Summary
우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.
Abstract
장 상피는 인체 건강에 필수적인 역할을 하며 숙주와 외부 환경 사이에 장벽을 제공합니다. 이 매우 역동적인 세포층은 미생물과 면역 집단 사이의 첫 번째 방어선을 제공하고 장 면역 반응을 조절하는 데 도움이 됩니다. 상피 장벽의 파괴는 염증성 장 질환(IBD)의 특징이며 치료 표적화에 관심이 있습니다. 3차원 결장 배양 시스템은 IBD 발병기전에서 장 줄기 세포 역학 및 상피 세포 생리학을 연구하는 데 매우 유용한 시험관 내 모델입니다. 이상적으로는 동물의 염증이 있는 상피 조직에서 콜로노이드를 확립하는 것이 질병에 대한 유전적 및 분자적 영향을 평가하는 데 가장 유익할 것입니다. 그러나, 우리는 생체 내 상피 변화가 급성 염증이 있는 마우스에서 확립된 콜로노이드에서 반드시 유지되는 것은 아니라는 것을 보여주었습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 IBD 동안 일반적으로 상승하는 염증 매개체의 칵테일로 콜로노이드를 치료하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 시스템은 다양한 배양 조건에 유비쿼터스로 적용될 수 있지만, 이 프로토콜은 차별화된 콜로노이드와 확립된 콜로노이드에서 파생된 2차원 단층 모두에 대한 처리를 강조합니다. 전통적인 배양 환경에서 콜로노이드는 장내 줄기 세포가 풍부하여 줄기 세포 틈새를 연구하기에 이상적인 환경을 제공합니다. 그러나 이 시스템은 장벽 기능과 같은 장 생리학의 특징을 분석할 수 없습니다. 또한, 전통적인 콜로노이드는 전염증성 자극에 대한 말단적으로 분화된 상피 세포의 세포 반응을 연구할 기회를 제공하지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 이러한 제한 사항을 해결하기 위한 대체 실험 프레임워크를 제공합니다. 2차원 단층 배양 시스템은 또한 생체 외에서 치료 약물 스크리닝을 위한 기회를 제공합니다. 이 편광된 세포층은 세포의 기저부에 있는 염증 매개체로 치료할 수 있으며 IBD 치료에서의 유용성을 결정하기 위해 정점적으로 추정 치료제와 병행할 수 있습니다.
Introduction
염증성 장 질환(IBD)은 염증 및 임상적 정지 에피소드를 특징으로 하는 만성, 완화 및 재발성 질환입니다. IBD의 병인은 다인성이지만, 이 질환의 주요 특징은 상피 구획 내에서 활성화된 전염증성 신호 캐스케이드 외에도 장벽 기능 결함과 장 상피의 투과성 증가를 포함한다 1,2. 염증의 세포 배양 및 쥐 모델을 포함하여 IBD 동안 상피 반응을 요약하기 위해 여러 시험관 내 및 생체 내 모델이 사용되었습니다3. 그러나, 이들 모든 시스템은 IBD4 동안 상피 변화를 요약하는 능력을 제한하는 중요한 단점을 가지고 있다. IBD 연구에 사용되는 대부분의 세포주는 형질전환되고, 단층을 형성할 수 있는 능력을 가지며,3개를 분화시킬 수 있지만 숙주에서 형질전환되지 않은 장 상피 세포와 본질적으로 다르게 증식합니다. 염증의 여러 다른 쥐 모델이 IBD를 연구하는 데 사용되며, 그 중 일부는 녹아웃 모델, 감염성 모델, 화학적 염증 모델 및 T 세포 전달 모델 5,6,7,8을 포함합니다. 각각은 유전적 소인, 장벽 기능 장애, 면역 조절 완화 및 미생물군집과 같은 IBD의 특정 병인학적 측면을 연구할 수 있지만 질병의 다인성 특성을 연구하는 능력에는 한계가 있습니다.
엔테로이드 및 콜로노이드를 포함한 장 오가노이드는 지난 10년 동안 장 줄기 세포의 역학뿐만 아니라 장 항상성 및 질병에서 장 상피의 역할, 장벽 무결성 및 기능을 연구하기 위한 유용한 시험관 내 모델로 확립되었습니다. 이러한 실체는 IBD9의 발병기전에 대한 우리의 이해에 크게 기여했으며 개인화된 의학을 위한 새로운 기회를 열었습니다. 대장에서 줄기 세포 유래 자가 조직화 배양물인 콜로노이드(Colonoids)는 쥐와 인간 조직 모두에서 개발되어 장 선와(intestinal crypt) 내에 위치한 줄기세포가 번식하고 무기한 유지될 수 있도록 하는 과정이다10. 생체 내 줄기 세포 틈새는 성장을 지원하기 위해 세포외 인자, 특히 표준 Wnt 신호 전달 및 뼈 형태 형성 단백질 신호 전달 경로에 의존합니다11. 이러한 인자의 추가는 콜로노이드의 건강과 수명을 촉진할 뿐만 아니라 자가 재생 세포와 말단 분화 세포 모두로 구성된 생체 내 상피 세포 구조를 반영하지 않는 줄기 세포와 유사한 상태로 배양을 유도합니다12,13. 장 상피의 기능은 줄기 세포 구획과 분화된 세포 사이의 지속적인 누화에 의존하지만, 결장 배양 시스템에서 둘 다를 갖는 능력은 상당히 제한적입니다. 이러한 한계에도 불구하고 오가노이드 배양 시스템은 생체 외 상피의 고유 특성을 연구하기 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 당면한 과학적 질문에 답하기 위해 대안적 문화 전략을 고려해야 할 수도 있습니다.
덱스트란 황산나트륨(DSS)을 7일 동안 지속적으로 투여한 쥐는 상피 염증과 장벽 기능 장애를 모두 발생시키는 것으로 나타났다14. 또한, 인간 IBD에서 명백한 것으로 밝혀진 장 상피 내의 미토콘드리아 생물 발생 실패 및 대사 재프로그래밍도 대장염의 DSS 모델에서도 포착되었습니다15. 그러나 우리의 예비 데이터는 미토콘드리아 생물 발생 실패의 특성이 DSS 처리 동물의 선와에서 파생된 콜로노이드에서 유지되지 않는다는 것을 보여줍니다(보충 그림 1). 따라서 쥐 장 염증 동안 염증이 상피 변화를 유발하는 방법을 조사할 때 대체 배양 방법을 사용해야 합니다. 여기에서 우리는 1) 쥐 콜로노이드의 확립을 위해 전체 결장 조직에서 선와를 분리하는 방법, 2) 생체 내 세포 집단을 반영하기 위해 이 세포 집단을 최종적으로 분화하는 방법, 3) 이 시험관 내 모델에서 염증을 유도하는 방법. 염증이 있는 상피 내에서 약물 상호작용을 연구하기 위해 우리는 염증 매개체로 기저적으로 치료하고 약물 요법으로 정점으로 치료할 수 있는 쥐 결장에서 2-디멘소날(2D) 단층을 설정하는 프로토콜을 개발했습니다.
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Protocol
본원에 기술된 쥐 조직을 이용한 모든 실험은 피츠버그 대학교의 임상시험심사위원회에 의해 승인되었고, 피츠버그 대학교 및 UPMC의 동물 연구 및 관리 위원회에 의해 제시된 가이드라인에 따라 수행되었다.
1. 문화 준비
참고: 모든 시약은 재료 표 섹션에 나열되어 있으며 모든 용액 조성은 용액 조성 표(표 1)에서 찾을 수 있습니다.
- 표 1에 기재된 바와 같이 마우스 세척 배지를 준비한다. 4°C에서 최대 2개월까지 보관하세요.
- 표 1에 설명된 대로 크립트 격리 버퍼 1(CIB1)을 준비합니다. 4°C에서 최대 2개월까지 보관하세요.
주의 : Dithiothreitol (DTT)은 섭취시 잠재적 인 급성 독성과 해당 부위에 노출되면 피부와 눈이 손상되기 때문에 OSHA 위험 커뮤니케이션 표준에 따라 위험한 것으로 간주됩니다. 이 화학 물질을 취급할 때는 보호 장갑, 보안경 및 안면 보호구를 사용해야 합니다. - 표 1에 설명된 대로 크립트 격리 버퍼 2(CIB2)를 준비합니다. 4°C에서 최대 2개월까지 보관하세요.
- 이전에 발표된 프로토콜16에 따라 L-WRN 조절 배지를 준비합니다.
- 표 1에 기재된 바와 같이 완전한 콜로노이드 배지를 준비한다. 완전한 콜로노이드 성장 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
- 표 1에 기재된 바와 같이 분화 배지를 준비한다. 이 프로토콜은 이전에 발표된 논문17에서 수정되었습니다. 분화 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
- 표 1에 기재된 바와 같이 염증 매개체 배지를 준비한다. 이 프로토콜은 이전에 발표된 논문18에서 수정되었습니다. 염증 매개체 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
- 쥐 단층 배지를 준비하십시오. Y-27632는 염증 인자 및/또는 약물로 단층에 도전할 때 생략합니다. 쥐 단층 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
- 염증 매개체 단층 배지를 준비합니다. 염증 매개체 단층 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
2. 쥐 결장 조직에서 선와단 분리
알림: 얼음 위에서 티슈를 옮깁니다. -20°C 보관에서 적절한 양의 기저막 매트릭스를 꺼내 얼음에서 해동합니다. 각 24-웰은 15 μL의 기저막 매트릭스로 도말됩니다. 섹션 1에 설명된 대로 CIB2, CIB1 및 완전한 콜로노이드 성장 배지를 준비합니다.
- Institutional Animal Care and Use Committee가 승인한 프로토콜에 따라 C57BL/6J 마우스(6-8주령)를 안락사시키고 깨끗한 핀셋과 가위를 사용하여 결장의 말단부(약 5-7cm)를 추출합니다.
참고: 이 연구에서 피험자는 2-3분 동안 이산화탄소 챔버 배양을 사용하여 안락사시킨 후 경추 탈구를 했습니다.- 이를 위해 마우스를 등에 대고 흉곽 바로 아래에 수평 절개를한 다음 수평 절개 중앙에서 꼬리 바닥을 향해 수직 절개하여 복강을 노출시킵니다.
- 핀셋을 사용하여 소장을 들판 밖으로 옮기고 결장을 확인한 다음 꼬리 밑 부분까지 따라갑니다. 필요한 경우 가위로 골반을 부러뜨려 원위 결장을 완전히 노출시킵니다. 가위를 사용하여 결장의 가장 말단 5-7cm를 자릅니다.
- 결장 조직을 깨끗한 표면에 놓습니다. 결장을 둘러싸고 있는 과도한 장막 지방을 제거하십시오. 18G 1 1/2 바늘에 부착된 주사기를 사용하여 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 결장의 내강 내용물을 씻어내어 대변을 제거합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 DPBS 10mL가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 결장을 넣고 얼음 위에 놓습니다.
참고: 한 마리 이상의 동물로부터 결장을 분리하는 경우 다음 동물로 진행하기 전에 조직을 얼음 위에 놓습니다. - 결장 조직을 얼음처럼 차가운 DPBS 10mL가 담긴 페트리 접시에 옮기고 P1,000 피펫을 사용하여 DPBS로 내강을 두 번 관개합니다.
- 가위를 사용하여 결장을 세로로 열고 DPBS에서 ~30초 동안 핀셋을 사용하여 부드럽게 흔들어 남아 있는 배설물 내용물을 제거합니다.
- 조직을 얼음처럼 차가운 DPBS 10mL가 담긴 새 페트리 접시에 옮기고 가위를 사용하여 결장을 2cm 조각으로 자르고 7mL의 얼음처럼 차가운 CIB1이 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣기 전에 핀셋을 사용하여 다시 부드럽게 흔듭니다. CIB1의 조직을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
알림: 나머지 단계는 생물 안전 캐비닛 내부에서 수행됩니다. - 핀셋을 사용하여 조직을 7mL의 CIB2가 들어 있는 예열된 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다.
- 조직이 코니컬 튜브의 바닥에 가라앉도록 한 다음 CIB2를 피펫팅하여 50mL 코니컬 튜브에서 CIB2를 제거합니다. 그런 다음 동일한 원추형 튜브에 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지 10mL를 추가합니다.
- 새 50mL 원뿔형 튜브를 구하고 열린 튜브 위에 70μm 필터를 놓습니다.
- 결장 내용물이 있는 튜브를 잡고 손을 약 45° 회전시킵니다. 튜브를 45초 동안 흔들고 세게 흔들어 지하실을 해제합니다. 그런 다음 크립트 현탁액을 70μm 세포 여과기를 통해 새 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다.
- 핀셋을 사용하여 결장 조직을 빈 50mL 원추형 튜브에 다시 넣고 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지 10mL를 추가합니다. 새로운 70μm 셀 스트레이너를 구하고 이전 여과 용액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓습니다.
- 다시, 크립트 조각이 들어있는 50 mL 튜브를 집어 들고 2.9 단계와 동일한 방식으로 흔든다. 70μm 셀 스트레이너를 통해 배지를 50mL 원뿔형 튜브로 여과하여 이전에 여과된 크립트와 결합합니다.
참고: 선와 수율이 낮으면 10mL의 마우스 세척 배지가 있는 빈 50mL 원뿔형 튜브에 조직을 넣어 결장 조직을 추가로 흔듭니다. 조직을 45-50초 동안 흔들어 지하실을 풀어줍니다. 또한, 지하실 수율이 낮 으면, 흔들림의 격렬함을 증가시킨다. 마지막으로, 전체 crypt 수율이 낮 으면 피펫과 튜브 모두 태아 소 혈청 (FBS)으로 코팅하여 조직이 플라스틱에 부착되는 것을 방지 할 수 있습니다. - 300 x g 에서 5°C에서 5분 동안 여과된 크립트가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브를 원심분리합니다.
알림: 펠릿은 50mL 원뿔형 튜브의 바닥에서 관찰되어야 합니다. - 피펫팅으로 배지를 경사 조절하고, 10mL의 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 위아래로 피펫팅하여 크립트를 다시 현탁하고, 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 300 x g 에서 5°C에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 더 깨끗한 제제를 얻으려면 추가로 10mL의 마우스 세척 배지로 크립트를 세척하십시오. 이전 배지를 경사 조절하고, 10 mL의 마우스 세척 배지에서 위아래로 피펫팅하여 크립트를 재현탁한다. 15mL 코니컬 튜브를 사용하여 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다.
알림: 매체를 피펫팅할 때 주의해야 합니다., 때때로, 펠릿이 단단히 원심분리되지 않기 때문에. 펠릿이 단단하지 않은 경우 대부분의 배지에서 피펫을 제거하고 500μL를 1mL로 남겨둡니다. 그런 다음 10mL의 마우스 세척 배지에 피펫팅하여 펠릿을 재현탁하고 용액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 더 작은 원추형 튜브에서 원심분리하면 펠릿의 견고성을 향상시킬 수 있습니다. - 배지를 디캔팅하고 10mL의 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 위아래로 피펫팅하여 크립트를 다시 중단합니다. 재현탁되면 명시야 현미경으로 10μL의 배지를 유리 슬라이드에 즉시 피펫팅하여 선와를 계수합니다.
- 슬라이드의 개별 끝에 두 개의 10μL 방울을 놓고 각 방울의 크립트 수를 계산합니다. 두 방울 사이의 숫자를 평균하여 10μL당 크립트 수를 결정합니다. 이 숫자에 100을 곱하면 1mL의 크립트 수를 얻을 수 있습니다.
참고: 정확한 계수를 위해 10μL의 크립트 현탁액은 재현탁 후 즉시 제거해야 합니다. 그렇지 않으면 지하실이 튜브 바닥으로 떨어져 계산이 부정확해집니다.
- 슬라이드의 개별 끝에 두 개의 10μL 방울을 놓고 각 방울의 크립트 수를 계산합니다. 두 방울 사이의 숫자를 평균하여 10μL당 크립트 수를 결정합니다. 이 숫자에 100을 곱하면 1mL의 크립트 수를 얻을 수 있습니다.
- 웰당 300-500개의 크립트를 플레이팅하는 것을 목표로 마우스 세척 배지에 재현탁된 적절한 양의 크립트를 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 10mL를 가져옵니다. 튜브를 300 x g 에서 5°C에서 4분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 작은 펠릿이 보여야 합니다.
- 파워 피펫으로 상청액을 제거합니다. P200 피펫을 사용하여 펠릿만 남기고 잔류 배지를 조심스럽게 제거합니다.
- 펠릿을 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스에 적당량 위아래로 천천히 피펫팅하여 재현탁합니다. 크립트 펠릿을 다시 매달아 놓을 때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 플레이트의 각 웰에 300-500 crypts/15 μL의 기저막 매트릭스를 플레이트합니다. 도금 후 조직 배양 접시를 뒤집고 37°C 인큐베이터에 10-20분 동안 넣습니다.
- 플레이트를 되돌리고 500 μL의 완전한 마우스 콜로노이드 배지를 각 웰에 추가합니다. 통과할 준비가 될 때까지 격일로 매체를 교체하십시오. 3-5 일마다 콜로노이드를 통과시킵니다.
3. 콜로노이드 통과
참고: 각 우물은 일반적으로 원래 우물의 밀도에 따라 1:4에서 1:6으로 통과할 수 있습니다. -20°C에서 적절한 양의 기저막 매트릭스를 꺼내 얼음 위에 올려 해동합니다. 콜로노이드는 두 번의 통과 후 실험에 사용할 수 있습니다. 콜로노이드를 통과시킬 때 오염을 방지하기 위해 생물학적 안전 캐비닛에서 단계를 수행합니다.
- 통과할 웰에서 배지를 제거합니다.
- 초기 격리 중에 발생할 수 있는 기저막 매트릭스 내에 파편이 있는 경우 다음 프로토콜을 사용하여 파편을 청소할 수 있습니다.
- Ca2+ 또는 Mg2+ 가 없는 DPBS에 얼음처럼 차가운 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 1mL를 각 웰에 추가합니다. 생물 안전 캐비닛에 5분 동안 그대로 두십시오.
- P1000 피펫을 사용하여 3 내지 7회 상하로 피펫팅하여 기저막 매트릭스를 파괴하고, 웰의 내용물을 15 mL 코니컬 튜브에 수집하였다. Ca 2+ 또는 Mg2+ 없이 DPBS에서 총 5-10mL의 0.1% BSA로 콜로노이드를 원심분리합니다. 0.1% BSA로 적절한 부피를 만드십시오.
- 150°C에서 5분 동안 4 x g 에서 원심분리하여 콜로노이드를 펠릿화하지만 파편은 펠릿화하지 않습니다.
- 피펫팅으로 DPBS를 디캔팅하고 펠릿을 남깁니다. 실온(RT) 효소 해리 시약 1mL를 넣고 3-5회 피펫팅합니다.
- 효소 해리 시약과 파쇄된 결장노이드가 포함된 15mL 원뿔형 튜브를 37°C 수조에 3-4분 동안 넣습니다.
- 수조에서 튜브를 꺼내 3-5회 피펫팅한 다음 마우스 세척 배지로 10mL를 가져옵니다. 3.6단계로 진행합니다.
- 초기 격리 중에 발생할 수 있는 기저막 매트릭스 내에 파편이 있는 경우 다음 프로토콜을 사용하여 파편을 청소할 수 있습니다.
- 500 μL의 RT 효소 해리 시약을 각 웰에 넣고 약 1분 동안 그대로 두었다가 3-7회 위아래로 피펫팅하여 기저막 매트릭스를 파괴합니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에 3-4분 동안 넣습니다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 P1000 피펫을 사용하여 3-7회 위아래로 피펫하여 콜로노이드를 해리합니다.
- 내용물을 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 최대 10mL를 만듭니다.
- 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 샘플을 원심분리합니다.
- 필요에 따라 파워 피펫과 P200 피펫을 사용하여 배지를 제거하여 원뿔형 튜브에 펠릿만 남도록 합니다.
- 얼마나 많은 웰을 도금해야 하는지에 따라 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 적절한 양의 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스에 재현탁합니다. 피펫팅할 때 기포가 생기지 않도록 하십시오. 웰당 15 μL의 기저막 매트릭스 방울에 콜로노이드 단편을 배치합니다.
- 크립트를 플레이트하고 조직 배양 플레이트를 뒤집은 다음 플레이트를 37°C 인큐베이터에 10-20분 동안 넣습니다.
- 마지막으로, 플레이트를 되돌리고, 500 μL의 완전한 마우스 콜로노이드 배지를 각 웰에 추가한다. 약 3-5일 후에 다시 통과할 수 있을 만큼 커질 때까지 격일로 배지를 교체하십시오.
4. 대장 세포의 최종 분화
- 위와 같이 콜로노이드를 계대배양하고, 500 μL의 완전한 마우스 콜로노이드 배지를 각 웰에 첨가한다.
- 계대배양 후 최소 48시간 후에 완전한 마우스 결장막 배지를 제거하고 분화 배지 500μL를 각 웰에 추가합니다(섹션 1 참조).
- 분화 배지로 콜로노이드를 48시간 동안 배양한 후 RNA 및 단백질 수집을 포함한 실험에 사용할 수 있습니다.
참고: 콜로노이드는 RNA를 수집하고 정량적 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 통해 줄기 세포 마커 및 세포 증식 마커인 Lgr5 및 Ki67의 발현을 각각 평가하여 분화를 평가할 수 있습니다. 말기 분화된 세포는 세포가 줄기와 더 유사한 전통적인 콜로노이드 배지에서 성장한 콜로노이드에 비해 상대적으로 낮은 Lgr5 및 Ki67의 발현을 가져야 합니다. 콜로노이드가 분화 배지에서 배양해야 하는 시간은 각 개별 실험실에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다. 프라이머 목록에 대해서는 보충 표 1을 참조하십시오.
5. 염증매개체로 분화된 대장균에 염증 유도
- 분화 배지와 함께 2-3일 동안 배양한 후 기존 배지를 제거하고 염증 매개체 배지 500μL를 각 웰에 추가합니다.
- RNA와 단백질을 수집하기 전에(또는 다른 다운스트림 매개변수를 평가하기 전에) 웰을 24-72시간 동안 배양합니다. 매일 매체를 변경하십시오.
6. 확립된 쥐 콜로노이드에서 파생된 장 상피 단층
참고: 쥐 장 상피 단층은 최소 2회 계대된 쥐 결장에서 파생됩니다. 3-5 일 안에 성공적인 단층 형성을 허용하려면 콜로노이드를 단일 세포로 분리하지 않는 것이 중요합니다. 효소에 의해 세포 클러스터로 해리된 단편화된 오가노이드는 성장에 이상적입니다.
- 실험을 시작하기 전에 모든 시약을 준비하십시오. 기저막 매트릭스를 얼음 위에서 해동합니다. 섹션 1에 설명된 대로 쥐 단층 배지를 준비합니다. 해동된 기저막을 차가운 쥐 단층 배지로 1:20으로 희석합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
- 멸균 겸자를 사용하여 0.4μm 투명 세포 배양 삽입물을 24웰 조직 배양 플레이트의 단일 웰에 넣습니다(표 재료). 삽입물의 모서리 갈래를 잡고 우물로 옮깁니다. 적절한 수의 세포 배양 삽입물을 배양에 사용할 수 있을 때까지 반복합니다.
알림: 기저막 매트릭스로만 추가 제어 웰을 코팅해야 합니다. 이러한 세포 배양 삽입물은 후속 단계(단계 6.3)에 기술된 바와 같이, 세포가 존재하지 않는 세포 배양 삽입물의 배경 저항성을 측정하기 위해 사용될 것이다. - P200 피펫을 사용하여 각 세포 배양 삽입물의 정점(상단) 표면을 150μL의 희석된 기저막 매트릭스로 덮습니다. 인서트의 멤브레인을 건드리지 않고 인서트 중앙에 피펫 팁을 놓고 용액을 부드럽게 배출합니다. 플레이트를 5%CO2 가 포함된 멸균된 37°C 인큐베이터에 최소 1시간 동안 놓습니다.
- 사용하기 전에 기저막 매트릭스를 부드럽게 제거하고 세포 배양 삽입물을 생물학적 안전 캐비닛에서 최소 10분 동안 건조시킵니다.
- 기저막 매트릭스를 제거하려면 24웰 플레이트를 45° 각도로 회전합니다. 한 손가락을 프롱 모서리에 대고 인서트를 고정하고 P200 피펫을 사용하여 인서트 바닥면을 따라 피펫 팁을 부드럽게 놓고 매트릭스를 제거합니다.
- 각각의 세포 배양 삽입물을 Ca2+ 또는 Mg2+ 없이 150 μL의 멸균 DPBS로 세척하여 임의의 과잉 잔류물을 제거한다.
- 10분 건조 후, 쥐 단층 배지 400 μL를 세포 배양 삽입물의 하단에 첨가하고 75 μL를 상단에 첨가한다. 모든 세포 배양 삽입물이 잠길 때까지 반복합니다. 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛에 그대로 두거나 필요할 때까지 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
- 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 성숙한(성장 3-5일차에 오가노이드) 장 콜로노이드의 24웰 플레이트를 제거하고 생물학적 안전 캐비닛 아래에 놓습니다. 멸균 팁을 사용하여 배지를 제거하고 1mL의 RT 멸균 DPBS(Ca 2+ 또는 Mg2+ 없음)로 각 웰을 세척합니다.
참고: 75-125개의 성숙한 콜로노이드의 개별 웰을 1:4의 비율로 분할합니다. - 멸균 팁을 사용하여 Ca2+ 또는Mg2+ 없이 DPBS를 제거하고, 계대할 각 웰에 500μL의 RT 효소 해리 시약을 배치하여 기저막 매트릭스의 각 플러그를 분해합니다.
- 각 웰을 위아래로 약 6-10회 피펫하여 플러그를 끊습니다. 플러그를 제거하기 위해 플레이트 바닥을 긁지 마십시오. 대신 24웰 플레이트를 45° 각도로 회전하고 피펫 끝을 플러그 가장자리에 놓고 부드럽게 빼냅니다.
- 24웰 플레이트를 멸균된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 3-4분 동안 다시 놓습니다.
- 플레이트를 제거하고, 생물학적 안전 캐비닛 아래의 각 웰에 대해 효소 해리 시약을 5-7회 위아래로 피펫팅합니다. 분리된 콜로노이드를 각 웰에서 멸균된 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 최대 10mL의 용량을 가져옵니다.
- 스윙 버킷 원심분리기에서 4°C에서 300 x g 의 5분 동안 부분적으로 분해된 콜로노이드를 원심분리합니다.
- 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 10mL 피펫을 사용하여 펠릿에서 상청액을 제거합니다. P200 피펫을 사용하여 남아 있는 배지를 제거합니다. 쥐 단층 배지에 콜로노이드 펠릿을 재현탁합니다. 플레이팅할 단편화된 콜로노이드의 각 세포 배양 삽입물당 75μL의 배지를 추가합니다.
- 75 μL의 콜로노이드 현탁액을 각 세포 배양 삽입물의 중앙에 추가합니다. 콜로노이드 현탁액을 각 웰에 추가하기 전에 75μL를 제거하기 전에 한두 번 위아래로 부드럽게 피펫하여 보다 균일한 도금을 가능하게 합니다.
- 세포 배양 삽입물이 있는 24웰 플레이트를 회전 플랫폼에 10분 동안 놓아 세포 배양 삽입물 전체에 균일한 분산을 추가로 허용합니다.
- 플레이트를 멸균된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 넣습니다.
- 다음날(Day 1), P200 피펫으로 배지를 3-5회 위아래로 피펫팅하여 부착되지 않은 콜로노이드 단편을 제거합니다. 부착된 장 세포를 방해하지 않도록 팁을 세포 배양 삽입물 내부와 함께 부드럽게 놓습니다. 부착되지 않은 모든 조각이 제거되는 것을 방지하므로 매체에 기포를 넣지 마십시오.
- 배지와 콜로노이드 혼합물을 즉시 제거하십시오. 모든 세포 배양 삽입물이 세척될 때까지 반복합니다.
- 150 μL의 미리 데워진 쥐 단층 배지를 각 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에 부드럽게 추가합니다. 400 μL의 따뜻해진 쥐 단층 배지를 새로운 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 멸균 집게를 사용하여 갈래를 잡고 세포 배양 삽입물을 새 플레이트로 옮깁니다. 합류 할 때까지 격일로 매체를 변경하십시오.
참고: 콜로노이드 조각은 도금 후 3-5일 후에 합류 단층을 형성해야 합니다.
7. 단층 배양 3 - 5일에 전압저항계를 사용하여 상피 단층의 순 저항 측정
알림: 젓가락 전극은 집게와 비슷하며 길이가 비대칭입니다. 프로브의 긴 팔은 기저측 전극이고 짧은 팔은 정점 전극입니다. 상기 프로브는 세포 배양 삽입물의 내부와 외부 사이에 삽입하기 어려울 수 있다. 삽입 시 프로브를 약간의 각도로 배치한 다음 프로브를 수직으로 곧게 펴면 프로브가 고착되는 것을 방지할 수 있습니다. 각 세포 배양 삽입물의 순 저항은 값에 영향을 줄 수 있으므로 유사한 각도로 읽어야 합니다.
- 전압계와 모든 시약을 생물학적 안전 캐비닛 안에 넣습니다.
- 전압저항계를 가장 가까운 AC 콘센트에 꽂고 전극 프로브의 플라스틱 모듈식 커넥터를 전면 디스플레이의 INPUT 잭에 꽂습니다.
- 전압저항계를 45° 각도로 배치하려면 장비 뒷면에 있는 금속 암이 제자리에 고정될 때까지 바깥쪽으로 돌립니다.
- 이제 전면 디스플레이의 전원 스위치를 위로 돌려 전압계를 켭니다. 마지막으로 스위치를 OHMS 쪽으로 뒤집어 이 메트릭에 판독값을 표시합니다.
- 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 제거하고 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛에 평평하게 놓습니다. 경상피 전기 저항(TEER)은 온도에 민감합니다. TEER을 읽기 직전에만 플레이트를 제거하십시오.
- 전극 프로브를 예열된 70% 에탄올로 30초에서 1분 동안 멸균합니다. 프로브를 제거하고 뒤집어서 1-2회 튕겨 과도한 에탄올을 제거합니다. 프로브를 약 30초 동안 자연 건조시킵니다.
- 프로브에 남아 있는 에탄올은 미리 데워진 마우스 세척 배지로 세척합니다.
주의: 프로브의 위쪽에 남아 있는 에탄올 방울이 세포 배양 삽입물에 떨어지지 않도록 하십시오. 에탄올을 배지로 세척 할 때 배지가 멸균 에탄올 필드 위로 올라가지 않도록하십시오. 이로 인해 오염된 배지가 세포 배양 삽입물에 들어갈 수 있습니다. - 프로브를 세포 배양 삽입물에 수직으로 잡습니다. 기저측 전극(프로브의 긴 끝)이 24웰 플레이트의 바닥에 닿을 때까지 세포 배양 삽입물의 바깥쪽에 삽입합니다. 정점 전극(프로브의 짧은 끝)을 세포 배양 삽입물에 밀어 넣습니다. 두 전극의 거리를 우물에서 우물로 바꾸지 마십시오. 이것은 TEER 측정에 영향을 미칩니다.
- TEER을 읽기 전에 정점 전극이 세포 배양 삽입물의 베이스에 닿지 않는지 확인하십시오. 백그라운드 컨트롤 세포 배양 삽입물로 시작하고 값을 기록합니다. 값은 전압계 전면에 자동으로 디지털 방식으로 표시됩니다.
- 각 세포 배양 삽입물에 대해 7.5-7.6단계를 반복합니다.
참고: 세포 배양 삽입물 사이에 다른 실험 조건이 존재하는 경우 각각의 새로운 조건 사이에 프로브를 멸균합니다. 7.1 단계에서 시작하여 단계를 숫자로 진행합니다. - 모든 TEER 측정이 기록되면 24웰 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.
- 350 Ω 이상의 순 값은 단층 형성을 나타냅니다. 단층 형성이 이루어질 때까지 다음 날에 다시 반복하십시오.
참고: 일반적으로 1,000 Ω 이상의 값은 3일차에 캡처할 수 있지만 시간이 지남에 따라 모두 약 350 Ω 더 낮은 숫자로 수렴됩니다.
8. 전압저항계의 순 저항 측정을 사용하여 TEER 계산
참고: 콜로노이드의 성공적인 단층 형성은 115 Ω·cm2보다 큰 TEER 측정값을 제공합니다.
- 개별 순 저항 값을 취하고 배경에서 순 저항을 뺍니다. 기저 매트릭스 멤브레인으로 코팅된 세포 배양 삽입물은 약 100 Ω의 순 판독값을 제공합니다.
- 배경에서 뺀 순 저항 측정값에 세포 배양 삽입물의 표면적을 곱합니다. 24-웰 세포 배양 삽입물은 0.33cm2의 표면적을 갖는다.
- 값이 115 Ω·cm2 이상인 경우 다운스트림 실험 분석으로 진행합니다.
9. 염증 매개체로 상피 단층에서 염증 유도
- 성공적인 단층이 형성되면 배양의 기초 쪽에 있는 배양에 염증 매개체를 추가합니다. 단계 1.9에 설명된 대로 염증 매개체 단층 배지를 준비하고 새로운 24웰 플레이트의 각 웰에 400μL를 추가합니다.
- 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에서 배지를 제거하고, Y-27632가 없는 뮤린 단층 배지 150 μL를 첨가한다. 이 쪽에 염증 매개체를 보충하지 마십시오. 그러나 세포 사멸이 과도하다고 생각되면 Y-27632를 미디어에 그대로 두십시오. 이는 최종 사용자가 결정해야 합니다.
- 세포 배양 삽입물을 새로운 24-웰 플레이트로 옮기고, 염증 매개체 단층 배지가 보충된 웰에 넣는다.
- 실험에 따라 24-72 시간 동안 염증 매개체로 단층을 자극하십시오.
- 이 염증 모델을 사용하여 약물 반응을 테스트하려면 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에 있는 단층 배지에 선택한 약물을 보충합니다. 약물은 약물의 작용 메커니즘 및 평가할 다운스트림 매개변수에 따라 실험의 어느 지점에서나 추가할 수 있습니다.
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Representative Results
3D 장 결장 배양 시스템은 장 점막 항상성에 대한 상피의 본질적인 기여를 연구하는 데 매우 중요한 도구입니다. 설명된 프로토콜은 8주령에 C57BL/6J(WT) 마우스에서 크립트를 분리하고 여러 다운스트림 애플리케이션을 위해 조작할 수 있는 장기 콜로노이드 배양 시스템을 구축하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 기저막 매트릭스에서 크립트를 분리하고 도금할 때, 크립드는 명시야 현미경으로 시각화할 때 구조가 조밀하고 다세포로 나타납니다. 그것들은 모양이 구형이거나 길쭉하고 원통형일 수 있으며, 생체 내 장 구조 내에서 일반적으로 관찰되는 단일 선와와 같은 구조와 유사합니다(그림 1A). 1일차까지 대부분의 선와가 조밀한 구형 구조를 형성하고 몇 개의 콜로노이드가 상피 세포가 없는 내부 내강(빈 공간)을 발달시키기 시작합니다(그림 1B). 다음 며칠 동안 계속 성장함에 따라 콜로노이드의 직경은 계속 증가하고 콜로노이드의 내강은 더 명확해집니다(그림 1C). 5일째까지 각 콜로노이드는 직경이 약 100-250μm이며 상피 줄기 세포의 얇은 층으로 둘러싸인 크고 두드러진 내강을 형성합니다(그림 1D). 이 시점에서, 콜로노이드는 패시징을 위해 효소적으로나 기계적으로 파괴된다. 두 번의 통과 후 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.
DSS 처리된 마우스의 결장 긁힘에서 관찰된 대사 변화가 동일한 DSS 체계의 마우스에서 유래한 콜로노이드에 유지되는지 평가하기 위해 8주령 WT 마우스를 임 의로 음용수에서 2% DSS로 처리했습니다. 연령 매칭 및 성별 매칭 WT 대조군 동물에게 DSS 없이 임의 로 식수를 제공했습니다. 7일 후, 마우스를 희생시키고, 대조군(n=3, 수컷) 및 DSS-처리된 동물(n=3, 수컷) 모두의 결장으로부터 크립트를 분리하여 콜로노이드를 확립하였다. 2개의 계대 후, 단백질을 콜로노이드의 각 세트로부터 분리하고, 미토콘드리아 생물 발생의 마스터 조절 단백질인 과산화소체 증식제-활성제 수용체-감마 보조활성제-1α(PGC1α)의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가하였다(보충 그림 1). DSS 처리된 마우스로부터 확립된 콜로노이드와 대조군 마우스로부터 확립된 콜로노이드를 비교했을 때, PGC1α 발현에는 유의한 차이가 없었으며, 이는 이러한 콜로노이드 배양 방법론이 마우스에서 관찰되는 생체 내 대사 변화를 적절하게 반영하지 않는다는 것을 시사한다15.
PGC1α가 장 염증성 손상 동안 미토콘드리아 생물발생을 개시하지 못하는 것은 주로 분화된 결장 상피에 국한된다15,19. 생체 내에서 관찰된 변화를 반영하기 위해 우리는 콜로노이드를 보다 차별화된 상태로 향하게 하기로 결정했습니다. 이러한 이동을 유도하기 위해 콜로노이드는 처음에 전통적인 콜로노이드 배지와 함께 배양되었습니다. 24시간 내지 48시간 후, 콜로노이드는 추가 48시간 동안 분화 배지로 전환되었습니다. 분화하는 동안, 소수의 콜로노이드가 구형 구조에서 배상세포와 결장세포가 풍부한 신진 구조로 전환되었다17(그림 2A,B). WRN 보충 배지에서 성장한 콜로노이드는 빠르게 분열하는 Lgr5+ 줄기 세포로 농축되었습니다. Lgr5+ 줄기 세포와 다른 증식 세포가 모두 분화 동안 세포 주기를 빠져나갔는지 확인하기 위해 qPCR을 통해 mRNA 수준을 분석했습니다. Lgr5(97%, p = 0.0023) 및 Ki67(75%, p = 0.0007) 수준 모두에서 현저한 하향 조절이 전통 배양 환경에서 자란 콜로노이드(n = 6)와 비교하여 분화된 콜로노이드(n = 6)에서 관찰되었습니다. 보충 그림 2A, B). 또한 분화된 콜로노이드는 주로 점액을 분비하는 잔 세포로 구성될 것으로 예상할 수 있습니다. 또한, 사실, MUC2는 전통적으로 성장한 콜로노이드에 비해 분화된 콜로노이드에서 거의 2배 상향 조절되었습니다(n = 3, p = 0.0433, 보충 그림 3). 종합하면, 이러한 데이터는 콜로노이드가 성공적으로 분화되었고 다운스트림 실험을 위한 준비가 되었음을 시사합니다. 다음에, 염증 매개체를 프로토콜의 섹션 5에 기재된 바와 같이 분화 배지에 첨가하였다. 단백질 및 RNA는 분석을 위해 염증 매개체를 도입한 후 최대 72시간까지 수집하였다. 그러나, 72 시간에, 증가 된 세포 사멸이 때때로 관찰되었다.
분화된 결장노이드에 대한 염증 매개체의 도입이 인간 IBD 및 쥐 대장염의 급성 모델 모두에서 관찰된 미토콘드리아 생물발생 실패를 모방할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, PGC1α 및 전사 인자 A, 미토콘드리아(TFAM)의 단백질 발현을 72시간 동안 염증 매개체로 처리된 분화된 결장노이드(n = 5)에서 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가했습니다. PGC1α 발현은 대장염의 쥐 모델에서 감소하는 것으로 나타났으며, 뿐만 아니라 인간 IBD15. 미토콘드리아 게놈의 전사와 복제를 모두 유도하는 단백질인 TFAM도 대장염의 쥐 모델에서 감소하는 것으로 나타났으며 인간 IBD15,20에서 유전자 발현이 감소하는 것으로 나타났습니다. 우리는 이러한 염증 매개체에 대한 노출 72시간 후 분화된 결장에서 PGC1α(50.4%, p = 0.0442) 및 TFAM (88.9%, p = 0.004) 발현 모두에서 유사한 하향 조절을 관찰했습니다(그림 3). 종합적으로, 이것은 사이토카인으로 분화된 콜로노이드를 처리하는 것이 시험관 내에서 미토콘드리아 역학을 연구하는 이상적인 모델임을 시사합니다.
3D 콜로노이드 배양 환경에서 다양한 세포 및 분자 기능을 검사할 수 있지만, 장벽 기능, 숙주-병원체 상호작용 및 경구 흡수 치료제가 염증에 미치는 영향을 평가할 때 2D 단층 배양 시스템이 우수합니다21,22. 손상되지 않은 장벽을 가진 융합 세포의 연속 층을 형성하면 다양한 생물학적 또는 화학적 제제를 세포의 정점 및/또는 기저부에 쉽게 배치할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 두 번 계대된 기존 WT 콜로노이드에서 2D 단층 배양을 설정할 수 있습니다. 효소 및 기계적으로 파괴된 콜로노이드는 기저막 매트릭스로 코팅된 세포 배양 삽입물에 도말됩니다. 초기 도금 시, 단편화된 콜로노이드는 15 내지 150개 세포 범위의 세포 클러스터에 나타난다(도 4A). 3일째까지 세포는 평평해지기 시작하고 세포 배양 삽입물을 천천히 덮기 시작하여 일반적으로 합류도에 도달합니다(그림 4B). 다음 며칠 동안 단층은 계속 성장하여 TEER로 정량적으로 측정할 수 있는 지속적인 장벽을 형성합니다(그림 4C,D). 흥미롭게도 TEER 측정은 3일차부터 5일차까지 변동합니다. 단층은 넓은 범위(200-800 Ω·cm 2)에서 초기에 더 높은 값을 갖지만 이러한 값은 5일째(115-150 Ω·cm2, 그림 5A)까지 더 낮은 숫자로 천천히 수렴합니다. 단층이 정상 상태에 도달하면 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.
염증에 대한 콜로노이드 유래 단층의 상피 반응을 특성화하기 위해, 염증 매개체를 48시간 동안 세포의 기저부(삽입물 외부)에 배치했습니다. RNA를 추출하고, 다양한 줄기 및 세포 분화 마커와 접합 단백질의 mRNA 수준을 qPCR을 통해 분석하였다. Lgr5는 어느 조건에서도 검출되지 않았지만, 또 다른 줄기 세포 마커인 mTERT는 처리되지 않은 대조군에 비해 염증이 있는 단층에서 거의 60% 감소했습니다(보충 그림 4A). 다음으로, 분화된 세포 유형의 두 가지 마커인 Muc2와 알칼리성 포스파타제(Alpi)의 발현을 분석했습니다. 두 mRNA 전사체 모두 대조군 세포에 비해 염증이 있는 단층에서 더 낮았다 (보충 도 4A). 줄기 세포와 유사분열 후 세포 모두 결장 염증 동안 일반적으로 감소합니다23,24,25, 이 연구에서 얻은 단층 모델에서도 유사한 반응이 관찰되었습니다.
단층 시스템의 장점은 장벽 반응을 평가할 수 있다는 것입니다. 면역 자극 상태에서 장벽이 손상되었는지 여부를 확인하기 위해 48시간 후에 TEER 값을 측정했습니다. 대조군 단분자층(n=2)에 대한 TEER 값은 평균 129.16 Ω·cm2였지만 염증이 있는 단분자층에서는 평균 98.54 Ω·cm2로 유의하게 떨어졌습니다(p = 0.0087). 염증 상태에서 장벽이 손상되었음을 추가로 확인하기 위해 세 가지 다른 밀착 접합 마커인 Zo-1, Occludin 및 Claudin에 대한 mRNA 수준을 평가했습니다. 세 가지 마커 모두 염증이 없는 마커에 비해 염증 상태의 수준이 감소했습니다(보충 그림 4B). 총체적으로, 이들 데이터는 장벽 기능장애가 염증이 있는 단층에 존재하고, IBD 병인 동안 관찰된 장벽 기능장애를 모방한다는 것을 보여준다.
그림 1: 장기 콜로노이드 배양을 위한 쥐 선와(murine crypt)의 초기 분리. (A) 0일째에 300-500개의 선와를 기저막 기질에 도말하고(도금 후 5시간 후에 얻은 사진), (B) 1일, (C) 3일 및 (D) 5일. 5일째에 콜로노이드를 통과할 준비가 되었습니다. 배율 = 10x; 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전통적인 콜로노이드 배양에서 최종적으로 분화된 콜로노이드의 확립. 분화 배지는 쥐 콜로노이드를 통과시킨 후 48시간 후에 콜로노이드 상에 놓였습니다. (A) 24시간 및 (B) 48시간 후, 콜로노이드는 말단적으로 분화된 세포로 농축됩니다. 배율 = 10x; 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 염증 매개체로 처리된 쥐 분화 콜로노이드에서 PGC1α 및 TFAM 단백질 발현. 염증 매개체가 보충된 배지를 분화된 콜로노이드에 놓고 노출 후 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 단백질을 수집했습니다. (A) PGC1α의 단백질 발현은 72 h에 걸쳐 전체적으로 유의한 감소(p = 0.0442)를 보였고, TFAM은 72 h에서 염증 매개체에 노출된 후 유의하게 하향 조절되었고(p = 0.004), (B) ANOVA에 의해 분석되었을 때 24 h, 48 h 및 72 h에서 단백질 발현의 하향 추세가 있었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 기존 콜로노이드에서 단층의 형성 및 성장. 효소 및 기계적으로 파괴된 콜로노이드를 기저막 매트릭스로 코팅된 세포 배양 삽입물에 도말했습니다. 초기 도금 시, 단편화된 콜로노이드는 (A) 세포 클러스터에 나타났고, (B) 3일째에는 평평해지기 시작하여 세포 배양 삽입물을 천천히 덮었습니다. (C) 5일째 및 (D) 7일째에, 단일층은 TEER에 의해 정량적으로 측정될 수 있는 연속적인 장벽을 형성하기 위해 계속 성장하였다. 배율 = 10x; 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 콜로노이드 유래 단층 및 염증 단층을 설정하기 위한 TEER 값. (A) TEER 값은 3일차부터 5일차까지 전압저항계를 사용하여 측정되었습니다. 단층은 넓은 범위에서 초기에 더 높은 값을 가졌지 만 5 일째까지 천천히 더 낮은 숫자로 수렴했습니다. 단층이 정상 상태에 도달하면 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다. (B) TEER 값은 염증이 없는 대조군(n = 2)에 비해 염증이 있는 단층(n = 2)에서 더 낮았습니다. 대조군 단분자층의 평균 TEER은 129.16ohms·cm2였고, 염증이 있는 단분자층의 TEER은 t-test를 사용하여 분석했을 때 평균 98.54 Ω·cm2로 유의하게 낮았습니다(p = 0.0087). **p < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 용액 조성 표. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: WT 대조군 및 2% DSS 처리된 마우스로부터 분리된 전통적인 콜로노이드 배지에서 성장한 쥐 콜로노이드에서의 PGC1α 단백질 발현. 콜로노이드는 7일 후 8주령 WT 대조군 마우스와 2% DSS 처리된 마우스 모두에서 유래되었습니다. 단백질은 도금 후 4일째에 2회 계대 배양된 콜로노이드로부터 분리되었습니다. unpaired t-test로 분석하였을 때 7일 동안 2% DSS에 노출된 마우스와 비교하여 대조군 마우스에서 유래된 콜로노이드에서 PGC1α 단백질 발현(p =0.9996)에 차이가 없었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 분화된 콜로노이드에서 감소된 Lgr5 및 Ki67 mRNA 발현. 48시간 전에 계대배양된 쥐 콜로노이드는 RNA 및 cDNA 합성을 분리하기 전에 48시간 동안 분화 배지에 노출되었습니다. mRNA 수준은 qPCR을 통해 결정되고 비교 CT 방법으로 분석되었습니다. (A) Lgr5 및 (B) Ki67은 t-test를 사용하여 통계적으로 분석했을 때 분화된 콜로노이드에서 유의하게 감소했습니다(p=0.0023, p=0.0007). 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.**p < 0.005. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 분화된 쥐 콜로노이드에서 증가된 점액 분비 잔 세포. 48시간 전에 계대된 쥐 콜로노이드는 48시간 동안 분화 배지에 노출되었습니다. 세포를 RIPA 완충액에서 용해시키고, 단백질을 웨스턴 블롯 분석에 의해 시각화하였다. (A) MUC2 발현은 미분화 콜로노이드에 비해 분화된 콜로노이드의 각 세트에서 증가하였다. (B) 분화 조건에서 MUC2 단백질의 거의 2배 변화가 관찰되었으며, 이는 t-검정(p =0.0433)을 사용하여 분석했을 때 유의했습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. *p < 0.05. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 염증 매개체로 처리된 단층에서 줄기 및 분화 마커와 단단한 접합 마커의 발현 감소. 쥐 콜로노이드 유래 단층(5일)을 48시간 동안 염증 매개체에 노출시키고, RNA를 연속적으로 수집하고, cDNA를 합성했습니다(n = 2). 줄기, 분화 및 접합 마커의 mRNA 수준을 qPCR을 통해 결정하고 비교 CT 방법으로 분석했습니다. (A) 줄기 세포 마커인 Lgr5는 어느 조건에서도 검출되지 않았지만 mTERT 는 염증성 조건에서 실질적으로 감소했습니다. 배 세포 마커인 Muc2와 결장세포 마커인 Alpi는 처리되지 않은 단층과 비교하여 염증이 있는 단층에서 모두 감소했습니다. (B) 밀착 접합 마커인 Zo-1, Ocludin 및 Claudin은 모두 대조군에 비해 염증 처리된 단층에서 더 낮았습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 프라이머 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
오가노이드 개발은 과학계가 접시에 담긴 동물이나 인간의 세포 구조와 기능을 부분적으로 요약할 수 있는 능력으로 체외에서 장기 시스템을 연구하는 방식에 혁명을 일으켰습니다. 또한, 질병이 있는 인간에게서 파생된 오가노이드 시스템은 치료 의사 결정을 안내할 수 있는 개인화된 의학을 위한 유망한 도구를 제공합니다. 여기에서는 잘 작동하는 크립트 격리 프로토콜에 대해 설명하고 도금 전에 격리에서 과도한 파편을 청소할 수 있는 주요 단계를 소개합니다. 또한 이 과정에서 종종 간과되는 주요 세부 사항, 즉 도금을 위한 크립트를 정확하게 계산하는 능력에 대해 설명합니다. 결장세포가 확립되면 IBD 동안 장 상피의 변화를 연구하는 능력을 향상시킬 수 있는 세포 분화 또는 단층 형성을 허용하는 주요 조작에 대해 간략하게 설명합니다.
포유류의 결장 상피에 있는 crypt-villus 축은 서로 다른 기능을 가진 서로 다른 세포 유형으로 구성된 복잡한 구조입니다. 이 축의 유지는 내인성 및 외인성 세포 인자에 달려 있으며, 이는 함께 상피 항상성을 유지하는 데 도움이 된다18. 우리는 전통적인 배지에서 성장한 쥐 콜로노이드가 생체 내에서 볼 수 있는 줄기 세포와 말기 분화 세포의 집합체와 달리 주로 줄기 세포를 반영한다는 점에 주목했습니다. 또한, 이러한 방식으로 성장하고 유지되는 쥐 콜로노이드는 평평한 단층과 반대되는 원형 구조입니다. 이러한 차이는 시험관 내에서 장 질환을 연구하려는 우리의 시도에 잠재적인 영향을 미칩니다. 특히, 우리는 오가노이드를 사용하여 장벽 기능의 변화와 염증이 말기 분화된 장 상피 세포에 미치는 영향을 연구하는 능력에 한계가 있습니다.
여기에서 우리는 결장형을 성장시키기 위한 쥐 선와를 분리하는 것뿐만 아니라 장 상피 생리학 및 염증에 대한 상피 반응을 연구하기 위해 이러한 결장류를 조작하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 만능 줄기 세포와 말기 분화 세포의 구배를 촉진하는 여러 외인성 인자 중에는 선와가 풍부하고 줄기 세포 건강을 촉진하는 Wnt 표준 경로가 있습니다. Wnt 신호전달은 줄기세포가 말단적으로 분화된 세포로 진화하는 것과 동시에 선와축의 끝에서 감소한다26. 우리는 결장 세포의 말단 분화를 허용하는 프로토콜을 설명했습니다. 다른 사람들과 마찬가지로 성장 배지에서 Wnt를 제거하여 감별하지만 더 낮은 농도의 R-스폰딘(500ng/mL 대 1μg/mL R-스폰딘)을 사용합니다17. 놀랍게도, R-스폰딘의 50% 감소는 오가노이드의 성공적인 분화에 영향을 미치지 않습니다. 더 낮은 농도로 분화하는 능력은 생체 내 생리적 환경과 더 유사할 수 있는 덜 인공적인 시스템을 구축하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 유한한 말단 분화(보충 그림 2 및 보충 그림 3)와 세포 불멸을 유지할 수 없게 만들지만, 그럼에도 불구하고 결장세포, 장 내분비 세포 및 배 세포를 포함한 말단 분화된 상피가 IBD 및 기타 질병 상태에 미치는 생리학적 기여를 더 잘 이해하는 데 유용한 방법입니다. 또한, 우리는 IBD 환자에서 전통적으로 증가한 이 배지에 특정 사이토카인을 보충하면 분화된 오가노이드 시스템이 염증 상태로 향하게 된다는 것을 보여줍니다. 72시간 동안 염증성 사이토카인으로 처리된 분화된 콜로노이드는 대장염 및 인간 IBD의 다른 확립된 모델에서 나타난 대사 소견 중 일부를 보다 밀접하게 반영합니다(그림 3). 또한, 이러한 방식으로 처리된 분화된 콜로노이드는 분화된 상피에 대한 세포 항상성에 대한 염증의 영향을 더 잘 반영할 가능성이 있습니다. 우리는 또한 생체 내 장벽 기능을 분석할 수 있도록 상피의 정점 및 기저부 측면을 모두 형성할 수 있는 단층을 개발하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 이 시스템은 분화할 필요 없이 장벽 기능 장애의 메커니즘을 연구하고 치료를 위한 새로운 치료 표적을 육성하는 데 유용합니다.
위에서 설명한 프로토콜과 관련된 몇 가지 제한 사항과 잠재적인 함정에 유의해야 합니다. 지하실의 성공적인 분리와 결장류의 발달은 각 동물의 지하실 수확량, 지하실 계산의 정확성 및 준비의 청결도에 의해 제한 될 수 있습니다. 재현탁 후 분리된 선와를 세는 속도, 밑에 있는 근섬유에서 선와가 기계적으로 분리되는 변화, 세척 횟수 및 원심 회전은 성공적인 결장막 배양에 기여합니다. 또한, 2D 단층 배양을 위한 계대배양 또는 플레이팅 중에 오가노이드를 단일 세포로 완전히 분리하지 않는 것이 중요합니다. 30 내지 50 세포의 클러스터는 배양이 장기 배양을 위해 전파되도록 하는 데 이상적이다. 위의 프로토콜은 잠재적인 문제가 있는 영역과 이러한 문제를 해결하기 위한 선택적 추가 단계를 설명합니다. 궁극적으로, 프로토콜은 각 동물의 변이뿐만 아니라 스킬 세트 및 기동(즉, 흔들림)의 내재적 가변성으로 인해 격리를 수행하는 개인에 의한 최적화를 요구할 수 있다. 최종 사용자는 IBD에서 발견되는 유전적 및 분자적 다양성을 포착하기 위해 추가적인 최적화가 필요할 수 있습니다.
궁극적으로, 콜로노이드 시스템은 생체 내에서 인간 생리학 및 질병의 주요 측면을 요약하는 데 매우 유용한 도구이지만, 이 시스템은 궁극적으로 인간 질병의 모든 측면을 연구하는 능력에 한계가 있습니다. 콜로노이드 발달을 위한 전통적인 방법은 줄기 세포 역학의 주요 측면을 설명했습니다. 그러나, 이러한 발견은 종종 숙주 상피 내의 말단적으로 분화된 세포에서의 발견을 적절하게 반영하지 못한다. 이 연구에 요약된 전략은 연구자에게 적절하게 사용될 경우 염증 동안 장 상피 구조 및 기능의 주요 측면을 밝힐 수 있는 오가노이드 조작을 위한 비교적 빠르고 저렴한 모델을 제공합니다.
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Disclosures
기고 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 보조금 R01DK120986 (KPM에)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
References
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