In-vitro-Modell für die Untersuchung der Dynamik von Darmstammzellen und der Physiologie von Epithelzellen in der Pathogenese von CED. Im Idealfall wäre die Etablierung von Kolonoiden aus dem entzündeten Epithelgewebe von Tieren am vorteilhaftesten, um die genetischen und molekularen Einflüsse auf Krankheiten zu beurteilen. Wir haben jedoch gezeigt, dass in vivo Epithelveränderungen bei Kolonoiden, die von Mäusen mit akuter Entzündung gebildet wurden, nicht unbedingt erhalten bleiben. Um dieser Einschränkung zu begegnen, haben wir ein Protokoll zur Behandlung von Kolonoiden mit einem Cocktail von Entzündungsmediatoren entwickelt, die typischerweise während einer CED erhöht sind. Während dieses System ubiquitär auf verschiedene Kulturbedingungen angewendet werden kann, legt dieses Protokoll den Schwerpunkt auf die Behandlung sowohl auf differenzierten Kolonoiden als auch auf 2-dimensionalen Monoschichten, die von etablierten Kolonoiden abgeleitet sind. In einer traditionellen Kulturumgebung werden Kolonoide mit Darmstammzellen angereichert, was eine ideale Umgebung für die Untersuchung der Stammzellnische bietet. Dieses System erlaubt jedoch keine Analyse der Merkmale der Darmphysiologie, wie z.B. der Barrierefunktion. Darüber hinaus bieten traditionelle Kolonoide nicht die Möglichkeit, die zelluläre Antwort von terminal-differenzierten Epithelzellen auf proinflammatorische Reize zu untersuchen. Die hier vorgestellten Methoden bieten einen alternativen experimentellen Rahmen, um diese Einschränkungen zu adressieren. Das 2-dimensionale Monolayer-Kultursystem bietet auch die Möglichkeit für ein therapeutisches Wirkstoff-Screening ex vivo. Diese polarisierte Zellschicht kann mit Entzündungsmediatoren auf der basalen Seite der Zelle und gleichzeitig mit putativen Therapeutika apikal behandelt werden, um ihren Nutzen bei der CED-Behandlung zu bestimmen.

Introduction

Entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind eine chronische, remittierende und rezidivierende Erkrankung, die durch Episoden von Entzündungen und klinischer Ruhe gekennzeichnet ist. Die Ätiologie der CED ist multifaktoriell, aber zu den wichtigsten charakteristischen Merkmalen der Erkrankung gehören eine gestörte Barrierefunktion und eine erhöhte Permeabilität des Darmepithels sowie proinflammatorische Signalkaskaden, die innerhalb des Epithelkompartiments aktiviert werden ^1,2. Mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle wurden verwendet, um die Epithelreaktion während CED zu rekapitulieren, einschließlich Zellkultur- und Mausmodellen der Entzündung³. Alle diese Systeme weisen jedoch wichtige Mängel auf, die ihre Fähigkeit einschränken, die epithelialen Veränderungen während der IBD⁴ zu rekapitulieren. Die meisten Zelllinien, die zur Untersuchung von CED verwendet werden, sind transformiert, haben die Fähigkeit, eine Monoschicht zu bilden, und können³ differenzieren, sich aber intrinsisch anders vermehren als nicht transformierte Darmepithelzellen im Wirt. Zur Untersuchung von CED werden verschiedene murine Entzündungsmodelle verwendet, darunter Knockout-Modelle, infektiöse Modelle, chemische Entzündungsmodelle und T-Zell-Transfermodelle 5,6,7,8. Während jeder von ihnen bestimmte ätiologische Aspekte der CED untersuchen kann, wie z. B. genetische Veranlagungen, Barrieredysfunktionen, Immunderegulation und das Mikrobiom, sind sie in ihrer Fähigkeit, die multifaktorielle Natur der Krankheit zu untersuchen, begrenzt.

Intestinale Organoide, einschließlich Enteroide und Kolonoide, haben sich in den letzten zehn Jahren als nützliches In-vitro-Modell etabliert, um nicht nur die Dynamik von Darmstammzellen zu untersuchen, sondern auch ihre Rolle, die Barriereintegrität und die Funktion des Darmepithels bei der Darmhomöostase und -erkrankung spielen. Diese Entitäten haben wesentlich zu unserem Verständnis der Pathogenese von CED⁹ beigetragen und neue Möglichkeiten für die personalisierte Medizin eröffnet. Kolonoide oder aus Stammzellen gewonnene, selbstorganisierende Gewebekulturen aus dem Dickdarm wurden sowohl aus murinem als auch aus menschlichem Gewebe in einem Prozess entwickelt, der es Stammzellen in Darmkrypten ermöglicht, sich zu vermehren und auf unbestimmte Zeit erhalten zu bleiben¹⁰. Die Stammzellnische in vivo stützt sich auf extrazelluläre Faktoren, um ihr Wachstum zu unterstützen, insbesondere auf die kanonischen Wnt-Signalwege und die knochenmorphogenen Proteinsignalwege¹¹. Die Hinzufügung dieser Faktoren fördert die Gesundheit und Langlebigkeit von Kolonoiden, treibt die Kultur aber auch in Richtung eines stammzellähnlichen Zustands, der nicht die in vivo epitheliale Zellarchitektur widerspiegelt, die sowohl aus sich selbst erneuernden als auch aus terminalen differenzierten Zellen besteht^12,13. Während die Funktionalität des Darmepithels von der kontinuierlichen Wechselwirkung zwischen dem Stammzellkompartiment und den differenzierten Zellen abhängt, ist die Fähigkeit, beides in einem Kolonoidkultursystem zu haben, ziemlich begrenzt. Trotz dieser Einschränkungen bleibt das Organoid-Kultursystem der Goldstandard, um die intrinsischen Eigenschaften des Epithels ex vivo zu untersuchen. Nichtsdestotrotz müssen möglicherweise alternative Kulturstrategien in Betracht gezogen werden, um die vorliegende wissenschaftliche Frage zu beantworten.

Es wurde gezeigt, dass Mäuse, die ein kontinuierliches 7-tägiges Regime von Dextrans-Natriumsulfat (DSS) erhalten, sowohl eine epitheliale Entzündung als auch eine Barrieredysfunktion entwickeln¹⁴. Darüber hinaus wurden auch das Versagen der mitochondrialen Biogenese und die metabolische Reprogrammierung innerhalb des Darmepithels, die sich bei humaner CED gezeigt haben, in diesem DSS-Modell der Kolitis¹⁵ erfasst. Unsere vorläufigen Daten zeigen jedoch, dass die Merkmale des Versagens der mitochondrialen Biogenese in Kolonoiden, die aus den Krypten von DSS-behandelten Tieren stammen, nicht erhalten bleiben (ergänzende Abbildung 1). Daher müssen alternative Kulturmethoden verwendet werden, um zu untersuchen, wie Entzündungen epitheliale Veränderungen während der murinen Darmentzündung vorantreiben. Hier skizzieren wir ein von uns entwickeltes Protokoll, das beschreibt, 1) wie man Krypten aus ganzem Dickdarmgewebe isoliert, um murine Kolonoide zu etablieren, 2) wie man diese Zellpopulation terminal, um die Zellpopulation widerzuspiegeln, wie sie in vivo steht, und 3) wie man in diesem In-vitro-Modell eine Entzündung induziert. Um Arzneimittelwechselwirkungen innerhalb des entzündeten Epithels zu untersuchen, haben wir ein Protokoll entwickelt, um 2-dimensionale (2D) Monoschichten aus murinen Kolonoiden zu etablieren, die basal mit Entzündungsmediatoren und apikal mit medikamentösen Therapien behandelt werden können.

Protocol

Alle hier beschriebenen Versuche mit murinem Gewebe wurden vom Institutional Review Board der University of Pittsburgh genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Research and Care Committee der University of Pittsburgh und des UPMC durchgeführt.

1. Vorbereitung auf die Kultur

HINWEIS: Alle Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt und alle Lösungszusammensetzungen finden Sie in der Tabelle der Lösungszusammensetzung (Tabelle 1).

1. Bereiten Sie das Mauswaschmedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Bei 4°C bis zu 2 Monate lagern.
2. Bereiten Sie den Crypt-Isolationspuffer 1 (CIB1) wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Bei 4°C bis zu 2 Monate lagern.
   VORSICHT: Dithiothreitol (DTT) wird vom OSHA Hazard Communication Standard aufgrund der potenziellen akuten Toxizität bei Verschlucken und Haut- und Augenschäden, wenn diese Bereiche ihm ausgesetzt sind, als gefährlich eingestuft. Beim Umgang mit dieser Chemikalie sollten Schutzhandschuhe, Augenschutz und Gesichtsschutz verwendet werden.
3. Bereiten Sie den Crypt Isolation Buffer 2 (CIB2) wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Bei 4°C bis zu 2 Monate lagern.
4. L-WRN-konditioniertes Medium nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll¹⁶ herstellen.
5. Bereiten Sie das vollständige Kolonoidmedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Vollständiges Kolonwachstumsmedium kann bis zu 5 Tage bei 4°C gelagert werden, ohne dass es zu einem Aktivitätsverlust kommt.
6. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Dieses Protokoll wurde gegenüber einem zuvor veröffentlichten Artikel¹⁷ modifiziert. Das Differenzierungsmedium kann bis zu 5 Tage bei 4°C gelagert werden, ohne dass es zu einem Aktivitätsverlust kommt.
7. Bereiten Sie das Entzündungsmediatormedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Dieses Protokoll wurde gegenüber einem zuvor veröffentlichten Artikel¹⁸ modifiziert. Das Entzündungsmediatormedium kann bis zu 5 Tage bei 4°C gelagert werden, ohne dass es zu einem Aktivitätsverlust kommt.
8. Bereiten Sie das murine Monolayer-Medium vor. Y-27632 weglassen, wenn die Monoschichten mit Entzündungsfaktoren und/oder Medikamenten belastet werden. Das murine Monolayer-Medium kann bis zu 5 Tage bei 4°C gelagert werden, ohne dass es zu einem Aktivitätsverlust kommt.
9. Bereiten Sie das Entzündungsmediator Monolayer-Medium vor. Das Entzündungsmediator Monolayer-Medium kann bis zu 5 Tage bei 4°C gelagert werden, ohne dass es zu einem Aktivitätsverlust kommt.

2. Kryptenisolierung aus murinem Dickdarmgewebe

HINWEIS: Übertragen Sie das Gewebe auf Eis. Nehmen Sie die entsprechende Menge der Basalmembranmatrix aus der Lagerung bei −20 °C und tauen Sie sie auf Eis auf. Jede 24-Well-Beschichtung ist mit 15 μl Basalmembranmatrix beschichtet. Bereiten Sie CIB1, CIB2 und das vollständige Dickdarmwachstumsmedium wie in Abschnitt 1 beschrieben vor.

1. Euthanasieren Sie eine C57BL/6J-Maus (6-8 Wochen alt) gemäß dem vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokoll und entfernen Sie das distale Ende (ca. 5-7 cm) des Dickdarms mit einer sauberen Pinzette und Schere.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden die Probanden mit einer Kohlendioxid-Kammer-Inkubation für 2-3 Minuten euthanasiert, gefolgt von einer Zervixluxation.
   1. Legen Sie dazu die Maus auf den Rücken, machen Sie einen horizontalen Schnitt direkt unter dem Brustkorb und dann einen vertikalen Schnitt von der Mitte des horizontalen Einschnitts in Richtung Schwanzansatz, um die Bauchhöhle freizulegen.
   2. Bewegen Sie mit einer Pinzette den Dünndarm aus dem Feld, identifizieren Sie den Dickdarm und folgen Sie ihm bis zum Schwanzansatz. Brechen Sie das Becken mit einer Schere, um den distalen Dickdarm bei Bedarf vollständig freizulegen. Schneiden Sie mit der Schere die distalsten 5-7 cm des Dickdarms ab.
2. Legen Sie das Dickdarmgewebe auf eine saubere Oberfläche. Entfernen Sie das überschüssige seröse Fett, das den Dickdarm umgibt. Entfernen Sie die Fäkalien, indem Sie den luminalen Inhalt des Dickdarms mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit einer Spritze spülen, die an einer 18 G 1 1/2 Nadel befestigt ist. Geben Sie dann den Dickdarm in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das 10 ml eiskaltes DPBS enthält, und legen Sie es auf Eis.
   HINWEIS: Wenn Sie den Dickdarm von mehr als einem Tier isolieren, legen Sie das Gewebe auf Eis, bevor Sie mit dem nächsten Tier fortfahren.
3. Übertragen Sie das Dickdarmgewebe in eine Petrischale mit 10 ml eiskaltem DPBS und spülen Sie das Lumen zweimal mit DPBS mit einer P1.000-Pipette.
4. Öffnen Sie den Dickdarm in Längsrichtung mit einer Schere und schütteln Sie ihn vorsichtig mit einer Pinzette ~30 s lang im DPBS, um den restlichen Stuhlinhalt zu entfernen.
5. Übertragen Sie das Gewebe in eine neue Petrischale mit 10 ml eiskaltem DPBS und schütteln Sie es erneut vorsichtig mit einer Pinzette, bevor Sie den Dickdarm mit einer Schere in 2 cm große Stücke schneiden und in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 7 ml eiskaltem CIB1 legen. Inkubieren Sie das Gewebe in CIB1 für 20 Minuten auf Eis.
   HINWEIS: Die restlichen Schritte werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt.
6. Das Gewebe wird mit einer Pinzette in ein vorgewärmtes konisches 50-ml-Röhrchen mit 7 ml CIB2 überführt und 5 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert.
7. Entfernen Sie das CIB2 aus dem konischen 50-ml-Röhrchen, indem Sie das Gewebe am Boden des konischen Röhrchens absetzen lassen und dann das CIB2 abpipettieren. Geben Sie dann 10 ml eiskaltes Mauswaschmedium in dasselbe konische Röhrchen.
8. Besorgen Sie sich ein neues konisches 50-ml-Röhrchen und setzen Sie einen 70-μm-Filter auf das offene Röhrchen.
9. Während Sie das Röhrchen mit dem Dickdarminhalt halten, drehen Sie die Hand um ca. 45°. Schütteln Sie die Röhre 45 s lang schaukelnd und kräftig, um die Krypten freizugeben. Gießen Sie dann die Kryptensuspension durch das 70-μm-Zellsieb in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen.
10. Legen Sie das Dickdarmgewebe mit einer Pinzette zurück in das leere konische 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 10 ml eiskaltes Mauswaschmedium hinzu. Besorgen Sie sich ein neues 70-μm-Zellsieb und legen Sie es auf das konische 50-ml-Röhrchen, das die zuvor gefilterte Lösung enthält.
11. Nehmen Sie wieder das 50-ml-Röhrchen mit den Kryptenfragmenten in die Hand und schütteln Sie es auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.9. Filtern Sie das Medium durch das 70-μm-Zellsieb in das konische 50-ml-Röhrchen, um es mit den zuvor gefilterten Krypten zu verbinden.
    HINWEIS: Wenn die Kryptenausbeute gering ist, schütteln Sie das Dickdarmgewebe ein weiteres Mal, indem Sie das Gewebe in ein leeres konisches 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Mauswaschmedium geben. Schütteln Sie das Gewebe 45-50 s lang, um die Krypten zu lösen. Wenn die Ausbeute der Krypta gering ist, dann erhöhe die Heftigkeit des Schüttelns. Wenn die Gesamtausbeute der Krypta gering ist, können sowohl die Pipetten als auch die Röhrchen mit fötalem Kälberserum (FBS) beschichtet werden, um das Anhaften des Gewebes am Kunststoff zu verhindern.
12. Das konische 50-ml-Röhrchen mit den filtrierten Krypten wird bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
    HINWEIS: Ein Pellet sollte am Boden des konischen 50-ml-Röhrchens beobachtet werden.
13. Dekantieren Sie das Medium durch Pipettieren, resuspendieren Sie die Krypten, indem Sie es mit 10 ml eiskaltem Mauswaschmedium auf und ab pipettieren, und geben Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen um. Bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
14. Um eine sauberere Zubereitung zu erhalten, waschen Sie die Krypten mit zusätzlichen 10 ml Mauswaschmedium. Dekantieren Sie das vorherige Medium und suspendieren Sie die Krypten erneut, indem Sie in 10 ml Mauswaschmedium auf und ab pipettieren. Bei 300 x g 5 min bei 4 °C in einem konischen 15-ml-Röhrchen zentrifugieren.
    HINWEIS: Beim Pipettieren des Mediums ist Vorsicht geboten, da das Pellet manchmal nicht fest zentrifugiert ist. Wenn das Pellet nicht dicht ist, pipettieren Sie den größten Teil des Mediums ab und lassen Sie 500 μl bis 1 ml übrig. Anschließend wird das Pellet durch Pipettieren in 10 ml Mauswaschmedium resuspendiert und die Lösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Das Zentrifugieren in einem kleineren konischen Röhrchen kann die Dichtigkeit des Pellets verbessern.
15. Dekantieren Sie das Medium und suspendieren Sie die Krypten erneut, indem Sie es mit 10 ml eiskaltem Mauswaschmedium auf und ab pipettieren. Nach der Resuspendierung werden die Krypten unter einem Hellfeldmikroskop gezählt, indem sofort 10 μl des Mediums auf einen Objektträger pipettiert werden.
    1. Geben Sie zwei 10-μl-Tropfen auf separate Enden des Objektträgers und zählen Sie die Anzahl der Krypten in jedem Tröpfchen. Berechnen Sie den Mittelwert der Zahlen zwischen den beiden Tropfen, um die Anzahl der Krypten pro 10 μl zu bestimmen. Multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um die Anzahl der Krypten in 1 ml zu erhalten.
       HINWEIS: Für eine genaue Zählung müssen 10 μl der Kryptensuspension sofort nach der Resuspension entfernt werden. Ist dies nicht der Fall, fallen die Krypten auf den Boden der Röhre, was zu einer ungenauen Zählung führt.
16. Mit dem Ziel, 300-500 Krypten pro Vertiefung zu plattieren, überführen Sie das entsprechende Volumen der im Mauswaschmedium resuspendierten Krypten in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen und bringen Sie es mit eiskaltem Mauswaschmedium auf 10 ml. Das Röhrchen wird bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Ein kleines Kügelchen sollte am Boden des Röhrchens sichtbar sein.
17. Entfernen Sie den Überstand mit einer Powerpipette. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um das Restmedium vorsichtig zu entfernen, so dass nur das Pellet übrig bleibt.
18. Resuspendieren Sie das Pellet in der entsprechenden Menge eiskalter Basalmembranmatrix, indem Sie es langsam auf und ab pipettieren. Achten Sie darauf, dass Sie keine Blasen bilden, wenn Sie das Kryptenpellet wieder aufhängen. Platte 300-500 Krypten/15 μL Basalmembranmatrix in jeder Vertiefung einer Platte. Nach dem Plattieren wird die Gewebekulturplatte umgedreht und für 10-20 Minuten in einen 37 °C warmen Inkubator gelegt.
19. Drehen Sie die Platte um und geben Sie 500 μl des vollständigen Maus-Kolonoidmediums in jede Vertiefung. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis sie für die Passage bereit sind. Passage der Kolonoide alle 3-5 Tage.

3. Passage der Kolonoide

HINWEIS: Jede Vertiefung kann in der Regel 1:4 bis 1:6 entsprechend der Dichte der ursprünglichen Vertiefung durchgelassen werden. Nehmen Sie die entsprechende Menge der Basalmembranmatrix aus −20 °C und legen Sie sie zum Auftauen auf Eis. Kolonoide können nach zwei Passagen für Experimente verwendet werden. Bei der Passage von Kolonoiden werden die Schritte in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt, um eine Kontamination zu vermeiden.

1. Entnehmen Sie das Medium aus den Wells, die durchgelassen werden sollen.
   1. Wenn sich Ablagerungen in der Basalmembranmatrix befinden, was während der anfänglichen Isolierung passieren kann, kann das folgende Protokoll verwendet werden, um die Ablagerungen zu reinigen:
      1. 1 ml eiskaltes 0,1%iges Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS ohne Ca 2+ oder Mg²⁺ in jede Vertiefung geben. 5 Minuten in der biologischen Sicherheitswerkbank ruhen lassen.
      2. Pipettieren Sie drei- bis siebenmal mit einer P1000-Pipette nach oben und unten, um die Basalmembranmatrix zu unterbrechen, und sammeln Sie den Inhalt der Vertiefungen in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Kolonoide in insgesamt 5-10 ml 0,1% BSA in DPBS ohne Ca 2+ oder Mg²⁺. Mit 0,1 % BSA auf das entsprechende Volumen auffüllen.
      3. Bei 150 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Kolonoide, aber nicht die Ablagerungen zu pelletieren.
      4. Dekantieren Sie das DPBS durch Pipettieren, wobei das Pellet übrig bleibt. Geben Sie 1 ml enzymatisches Dissoziationsreagenz (RT) bei Raumtemperatur hinzu und pipettieren Sie drei- bis fünfmal.
      5. Legen Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit dem enzymatischen Dissoziationsreagenz und den aufgebrochenen Kolonoiden für 3-4 Minuten in ein 37 °C warmes Wasserbad.
      6. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Wasserbad, pipettieren Sie es 3-5 Mal und bringen Sie es dann mit Mauswaschmedium auf 10 ml. Fahren Sie mit Schritt 3.6 fort.
2. Geben Sie 500 μl enzymatisches RT-Dissoziationsreagenz in jede Vertiefung und lassen Sie es etwa 1 Minute lang einwirken, bevor Sie drei- bis siebenmal auf und ab pipettieren, um die Basalmembranmatrix zu unterbrechen.
3. Legen Sie die Platte für 3-4 Minuten in einen 37°C-Inkubator.
4. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und pipettieren Sie sie drei- bis siebenmal mit einer P1000-Pipette, um die Kolonoide zu dissoziieren.
5. Füllen Sie den Inhalt in ein konisches 15-ml-Röhrchen und füllen Sie ihn mit eiskaltem Mauswaschmedium auf bis zu 10 ml auf.
6. Die Probe wird bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
7. Entnehmen Sie das Medium bei Bedarf mit einer Powerpipette und einer P200-Pipette, so dass nur noch ein Pellet im konischen Röhrchen verbleibt.
8. Resuspendieren Sie in einer angemessenen Menge eiskalter Basalmembranmatrix, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, je nachdem, wie viele Wells beschichtet werden sollen. Beim Pipettieren keine Blasen einführen. Geben Sie die Kolonoidfragmente in 15 μl Basalmembran-Matrixtropfen pro Well.
9. Platten Sie die Krypten, drehen Sie die Gewebekulturplatte um und legen Sie die Platte dann für 10-20 Minuten in einen 37°C-Inkubator.
10. Zum Schluss kehren Sie die Platte um und geben 500 μl vollständiges Maus-Kolonoidmedium in jede Vertiefung. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis sie groß genug sind, um in ca. 3-5 Tagen erneut durchgelassen zu werden.

4. Enddifferenzierung der Dickdarmzellen

1. Passieren Sie die Kolonoide wie oben und geben Sie 500 μl des vollständigen Maus-Kolonoidmediums in jede Vertiefung.
2. Entfernen Sie mindestens 48 Stunden nach der Passage das vollständige Maus-Kolonoidmedium und geben Sie 500 μl des differenzierenden Mediums in jede Vertiefung (siehe Abschnitt 1).
3. Die Kolonoide werden 48 Stunden lang mit Differenzierungsmedien inkubiert, danach können sie in Experimenten verwendet werden, einschließlich der Sammlung von RNA und Proteinen.
   HINWEIS: Die Differenzierung von Kolonoiden kann durch das Sammeln von RNA und das Beurteilen der Expression von Lgr5 und Ki67, einem Stammzellmarker bzw. Zellproliferationsmarker, mittels quantitativer reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) beurteilt werden. Terminal differenzierte Zellen sollten eine relativ geringe Expression von Lgr5 und Ki67 aufweisen im Vergleich zu Kolonoiden, die in traditionellem Kolonoidmedium gezüchtet wurden, wo die Zellen eher stammartig sind. Die Zeitspanne, die die Kolonoide benötigen, um im Differenzierungsmedium zu inkubieren, muss möglicherweise für jedes einzelne Labor optimiert werden. Die Liste der Primer finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1 .

5. Induktion von Entzündungen in differenzierten Kolonoiden mit Entzündungsmediatoren

1. Nachdem die Kolonoide 2-3 Tage lang mit dem Differenzierungsmedium inkubiert wurden, entfernen Sie das vorhandene Medium und geben Sie 500 μl des Entzündungsmediatormediums in jede Vertiefung.
2. Lassen Sie die Wells 24-72 Stunden inkubieren, bevor Sie die RNA und das Protein sammeln (oder andere nachgeschaltete Parameter bewerten). Wechsle jeden Tag das Medium.

6. Intestinale epitheliale Monoschichten, die von etablierten murinen Kolonoiden abgeleitet sind

ANMERKUNG: Murine Darmepithel-Monoschichten werden von murinen Kolonoiden abgeleitet, die mindestens zweimal durchgangen wurden. Um eine erfolgreiche Monolayerbildung in 3-5 Tagen zu ermöglichen, ist es zwingend erforderlich, die Kolonoide nicht in einzelne Zellen zu trennen. Fragmentierte Organoide, die enzymatisch in zelluläre Cluster dissoziiert wurden, sind ideal für das Wachstum.

1. Bereiten Sie alle Reagenzien vor, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Die Basalmembranmatrix auf Eis auftauen. Bereiten Sie das murine Monolayer-Medium wie in Abschnitt 1 beschrieben vor. Verdünnen Sie die aufgetaute Basalmembran 1:20 mit dem kalten murinen Monolayer-Medium. Auf Eis bleiben.
2. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um einen 0,4 μm transparenten Zellkultureinsatz in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte zu legen (Materialtabelle). Nimm einen Eckzacken des Einsatzes und lege ihn in die Vertiefung. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die entsprechende Anzahl von Zellkultureinsätzen für die Kultur zur Verfügung steht.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie eine zusätzliche Kontrollmulde nur mit der Basalmembranmatrix beschichten. Dieser Zellkultureinsatz wird verwendet, um die Hintergrundresistenz des Zellkultureinsatzes ohne vorhandene Zellen zu messen, wie im nachfolgenden Schritt (Schritt 6.3) beschrieben.
3. Bedecken Sie mit einer P200-Pipette die apikale (obere) Oberfläche jedes Zellkultureinsatzes mit 150 μl verdünnter Basalmembranmatrix. Platzieren Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Einsatzes, ohne die Membran des Einsatzes zu berühren, und stoßen Sie die Lösung vorsichtig aus. Legen Sie die Platte für mindestens 1 h in einen sterilen 37°C-Inkubator mit 5% CO₂ .
4. Entfernen Sie die Basalmembranmatrix vor Gebrauch vorsichtig und lassen Sie die Zellkultureinsätze mindestens 10 Minuten lang in einer biologischen Sicherheitswerkbank trocknen.
   1. Um die Basalmembranmatrix zu entfernen, drehen Sie die 24-Well-Platte in einem Winkel von 45°. Legen Sie einen einzelnen Finger auf die Ecke des Zinkens, um den Einsatz zu stabilisieren, und setzen Sie mit einer P200-Pipette die Pipettenspitze vorsichtig an der Unterseite des Einsatzes entlang und entfernen Sie die Matrize.
   2. Entfernen Sie überschüssige Rückstände, indem Sie jeden Zellkultureinsatz mit 150 μl sterilem DPBS ohne Ca 2+ oder Mg²⁺ waschen.
5. Nach 10 Minuten Trocknung werden 400 μl des murinen Monolayer-Mediums auf die Unterseite des Zellkultureinsatzes und 75 μl auf die Oberseite gegeben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellkultureinsätze eingetaucht sind. Lassen Sie die Platte in der biologischen Sicherheitswerkbank oder legen Sie sie bis zur Verwendung zurück in den Inkubator.
6. Entfernen Sie die 24-Well-Platte mit reifen Darmkolonoiden (Organoide am Tag 3-5 des Wachstums) aus dem 37 °C warmen 5 % CO_{2 -}Inkubator und stellen Sie sie unter die biologische Sicherheitswerkbank. Entfernen Sie das Medium mit sterilen Spitzen und waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml sterilem RT-DPBS (ohne Ca 2+ oder Mg²⁺).
   HINWEIS: Eine einzelne Vertiefung von 75-125 reifen Kolonoiden wird in einem Verhältnis von 1:4 geteilt.
7. Entfernen Sie das DPBS ohne Ca 2+ oder Mg²⁺ mit sterilen Spitzen und verdauen Sie jeden Pfropfen der Basalmembranmatrix, indem Sie 500 μl des enzymatischen RT-Dissoziationsreagenzes in jede zu passierende Vertiefung geben.
8. Pipettieren Sie jede Vertiefung ca. 6-10 Mal nach oben und unten, um den Pfropfen aufzubrechen. Kratzen Sie nicht an der Unterseite der Platte, um den Stecker zu entfernen. Drehen Sie stattdessen die 24-Well-Platte in einem Winkel von 45°, platzieren Sie die Spitze der Pipette am Rand des Pfropfens und lösen Sie sie vorsichtig.
9. Legen Sie die 24-Well-Platte für 3-4 Minuten in einen sterilen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ .
10. Entfernen Sie die Platte und pipetieren Sie das enzymatische Dissoziationsreagenz fünf- bis siebenmal für jede Vertiefung unter einer biologischen Sicherheitswerkbank auf und ab. Übertragen Sie die dissoziierten Kolonoide aus jeder Vertiefung in ein steriles, konisches 15-ml-Röhrchen. Auf ein Volumen von 10 ml mit eiskaltem Mauswaschmedium aufbringen.
11. Die teilweise aufgeschlossenen Kolonoide werden bei 300 x g bei 4 °C für 5 min in einer Schwenkeimerzentrifuge zentrifugiert.
12. Unter der biologischen Sicherheitswerkbank den Überstand mit einer 10-ml-Pipette aus dem Pellet entfernen. Entfernen Sie das verbleibende Medium mit einer P200-Pipette. Resuspendieren Sie das Kolonoid-Pellet in murinem Monolayer-Medium. Fügen Sie 75 μl Medium pro Zellkultureinsatz der zu beschichtenden fragmentierten Kolonoide hinzu.
13. Geben Sie 75 μl Kolonoidsuspension in die Mitte jedes Zellkultureinsatzes. Bevor Sie die Kolonoidsuspension in jede Vertiefung geben, pipeptieren Sie vorsichtig ein- oder zweimal auf und ab, bevor Sie die 75 μl entfernen, was eine gleichmäßigere Beschichtung ermöglicht.
14. Platzieren Sie die 24-Well-Platte mit Zellkultureinsätzen 10 Minuten lang auf einer rotierenden Plattform, um eine gleichmäßige Verteilung über den Zellkultureinsatz zu ermöglichen.
15. Legen Sie die Platte in einen sterilen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ .
16. Am nächsten Tag (Tag 1) lösen Sie die nicht anhaftenden Kolonoidfragmente, indem Sie das Medium drei- bis fünfmal mit einer P200-Pipette auf und ab pipettieren. Platzieren Sie die Spitze vorsichtig an der Innenseite des Zellkultureinsatzes, um die anhaftenden Darmzellen nicht zu stören. Führen Sie keine Blasen in das Medium ein, da dies die Entfernung aller nicht anhaftenden Fragmente verhindert.
17. Entfernen Sie sofort die Mischung aus Medium und Dickdarm. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellkultureinsätze gereinigt sind.
18. Geben Sie vorsichtig 150 μl vorgewärmtes murines Monolayer-Medium auf die apikale Seite jedes Zellkultureinsatzes. Geben Sie 400 μl erwärmtes murines Monolayer-Medium in jede Vertiefung einer neuen 24-Well-Platte. Übertragen Sie den Zellkultureinsatz auf die neue Platte, indem Sie den Stift mit einer sterilen Pinzette greifen. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag bis zur Konfluenz.
    HINWEIS: Die Kolonoidfragmente sollten 3-5 Tage nach der Plattierung eine konfluierende Monoschicht bilden.

7. Messung des Nettowiderstands der epithelialen Monolagen mit einem Voltohmmeter an den Tagen 3 - 5 der Monolayer-Kultur

HINWEIS: Die Essstäbchenelektroden ähneln einer Pinzette und sind asymmetrisch in der Länge. Der längere Arm der Sonde ist die basolaterale Elektrode und der kürzere Arm ist die apikale Elektrode. Es kann schwierig sein, die Sonde zwischen der Innen- und Außenseite des Zellkultureinsatzes einzuführen. Wenn Sie die Sonde beim Einführen in einem leichten Winkel platzieren und anschließend die Sonde vertikal ausrichten, wird verhindert, dass die Sonde stecken bleibt. Achten Sie darauf, den Nettowiderstand jedes Zellkultureinsatzes in einem ähnlichen Winkel abzulesen, da dies die Werte beeinflussen kann.

1. Legen Sie das Voltohmmeter und alle Reagenzien in eine biologische Sicherheitswerkbank.
   1. Schließen Sie das Voltohmmeter an die nächstgelegene Steckdose an und stecken Sie den modularen Kunststoffstecker der Elektrodensonde in die INPUT-Buchse auf dem Frontdisplay.
   2. Um das Voltohmmeter in einem Winkel von 45° zu platzieren, schwenken Sie den Metallarm an der Rückseite des Geräts heraus, bis er einrastet.
   3. Schalten Sie nun das Voltohmmeter ein, indem Sie den Netzschalter auf dem Frontdisplay nach oben klappen. Zum Schluss legen Sie den Schalter in Richtung OHMS hoch, um den Messwert in dieser Metrik anzuzeigen.
2. Nehmen Sie die 24-Well-Platte aus dem 37 °C und 5 % CO_{2 -} Inkubator und legen Sie die Platte flach in die biologische Sicherheitswerkbank. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) ist temperaturempfindlich. Entfernen Sie die Platte erst unmittelbar vor dem Lesen des TEER.
3. Sterilisieren Sie die Elektrodensonde in vorgewärmtem 70%igem Ethanol für 30 s bis 1 min. Entferne die Sonde, drehe sie um und schnippe sie ein bis zwei Mal, um das überschüssige Ethanol zu entfernen. Lassen Sie die Sonde ca. 30 s an der Luft trocknen.
4. Waschen Sie das restliche Ethanol auf der Sonde mit vorgewärmtem Mauswaschmedium.
   VORSICHT: Lassen Sie keine der verbleibenden Ethanoltröpfchen höher auf der Sonde in den Zellkultureinsatz fallen. Wenn Sie das Ethanol mit Medium abwaschen, lassen Sie das Medium nicht über das sterile Ethanolfeld hinaus. Dies könnte dazu führen, dass kontaminiertes Medium in den Zellkultureinsatz gelangt.
5. Halten Sie die Sonde senkrecht zum Zellkultureinsatz. Führen Sie die basolaterale Elektrode (längeres Ende der Sonde) an der Außenseite des Zellkultureinsatzes ein, bis sie die Basis der 24-Well-Platte berührt. Schieben Sie die apikale Elektrode (kürzeres Ende der Sonde) in den Zellkultureinsatz. Variieren Sie den Abstand der beiden Elektroden nicht von Vertiefung zu Vertiefung. Dies wirkt sich auf die TEER-Messung aus.
6. Stellen Sie sicher, dass die apikale Elektrode die Basis des Zellkultureinsatzes nicht berührt, bevor Sie den TEER ablesen. Beginnen Sie mit der Einfügung der Zellkultur für das Hintergrundsteuerelement, und notieren Sie den Wert. Der Wert wird automatisch digital auf der Vorderseite des Voltohmmeters angezeigt.
7. Wiederholen Sie die Schritte 7.5-7.6 für jeden Zellkultureinsatz.
   HINWEIS: Wenn zwischen den Zellkultureinsätzen unterschiedliche Versuchsbedingungen bestehen, sterilisieren Sie die Sonde zwischen den einzelnen neuen Bedingungen. Beginnen Sie mit Schritt 7.1 und gehen Sie die Schritte numerisch durch.
8. Setzen Sie die 24-Well-Platte wieder in den Inkubator ein, sobald alle TEER-Messungen aufgezeichnet wurden.
9. Die Nettowerte bei 350 Ω oder mehr deuten auf die Bildung von Monolagen hin. Wiederholen Sie dies an den folgenden Tagen, bis die Monolagenbildung erreicht ist.
   HINWEIS: Im Allgemeinen können an Tag 3 Werte von 1.000 Ω oder mehr erfasst werden, aber im Laufe der Zeit konvergieren sie alle auf eine niedrigere Zahl um 350 Ω.

8. Berechnung des TEER anhand von Nettowiderstandsmessungen mit dem Voltohmmeter

ANMERKUNG: Eine erfolgreiche Monolayer-Bildung der Kolonoide führt zu TEER-Messungen von mehr als 115 Ω·cm².

1. Nehmen Sie einzelne Nettowiderstandswerte und subtrahieren Sie den Nettowiderstand von der Hintergrundwelle. Die mit der Basalmatrixmembran beschichteten Zellkultureinsätze ergeben einen Nettowert von etwa 100 Ω.
2. Nehmen Sie die vom Hintergrund subtrahierten Nettowiderstandsmessungen und multiplizieren Sie sie mit der Oberfläche des Zellkultureinsatzes. Ein 24-Well-Zellkultureinsatz hat eine Oberfläche von 0,33^cm2.
3. Wenn die Werte 115 Ω·^cm2 oder mehr betragen, fahren Sie mit den nachgeschalteten experimentellen Assays fort.

9. Induktion von Entzündungen in den epithelialen Monolayern mit Entzündungsmediatoren

1. Sobald sich erfolgreiche Monolayer gebildet haben, fügen Sie der Kultur auf der basalen Seite der Kultur Entzündungsmediatoren hinzu. Bereiten Sie das Entzündungsmediator-Monolayer-Medium vor, wie in Schritt 1.9 beschrieben, und geben Sie 400 μl in jede Vertiefung in eine neue 24-Well-Platte.
2. Entfernen Sie das Medium von der apikalen Seite des Zellkultureinsatzes und fügen Sie 150 μl des murinen Monolayer-Mediums ohne Y-27632 hinzu. Ergänzen Sie diese Seite nicht mit Entzündungsmediatoren. Wenn der Zelltod jedoch übertrieben erscheint, belassen Sie das Y-27632 in den Medien. Dies muss vom Endnutzer festgelegt werden.
3. Übertragen Sie die Zellkultureinsätze auf eine neue 24-Well-Platte und legen Sie sie in die mit dem Entzündungsmediator-Monolayer-Medium ergänzten Vertiefungen.
4. Stimulieren Sie die Monoschichten je nach Experiment für 24-72 h mit Entzündungsmediatoren.
5. Um das Ansprechen von Medikamenten mit diesem Entzündungsmodell zu testen, ergänzen Sie das Monolayer-Medium auf der apikalen Seite des Zellkultureinsatzes mit dem Medikament Ihrer Wahl. Das Medikament kann zu jedem Zeitpunkt des Experiments hinzugefügt werden, abhängig vom Wirkmechanismus des Arzneimittels und den nachgeschalteten Parametern, die bewertet werden sollen.

Representative Results

Das 3D-Darmkolonoidkultursystem ist ein unschätzbares Werkzeug, um den intrinsischen Beitrag des Epithels zur Homöostase der Darmschleimhaut zu untersuchen. Das beschriebene Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Isolierung von Krypten aus C57BL/6J (WT)-Mäusen im Alter von 8 Wochen und zur Etablierung eines langfristigen Kolonoidkultursystems, das für mehrere nachgeschaltete Anwendungen manipuliert werden kann. Nach der Isolierung und Plattierung von Krypten in der Basalmembranmatrix erscheinen die Krypten dicht und vielzellig in ihrer Struktur, wenn sie durch Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht werden. Sie können kugelförmig oder länglich und zylindrisch sein und der einzelnen, kryptenartigen Struktur ähneln, die normalerweise in der In-vivo-Darmarchitektur beobachtet wird (Abbildung 1A). An Tag 1 bildet die Mehrheit der Krypten eine kompakte, kugelförmige Struktur, wobei einige Kolonoide beginnen, ein inneres Lumen (leerer Raum) ohne Epithelzellen zu entwickeln (Abbildung 1B). Während sie in den nächsten Tagen weiter wachsen, nehmen die Durchmesser der Kolonoide weiter zu und die Lumen der Kolonoide werden definierter (Abbildung 1C). Am 5. Tag hat jedes Kolonoid einen Durchmesser von etwa 100-250 μm und bildet ein großes, prominentes Lumen, das von einer dünnen Schicht epithelialer Stammzellen umgeben ist (Abbildung 1D). Zu diesem Zeitpunkt werden die Kolonoide sowohl enzymatisch als auch mechanisch für die Passage gestört. Nach zwei Durchgängen können sie für nachgelagerte Experimente verwendet werden.

Um zu beurteilen, ob die metabolischen Veränderungen, die in den Dickdarmabschabungen von DSS-behandelten Mäusen beobachtet wurden, in Kolonoiden von Mäusen mit demselben DSS-Regime beibehalten werden, wurden 8 Wochen alte WT-Mäuse mit 2% DSS im Trinkwasser ad libitum behandelt. Alters- und geschlechtsgleiche WT-Kontrolltiere erhielten ad libitum Trinkwasser ohne DSS. Nach 7 Tagen wurden die Mäuse getötet und Krypten aus den Dickdarmen sowohl der Kontrolltiere (n = 3, männlich) als auch der DSS-behandelten Tiere (n = 3, männlich) isoliert, um Kolonoide zu etablieren. Nach zwei Passagen wurde das Protein aus jedem Satz von Kolonoiden isoliert und die Expression von Peroxisom-Proliferator-Aktivator-Rezeptor-Gamma-Koaktivator-1α (PGC1α), dem Hauptregulatorprotein der mitochondrialen Biogenese, mittels Western-Blot-Analyse beurteilt (ergänzende Abbildung 1). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der PGC1α-Expression beim Vergleich der Kolonoide, die aus den DSS-behandelten Mäusen gebildet wurden, mit den Kolonoiden, die aus den Kontrollmäusen gebildet wurden, was darauf hindeutet, dass diese Kolonoidkulturmethodik die in vivo metabolischen Veränderungen, die bei Mäusen beobachtet werden, nicht angemessen widerspiegelt¹⁵.

Das Versagen von PGC1α, die mitochondriale Biogenese während eines intestinalen Entzündungsinsults zu initiieren, ist primär auf das differenzierte Kolonepithel lokalisiert^15,19. Um die in vivo beobachteten Veränderungen widerzuspiegeln, haben wir uns entschieden, die Kolonoide in einen differenzierteren Zustand zu lenken. Um diese Verschiebung zu induzieren, wurden die Kolonoide zunächst mit traditionellem Kolonoidmedium inkubiert. Nach 24 h bis 48 h wurden die Kolonoide für weitere 48 h auf Differenzierungsmedium umgestellt. Während der Differenzierung ging ein kleiner Prozentsatz der Kolonoide von einer sphärischen Architektur in knospige Strukturen über, die mit Becherzellen und Kolonozyten angereichert waren¹⁷ (Abbildung 2A,B). Die Kolonoide, die in WRN-supplementiertem Medium gezüchtet wurden, waren mit sich schnell teilenden Lgr5⁺-Stammzellen angereichert. Um zu bestätigen, dass sowohl die Lgr5⁺-Stammzellen als auch andere proliferierende Zellen während der Differenzierung den Zellzyklus verließen, wurden die mRNA-Spiegel mittels qPCR analysiert. Eine signifikante Herunterregulierung sowohl der Lgr5- (97%, p = 0,0023) als auch der Ki67-Spiegel (75%, p = 0,0007) wurde in den differenzierten Kolonoiden (n = 6) im Vergleich zu den in einer traditionellen Kultur gezüchteten Kolonoiden (n = 6; Ergänzende Abbildung 2A,B). Man würde auch erwarten, dass die differenzierten Kolonoide hauptsächlich aus schleimabsondernden Becherzellen bestehen. Darüber hinaus war MUC2 in den differenzierten Kolonoiden im Vergleich zu ihren traditionell gezüchteten Gegenstücken fast doppelt so hoch reguliert (n = 3, p = 0,0433, ergänzende Abbildung 3). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Kolonoide erfolgreich differenziert wurden und für nachgelagerte Experimente bereit waren. Als nächstes wurden Entzündungsmediatoren in das Differenzierungsmedium gegeben, wie in Abschnitt 5 des Protokolls beschrieben. Protein und RNA wurden bis zu 72 h nach Einführung der Entzündungsmediatoren zur Analyse gesammelt. Bei 72 h wurde jedoch gelegentlich ein erhöhter Zelltod beobachtet.

Um zu beurteilen, ob die Einführung von Entzündungsmediatoren in differenzierte Kolonoide das Versagen der mitochondrialen Biogenese nachahmen könnte, das sowohl bei humanen CED als auch in einem akuten Modell der murinen Kolitis beobachtet wurde, wurde die Proteinexpression von PGC1α und Transkriptionsfaktor A, Mitochondrien (TFAM) mittels Western-Blot-Analyse in differenzierten Kolonoiden (n = 5) untersucht, die über 72 h mit Entzündungsmediatoren behandelt wurden. sowie bei humaner CED¹⁵. TFAM, ein Protein, das sowohl die Transkription als auch die Replikation des mitochondrialen Genoms antreibt, ist in murinen Kolitismodellen ebenfalls vermindert, und es wurde gezeigt, dass seine Genexpression in humanen CED^{vermindert ist 15,20}. Wir beobachteten eine ähnliche Herunterregulierung sowohl in der PGC1α- (50,4%, p = 0,0442) als auch in der TFAM-Expression (88,9%, p = 0,004) in den differenzierten Kolonoiden nach 72 h Exposition gegenüber diesen Entzündungsmediatoren (Abbildung 3). Zusammenfassend deutet dies darauf hin, dass die Behandlung differenzierter Kolonoide mit Zytokinen ein ideales Modell ist, um die mitochondriale Dynamik in vitro zu untersuchen.

Während verschiedene zelluläre und molekulare Funktionen in 3D-Kolonoidkulturen untersucht werden können, sind 2D-Monolayer-Kultursysteme überlegen, wenn es darum geht, die Barrierefunktion, Wirt-Pathogen-Interaktionen und die Auswirkungen von oral resorbierten Therapeutika auf Entzündungen zu beurteilen^21,22. Die Bildung einer kontinuierlichen Schicht konfluierender Zellen mit einer intakten Barriere ermöglicht es, verschiedene biologische oder chemische Wirkstoffe problemlos auf der apikalen und/oder basalen Seite der Zellen zu platzieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Etablierung von 2D-Monolayer-Kulturen aus bereits existierenden WT-Kolonoiden, die zweimal durchlaufen wurden. Kolonoide, die enzymatisch und mechanisch aufgebrochen wurden, werden auf Zellkultureinsätze plattiert, die mit Basalmembranmatrix beschichtet sind. Nach der ersten Plattierung erscheinen die fragmentierten Kolonoide in Zellclustern von 15 bis 150 Zellen (Abbildung 4A). An Tag 3 haben die Zellen begonnen, sich abzuflachen und den Zellkultureinsatz langsam zu bedecken, wobei sie im Allgemeinen eine Konfluenz erreichen (Abbildung 4B). In den nächsten Tagen wachsen die Monolagen weiter und bilden eine kontinuierliche Barriere, die mit TEER quantitativ gemessen werden kann (Abbildung 4C,D). Interessanterweise schwanken die TEER-Messungen zwischen Tag 3 und Tag 5. Die Monolagen haben früher höhere Werte mit einem breiten Bereich (200-800 Ω·cm 2), aber diese Werte konvergieren langsam bis Tag 5 auf eine niedrigere Zahl (115-150 Ω·cm², Abbildung 5A). Wenn die Monolagen einen stationären Zustand erreichen, können sie für nachgelagerte Experimente verwendet werden.

Um die epitheliale Reaktion von Kolonoid-abgeleiteten Monolayern auf Entzündungen zu charakterisieren, wurden Entzündungsmediatoren für 48 h auf der basalen Seite (der Außenseite des Einsatzes) der Zellen platziert. Die RNA wurde extrahiert und die mRNA-Spiegel verschiedener Stamm- und Zelldifferenzierungsmarker sowie Verbindungsproteine mittels qPCR analysiert. Lgr5 wurde in beiden Fällen nicht nachgewiesen, aber ein anderer Stammzellmarker, mTERT, war in den entzündeten Monoschichten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um fast 60 % reduziert (Ergänzende Abbildung 4A). Als nächstes analysierten wir die Expression von zwei Markern differenzierter Zelltypen, Muc2 und alkalischer Phosphatase (Alpi). Beide mRNA-Transkripte waren in den entzündeten Monoschichten niedriger als in den Kontrollzellen (Ergänzende Abbildung 4A). Sowohl Stamm- als auch postmitotische Zellen sind während einer Dickdarmentzündung häufig erniedrigt^23,24,25, und eine ähnliche Reaktion wurde in dem in dieser Studie erhaltenen Monolayer-Modell beobachtet.

Ein Vorteil des Monolayer-Systems ist die Möglichkeit, die Barriereantwort zu bewerten. Um festzustellen, ob die Barriere in der immunstimulierten Bedingung beeinträchtigt war, maßen wir die TEER-Werte nach 48 Stunden. Die TEER-Werte für die Kontrollmonolagen (n = 2) betrugen durchschnittlich 129,16 Ω·cm2, fielen aber signifikant (p = 0,0087) auf durchschnittlich 98,54 Ω·^cm2 in den entzündeten Monolagen (Abbildung 5B). Um weiter zu bestätigen, dass die Barriere bei der entzündlichen Erkrankung beeinträchtigt war, untersuchten wir die mRNA-Spiegel für drei verschiedene Tight-Junction-Marker, Zo-1, Occludin und Claudin. Alle drei Marker wiesen im entzündeten Zustand im Vergleich zu ihren nicht entzündeten Gegenstücken reduzierte Werte auf (Ergänzende Abbildung 4B). Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass eine Barrieredysfunktion in den entzündeten Monoschichten vorhanden ist und die Barrieredysfunktion nachahmt, die während der Pathogenese von CED beobachtet wird.

Abbildung 1: Initiale Isolierung muriner Krypten zur Etablierung einer Langzeit-Kolonoidkultur. (A) An Tag 0 wurden 300-500 Krypten in Basalmembranmatrix plattiert (Bild 5 h nach der Plattierung erhalten), und das Wachstum der Kolonoide wurde an (B) Tag 1, (C) Tag 3 und (D) Tag 5 erfasst. An Tag 5 waren die Kolonoide bereit für die Passage. Vergrößerung = 10x; Maßstabsbalken = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Etablierung von terminal-differenzierten Kolonoiden aus traditioneller Kolonoidkultur. Das Differenzierungsmedium wurde 48 Stunden nach der Passage der murinen Kolonoide auf die Kolonoide aufgetragen. Nach (A) 24 h und (B) 48 h reichern sich die Kolonoide mit terminalen differenzierten Zellen an. Vergrößerung = 10x; Maßstabsbalken = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: PGC1α- und TFAM-Proteinexpression in murinen differenzierten Kolonoiden, die mit Entzündungsmediatoren behandelt wurden. Medium, das mit Entzündungsmediatoren ergänzt wurde, wurde auf die differenzierten Kolonoide gegeben, und das Protein wurde 0 h, 24 h, 48 h und 72 h nach der Exposition gesammelt. (A) Die Proteinexpression von PGC1α zeigte eine insgesamt signifikante Abnahme (p = 0,0442) über 72 h. TFAM war nach Exposition mit Entzündungsmediatoren nach 72 h signifikant herunterreguliert (p = 0,004), und (B) es gab einen Abwärtstrend in der Proteinexpression nach 24 h, 48 h und 72 h bei der Analyse durch ANOVA. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,005. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Etablierung und Wachstum von Monolayern aus bereits existierenden Kolonoiden. Kolonoide, die enzymatisch und mechanisch aufgebrochen worden waren, wurden auf Zellkultureinsätze plattiert, die mit einer Basalmembranmatrix beschichtet waren. Bei der ersten Plattierung erschienen die fragmentierten Kolonoide in (A) Zellclustern, und am (B) Tag 3 hatten sie begonnen, sich abzuflachen und den Zellkultureinsatz langsam zu bedecken. (C) An Tag 5 und (D) Tag 7 wuchsen die Monolagen weiter und bildeten eine kontinuierliche Barriere, die mittels TEER quantitativ gemessen werden konnte. Vergrößerung = 10x; Maßstabsbalken = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: TEER-Werte für die Etablierung von Kolonoid-abgeleiteten Monolayern und entzündeten Monolayern. (A) Die TEER-Werte wurden mit einem Voltohmmeter von Tag 3 bis Tag 5 gemessen. Die Monoschichten hatten früher höhere Werte mit einem breiten Bereich, konvergierten aber langsam bis Tag 5 auf eine niedrigere Zahl. Sobald die Monolagen einen stationären Zustand erreicht haben, können sie für nachgelagerte Experimente verwendet werden. (B) Die TEER-Werte waren in den entzündeten Monolagen (n = 2) niedriger als in den nicht entzündeten Kontrollen (n = 2). Die Kontroll-Monolagen hatten einen durchschnittlichen TEER von 129,16 Ohm·cm2, und der TEER der entzündeten Monolagen war signifikant niedriger (p = 0,0087), mit einem Durchschnitt von 98,54 Ω·^cm2, wenn sie mit einem t-Test analysiert wurden. **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Tabelle der Lösungszusammensetzung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: PGC1α-Proteinexpression in murinen Kolonoiden, die in traditionellem Kolonoidmedium gezüchtet wurden, das aus WT-Kontrollen und 2% DSS-behandelten Mäusen isoliert wurde. Die Kolonoide stammten sowohl von 8 Wochen alten WT-Kontrollmäusen als auch von 2% DSS-behandelten Mäusen nach 7 Tagen. Das Protein wurde aus Kolonoiden isoliert, die zweimal und am Tag 4 nach der Plattierung durchgelassen wurden. Es gab keinen Unterschied in der PGC1α-Proteinexpression (p = 0,9996) in den Kolonoiden, die von den Kontrollmäusen stammten, im Vergleich zu den Mäusen, die 7 Tage lang 2% DSS ausgesetzt waren, wenn sie mit einem ungepaarten t-Test analysiert wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Reduzierte Lgr5- und Ki67-mRNA-Expression in differenzierten Kolonoiden. Mauskolonoide, die 48 Stunden zuvor durchgelassen wurden, wurden 48 Stunden lang dem Differenzierungsmedium ausgesetzt, bevor die RNA- und cDNA-Synthese isoliert wurde. Die mRNA-Spiegel wurden mittels qPCR bestimmt und mit der vergleichenden CT-Methode analysiert. (A) Lgr5 und (B) Ki67 waren in den differenzierten Kolonoiden bei statistischer Analyse mit einem t-Test signifikant erniedrigt (p = 0,0023, p = 0,0007). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.**p < 0,005. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Erhöhte Mucin-sezernierende Becherzellen in differenzierten murinen Kolonoiden. Murine Kolonoide, die 48 Stunden zuvor durchlaufen wurden, wurden 48 Stunden lang dem Differenzierungsmedium ausgesetzt. Die Zellen wurden in RIPA-Puffer lysiert und das Protein wurde durch Western-Blot-Analyse visualisiert. (A) Die MUC2-Expression war in jedem Satz differenzierter Kolonoide im Vergleich zu den undifferenzierten Kolonoiden erhöht. (B) Unter den differenzierenden Bedingungen wurde eine nahezu zweifache Veränderung des MUC2-Proteins beobachtet, die bei der Analyse mit einem t-Test signifikant war (p = 0,0433). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Reduzierte Expression von Stamm- und Differenzierungsmarkern sowie Tight-Junctional-Markern in Monolayern, die mit Entzündungsmediatoren behandelt wurden. Aus dem Dickdarm gewonnene Monoschichten der Maus (Tag 5) wurden 48 h lang Entzündungsmediatoren ausgesetzt, anschließend wurde RNA gesammelt und cDNA synthetisiert (n = 2). Die mRNA-Spiegel von Stamm-, Differenzierungs- und Verbindungsmarkern wurden mittels qPCR bestimmt und mit der vergleichenden CT-Methode analysiert. (A) Der Stammzellmarker Lgr5 wurde in keiner der beiden Erkrankungen nachgewiesen, aber mTERT war bei entzündlichen Erkrankungen erheblich reduziert. Der Becherzellmarker Muc2 und der Kolonozytenmarker Alpi waren in den entzündeten Monolayern im Vergleich zu den unbehandelten Monolayern erniedrigt. (B) Die Tight-Junction-Marker Zo-1, Occludin und Claudin waren alle in entzündlich behandelten Monoschichten niedriger als in der Kontrolle. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Liste der Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Entwicklung von Organoiden hat die Art und Weise revolutioniert, wie die wissenschaftliche Gemeinschaft Organsysteme in vitro untersucht, mit der Fähigkeit, die zelluläre Struktur und Funktion eines Tieres oder Menschen in einer Schale teilweise zu rekapitulieren. Darüber hinaus bieten organoide Systeme, die von Menschen mit Krankheiten abgeleitet wurden, ein vielversprechendes Werkzeug für die personalisierte Medizin, das die therapeutische Entscheidungsfindung leiten könnte. Hier beschreiben wir ein gut funktionierendes Kryptenisolationsprotokoll und stellen wichtige Schritte vor, die es ermöglichen, überschüssigen Schmutz in der Isolierung vor dem Plattieren zu entfernen. Darüber hinaus erklären wir ein wichtiges Detail, das dabei oft übersehen wird – die Möglichkeit, die Krypten für die Plattierung genau zu zählen. Sobald die Kolonoide etabliert sind, skizzieren wir die wichtigsten Manipulationen, die ihre zelluläre Differenzierung oder Monolayerbildung ermöglichen, was die Fähigkeit verbessern könnte, Veränderungen im Darmepithel während CED zu untersuchen.

Die Krypten-Zotten-Achse im Dickdarmepithel von Säugetieren ist eine komplexe Struktur, die sich aus verschiedenen Zelltypen mit unterschiedlichen Funktionen zusammensetzt. Die Aufrechterhaltung dieser Achse hängt sowohl von intrinsischen als auch von extrinsischen zellulären Faktoren ab, die zusammen zur Aufrechterhaltung der epithelialen Homöostase beitragen¹⁸. Wir haben festgestellt, dass murine Kolonoide, die in traditionellem Medium gezüchtet werden, in erster Linie Stammzellen widerspiegeln, im Gegensatz zu dem Konglomerat aus Stammzellen und terminal-differenzierten Zellen, das in vivo beobachtet wird. Darüber hinaus sind murine Kolonoide, die auf diese Weise gezüchtet und erhalten werden, kreisförmige Strukturen im Gegensatz zu flachen Monoschichten. Diese Unterschiede haben potentielle Implikationen für unsere Versuche, Darmerkrankungen in vitro zu untersuchen. Insbesondere sind wir nur begrenzt in der Lage, Organoide zu verwenden, um Veränderungen der Barrierefunktion sowie die Auswirkungen von Entzündungen auf terminal-differenzierte Darmepithelzellen zu untersuchen.

Hier beschreiben wir Protokolle nicht nur für die Isolierung von murinen Krypten, um Kolonoide zu züchten, sondern auch für die Manipulation dieser Kolonoide, um die Physiologie des Darmepithels und die epitheliale Reaktion auf Entzündungen zu untersuchen. Zu den verschiedenen extrinsischen Faktoren, die den Gradienten von pluripotenten Stammzellen und terminalen differenzierten Zellen fördern, gehört der kanonische Wnt-Signalweg, der reich an Krypten ist und die Gesundheit der Stammzellen fördert. Der Wnt-Signalweg nimmt an der Spitze der Kryptenachse ab, was mit der Evolution von Stammzellen zu terminal-differenzierten Zellen zusammenfällt²⁶. Wir haben ein Protokoll beschrieben, das die terminale Differenzierung von Kolonoidzellen ermöglicht. Wie andere unterscheiden wir uns, indem wir Wnt aus dem Wachstumsmedium entfernen, aber wir verwenden eine niedrigere Konzentration von R-Spondin (500 ng/ml gegenüber 1 μg/ml R-Spondin)¹⁷. Überraschenderweise hat eine 50%ige Reduktion von R-Spondin keinen Einfluss auf die erfolgreiche Differenzierung der Organoide. Die Fähigkeit, mit einer niedrigeren Konzentration zu differenzieren, hilft bei der Etablierung eines weniger künstlichen Systems, das der physiologischen Umgebung in vivo ähnlicher sein könnte. Obwohl dieses Protokoll zu einer endlichen terminalen Differenzierung führt (ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3) und der Unfähigkeit, die zelluläre Unsterblichkeit aufrechtzuerhalten, ist es dennoch eine nützliche Methode, um den physiologischen Beitrag des terminalen differenzierten Epithels, einschließlich Kolonozyten, enteroendokriner Zellen und Becherzellen, zu CED und anderen Krankheitszuständen besser zu verstehen. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Supplementierung spezifischer Zytokine in dieses Medium, die traditionell bei Patienten mit CED erhöht sind, das differenzierte Organoidsystem in einen entzündlichen Zustand lenkt. Über einen Zeitraum von 72 Stunden spiegeln differenzierte Kolonoide, die mit inflammatorischen Zytokinen behandelt wurden, einige der metabolischen Befunde wider, die in anderen etablierten Modellen für Kolitis und humane CED gezeigt wurden (Abbildung 3). Darüber hinaus spiegeln differenzierte Kolonoide, die auf diese Weise behandelt werden, wahrscheinlich die Auswirkungen der Entzündung auf die zelluläre Homöostase auf das differenzierte Epithel besser wider. Wir haben auch ein Protokoll für die Entwicklung von Monolayern entworfen, das die Bildung sowohl einer apikalen als auch einer basalen Seite des Epithels ermöglicht, was eine Analyse der Barrierefunktion in vivo ermöglicht. Dieses System ist nützlich, um die Mechanismen der Barrieredysfunktion zu untersuchen, ohne dass eine Differenzierung erforderlich ist, und um neue therapeutische Ziele für die Behandlung zu kultivieren.

Einige Einschränkungen und potenzielle Fallstricke in Bezug auf die oben beschriebenen Protokolle müssen beachtet werden. Die erfolgreiche Isolierung von Krypten und die Entwicklung von Kolonoiden kann durch die Kryptenausbeute jedes Tieres, die Genauigkeit der Zählung der Krypten und die Sauberkeit der Präparation begrenzt werden. Die Geschwindigkeit der Zählung der isolierten Krypten nach der Resuspension, Variationen in der mechanischen Dissoziation der Krypten von der darunter liegenden Muscularis und die Anzahl der Washes und Zentrifugalspins tragen zu einer erfolgreichen Kolonoidkultur bei. Darüber hinaus ist es wichtig, die Organoide während der Passage oder Plattierung für die 2D-Monolayer-Kultur nicht vollständig in einzelne Zellen zu zerlegen. Cluster von 30 bis 50 Zellen sind ideal, damit sich die Kultur für die Langzeitkultur vermehren kann. In den oben genannten Protokollen werden Bereiche mit potenziellen Fallstricken und optionale zusätzliche Schritte zur Behebung dieser Probleme aufgeführt. Letztendlich kann das Protokoll aufgrund der inhärenten Variabilität der Fähigkeiten und Manöver (z. B. Schütteln) sowie der Variation bei jedem Tier eine Optimierung durch die Person erfordern, die die Isolierung durchführt. Möglicherweise ist eine zusätzliche Optimierung durch den Endanwender erforderlich, um die genetische und molekulare Vielfalt bei CED zu erfassen.

Letztendlich ist das Kolonoidsystem zwar ein sehr nützliches Werkzeug, um Schlüsselaspekte der menschlichen Physiologie und Krankheit in vivo zu rekapitulieren, aber dieses System ist letztendlich in seiner Fähigkeit, alle Aspekte menschlicher Krankheiten zu untersuchen, begrenzt. Traditionelle Methoden zur Entwicklung des Dickdarms haben Schlüsselaspekte der Stammzelldynamik aufgeklärt. Diese Befunde spiegeln jedoch oft nicht adäquat die Befunde in terminal-differenzierten Zellen innerhalb des Wirtsepithels wider. Die in dieser Studie skizzierten Strategien bieten den Forschern ein relativ schnelles, kostengünstiges Modell für die Manipulation von Organoiden, das, wenn es richtig eingesetzt wird, Aufschluss über Schlüsselaspekte der Struktur und Funktion des Darmepithels während der Entzündung geben kann.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)