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Biology

स्थापित मुराइन कोलोनोइड्स पर विट्रो में आंतों की सूजन के उपकला प्रभावों का अध्ययन

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64804
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 2,3
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम 3-आयामी कोलोनोइड्स के विकास के लिए मुराइन कोलोनिक क्रिप्ट ्स के अलगाव का विवरण देने वाले एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। स्थापित कोलोनोइड्स को तब एक भड़काऊ चुनौती प्राप्त करने या उपकला मोनोलेयर स्थापित करने के लिए निर्देशित होने से पहले मेजबान उपकला की सेलुलर संरचना को प्रतिबिंबित करने के लिए टर्मिनल रूप से विभेदित किया जा सकता है।

Abstract

आंतों के उपकला मानव स्वास्थ्य में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, मेजबान और बाहरी वातावरण के बीच एक बाधा प्रदान करता है। यह अत्यधिक गतिशील कोशिका परत माइक्रोबियल और प्रतिरक्षा आबादी के बीच रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करती है और आंतों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करने में मदद करती है। उपकला बाधा का विघटन सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) की एक पहचान है और चिकित्सीय लक्ष्यीकरण के लिए रुचि है। 3-आयामी कोलोनॉइड कल्चर सिस्टम आईबीडी रोगजनन में आंतों के स्टेम सेल गतिशीलता और उपकला सेल फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी इन विट्रो मॉडल है। आदर्श रूप से, जानवरों के सूजन उपकला ऊतक से कोलोनोइड स्थापित करना बीमारी पर आनुवंशिक और आणविक प्रभावों का आकलन करने में सबसे फायदेमंद होगा। हालांकि, हमने दिखाया है कि विवो उपकला में परिवर्तन आवश्यक रूप से तीव्र सूजन वाले चूहों से स्थापित कोलोनोइड्स में बरकरार नहीं हैं। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हमने भड़काऊ मध्यस्थों के कॉकटेल के साथ कोलोनोइड्स का इलाज करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो आमतौर पर आईबीडी के दौरान ऊंचा होता है। जबकि इस प्रणाली को विभिन्न संस्कृति स्थितियों के लिए सर्वव्यापी रूप से लागू किया जा सकता है, यह प्रोटोकॉल स्थापित कोलोनोइड्स से प्राप्त विभेदित कोलोनोइड्स और 2-आयामी मोनोलेयर दोनों पर उपचार पर जोर देता है। एक पारंपरिक संस्कृति सेटिंग में, कोलोनोइड्स आंतों की स्टेम कोशिकाओं से समृद्ध होते हैं, जो स्टेम सेल आला का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श वातावरण प्रदान करते हैं। हालांकि, यह प्रणाली आंतों के शरीर विज्ञान की विशेषताओं के विश्लेषण की अनुमति नहीं देती है, जैसे कि बाधा समारोह। इसके अलावा, पारंपरिक कोलोनोइड प्रोइन्फ्लेमेटरी उत्तेजनाओं के लिए टर्मिनल रूप से विभेदित उपकला कोशिकाओं की सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने का अवसर प्रदान नहीं करते हैं। यहां प्रस्तुत विधियां इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए एक वैकल्पिक प्रयोगात्मक ढांचा प्रदान करती हैं। 2-आयामी मोनोलेयर कल्चर सिस्टम भी विवो में चिकित्सीय दवा स्क्रीनिंग के लिए एक अवसर प्रदान करता है। कोशिकाओं की इस ध्रुवीकृत परत को सेल के बेसल साइड पर भड़काऊ मध्यस्थों के साथ इलाज किया जा सकता है और आईबीडी उपचार में उनकी उपयोगिता निर्धारित करने के लिए कथित चिकित्सीय के साथ सहवर्ती रूप से इलाज किया जा सकता है।

Introduction

सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) एक पुरानी, उत्सर्जक और रिलैप्सिंग बीमारी है जो सूजन और नैदानिक उत्तेजना के एपिसोड की विशेषता है। आईबीडी का एटियलजि बहुक्रियाशील है, लेकिन रोग की प्रमुख विशेषताओं में दोषपूर्ण बाधा कार्य और आंतों के उपकला की बढ़ी हुई पारगम्यता शामिल है, इसके अलावा उपकला डिब्बे 1,2 के भीतर सक्रिय प्रोइन्फ्लेमेटरी सिग्नलिंग कैस्केड शामिल हैं। आईबीडी के दौरान उपकला प्रतिक्रिया को पुन: उत्पन्न करने के लिए कई इन विट्रो और इन विवो मॉडल का उपयोग किया गया है, जिसमें सेल कल्चर और सूजनके मुराइन मॉडल शामिल हैं। हालांकि, इन सभी प्रणालियों में महत्वपूर्ण कमियां हैं जो आईबीडी4 के दौरान उपकला परिवर्तनों को पुन: उत्पन्न करने की उनकी क्षमता को सीमित करती हैं। आईबीडी का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली अधिकांश सेल लाइनें रूपांतरित होती हैं, एक मोनोलेयर बनाने की क्षमता होती है, और3 को अलग कर सकती हैं लेकिन आंतरिक रूप से मेजबान में गैर-रूपांतरित आंतों के उपकला कोशिकाओं की तुलना में अलग-अलग प्रचार करती हैं। आईबीडी का अध्ययन करने के लिए सूजन के कई अलग-अलग मुराइन मॉडल का उपयोग किया जाता है, जिनमें से कुछ में नॉकआउट मॉडल, संक्रामक मॉडल, रासायनिक भड़काऊ मॉडल और टी-सेल ट्रांसफर मॉडल 5,6,7,8 शामिल हैं। जबकि प्रत्येक आईबीडी के कुछ एटियलॉजिकल पहलुओं का अध्ययन कर सकता है, जैसे कि आनुवंशिक प्रवृत्ति, बाधा शिथिलता, प्रतिरक्षा विनियमन, और माइक्रोबायोम, वे रोग की बहुक्रियाशील प्रकृति का अध्ययन करने की उनकी क्षमता में सीमित हैं।

एंटरोइड्स और कोलोनोइड्स सहित आंतों के ऑर्गेनोइड, पिछले दशक में न केवल आंतों के स्टेम कोशिकाओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी इन विट्रो मॉडल के रूप में स्थापित किए गए हैं, बल्कि आंतों के होमियोस्टैसिस और बीमारी में आंतों के उपकला की बाधा अखंडता और कार्य की भूमिका भी है। इन संस्थाओं ने आईबीडी9 के रोगजनन की हमारी समझ में महत्वपूर्ण योगदान दिया है और व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए नए अवसर खोले हैं। बृहदान्त्र से कोलोनोइड्स, या स्टेम सेल-व्युत्पन्न, स्व-संगठित ऊतक संस्कृतियों को एक ऐसी प्रक्रिया में मुराइन और मानव ऊतक दोनों से विकसित किया गया है जो आंतों के क्रिप्ट के भीतर स्थित स्टेम कोशिकाओं को फैलानेऔर अनिश्चित काल तक बनाए रखने की अनुमति देता है। विवो में स्टेम सेल आला इसके विकास का समर्थन करने के लिए बाह्य कारकों पर निर्भर करता है, विशेष रूप से कैननिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग और बोन-मॉर्फोजेनिक प्रोटीन सिग्नलिंग मार्ग11। इन कारकों के अलावा कोलोनोइड्स के स्वास्थ्य और दीर्घायु को बढ़ावा देता है, लेकिन संस्कृति को स्टेम सेल जैसी स्थिति की ओर भी बढ़ाता है जो विवो उपकला सेलुलर वास्तुकला में प्रतिबिंबित नहीं होता है, जिसमें आत्म-नवीनीकरण और टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाएं12,13 दोनों होती हैं। जबकि आंतों के उपकला की कार्यक्षमता स्टेम सेल डिब्बे और विभेदित कोशिकाओं के बीच निरंतर क्रॉसटॉक पर निर्भर है, एक कोलोनॉइड संस्कृति प्रणाली में दोनों होने की क्षमता काफी सीमित है। इन सीमाओं के बावजूद, ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम एपिथेलियम एक्स विवो के आंतरिक गुणों का अध्ययन करने के लिए स्वर्ण मानक बना हुआ है। बहरहाल, हाथ में वैज्ञानिक प्रश्न का उत्तर देने के लिए वैकल्पिक संस्कृति रणनीतियों पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है।

यह दिखाया गया है कि डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) के निरंतर 7 दिन के आहार पर चूहों में उपकला सूजन और बाधा शिथिलतादोनों विकसित होते हैं। इसके अलावा, आंतों के उपकला के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस विफलता और चयापचय रीप्रोग्रामिंग, जिसे मानव आईबीडी में स्पष्ट दिखाया गया है, को भी कोलाइटिस15 के इस डीएसएस मॉडल में कैप्चर किया गया है। हालांकि, हमारे प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस विफलता की विशेषताओं को डीएसएस-उपचारित जानवरों (पूरक चित्रा 1) के क्रिप्ट से प्राप्त कोलोनोइड्स में बरकरार नहीं रखा जाता है। इस प्रकार, वैकल्पिक संस्कृति विधियों का उपयोग यह जांचते समय किया जाना चाहिए कि मुराइन आंतों की सूजन के दौरान सूजन उपकला परिवर्तनों को कैसे चलाती है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल को रेखांकित करते हैं जिसे हमने विकसित किया है जो बताता है कि 1) मुराइन कोलोनोइड्स की स्थापना के लिए पूरे कोलोनिक ऊतक से क्रिप्ट को कैसे अलग किया जाए, 2) सेल आबादी को प्रतिबिंबित करने के लिए इस सेल आबादी को टर्मिनल रूप से कैसे अलग किया जाए जैसा कि यह विवो में खड़ा है, और 3) इस इन विट्रो मॉडल में सूजन को कैसे प्रेरित किया जाए। सूजन वाले एपिथेलियम के भीतर दवा की बातचीत का अध्ययन करने के लिए, हमने म्यूरिन कोलोनोइड्स से 2-डायमेंसोनल (2 डी) मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसे भड़काऊ मध्यस्थों के साथ बेसल रूप से इलाज किया जा सकता है और दवा उपचारों के साथ एपिकल रूप से इलाज किया जा सकता है।

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Protocol

यहां वर्णित मुराइन ऊतकों का उपयोग करके सभी प्रयोग पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किए गए थे और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय और यूपीएमसी में पशु अनुसंधान और देखभाल समिति द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे।

1. संस्कृति के लिए तैयारी

नोट: सभी अभिकर्मकों को सामग्री की तालिका अनुभाग में सूचीबद्ध किया गया है और सभी समाधान रचनाएँ समाधान संरचना तालिका (तालिका 1) में पाई जा सकती हैं।

  1. तालिका 1 में वर्णित माउस धोने का माध्यम तैयार करें। 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. तालिका 1 में वर्णित क्रिप्ट अलगाव बफर 1 (सीआईबी 1) तैयार करें। 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) को ओएसएचए जोखिम संचार मानक द्वारा खतरनाक माना जाता है क्योंकि संभावित तीव्र विषाक्तता और त्वचा और आंखों को नुकसान होता है यदि उन क्षेत्रों को इसके संपर्क में लाया जाता है। इस रसायन को संभालते समय सुरक्षात्मक दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और चेहरे की सुरक्षा का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. तालिका 1 में वर्णित क्रिप्ट अलगाव बफर 2 (सीआईबी 2) तैयार करें। 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल16 के अनुसार एल-डब्ल्यूआरएन-वातानुकूलित माध्यम तैयार करें।
  5. तालिका 1 में वर्णित के रूप में पूर्ण कोलोनॉयड माध्यम तैयार करें। पूर्ण कोलोनॉयड विकास माध्यम को गतिविधि के नुकसान के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. तालिका 1 में वर्णित विभेदन माध्यम तैयार करें। इस प्रोटोकॉल को पहले प्रकाशित पेपर17 से संशोधित किया गया था। विभेदन माध्यम को गतिविधि के नुकसान के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. तालिका 1 में वर्णित सूजन मध्यस्थ माध्यम तैयार करें। यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित पेपर18 से संशोधित किया गया था। सूजन मध्यस्थ माध्यम को गतिविधि के नुकसान के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. मुराइन मोनोलेयर माध्यम तैयार करें। भड़काऊ कारकों और / या दवा (ओं) के साथ मोनोलेयर को चुनौती देते समय वाई -27632 को छोड़ दें। मुराइन मोनोलेयर माध्यम को गतिविधि के नुकसान के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  9. सूजन मध्यस्थ मोनोलेयर माध्यम तैयार करें। सूजन मध्यस्थ मोनोलेयर माध्यम को गतिविधि के नुकसान के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

2. म्यूरिन कोलोनिक ऊतक से क्रिप्ट अलगाव।

नोट: बर्फ पर ऊतक स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की उचित मात्रा लें, और बर्फ पर पिघलें। प्रत्येक 24-कुएं को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 15 μL के साथ चढ़ाया जाता है। अनुभाग 1 में वर्णित CIB1, CIB2, और पूर्ण कोलोनॉइड विकास माध्यम तैयार करें।

  1. संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार एक C57BL/6J माउस (6-8 सप्ताह पुराना) को इच्छामृत्यु दें, और स्वच्छ चिमटी और कैंची का उपयोग करके बृहदान्त्र के डिस्टल छोर (लगभग 5-7 सेमी) को निकालें।
    नोट: इस अध्ययन में, विषयों को 2-3 मिनट के लिए कार्बन डाइऑक्साइड चैंबर इनक्यूबेशन का उपयोग करके इच्छामृत्यु दी गई थी, जिसके बाद ग्रीवा अव्यवस्था थी।
    1. इसके लिए उसकी पीठ पर माउस रखें, रिबकेज के ठीक नीचे क्षैतिज चीरा लगाएं और फिर पेट की गुहा को उजागर करने के लिए पूंछ के आधार की ओर क्षैतिज चीरा के बीच से एक ऊर्ध्वाधर चीरा लगाएं।
    2. चिमटी के साथ, छोटी आंत को खेत से बाहर ले जाएं, बृहदान्त्र की पहचान करें, और इसे पूंछ के आधार तक ले जाएं। यदि आवश्यक हो तो डिस्टल बृहदान्त्र को पूरी तरह से उजागर करने के लिए कैंची के साथ श्रोणि को तोड़ें। बृहदान्त्र के सबसे बाहर 5-7 सेमी काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  2. बृहदान्त्र ऊतक को एक साफ सतह पर रखें। बृहदान्त्र को घेरने वाले अतिरिक्त सेरसल वसा को हटा दें। 18 ग्राम 1 1/2 सुई से जुड़ी सिरिंज का उपयोग करके डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के साथ बृहदान्त्र की ल्यूमिनल सामग्री को फ्लश करके फेकल पदार्थ को हटा दें। फिर, बृहदान्त्र को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें जिसमें 10 एमएल बर्फ-ठंडा डीपीबीएस होता है, और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: यदि बृहदान्त्र को एक से अधिक जानवरों से अलग किया जाता है, तो अगले जानवर को जारी रखने से पहले ऊतक को बर्फ पर रखें।
  3. बृहदान्त्र ऊतक को 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे डीपीबीएस के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और पी 1,000 पिपेट का उपयोग करके डीपीबीएस के साथ लुमेन को दो बार सिंचाई करें।
  4. कैंची का उपयोग करके बृहदान्त्र को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें, और किसी भी शेष फेकल सामग्री को हटाने के लिए डीपीबीएस में ~ 30 सेकंड के लिए चिमटी का उपयोग करके धीरे से हिलाएं।
  5. ऊतक को 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे डीपीबीएस के साथ एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और कैंची का उपयोग करके बृहदान्त्र को 2 सेमी टुकड़ों में काटने से पहले चिमटी का उपयोग करके फिर से हिलाएं और उन्हें 7 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे सीआईबी 1 के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें। 20 मिनट के लिए बर्फ पर सीआईबी 1 में ऊतक को सेने दें।
    नोट: शेष चरण एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर किए जाते हैं।
  6. चिमटी का उपयोग करके ऊतक को पहले से गर्म 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 7 मिलीलीटर सीआईबी 2 होता है, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
  7. ऊतक को शंक्वाकार ट्यूब के तल पर व्यवस्थित करके और फिर सीआईबी 2 को बंद करके 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से सीआईबी 2 को हटा दें। फिर, उसी शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा माउस धोने का माध्यम जोड़ें।
  8. एक नया 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब प्राप्त करें, और खुली ट्यूब के शीर्ष पर 70 μm फ़िल्टर रखें।
  9. बृहदान्त्र सामग्री के साथ ट्यूब को पकड़ते समय, हाथ को लगभग 45 ° घुमाएं। क्रिप्ट्स को छोड़ने के लिए 45 सेकंड के लिए ट्यूब को रॉकिंग और जोरदार तरीके से हिलाएं। फिर, क्रिप्ट सस्पेंशन को 70 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से एक नए 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में डालें।
  10. चिमटी का उपयोग करके, बृहदान्त्र ऊतक को खाली 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में वापस रखें, और 10 एमएल बर्फ-ठंडा माउस धोने का माध्यम जोड़ें। एक नया 70 μm सेल छन्नी प्राप्त करें, और इसे पिछले फ़िल्टर किए गए समाधान वाले 50 mL शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर रखें।
  11. फिर, क्रिप्ट टुकड़ों वाले 50 एमएल ट्यूब को उठाएं, और इसे चरण 2.9 के समान तरीके से हिलाएं। पहले फ़िल्टर किए गए क्रिप्ट्स के साथ संयोजन करने के लिए 70 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में माध्यम को फ़िल्टर करें।
    नोट: यदि क्रिप्ट उपज कम है, तो ऊतक को 10 एमएल माउस धोने के माध्यम के साथ एक खाली 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखकर बृहदान्त्र ऊतक को एक अतिरिक्त समय हिलाएं। क्रिप्ट्स को छोड़ने के लिए ऊतक को 45-50 सेकंड तक हिलाएं। इसके अलावा, यदि क्रिप्ट उपज कम है, तो झटकों की कठोरता बढ़ाएं। अंत में, यदि समग्र क्रिप्ट उपज कम है, तो प्लास्टिक के लिए ऊतक के पालन को रोकने के लिए पिपेट और ट्यूब दोनों को भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ लेपित किया जा सकता है।
  12. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें जिसमें फ़िल्टर किए गए क्रिप्ट ्स 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हों।
    नोट: 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के तल पर एक गोली देखी जानी चाहिए।
  13. पाइपिंग द्वारा माध्यम को डिकैंट करें, 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे माउस धोने के माध्यम के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके क्रिप्ट ्स को फिर से निलंबित करें, और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  14. क्लीनर तैयारी प्राप्त करने के लिए, क्रिप्ट्स को अतिरिक्त 10 एमएल माउस वॉश माध्यम से धोएं। पिछले माध्यम को हटा दें, और 10 एमएल माउस वॉश माध्यम में ऊपर और नीचे पाइप करके क्रिप्ट को फिर से निलंबित करें। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: माध्यम को बंद करते समय सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि, कभी-कभी, गोली को कसकर सेंट्रीफ्यूज नहीं किया जाता है। यदि गोली तंग नहीं है, तो अधिकांश माध्यम को बंद कर दें, जिससे 500 μL से 1 mL तक बचें। फिर, 10 एमएल माउस वॉश माध्यम में पाइपिंग करके गोली को फिर से निलंबित करें, और घोल को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक छोटे शंक्वाकार ट्यूब में सेंट्रीफ्यूजिंग गोली की जकड़न में सुधार कर सकती है।
  15. माध्यम को बंद करें, और 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा माउस धोने के माध्यम के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके क्रिप्ट ्स को फिर से निलंबित करें। एक बार फिर से निलंबित होने के बाद, ग्लास स्लाइड पर माध्यम के 10 μL को तुरंत पाइप करके एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत क्रिप्ट ्स की गणना करें।
    1. स्लाइड के अलग-अलग सिरों पर दो 10 μL बूंदें रखें, और प्रत्येक बूंद में क्रिप्ट ्स की संख्या की गणना करें। प्रति 10 μL क्रिप्ट्स की संख्या निर्धारित करने के लिए दो बूंदों के बीच की संख्याओं का औसत निकालें। 1 mL में क्रिप्ट्स की संख्या प्राप्त करने के लिए इस संख्या को 100 से गुणा करें।
      नोट: सटीक गिनती के लिए, क्रिप्ट निलंबन के 10 μL को पुन: निलंबन के तुरंत बाद हटा दिया जाना चाहिए। यदि नहीं, तो क्रिप्ट ट्यूब के निचले हिस्से में गिर जाएंगे, जिसके परिणामस्वरूप गलत गिनती होगी।
  16. प्रति कुएं 300-500 क्रिप्ट चढ़ाने के लक्ष्य के साथ, माउस वॉश माध्यम में पुन: निलंबित क्रिप्ट्स की उचित मात्रा को एक नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ-ठंडे माउस वॉश माध्यम के साथ 10 एमएल तक लाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूब के तल पर एक छोटी गोली दिखाई देनी चाहिए।
  17. एक पावर पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। किसी भी अवशिष्ट माध्यम को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए पी 200 पाइप का उपयोग करें, केवल गोली को छोड़ दें।
  18. पेलेट को बर्फ-ठंडे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की उचित मात्रा में धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके पुन: निलंबित करें। क्रिप्ट गोली को निलंबित करते समय बुलबुले पेश न करने के लिए सावधान रहें। प्लेट के प्रत्येक कुएं में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की प्लेट 300-500 क्रिप्ट्स/15 μL। चढ़ाना के बाद, ऊतक संस्कृति प्लेट को उल्टा करें, और इसे 10-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  19. प्लेट को वापस करें, और प्रत्येक कुएं में पूर्ण माउस कोलोनॉयड माध्यम के 500 μL जोड़ें। हर दूसरे दिन माध्यम बदलें जब तक कि वे पासिंग के लिए तैयार न हों। हर 3-5 दिनों में कोलोनोइड्स को पारित करें।

3. कोलोनोइड्स को पास करना।

नोट: प्रत्येक कुएं को आम तौर पर मूल कुएं के घनत्व के अनुसार 1: 4 से 1: 6 तक पारित किया जा सकता है। -20 डिग्री सेल्सियस से बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की उचित मात्रा लें, और इसे पिघलने के लिए बर्फ पर रखें। कोलोनोइड्स का उपयोग दो मार्गों के बाद प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। कोलोनोइड्स को पारित करते समय, संदूषण को रोकने के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट में कदम उठाए जाते हैं।

  1. माध्यम को कुओं से निकाल दें ताकि उन्हें पारित किया जा सके।
    1. यदि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के भीतर मलबा है, जो प्रारंभिक अलगाव के दौरान हो सकता है, तो मलबे को साफ करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है:
      1. प्रत्येक कुएं में सीए2 + या एमजी2 + के बिना डीपीबीएस में 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) जोड़ें। इसे जैविक सुरक्षा कैबिनेट में 5 मिनट के लिए बैठने दें।
      2. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को बाधित करने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करके तीन से सात बार ऊपर और नीचे पिपेट करें, और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कुओं की सामग्री एकत्र करें। सीए2 + या एमजी2 + के बिना डीपीबीएस में 0.1% बीएसए के कुल 5-10 एमएल में कोलोनोइड्स को सेंट्रीफ्यूज करें। 0.1% बीएसए के साथ उपयुक्त मात्रा तक बनाएं।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 150 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें ताकि कोलोनोइड्स को पेलेट किया जा सके लेकिन मलबे को नहीं।
      4. गोली को छोड़ते हुए, पाइप िंग करके डीपीबीएस को हटा दें। कमरे के तापमान (आरटी) एंजाइमी पृथक्करण अभिकर्मक के 1 एमएल जोड़ें, और पिपेट तीन से पांच बार।
      5. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को एंजाइमेटिक पृथक्करण अभिकर्मक और बाधित कोलोनोइड्स के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 3-4 मिनट के लिए रखें।
      6. पानी के स्नान, पिपेट से ट्यूब को 3-5 बार निकालें, और फिर माउस धोने के माध्यम के साथ 10 एमएल पर लाएं। चरण 3.6 पर आगे बढ़ें।
  2. प्रत्येक कुएं में आरटी एंजाइमेटिक पृथक्करण अभिकर्मक के 500 μL रखें, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को बाधित करने के लिए तीन से सात बार ऊपर और नीचे पाइप करने से पहले इसे लगभग 1 मिनट तक बैठने दें।
  3. प्लेट को 3-4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  4. इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें, और कोलोनोइड्स को अलग करने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करके तीन से सात बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  5. सामग्री को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ-ठंडे माउस धोने के माध्यम से 10 एमएल तक बनाएं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. आवश्यकतानुसार एक पावर पिपेट और एक पी 200 पिपेट का उपयोग करके माध्यम को हटा दें ताकि शंक्वाकार ट्यूब में केवल एक गोली बची रहे।
  8. कितने कुओं को चढ़ाया जाना है, इसके अनुसार धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके बर्फ-ठंडे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की उचित मात्रा में पुन: निलंबित करें। पाइपिंग करते समय बुलबुले पेश न करें। कोलोनॉइड के टुकड़ों को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स बूंदों के 15 μL प्रति अच्छी तरह से रखें।
  9. क्रिप्ट्स को प्लेट करें, टिशू कल्चर प्लेट को इनवर्ट करें, और फिर प्लेट को 10-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  10. अंत में, प्लेट को वापस करें, और प्रत्येक कुएं में 500 μL पूर्ण माउस कोलोनॉयड माध्यम जोड़ें। हर दूसरे दिन माध्यम को बदलें जब तक कि वे लगभग 3-5 दिनों में फिर से पारित होने के लिए पर्याप्त बड़े न हो जाएं।

4. कोलोनॉइड कोशिकाओं को टर्मिनल रूप से अलग करना।

  1. ऊपर दिए गए कोलोनोइड्स को पारित करें, और प्रत्येक कुएं में पूर्ण माउस कोलोनोइड माध्यम के 500 μL जोड़ें।
  2. पासिंग के कम से कम 48 घंटे बाद, पूर्ण माउस कोलोनॉइड माध्यम को हटा दें, और प्रत्येक कुएं में विभेदक माध्यम के 500 μL जोड़ें (अनुभाग 1 देखें)।
  3. 48 घंटे के लिए विभेदन मीडिया के साथ कोलोनोइड्स को इनक्यूबेट करें, जिसके बाद उनका उपयोग प्रयोगों में किया जा सकता है, जिसमें आरएनए और प्रोटीन का संग्रह भी शामिल है।
    नोट: कोलोनोइड्स को आरएनए एकत्र करके और मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) के माध्यम से क्रमशः एलजीआर 5 और केआई 67, एक स्टेम सेल मार्कर और सेल प्रसार मार्कर की अभिव्यक्ति का आकलन करके भेदभाव के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। पारंपरिक कोलोनॉयड माध्यम में उगाए गए कोलोनोइड्स की तुलना में टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं में Lgr5 और Ki67 की अपेक्षाकृत कम अभिव्यक्ति होनी चाहिए, जहां कोशिकाएं अधिक स्टेम जैसी होती हैं। कोलोनोइड्स को विभेदन माध्यम में इनक्यूबेट करने के लिए आवश्यक समय की अवधि को प्रत्येक व्यक्तिगत प्रयोगशाला के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। प्राइमरों की सूची के लिए पूरक तालिका 1 देखें।

5. भड़काऊ मध्यस्थों के साथ विभेदित कोलोनोइड्स में सूजन को प्रेरित करना

  1. कोलोनोइड्स को विभेदन माध्यम के साथ 2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करने के बाद, मौजूदा माध्यम को हटा दें, और प्रत्येक कुएं में सूजन मध्यस्थ माध्यम के 500 μL जोड़ें।
  2. आरएनए और प्रोटीन एकत्र करने (या अन्य डाउनस्ट्रीम मापदंडों का आकलन) से पहले कुओं को 24-72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। हर दिन माध्यम बदलें।

6. स्थापित मुराइन कोलोनोइड्स से प्राप्त आंतों के उपकला मोनोलेयर।

नोट: मुराइन आंतों के उपकला मोनोलेयर मुराइन कोलोनोइड्स से प्राप्त होते हैं जिन्हें कम से कम दो बार पारित किया गया है। 3-5 दिनों में सफल मोनोलेयर गठन की अनुमति देने के लिए, कोलोनोइड्स को एकल कोशिकाओं में अलग नहीं करना अनिवार्य है। खंडित ऑर्गेनोइड ्स जिन्हें सेलुलर समूहों में एंजाइमेटिक रूप से अलग किया गया है, विकास के लिए आदर्श हैं।

  1. प्रयोग शुरू करने से पहले सभी अभिकर्मकों को तैयार करें। बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को पिघलाएं। खंड 1 में वर्णित मुराइन मोनोलेयर माध्यम तैयार करें। ठंडे मुराइन मोनोलेयर माध्यम के साथ पिघले हुए तहखाने की झिल्ली को 1:20 तक पतला करें। बर्फ पर रहो।
  2. 24-वेल टिशू कल्चर प्लेट (सामग्री की तालिका) के एक कुएं में 0.4 μm पारदर्शी सेल कल्चर डालने के लिए बाँझ बल का उपयोग करें। डालने का एक कोना पकड़ें, और इसे कुएं में स्थानांतरित करें। तब तक दोहराएं जब तक कि संस्कृति के लिए उचित संख्या में सेल कल्चर इंसर्ट उपलब्ध न हों।
    नोट: केवल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ एक अतिरिक्त नियंत्रण अच्छी तरह से कोट करना सुनिश्चित करें। इस सेल कल्चर इंसर्ट का उपयोग कोशिकाओं की उपस्थिति के बिना सेल कल्चर इंसर्ट के पृष्ठभूमि प्रतिरोध को मापने के लिए किया जाएगा, जैसा कि अगले चरण (चरण 6.3) में वर्णित है।
  3. पी 200 पाइप का उपयोग करके, प्रत्येक सेल कल्चर की एपिकल (शीर्ष) सतह को 150 μL पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ सम्मिलित करें। डालने की झिल्ली को छूने के बिना डालने के केंद्र में पाइप टिप रखें, और धीरे से समाधान को निष्कासित करें। प्लेट को कम से कम 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ एक बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  4. उपयोग से पहले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को धीरे से हटा दें, और सेल कल्चर इंसर्ट को कम से कम 10 मिनट के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सूखने दें।
    1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को हटाने के लिए, 24-वेल प्लेट को 45 ° कोण पर घुमाएं। सम्मिलित को स्थिर करने के लिए प्रोंग के कोने पर एक एकल उंगली रखें, और पी 200 पाइप का उपयोग करके, धीरे से डालने के निचले हिस्से के साथ पाइप टिप रखें और मैट्रिक्स को हटा दें।
    2. सीए2 + या एमजी2 + के बिना बाँझ डीपीबीएस के 150 μL के साथ प्रत्येक सेल कल्चर इन्सर्ट को धोकर किसी भी अतिरिक्त अवशेष को हटा दें।
  5. 10 मिनट सूखने के बाद, सेल कल्चर इंसर्ट के नीचे 400 μL म्यूरिन मोनोलेयर माध्यम और शीर्ष पर 75 μL जोड़ें। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी सेल कल्चर इंसर्ट डूब न जाएं। प्लेट को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में छोड़ दें, या इसे आवश्यकता होने तक इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर से परिपक्व (विकास के दिन 3-5 पर ऑर्गेनोइड्स) आंतों के कोलोनोइड्स की 24-अच्छी प्लेट को हटा दें, और इसे जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत रखें। बाँझ युक्तियों का उपयोग करके माध्यम को हटा दें, और प्रत्येक को 1 एमएल आरटी बाँझ डीपीबीएस (सीए 2 + या एमजी2 + के बिना) के साथ अच्छी तरह से धो लें।
    नोट: 75-125 परिपक्व कोलोनोइड ्स का एक व्यक्तिगत कुआं 1: 4 के अनुपात में विभाजित है।
  7. बाँझ युक्तियों का उपयोग करके सीए 2 + या एमजी2 + के बिना डीपीबीएस को हटा दें, और प्रत्येक कुएं में आरटी एंजाइमेटिक पृथक्करण अभिकर्मक के 500 μL रखकर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के प्रत्येक प्लग को पचाएं।
  8. प्लग को तोड़ने के लिए प्रत्येक को लगभग 6-10 बार ऊपर और नीचे अच्छी तरह से ऊपर और नीचे करें। प्लग को हटाने के लिए प्लेट के निचले हिस्से को खरोंच न करें। इसके बजाय, 24-वेल प्लेट को 45 ° कोण पर घुमाएं, प्लग के किनारे पर पाइप की नोक रखें, और धीरे से इसे हटा दें।
  9. 24-वेल प्लेट को 3-4 मिनट के लिए बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  10. प्लेट को हटा दें, और जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत प्रत्येक कुएं के लिए एंजाइमेटिक पृथक्करण अभिकर्मक को पांच से सात बार ऊपर और नीचे करें। प्रत्येक कुएं से असंबद्ध कोलोनोइड्स को एक बाँझ, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ-ठंडा माउस धोने के माध्यम के साथ 10 एमएल की मात्रा तक लाएं।
  11. आंशिक रूप से पचने वाले कोलोनोइड्स को 300 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक स्विंगिंग बाल्टी सेंट्रीफ्यूज में रखें।
  12. जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत, 10 एमएल पाइप का उपयोग करके गोली से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। P200 पाइप का उपयोग करके किसी भी शेष माध्यम को निकालें। म्यूरिन मोनोलेयर माध्यम में कोलोनॉइड गोली को पुन: निलंबित करें। प्रत्येक सेल कल्चर में 75 μL माध्यम जोड़ें और खंडित कोलोनोइड्स को चढ़ाया जाए।
  13. प्रत्येक सेल कल्चर इंसर्ट के केंद्र में कोलोनॉइड निलंबन के 75 μL जोड़ें। प्रत्येक कुएं में कोलोनॉइड निलंबन जोड़ने से पहले, 75 μL को हटाने से पहले एक या दो बार धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करें, जो अधिक समान चढ़ाना की अनुमति देता है।
  14. सेल कल्चर इंसर्ट के साथ 24-वेल प्लेट को 10 मिनट के लिए एक घूर्णन प्लेटफॉर्म पर रखें ताकि सेल कल्चर इंसर्ट में समान फैलाव की अनुमति मिल सके।
  15. प्लेट को एक बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  16. अगले दिन (दिन 1), पी 200 पाइप के साथ माध्यम को तीन से पांच बार ऊपर और नीचे करके असंबद्ध कोलोनॉयड टुकड़ों को हटा दें। धीरे से नोक को सेल कल्चर के अंदर के साथ रखें ताकि संलग्न आंतों की कोशिकाओं को बाधित न किया जा सके। माध्यम में बुलबुले पेश न करें, क्योंकि यह सभी असंबद्ध टुकड़ों को हटाने से रोकता है।
  17. तुरंत मध्यम और बृहदान्त्र मिश्रण को हटा दें। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी सेल कल्चर इंसर्ट साफ न हो जाएं।
  18. धीरे-धीरे प्रत्येक सेल कल्चर इंसर्ट के एपिकल साइड में प्री-वार्म्ड मुराइन मोनोलेयर माध्यम के 150 μL जोड़ें। एक नई 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में गर्म मुराइन मोनोलेयर माध्यम के 400 μL जोड़ें। सेल कल्चर को बाँझ बल का उपयोग करके इसके प्रोंग को पकड़कर नई प्लेट में स्थानांतरित करें। कंफ्लुएंसी तक हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
    नोट: कोलोनॉइड टुकड़े को 3-5 दिनों के बाद एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर बनाना चाहिए।

7. मोनोलेयर कल्चर के 3 - 5 दिनों पर वोल्टोहममीटर का उपयोग करके उपकला मोनोलेयर के शुद्ध प्रतिरोध को मापना

नोट: चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड बल से मिलते जुलते हैं और लंबाई में विषम होते हैं। जांच की लंबी बांह बेसोलेटरल इलेक्ट्रोड है, और छोटी बांह एपिकल इलेक्ट्रोड है। सेल कल्चर इंसर्ट के आंतरिक और बाहरी के बीच जांच डालना मुश्किल हो सकता है। जांच को डालने पर थोड़ा कोण पर रखने और उसके बाद जांच को ऊर्ध्वाधर सीधा करने से जांच को अटकने से रोका जा सकेगा। प्रत्येक सेल कल्चर के शुद्ध प्रतिरोध को एक समान कोण पर पढ़ना सुनिश्चित करें, क्योंकि यह मूल्यों को प्रभावित कर सकता है।

  1. वोल्टोहममीटर और सभी अभिकर्मकों को एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर रखें।
    1. वोल्टोहममीटर को निकटतम एसी आउटलेट में प्लग करें, और इलेक्ट्रोड जांच के प्लास्टिक मॉड्यूलर कनेक्टर को फ्रंट डिस्प्ले पर इनपुट जैक में प्लग करें।
    2. वोल्टोहममीटर को 45 डिग्री कोण पर रखने के लिए, उपकरण के पीछे की तरफ धातु की बांह को तब तक घुमाएं जब तक कि यह जगह में लॉक न हो जाए।
    3. अब, फ्रंट डिस्प्ले पर पावर स्विच अप को फ्लिप करके वोल्टोमीटर चालू करें। अंत में, इस मीट्रिक में रीडिंग प्रदर्शित करने के लिए स्विच को ओएचएमएस की ओर फ्लिप करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर से 24-वेल प्लेट को हटा दें, और प्लेट को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सपाट रखें। ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईआर) तापमान संवेदनशील है। टीईआर पढ़ने से तुरंत पहले प्लेट को हटा दें।
  3. 30 सेकंड से 1 मिनट के लिए पूर्व-गर्म 70% इथेनॉल में इलेक्ट्रोड जांच को निष्फल करें। अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए प्रोब, इनवर्ट और इसे एक से दो बार फ्लिक करें। जांच को लगभग 30 सेकंड के लिए हवा में सूखने दें।
  4. पहले से गर्म माउस धोने के माध्यम से जांच पर बचे किसी भी शेष इथेनॉल को धो लें।
    सावधानी: जांच पर उच्च शेष इथेनॉल बूंदों में से किसी को भी सेल कल्चर इंसर्ट में न गिरने दें। माध्यम से इथेनॉल को धोते समय, माध्यम को बाँझ इथेनॉल क्षेत्र से ऊपर न जाने दें। इससे दूषित माध्यम सेल कल्चर इंसर्ट में प्रवेश कर सकता है।
  5. सेल कल्चर इंसर्ट के लंबवत जांच पकड़ो। सेल कल्चर के बाहर बेसोलेटरल इलेक्ट्रोड (जांच का लंबा छोर) डालें जब तक कि यह 24-वेल प्लेट के आधार को छू न ले। एपिकल इलेक्ट्रोड (जांच का छोटा छोर) को सेल कल्चर इंसर्ट में स्लाइड करें। दो इलेक्ट्रोड की दूरी को अच्छी तरह से अच्छी तरह से अलग न करें। यह टीईआर माप को प्रभावित करेगा।
  6. सत्यापित करें कि टीईआर पढ़ने से पहले एपिकल इलेक्ट्रोड सेल कल्चर इंसर्ट के आधार को छू नहीं रहा है। पृष्ठभूमि नियंत्रण कक्ष संस्कृति सम्मिलित करने से प्रारंभ करें, और मान रिकॉर्ड करें. मान स्वचालित रूप से वोल्टोमीटर के सामने डिजिटल रूप से प्रदर्शित किया जाएगा।
  7. प्रत्येक कक्ष संस्कृति सम्मिलित करने के लिए चरण 7.5-7.6 दोहराएँ.
    नोट: यदि सेल कल्चर इंसर्ट के बीच अलग-अलग प्रयोगात्मक स्थितियां मौजूद हैं, तो प्रत्येक नई स्थिति के बीच जांच को निष्फल करें। चरण 7.1 से प्रारंभ करें, और चरणों के माध्यम से संख्यात्मक रूप से आगे बढ़ें।
  8. सभी टीईआर माप दर्ज होने के बाद 24-वेल प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  9. 350 Ω या उससे अधिक पर शुद्ध मान मोनोलेयर गठन के संकेत हैं। मोनोलेयर गठन प्राप्त होने तक बाद के दिनों में फिर से दोहराएं।
    नोट: आम तौर पर, 1,000 Ω या उससे अधिक के मूल्यों को दिन 3 पर कैप्चर किया जा सकता है, लेकिन समय के साथ, वे सभी 350 Ω के आसपास कम संख्या पर अभिसरण करेंगे।

8. वोल्टोहममीटर से शुद्ध प्रतिरोध माप का उपयोग करके टीईआर की गणना करना।

नोट: कोलोनोइड्स के सफल मोनोलेयर गठन से टीईआर माप 115 Ω.सेमी2 से अधिक होगा।

  1. व्यक्तिगत शुद्ध प्रतिरोध मान लें, और पृष्ठभूमि से शुद्ध प्रतिरोध को अच्छी तरह से घटाएं। बेसमेंट मैट्रिक्स झिल्ली के साथ लेपित सेल कल्चर इंसर्ट लगभग 100 Ω की शुद्ध रीडिंग देगा।
  2. पृष्ठभूमि-घटाए गए शुद्ध प्रतिरोध माप लें, और उन्हें सेल कल्चर इंसर्ट के सतह क्षेत्र से गुणा करें। एक 24-वेल सेल कल्चर इंसर्ट में 0.33 सेमी 2 का सतह क्षेत्र होताहै।
  3. यदि मान 115 Ω.सेमी2 या उससे अधिक हैं, तो डाउनस्ट्रीम प्रयोगात्मक परख पर आगे बढ़ें।

9. भड़काऊ मध्यस्थों के साथ उपकला मोनोलेयर में सूजन को प्रेरित करना

  1. एक बार सफल मोनोलेयर बनने के बाद, संस्कृति के बेसल पक्ष पर संस्कृति में भड़काऊ मध्यस्थों को जोड़ें। चरण 1.9 में वर्णित सूजन मध्यस्थ मोनोलेयर माध्यम तैयार करें, और एक नई 24-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं में 400 μL जोड़ें।
  2. सेल कल्चर सम्मिलित के एपिकल पक्ष से माध्यम को हटा दें, और वाई -27632 के बिना मुराइन मोनोलेयर माध्यम के 150 μL जोड़ें। भड़काऊ मध्यस्थों के साथ इस पक्ष को पूरक न करें। हालांकि, अगर कोशिका मृत्यु अत्यधिक लगती है, तो मीडिया में वाई -27632 छोड़ दें। यह अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. सेल कल्चर को एक नई 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, और उन्हें सूजन मध्यस्थ मोनोलेयर माध्यम के साथ पूरक कुओं में रखें।
  4. प्रयोग के आधार पर 24-72 घंटे के लिए भड़काऊ मध्यस्थों के साथ मोनोलेयर को उत्तेजित करें।
  5. इस भड़काऊ मॉडल का उपयोग करके दवा प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए, सेल कल्चर के एपिकल साइड पर मोनोलेयर माध्यम को पसंद की दवा के साथ पूरक करें। दवा की कार्रवाई के तंत्र और मूल्यांकन किए जाने वाले डाउनस्ट्रीम मापदंडों के आधार पर, दवा को प्रयोग में किसी भी बिंदु पर जोड़ा जा सकता है।

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Representative Results

आंतों के म्यूकोसल होमियोस्टैसिस के लिए एपिथेलियम के आंतरिक योगदान का अध्ययन करने के लिए 3 डी आंतों के कोलोनॉइड कल्चर सिस्टम एक अमूल्य उपकरण है। वर्णित प्रोटोकॉल 8 सप्ताह की उम्र में C57BL/6J (WT) चूहों से क्रिप्ट्स को अलग करने और एक दीर्घकालिक कोलोनॉइड कल्चर सिस्टम स्थापित करने के बारे में विस्तृत निर्देश प्रदान करता है जिसे कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए हेरफेर किया जा सकता है। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में क्रिप्ट्स के अलगाव और चढ़ाना पर, उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना किए जाने पर क्रिप्ट संरचना में घने और बहुकोशिकीय दिखाई देते हैं। वे आकार में गोलाकार या लम्बी और बेलनाकार हो सकते हैं, जो एकल, क्रिप्ट जैसी संरचना के समान होती है जो आमतौर पर विवो आंतों की वास्तुकला (चित्रा 1 ए) में देखी जाती है। दिन 1 तक, अधिकांश क्रिप्ट एक कॉम्पैक्ट, गोलाकार संरचना बनाते हैं, जिसमें कुछ कोलोनोइड उपकला कोशिकाओं से रहित एक आंतरिक लुमेन (खाली स्थान) विकसित करना शुरू करते हैं (चित्रा 1 बी)। जैसे-जैसे वे अगले कई दिनों में बढ़ते रहते हैं, कोलोनोइड्स के व्यास में वृद्धि जारी रहती है, और कोलोनोइड्स के लुमेन अधिक परिभाषित हो जाते हैं (चित्रा 1 सी)। दिन 5 तक, प्रत्येक कोलोनॉइड व्यास में लगभग 100-250 μm होता है, जो उपकला स्टेम कोशिकाओं की एक पतली परत से घिरा एक बड़ा, प्रमुख लुमेन बनाता है (चित्रा 1 डी)। इस बिंदु पर, कोलोनोइड्स दोनों एंजाइमेटिक रूप से और यांत्रिक रूप से पासिंग के लिए बाधित होते हैं। दो अंशों के बाद, उनका उपयोग डाउनस्ट्रीम प्रयोग के लिए किया जा सकता है।

यह आकलन करने के लिए कि क्या डीएसएस-उपचारित चूहों के कोलोनिक स्क्रैपिंग में देखे गए चयापचय परिवर्तनों को उसी डीएसएस शासन पर चूहों से प्राप्त कोलोनोइड्स में बनाए रखा जाता है, 8 सप्ताह के डब्ल्यूटी चूहों को पीने के पानी में 2% डीएसएस के साथ इलाज किया गया था। आयु-मिलान और लिंग-मिलान वाले डब्ल्यूटी नियंत्रण जानवरों को डीएसएस के बिना पीने का पानी दिया गया था। 7 दिनों के बाद, चूहों की बलि दी गई, और कोलोनोइड्स स्थापित करने के लिए नियंत्रण (एन = 3, नर) और डीएसएस-उपचारित जानवरों (एन = 3, पुरुष) दोनों के बृहदान्त्र से क्रिप्ट ्स को अलग किया गया। दो अंशों के बाद, प्रोटीन को कोलोनोइड्स के प्रत्येक सेट से अलग किया गया था, और माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस के मास्टर नियामक प्रोटीन पेरोक्सीसोम प्रोलिफ़ेरेटर-एक्टिवेटर रिसेप्टर-गामा कोएक्टिवेटर -1ए (पीजीसी 1ए) की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (पूरक चित्रा 1) के माध्यम से किया गया था। नियंत्रण चूहों से स्थापित कोलोनोइड्स बनाम डीएसएस-उपचारित चूहों से स्थापित कोलोनोइड्स की तुलना करते समय पीजीसी 1 ए अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, यह सुझाव देते हुए कि यह कोलोनॉइड कल्चरपद्धति चूहों में देखे जाने वाले विवो चयापचय परिवर्तनों को उचित रूप से प्रतिबिंबित नहीं करती है।

आंतों के भड़काऊ अपमान के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस शुरू करने के लिए पीजीसी 1 की विफलता मुख्य रूप से विभेदित कोलोनिक एपिथेलियम15,19 के लिए स्थानीयकृत है। विवो में देखे गए परिवर्तनों को प्रतिबिंबित करने के लिए, हमने कोलोनोइड्स को अधिक विभेदित स्थिति की ओर निर्देशित करने का फैसला किया। इस बदलाव को प्रेरित करने के लिए, कोलोनोइड्स को शुरू में पारंपरिक कोलोनोइड माध्यम से इनक्यूबेट किया गया था। 24 घंटे से 48 घंटे के बाद, कोलोनोइड्स को अतिरिक्त 48 घंटे के लिए भेदभाव माध्यम में बदल दिया गया। भेदभाव के दौरान, कोलोनोइड्स का एक छोटा प्रतिशत एक गोलाकार वास्तुकला से गोब्लेट कोशिकाओं और कोलोनोसाइट्स17 (चित्रा 2 ए, बी) से समृद्ध बुड्ड संरचनाओं में परिवर्तित हो गया। डब्ल्यूआरएन-पूरक माध्यम में उगाए गए कोलोनोइड्स को तेजी से विभाजित एलजीआर 5 + स्टेम कोशिकाओं से समृद्ध किया गया था। यह पुष्टि करने के लिए कि Lgr5+ स्टेम सेल और अन्य प्रसार कोशिकाएं दोनों भेदभाव के दौरान सेल चक्र से बाहर निकल गईं, एमआरएनए स्तरों का विश्लेषण क्यूपीसीआर के माध्यम से किया गया। पारंपरिक संस्कृति सेटिंग (एन = 6) में उगाए गए कोलोनोइड्स की तुलना में विभेदित कोलोनोइड्स (एन = 6) में एलजीआर 5 (97%, पी = 0.0023) और केआई 67 (75%, पी = 0.0007) दोनों स्तरों में महत्वपूर्ण डाउनरेगुलेशन देखा गया था। पूरक चित्र 2ए, बी)। कोई यह भी उम्मीद करेगा कि विभेदित कोलोनोइड्स में मुख्य रूप से बलगम-स्रावित गोब्लेट कोशिकाएं शामिल हों। इसके अतिरिक्त, वास्तव में, MUC2 को उनके पारंपरिक रूप से विकसित समकक्षों (n = 3, p = 0.0433, पूरक चित्रा 3) की तुलना में विभेदित कोलोनोइड्स में लगभग दो गुना अधिक विनियमित किया गया था। जब एक साथ लिया जाता है, तो इन आंकड़ों से पता चलता है कि कोलोनोइड्स को सफलतापूर्वक विभेदित किया गया था और डाउनस्ट्रीम प्रयोग के लिए तैयार थे। इसके बाद, भड़काऊ मध्यस्थों को भेदभाव माध्यम में जोड़ा गया, जैसा कि प्रोटोकॉल के खंड 5 में वर्णित है। विश्लेषण के लिए भड़काऊ मध्यस्थों की शुरूआत के बाद 72 घंटे तक प्रोटीन और आरएनए एकत्र किए गए थे। हालांकि, 72 घंटे में, कोशिका मृत्यु में वृद्धि कभी-कभी देखी गई थी।

यह आकलन करने के लिए कि क्या विभेदित कोलोनोइड्स के लिए भड़काऊ मध्यस्थों की शुरूआत मानव आईबीडी और मुराइन कोलाइटिस के एक तीव्र मॉडल दोनों में देखी गई माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस विफलता की नकल कर सकती है, पीजीसी 1 ए और प्रतिलेखन कारक ए, माइटोकॉन्ड्रिया (टीएफएएम) की प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन 72 घंटे से अधिक भड़काऊ मध्यस्थों के साथ इलाज किए गए विभेदित कोलोनोइड्स (एन = 5) में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से किया गया था। साथ ही मानव आईबीडी15 में। टीएफएएम, एक प्रोटीन जो माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम के प्रतिलेखन और प्रतिकृति दोनों को चलाता है, को कोलाइटिस के मुराइन मॉडल में भी कम दिखाया गया है, और इसकी जीन अभिव्यक्ति को मानव आईबीडी15,20 में कम दिखाया गया है। हमने इन भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में आने के 72 घंटे बाद विभेदित कोलोनोइड्स में पीजीसी 1 ए (50.4%, पी = 0.0442) और टीएफएएम (88.9%, पी = 0.004) अभिव्यक्ति दोनों में एक समान डाउनरेगुलेशन देखा (चित्रा 3)। सामूहिक रूप से, इससे पता चलता है कि साइटोकिन्स के साथ विभेदित कोलोनोइड्स का उपचार विट्रो में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है।

जबकि विभिन्न सेलुलर और आणविक कार्यों की जांच 3 डी कोलोनॉइड कल्चर सेटिंग्स में की जा सकती है, 2 डी मोनोलेयर कल्चर सिस्टम बैरियर फ़ंक्शन, होस्ट-पैथोजन इंटरैक्शन और सूजन पर मौखिक रूप से अवशोषित चिकित्सीय के प्रभाव का आकलन करते समय बेहतर होते हैं। एक बरकरार बाधा के साथ कंफ्लुएंट कोशिकाओं की एक निरंतर परत का गठन विभिन्न जैविक या रासायनिक एजेंटों को आसानी से कोशिकाओं के एपिकल और / या बेसल पक्ष पर रखने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल 2 डी मोनोलेयर संस्कृतियों को पहले से मौजूद डब्ल्यूटी कोलोनोइड्स से स्थापित करने की अनुमति देता है जिन्हें दो बार पारित किया गया है। कोलोनोइड्स जो एंजाइमेटिक और यांत्रिक रूप से बाधित हो गए हैं, उन्हें बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित सेल कल्चर इंसर्ट पर चढ़ाया जाता है। प्रारंभिक चढ़ाना पर, खंडित कोलोनोइड 15 से 150 कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) तक के सेलुलर समूहों में दिखाई देते हैं। दिन 3 तक, कोशिकाओं ने समतल होना शुरू कर दिया है और धीरे-धीरे सेल कल्चर इंसर्ट को कवर किया है, जो आम तौर पर सामंजस्य तक पहुंचता है (चित्रा 4 बी)। अगले कुछ दिनों में, मोनोलेयर बढ़ते रहते हैं और एक निरंतर बाधा बनाते हैं जिसे टीईआर (चित्रा 4 सी, डी) द्वारा मात्रात्मक रूप से मापा जा सकता है। दिलचस्प बात यह है कि टीईआर माप दिन 3 से दिन 5 तक उतार-चढ़ाव करते हैं। मोनोलेयर में पहले एक व्यापक सीमा (200-800Ω.सेमी 2) के साथ उच्च मान होते हैं, लेकिन ये मान धीरे-धीरे दिन 5 (115-150 Ω.सेमी2, चित्रा 5 ए) तक कम संख्या पर अभिसरण करते हैं। जब मोनोलेयर एक स्थिर स्थिति में पहुंच जाते हैं, तो उनका उपयोग डाउनस्ट्रीम प्रयोग के लिए किया जा सकता है।

सूजन के लिए कोलोनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर की उपकला प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए, भड़काऊ मध्यस्थों को 48 घंटे के लिए कोशिकाओं के बेसल साइड (इंसर्ट के बाहर) पर रखा गया था। आरएनए निकाला गया था, और विभिन्न स्टेम और सेल भेदभाव मार्करों के एमआरएनए स्तर, साथ ही जंक्शन प्रोटीन, क्यूपीसीआर के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। Lgr5 का किसी भी स्थिति में पता नहीं लगाया गया था, लेकिन एक अन्य स्टेम सेल मार्कर, एमटीआरटी, अनुपचारित नियंत्रण (पूरक चित्रा 4 ए) की तुलना में सूजन वाले मोनोलेयर में लगभग 60% कम हो गया था। इसके बाद, हमने विभेदित सेल प्रकारों के दो मार्करों, म्यूक 2 और क्षारीय फॉस्फेट (एल्पी) की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। नियंत्रण कोशिकाओं (पूरक चित्रा 4 ए) की तुलना में सूजन वाले मोनोलेयर में दोनों एमआरएनए प्रतिलेख कम थे। स्टेम और पोस्ट-माइटोटिक दोनों कोशिकाएं आमतौर पर कोलोनिक सूजन23,24,25 के दौरान कम हो जाती हैं, और इस अध्ययन में प्राप्त मोनोलेयर मॉडल में एक समान प्रतिक्रिया देखी गई थी।

मोनोलेयर प्रणाली का एक लाभ बाधा प्रतिक्रिया का आकलन करने की क्षमता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्रतिरक्षा-उत्तेजित स्थिति में बाधा से समझौता किया गया था, हमने 48 घंटे के बाद टीईआर मूल्यों को मापा। नियंत्रण मोनोलेयर (एन = 2) के लिए टीईआर मान औसतन 129.16 Ω.सेमी 2 था, लेकिन सूजन वाले मोनोलेयर (चित्रा 5 बी) में 98.54 Ω.सेमी2 के औसत तक काफी गिरावट (पी = 0.0087) थी। आगे की पुष्टि करने के लिए कि भड़काऊ स्थिति में बाधा से समझौता किया गया था, हमने तीन अलग-अलग तंग जंक्शन मार्करों, ज़ो -1, ऑक्लुडिन और क्लाउडिन के लिए एमआरएनए स्तरों का आकलन किया। सभी तीन मार्करों ने अपने बिना सूजन वाले समकक्षों (पूरक चित्रा 4 बी) की तुलना में सूजन की स्थिति में स्तर कम कर दिया था। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि सूजन वाले मोनोलेयर में बाधा शिथिलता मौजूद है और आईबीडी रोगजनन के दौरान देखी गई बाधा शिथिलता की नकल करती है।

Figure 1
चित्रा 1: दीर्घकालिक कोलोनॉइड संस्कृति की स्थापना के लिए मुराइन क्रिप्ट का प्रारंभिक अलगाव। (ए) दिन 0 पर, 300-500 क्रिप्ट को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (चढ़ाना के 5 घंटे बाद प्राप्त चित्र) में चढ़ाया गया था, और कोलोनोइड्स की वृद्धि को (बी) दिन 1, (सी) दिन 3, और (डी) दिन 5 पर कैप्चर किया गया था। 5 वें दिन, कोलोनोइड पारित होने के लिए तैयार थे। आवर्धन = 10x; स्केल बार = 400 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पारंपरिक कोलोनोइड संस्कृति से टर्मिनल रूप से विभेदित कोलोनोइड्स की स्थापना। मुराइन कोलोनोइड्स को पारित करने के 48 घंटे बाद कोलोनोइड्स पर भेदभाव माध्यम रखा गया था। (ए) 24 घंटे और (बी) 48 घंटे के बाद, कोलोनोइड टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं से समृद्ध हो जाते हैं। आवर्धन = 10x; स्केल बार = 400 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: भड़काऊ मध्यस्थों के साथ इलाज किए गए मुराइन विभेदित कोलोनोइड्स में पीजीसी 1 ए और टीएफएएम प्रोटीन अभिव्यक्ति। भड़काऊ मध्यस्थों के साथ पूरक माध्यम को विभेदित कोलोनोइड्स पर रखा गया था, और प्रोटीन को एक्सपोजर के बाद 0 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे एकत्र किया गया था। (A) PGC1a की प्रोटीन अभिव्यक्ति ने 72 घंटे में समग्र रूप से महत्वपूर्ण कमी (p = 0.0442) दिखाई। TFAM 72 घंटे में भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में आने के बाद काफी कम हो गया (p = 0.004) और (B) ANOVA द्वारा विश्लेषण किए जाने पर 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे में प्रोटीन अभिव्यक्ति में गिरावट की प्रवृत्ति थी। डेटा को मानक विचलन ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया। * पी < 0.05, ** पी < 0.005। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पहले से मौजूद कोलोनोइड्स से मोनोलेयर की स्थापना और विकास। कोलोनोइड्स जो एंजाइमेटिक और यांत्रिक रूप से बाधित हो गए थे, उन्हें एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित सेल कल्चर इंसर्ट पर चढ़ाया गया था। प्रारंभिक चढ़ाना पर, खंडित कोलोनोइड (ए) सेलुलर समूहों में दिखाई दिए, और (बी) दिन 3 तक, उन्होंने समतल होना शुरू कर दिया था और धीरे-धीरे सेल कल्चर सम्मिलित करना शुरू कर दिया था। (C) दिन 5 और (D) दिन 7 पर, मोनोलेयर एक निरंतर बाधा बनाने के लिए बढ़ते रहे जिसे TEER द्वारा मात्रात्मक रूप से मापा जा सकता है। आवर्धन = 10x; स्केल बार = 400 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: कोलोनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर और सूजन मोनोलेयर स्थापित करने के लिए टीईआर मान। (ए) टीईआर मूल्यों को दिन 3 से दिन 5 तक वोल्टोहममीटर का उपयोग करके मापा गया था। मोनोलेयर में पहले एक व्यापक सीमा के साथ उच्च मूल्य थे, लेकिन धीरे-धीरे 5 वें दिन तक कम संख्या में परिवर्तित हो गए। एक बार जब मोनोलेयर एक स्थिर अवस्था में पहुंच जाते हैं, तो उनका उपयोग डाउनस्ट्रीम प्रयोग के लिए किया जा सकता है। (बी) टीईआर मान सूजन वाले मोनोलेयर (एन = 2) में बिना सूजन वाले नियंत्रणों (एन = 2) की तुलना में कम थे। नियंत्रण मोनोलेयर में 129.16 ओम.सेमी 2 का औसत टीईआर था, और टी-टेस्ट का उपयोग करके विश्लेषण किए जाने पर सूजन वाले मोनोलेयर का टीईआर काफी कम (पी = 0.0087) था, जिसका औसत 98.54 Ω.सेमी2 था। ** पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: समाधान संरचना तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्र 1: डब्ल्यूटी नियंत्रण और 2% डीएसएस-उपचारित चूहों से अलग पारंपरिक कोलोनोइड माध्यम में उगाए गए मुराइन कोलोनोइड्स में पीजीसी 1 ए प्रोटीन अभिव्यक्ति। कोलोनोइड्स 8 सप्ताह के डब्ल्यूटी नियंत्रण चूहों और 7 दिनों के बाद 2% डीएसएस-उपचारित चूहों दोनों से प्राप्त किए गए थे। प्रोटीन को कोलोनोइड्स से दो बार और चढ़ाना के बाद दिन 4 पर अलग किया गया था। एक अप्रकाशित टी-परीक्षण द्वारा विश्लेषण किए जाने पर 7 दिनों के लिए 2% डीएसएस के संपर्क में आने वाले चूहों की तुलना में नियंत्रण चूहों से प्राप्त कोलोनोइड्स में पीजीसी 1 ए प्रोटीन अभिव्यक्ति (पी = 0.9996) में कोई अंतर नहीं था। डेटा को मानक विचलन ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: विभेदित कोलोनोइड्स में एलजीआर 5 और केआई 67 एमआरएनए अभिव्यक्ति में कमी। आरएनए और सीडीएनए संश्लेषण को अलग करने से पहले 48 घंटे पहले पारित मुराइन कोलोनोइड्स को 48 घंटे के लिए भेदभाव माध्यम के संपर्क में लाया गया था। एमआरएनए स्तर क्यूपीसीआर के माध्यम से निर्धारित किए गए थे और तुलनात्मक सीटी विधि द्वारा विश्लेषण किया गया था। (ए) एलजीआर 5 और (बी) केआई 67 को विभेदित कोलोनोइड्स में काफी कमी आई थी जब टी-टेस्ट (पी = 0.0023, पी = 0.0007) का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण किया गया था। डेटा को औसत ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया गया.**p < 0.005. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3: विभेदित मुराइन कोलोनोइड्स में म्यूसिन-स्रावित गोब्लेट कोशिकाओं में वृद्धि। 48 घंटे पहले पारित मुराइन कोलोनोइड्स को 48 घंटे के लिए भेदभाव माध्यम के संपर्क में लाया गया था। कोशिकाओं को आरआईपीए बफर में रखा गया था, और प्रोटीन को पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा देखा गया था। (ए) अविभाजित कोलोनोइड्स की तुलना में विभेदित कोलोनोइड्स के प्रत्येक सेट में एमयूसी 2 अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी। (बी) एमयूसी 2 प्रोटीन में लगभग दो गुना परिवर्तन विभेदक स्थितियों में देखा गया था, जो टी-टेस्ट (पी = 0.0433) का उपयोग करके विश्लेषण किए जाने पर महत्वपूर्ण था। डेटा को मानक विचलन ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया। * पी < 0.05. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: भड़काऊ मध्यस्थों के साथ इलाज किए गए मोनोलेयर में स्टेम और भेदभाव मार्करों के साथ-साथ तंग जंक्शनल मार्करों की कम अभिव्यक्ति। मुराइन कोलोनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर (दिन 5) को 48 घंटे के लिए भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में लाया गया था, आरएनए को बाद में एकत्र किया गया था, और सीडीएनए को संश्लेषित किया गया था (एन = 2)। स्टेम, भेदभाव और जंक्शनल मार्करों के एमआरएनए स्तर क्यूपीसीआर के माध्यम से निर्धारित किए गए थे और तुलनात्मक सीटी विधि द्वारा विश्लेषण किया गया था। (ए) स्टेम सेल मार्कर, एलजीआर 5, किसी भी स्थिति में पता नहीं चला था, लेकिन भड़काऊ स्थितियों में एमटीईआरटी काफी कम हो गया था। गोब्लेट सेल मार्कर, म्यूक 2, और कोलोनोसाइट मार्कर, एल्पी, दोनों अनुपचारित मोनोलेयर की तुलना में सूजन वाले मोनोलेयर में कम हो गए थे। (बी) तंग जंक्शन मार्कर, ज़ो -1, ऑक्लुडिन और क्लॉडिन, नियंत्रण की तुलना में भड़काऊ-उपचारित मोनोलेयर में सभी कम थे। डेटा को मानक विचलन ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: प्राइमरों की सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऑर्गेनॉइड विकास ने वैज्ञानिक समुदाय के अध्ययन के तरीके में क्रांति ला दी है, जिसमें सेलुलर संरचना और एक डिश में एक जानवर या मानव से आंशिक रूप से पुन: उत्पन्न करने की क्षमता है। इसके अलावा, बीमारियों के साथ मनुष्यों से प्राप्त ऑर्गेनॉइड सिस्टम व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए एक आशाजनक उपकरण प्रदान करते हैं जो चिकित्सीय निर्णय लेने का मार्गदर्शन कर सकते हैं। यहां, हम एक क्रिप्ट अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो अच्छी तरह से काम करता है और महत्वपूर्ण चरणों का परिचय देता है जो चढ़ाना से पहले अलगाव में अतिरिक्त मलबे को साफ करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, हम एक महत्वपूर्ण विवरण की व्याख्या करते हैं जिसे अक्सर प्रक्रिया में अनदेखा किया जाता है- चढ़ाना के लिए क्रिप्ट्स को सटीक रूप से गिनने की क्षमता। एक बार कोलोनोइड स्थापित हो जाने के बाद, हम प्रमुख जोड़तोड़ को रेखांकित करते हैं जो उनके सेलुलर भेदभाव या मोनोलेयर गठन की अनुमति देते हैं, जो आईबीडी के दौरान आंतों के उपकला में परिवर्तन का अध्ययन करने की क्षमता को बढ़ा सकते हैं।

स्तनधारियों में कोलोनिक एपिथेलियम में क्रिप्ट-विलस अक्ष एक जटिल संरचना है जो विभिन्न कार्यों के साथ विभिन्न सेल प्रकारों से बना है। इस अक्ष का रखरखाव आंतरिक और बाह्य सेलुलर कारकों दोनों पर टिका है, जो एक साथ उपकला होमियोस्टैसिस18 को बनाए रखने में मदद करते हैं। हमने ध्यान दिया है कि पारंपरिक माध्यम में उगाए जाने वाले मुराइन कोलोनोइड्स मुख्य रूप से स्टेम कोशिकाओं और टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं दोनों के समूह के विपरीत स्टेम कोशिकाओं को प्रतिबिंबित करते हैं जो विवो में देखे जाते हैं। इसके अलावा, इस तरह से उगाए और बनाए गए मुराइन कोलोनोइड्स फ्लैट मोनोलेयर के विपरीत गोलाकार संरचनाएं हैं। इन मतभेदों में विट्रो में आंतों की बीमारी का अध्ययन करने के हमारे प्रयासों के लिए संभावित निहितार्थ हैं। विशेष रूप से, हम बाधा समारोह में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करने की हमारी क्षमता में सीमित हैं, साथ ही टर्मिनल रूप से विभेदित आंतों के उपकला कोशिकाओं पर सूजन के प्रभाव भी।

यहां, हम न केवल कोलोनोइड्स विकसित करने के लिए मुराइन क्रिप्ट्स के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, बल्कि आंतों के उपकला शरीर विज्ञान और सूजन के लिए उपकला प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इन कोलोनोइड्स के हेरफेर के लिए भी हैं। प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं और टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं के ढाल को बढ़ावा देने वाले कई बाहरी कारकों में डब्ल्यूएनटी कैननिकल मार्ग है, जो क्रिप्ट में समृद्ध है और स्टेम सेल स्वास्थ्य को बढ़ावा देता है। डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग क्रिप्ट अक्ष के सिरे पर कम हो जाती है, जो स्टेम कोशिकाओं के विकास के साथ मेल खाती है। हमने एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जो कोलोनॉइड कोशिकाओं के टर्मिनल भेदभाव की अनुमति देता है। दूसरों की तरह, हम विकास माध्यम से डब्ल्यूएनटी को हटाकर अंतर करते हैं, लेकिन हम आर-स्पोंडिन (500 एनजी / एमएल बनाम 1 μg / mL R-स्पोंडिन) की कम सांद्रता का उपयोग करते हैं। हैरानी की बात है, आर-स्पोंडिन में 50% की कमी ऑर्गेनोइड्स के सफल भेदभाव को प्रभावित नहीं करती है। कम एकाग्रता के साथ अंतर करने की क्षमता एक कम कृत्रिम प्रणाली स्थापित करने में मदद करती है जो विवो में शारीरिक वातावरण से अधिक निकटता से मिलती-जुलती हो सकती है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप परिमित टर्मिनल भेदभाव (पूरक चित्रा 2 और पूरक चित्रा 3) और सेलुलर अमरता को बनाए रखने में असमर्थता होती है, फिर भी यह आईबीडी और अन्य रोग राज्यों के लिए कोलोनोसाइट्स, एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं और गोब्लेट कोशिकाओं सहित टर्मिनल रूप से विभेदित उपकला के शारीरिक योगदान को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक उपयोगी तरीका है। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि इस माध्यम में विशिष्ट साइटोकिन्स को पूरक करना, जो पारंपरिक रूप से आईबीडी वाले रोगियों में ऊंचा होता है, विभेदित ऑर्गेनॉइड सिस्टम को एक भड़काऊ स्थिति की ओर निर्देशित करता है। 72 घंटे के दौरान, भड़काऊ साइटोकिन्स के साथ इलाज किए गए विभेदित कोलोनोइड ्स कोलाइटिस और मानव आईबीडी के अन्य स्थापित मॉडलों में दिखाए गए कुछ चयापचय निष्कर्षों को अधिक बारीकी से दर्शाते हैं (चित्रा 3)। इसके अलावा, इस तरह से इलाज किए गए विभेदित कोलोनोइड्स विभेदित उपकला पर सेलुलर होमियोस्टैसिस पर सूजन के प्रभावों को अधिक प्रतिबिंबित करते हैं। हमने मोनोलेयर विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी रेखांकित किया है, जो एपिथेलियम के एपिकल और बेसल पक्ष दोनों के गठन को सक्षम बनाता है, जिससे विवो में बाधा समारोह के विश्लेषण की अनुमति मिलती है। यह प्रणाली भेदभाव की आवश्यकता के बिना बाधा शिथिलता के तंत्र का अध्ययन करने और उपचार के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों की खेती करने में उपयोगी है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बारे में कई सीमाओं और संभावित नुकसान पर ध्यान दिया जाना चाहिए। क्रिप्ट्स का सफल अलगाव और कोलोनोइड्स का विकास प्रत्येक जानवर से क्रिप्ट उपज, क्रिप्ट की गिनती की सटीकता और तैयारी की स्वच्छता से सीमित हो सकता है। पुन: निलंबन के बाद पृथक क्रिप्ट्स की गिनती की गति, अंतर्निहित मांसपेशियों से क्रिप्ट के यांत्रिक पृथक्करण में भिन्नता, और वॉश और केन्द्रापसारक स्पिन की संख्या सफल कोलोनॉइड संस्कृति में योगदान करती है। इसके अलावा, 2 डी मोनोलेयर संस्कृति के लिए पासिंग या प्लेटिंग के दौरान ऑर्गेनोइड्स को एकल कोशिकाओं में पूरी तरह से अलग नहीं करना महत्वपूर्ण है। 30 से 50 कोशिकाओं के समूह संस्कृति को दीर्घकालिक संस्कृति के लिए प्रचारित करने की अनुमति देने के लिए आदर्श हैं। उपरोक्त प्रोटोकॉल संभावित नुकसान के क्षेत्रों और इन समस्याओं के निवारण के लिए वैकल्पिक अतिरिक्त चरणों को नोट करते हैं। अंततः, प्रोटोकॉल को कौशल सेट और पैंतरेबाज़ी (यानी, हिलाने) में अंतर्निहित परिवर्तनशीलता के साथ-साथ प्रत्येक जानवर में भिन्नता के कारण अलगाव करने वाले व्यक्ति द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। आईबीडी में पाए जाने वाले आनुवंशिक और आणविक विविधता को पकड़ने के लिए अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

अंततः, जबकि कोलोनॉइड प्रणाली विवो में मानव शरीर विज्ञान और बीमारी के प्रमुख पहलुओं को पुन: परिभाषित करने के लिए एक अत्यधिक उपयोगी उपकरण है, यह प्रणाली अंततः मानव रोग के सभी पहलुओं का अध्ययन करने की क्षमता में सीमित है। कोलोनॉइड विकास के लिए पारंपरिक तरीकों ने स्टेम सेल गतिशीलता के प्रमुख पहलुओं को स्पष्ट किया है; हालांकि, ये निष्कर्ष अक्सर मेजबान उपकला के भीतर टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं में निष्कर्षों को पर्याप्त रूप से प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इस अध्ययन में उल्लिखित रणनीतियाँ जांचकर्ताओं को ऑर्गनॉइड हेरफेर के लिए अपेक्षाकृत तेज, सस्ती मॉडल प्रदान करती हैं, जो ठीक से नियोजित होने पर, सूजन के दौरान आंतों के उपकला संरचना और कार्य के प्रमुख पहलुओं पर प्रकाश डाल सकती हैं।

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Disclosures

योगदान करने वाले लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R01DK120986 संस्थान (केपीएम को) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

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References

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जीव विज्ञान अंक 196
स्थापित मुराइन कोलोनोइड्स पर <em>विट्रो में</em> आंतों की सूजन के उपकला प्रभावों का अध्ययन
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Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, … More

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

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