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Biology

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64804
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 2,3
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.

Abstract

O epitélio intestinal desempenha um papel essencial na saúde humana, fornecendo uma barreira entre o hospedeiro e o meio externo. Esta camada celular altamente dinâmica fornece a primeira linha de defesa entre as populações microbiana e imune e ajuda a modular a resposta imune intestinal. A ruptura da barreira epitelial é uma característica da doença inflamatória intestinal (DII) e é de interesse para direcionamento terapêutico. O sistema de cultura colonóide tridimensional é um modelo in vitro extremamente útil para o estudo da dinâmica das células-tronco intestinais e da fisiologia das células epiteliais na patogênese das DII. Idealmente, o estabelecimento de colonoides a partir do tecido epitelial inflamado de animais seria mais benéfico na avaliação das influências genéticas e moleculares na doença. No entanto, mostramos que alterações epiteliais in vivo não são necessariamente retidas em colonoides estabelecidos em camundongos com inflamação aguda. Para abordar essa limitação, desenvolvemos um protocolo para tratar colonoides com um coquetel de mediadores inflamatórios que são tipicamente elevados durante a DII. Embora este sistema possa ser aplicado de forma ubíqua a várias condições de cultura, este protocolo enfatiza o tratamento tanto em colonóides diferenciados quanto em monocamadas bidimensionais derivadas de colonoides estabelecidos. Em um ambiente de cultura tradicional, os colonoides são enriquecidos com células-tronco intestinais, proporcionando um ambiente ideal para estudar o nicho de células-tronco. No entanto, esse sistema não permite uma análise das características da fisiologia intestinal, como a função de barreira. Além disso, os colonoides tradicionais não oferecem a oportunidade de estudar a resposta celular de células epiteliais terminalmente diferenciadas a estímulos pró-inflamatórios. Os métodos aqui apresentados fornecem uma estrutura experimental alternativa para abordar essas limitações. O sistema de cultura monocamada bidimensional 2-dimensional também oferece uma oportunidade para triagem terapêutica ex vivo. Esta camada polarizada de células pode ser tratada com mediadores inflamatórios na face basal da célula e concomitantemente com terapêutica putativa apicamente para determinar sua utilidade no tratamento da DII.

Introduction

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica, remitente, recidivante, caracterizada por episódios de inflamação e quiescência clínica. A etiologia das DII é multifatorial, mas as principais características da doença incluem função de barreira defeituosa e aumento da permeabilidade do epitélio intestinal, além de cascatas de sinalização pró-inflamatórias ativadas dentro do compartimentoepitelial1,2. Vários modelos in vitro e in vivo têm sido utilizados para recapitular a resposta epitelial durante a DII, incluindo cultura celular e modelos murinos deinflamação3. No entanto, todos esses sistemas apresentam deficiências importantes que limitam sua capacidade de recapitular as alterações epiteliais durante aDII4. A maioria das linhagens celulares usadas para estudar a DII são transformadas, têm a capacidade de formar uma monocamada e podem diferenciar3, mas intrinsecamente se propagam de forma diferente das células epiteliais intestinais não transformadas no hospedeiro. Vários modelos murinos de inflamação são usados para estudar DII, alguns dos quais incluem modelos knockout, modelos infecciosos, modelos inflamatórios químicos e modelos de transferência de células T 5,6,7,8. Embora cada um possa estudar certos aspectos etiológicos da DII, como predisposições genéticas, disfunção de barreira, desregulação imunológica e microbioma, eles são limitados em sua capacidade de estudar a natureza multifatorial da doença.

Os organoides intestinais, incluindo enteróides e colonoides, têm se estabelecido na última década como um modelo in vitro útil para estudar não apenas a dinâmica das células-tronco intestinais, mas também seu papel que a integridade da barreira e a função do epitélio intestinal desempenham na homeostase e doença intestinal. Essas entidades têm contribuído significativamente para o nosso entendimento da patogênese da DII9 e têm aberto novas oportunidades para a medicina personalizada. Colonoides, ou culturas de tecidos auto-organizáveis derivados de células-tronco do cólon, têm sido desenvolvidos a partir de tecido murino e humano, em um processo que permite que células-tronco localizadas dentro de criptas intestinais se propaguem e sejam mantidas indefinidamente10. O nicho de células-tronco in vivo depende de fatores extracelulares para suportar seu crescimento, notadamente as vias canônicas de sinalização Wnt e osteomorfogênicas11. A adição desses fatores promove a saúde e a longevidade dos colonoides, mas também direciona a cultura para um estado semelhante ao das células-tronco que não reflete a arquitetura celular epitelial in vivo, que consiste tanto em células auto-renovadoras quanto terminalmente diferenciadas12,13. Enquanto a funcionalidade do epitélio intestinal é dependente do crosstalk contínuo entre o compartimento de células-tronco e células diferenciadas, a capacidade de ter ambos em um sistema de cultura colonóide é bastante limitada. Apesar dessas limitações, o sistema de cultura organoide continua sendo o padrão-ouro para o estudo das propriedades intrínsecas do epitélio ex vivo. No entanto, estratégias alternativas de cultura podem precisar ser consideradas para responder à questão científica em questão.

Foi demonstrado que camundongos em um regime contínuo de 7 dias de sulfato de sódio de dextran (DSS) desenvolvem inflamação epitelial e disfunção de barreira14. Além disso, a falha na biogênese mitocondrial e a reprogramação metabólica dentro do epitélio intestinal, que têm se mostrado evidentes na DII humana, também foram capturadas neste modelo de colite por DSS15. No entanto, nossos dados preliminares demonstram que as características de falha da biogênese mitocondrial não são retidas em colonoides derivados das criptas de animais tratados com DSS (Figura 1 Suplementar). Assim, métodos alternativos de cultura devem ser usados ao examinar como a inflamação conduz alterações epiteliais durante a inflamação intestinal murina. Aqui, delineamos um protocolo que desenvolvemos que descreve 1) como isolar criptas de todo o tecido colônico para o estabelecimento de colonoides murinos, 2) como diferenciar terminalmente essa população celular para refletir a população celular como ela está in vivo, e 3) como induzir inflamação neste modelo in vitro . Para estudar as interações medicamentosas dentro do epitélio inflamado, desenvolvemos um protocolo para estabelecer monocamadas 2-dimensonais (2D) de colonoides murinos que podem ser tratadas basalmente com mediadores inflamatórios e tratadas apicamente com terapias medicamentosas.

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Protocol

Toda a experimentação com tecidos murinos aqui descrita foi aprovada pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade de Pittsburgh e conduzida de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Pesquisa e Cuidado Animal da Universidade de Pittsburgh e UPMC.

1. Preparação para a cultura

NOTA: Todos os reagentes estão listados na seção Tabela de materiais e todas as composições de solução podem ser encontradas na tabela de composição da solução (Tabela 1).

  1. Preparar o meio de lavagem do rato, conforme descrito na Tabela 1. Conservar a 4°C por até 2 meses.
  2. Prepare o buffer de isolamento de criptografia 1 (CIB1) conforme descrito na Tabela 1. Conservar a 4°C por até 2 meses.
    CUIDADO: O ditiotreitol (TDT) é considerado perigoso pelo Padrão de Comunicação de Perigos da OSHA devido à toxicidade aguda potencial se ingerido e danos à pele e aos olhos se essas áreas forem expostas a ele. Luvas de proteção, proteção ocular e proteção facial devem ser usadas ao manusear esse produto químico.
  3. Prepare o buffer de isolamento de criptografia 2 (CIB2) conforme descrito na Tabela 1. Conservar a 4°C por até 2 meses.
  4. Preparar meio condicionado com L-WRN de acordo com protocolo previamente publicado16.
  5. Preparar o meio colonóide completo conforme descrito na Tabela 1. O meio de crescimento colonóide completo pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.
  6. Preparar o meio de diferenciação conforme descrito na Tabela 1. Esse protocolo foi modificado a partir de um trabalho publicadoanteriormente17. O meio de diferenciação pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.
  7. Preparar o meio mediador da inflamação conforme descrito na Tabela 1. Esse protocolo foi modificado a partir de um trabalho publicadoanteriormente18. O meio mediador da inflamação pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.
  8. Prepare o meio de monocamada murino. Omitir Y-27632 ao desafiar as monocamadas com fatores inflamatórios e/ou medicamento(s). O meio monocamada murino pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.
  9. Preparar o mediador de inflamação meio monocamada. O meio mediador da inflamação monocamada pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.

2. Isolamento de criptas do tecido colônico murino

NOTA: Transfira o tecido no gelo. Retire a quantidade apropriada de matriz de membrana basal do armazenamento de -20°C e descongele no gelo. Cada poço de 24 é revestido com 15 μL de matriz de membrana basal. Preparar CIB1, CIB2 e meio de crescimento colonóide completo conforme descrito na seção 1.

  1. Eutanasiar um camundongo C57BL/6J (6-8 semanas de idade) de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, e extrair a extremidade distal (aproximadamente 5-7 cm) do cólon usando pinça e tesoura limpas.
    NOTA: Neste estudo, os indivíduos foram eutanasiados usando incubação da câmara de dióxido de carbono por 2-3 min seguida de deslocamento cervical.
    1. Para isso, coloque o mouse de costas, faça uma incisão horizontal logo abaixo da caixa torácica e, em seguida, uma incisão vertical do meio da incisão horizontal em direção à base da cauda para expor a cavidade abdominal.
    2. Com uma pinça, mova o intestino delgado para fora do campo, identifique o cólon e siga-o até a base da cauda. Quebre a pelve com tesoura para expor totalmente o cólon distal, se necessário. Use a tesoura para cortar os 5-7 cm mais distais do cólon.
  2. Coloque o tecido do cólon em uma superfície limpa. Remova o excesso de gordura serosa que envolve o cólon. Remova a matéria fecal lavando o conteúdo luminal do cólon com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco usando uma seringa conectada a uma agulha 18 G 1 1/2. Em seguida, coloque o cólon em um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de DPBS gelada e coloque-o sobre gelo.
    NOTA: Se isolar o cólon de mais de um animal, coloque o tecido no gelo antes de continuar para o próximo animal.
  3. Transferir o tecido do cólon para uma placa de Petri com 10 mL de DPBS gelada e irrigar o lúmen duas vezes com DPBS usando uma pipeta P1.000.
  4. Abra o cólon longitudinalmente usando uma tesoura e agite suavemente usando uma pinça por ~30 s no DPBS para remover qualquer conteúdo fecal restante.
  5. Transferir o tecido para uma nova placa de Petri com 10 mL de DPBS gelada e, novamente, agitar suavemente com uma pinça antes de cortar o cólon em pedaços de 2 cm com tesoura e colocá-los em um tubo cônico de 50 mL com 7 mL de CIB1 gelado. Incubar o tecido em CIB1 sobre gelo por 20 min.
    NOTA: As demais etapas são realizadas dentro de um gabinete de segurança biológica.
  6. Transferir o tecido com uma pinça para um tubo cônico pré-aquecido de 50 mL contendo 7 mL de CIB2 e incubar em banho-maria a 37°C por 5 min.
  7. Remova a CIB2 do tubo cônico de 50 mL deixando o tecido se acomodar no fundo do tubo cônico e, em seguida, pipetando a CIB2. Em seguida, adicione 10 mL de meio de lavagem gelado ao mesmo tubo cônico.
  8. Obter um novo tubo cônico de 50 mL e colocar um filtro de 70 μm sobre o tubo aberto.
  9. Ao segurar o tubo com o conteúdo do cólon, gire a mão aproximadamente 45°. Agite o tubo de forma agitada e vigorosa por 45 s para liberar as criptas. Em seguida, despeje a suspensão da cripta através do filtro de células de 70 μm em um novo tubo cônico de 50 mL.
  10. Usando uma pinça, coloque o tecido do cólon de volta no tubo cônico vazio de 50 mL e adicione 10 mL de meio de lavagem gelado do rato. Obter um novo filtro celular de 70 μm e colocá-lo sobre o tubo cônico de 50 mL contendo a solução filtrada anterior.
  11. Novamente, pegue o tubo de 50 mL que contém os fragmentos da cripta e agite-o de maneira idêntica à do passo 2.9. Filtrar o meio através do filtro celular de 70 μm para o tubo cônico de 50 mL para combinar com as criptas previamente filtradas.
    NOTA: Se o rendimento da cripta for baixo, agite o tecido do cólon mais uma vez colocando o tecido num tubo cónico vazio de 50 ml com 10 ml de meio de lavagem em rato. Agite o tecido por 45-50 s para liberar as criptas. Além disso, se o rendimento da cripta for baixo, aumente a vigorosidade do tremor. Finalmente, se o rendimento geral das criptas for baixo, tanto os pipets quanto os tubos podem ser revestidos com soro fetal bovino (FBS) para evitar a aderência do tecido ao plástico.
  12. Centrifugar o tubo cônico de 50 mL contendo as criptas filtradas a 300 x g por 5 min a 4°C.
    NOTA: Um pellet deve ser observado no fundo do tubo cônico de 50 mL.
  13. Decantar o meio por pipetagem, ressuspender as criptas pipetando para cima e para baixo com 10 mL de meio de lavagem de camundongo gelado e transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4°C.
  14. Para obter uma preparação mais limpa, lave as criptas com mais 10 mL de meio de lavagem do rato. Decantar o meio anterior e ressuspender as criptas pipetando para cima e para baixo em 10 mL de meio de lavagem do rato. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4°C usando um tubo cônico de 15 mL.
    NOTA: Deve-se ter cuidado ao pipetar fora do meio porque, às vezes, o pellet não é centrifugado firmemente. Se o pellet não estiver apertado, pipetar a maior parte do meio, deixando 500 μL a 1 mL. Em seguida, ressuspenda o pellet por pipetagem em 10 mL de meio de lavagem em camundongo e transfira a solução para um tubo cônico de 15 mL. A centrifugação em um tubo cônico menor pode melhorar a estanqueidade do pellet.
  15. Decantar o meio e ressuspender as criptas pipetando para cima e para baixo com 10 mL de meio de lavagem de camundongo gelado. Uma vez ressuspensas, conte as criptas sob um microscópio de campo claro pipetando imediatamente 10 μL do meio em uma lâmina de vidro.
    1. Coloque duas gotas de 10 μL em extremidades separadas da lâmina e conte o número de criptas em cada gota. Faça a média dos números entre as duas gotas para determinar o número de criptas por 10 μL. Multiplique esse número por 100 para obter o número de criptas em 1 mL.
      NOTA: Para uma contagem precisa, 10 μL da suspensão da cripta devem ser imediatamente removidos após a resuspensão. Caso contrário, as criptas cairão no fundo do tubo, o que resultará em uma contagem imprecisa.
  16. Com o objetivo de chapear 300-500 criptas por poço, transfira o volume apropriado de criptas ressuspensas no meio de lavagem do mouse para um novo tubo cônico de 15 mL e leve para 10 mL com meio de lavagem de camundongo gelado. Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min a 4°C. Um pequeno pellet deve ser visível no fundo do tubo.
  17. Retire o sobrenadante com uma pipeta de alimentação. Use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente qualquer meio residual, deixando apenas o pellet.
  18. Ressuspenda o pellet na quantidade apropriada de matriz de membrana basal gelada pipetando lentamente para cima e para baixo. Tenha cuidado para não introduzir bolhas ao ressuspender a pelota da cripta. Placa 300-500 criptas/15 μL de matriz de membrana basal em cada poço de uma placa. Após o plaqueamento, inverter a placa de cultura de tecidos e colocá-la em estufa a 37°C por 10-20 min.
  19. Reverter a placa e adicionar 500 μL do meio colonóide completo do rato a cada poço. Troque o meio a cada dois dias até que estejam prontos para a passagem. Passe os colonóides a cada 3-5 dias.

3. Passagem dos colonóides

NOTA: Cada poço geralmente pode ser passado de 1:4 a 1:6 de acordo com a densidade do poço original. Retire a quantidade adequada de matriz da membrana basal de -20°C e coloque-a no gelo para descongelar. Os colonóides podem ser usados para experimentos após duas passagens. Ao passar colonoides, as etapas são realizadas em um gabinete de segurança biológica para evitar contaminação.

  1. Retire o meio dos poços a serem passados.
    1. Se houver detritos dentro da matriz da membrana basal, o que pode acontecer durante o isolamento inicial, o seguinte protocolo pode ser usado para limpar os detritos:
      1. Adicionar 1 mL de albumina de soro bovino (BSA) gelada a 0,1% em DPBS sem Ca 2+ ou Mg2+ em cada poço. Deixe descansar por 5 min no armário de segurança biológica.
      2. Pipetar para cima e para baixo três a sete vezes usando uma pipeta P1000 para romper a matriz da membrana basal e coletar o conteúdo dos poços em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar os colonóides em um total de 5-10 mL de BSA 0,1% em DPBS sem Ca 2+ ou Mg2+. Completar até ao volume adequado com 0,1% de BSA.
      3. Centrifugar a 150 x g durante 5 min a 4°C para peletizar os colonóides, mas não os detritos.
      4. Decantar o DPBS por pipetagem, deixando o pellet. Adicionar 1 mL de reagente de dissociação enzimática à temperatura ambiente (TR) e pipetar três a cinco vezes.
      5. Colocar o tubo cônico de 15 mL com o reagente de dissociação enzimática e colonoides rompidos em banho-maria a 37°C por 3-4 min.
      6. Retire o tubo do banho-maria, pipeta 3-5 vezes e, em seguida, leve para 10 mL com meio de lavagem do rato. Prossiga para a etapa 3.6.
  2. Coloque 500 μL do reagente de dissociação enzimática RT em cada poço e deixe descansar por aproximadamente 1 min antes de pipetar para cima e para baixo três a sete vezes para romper a matriz da membrana basal.
  3. Coloque a placa em uma incubadora a 37°C por 3-4 min.
  4. Retire a placa da incubadora e pipete para cima e para baixo três a sete vezes usando uma pipeta P1000 para dissociar os colonoides.
  5. Transfira o conteúdo para um tubo cônico de 15 mL e perfaça até 10 mL com meio de lavagem de camundongo gelado.
  6. Centrifugar a amostra a 300 x g durante 5 min a 4°C.
  7. Remova o meio usando uma pipeta de alimentação e uma pipeta P200, conforme necessário, para que apenas um pellet seja deixado no tubo cônico.
  8. Ressuspenda em uma quantidade apropriada de matriz de membrana basal gelada, pipetando suavemente para cima e para baixo de acordo com quantos poços devem ser chapeados. Não introduza bolhas ao pipetar. Colocar os fragmentos colonoides em 15 μL de gotas de matriz da membrana basal por poço.
  9. Plaqueie as criptas, inverta a placa de cultura de tecidos e, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37°C por 10-20 min.
  10. Finalmente, reverta a placa e adicione 500 μL de meio colonóide completo de camundongo a cada poço. Mude o meio a cada dois dias até que eles tenham crescido o suficiente para serem passados novamente em aproximadamente 3-5 dias.

4. Diferenciando terminalmente as células colonóides

  1. Passe os colonóides como acima, e adicione 500 μL do meio colonóide completo do rato a cada poço.
  2. Pelo menos 48 h após a passagem, remova o meio colonóide completo do rato e adicione 500 μL do meio diferenciador a cada poço (ver secção 1).
  3. Incubar os colonóides com meios de diferenciação por 48 h, após o que poderão ser utilizados em experimentos, incluindo a coleta de RNA e proteína.
    NOTA: Os colonóides podem ser avaliados quanto à diferenciação através da coleta de RNA e avaliação da expressão de Lgr5 e Ki67, um marcador de células-tronco e marcador de proliferação celular, respectivamente, via transcriptase reversa quantitativa - reação em cadeia da polimerase (qPCR). Células terminalmente diferenciadas devem ter uma expressão relativamente baixa de Lgr5 e Ki67 em comparação com colonóides cultivados em meio colonóide tradicional, onde as células são mais semelhantes a tronco. A duração do tempo que os colonóides precisam para incubar no meio de diferenciação pode precisar ser otimizada para cada laboratório individual. Consulte a Tabela Suplementar 1 para obter a lista de cartilhas.

5. Indução de inflamação em colonóides diferenciados com mediadores inflamatórios

  1. Após os colonóides terem sido incubados por 2-3 dias com o meio de diferenciação, remova o meio existente e adicione 500 μL do meio mediador da inflamação a cada poço.
  2. Permitir que os poços incubem por 24-72 h antes de coletar o RNA e a proteína (ou avaliar outros parâmetros a jusante). Mude o meio todos os dias.

6. Monocamadas epiteliais intestinais derivadas de colonóides murinos estabelecidos

NOTA: As monocamadas epiteliais intestinais murinas são derivadas de colonóides murinos que foram passados pelo menos duas vezes. Para permitir a formação bem-sucedida de monocamadas em 3-5 dias, é imperativo não separar os colonoides em células únicas. Organoides fragmentados que foram enzimaticamente dissociados em aglomerados celulares são ideais para o crescimento.

  1. Preparar todos os reagentes antes de iniciar o experimento. Descongelar a matriz da membrana basal no gelo. Preparar o meio de monocamada murino conforme descrito na secção 1 . Diluir a membrana basal descongelada 1:20 com o meio monocamada murino frio. Continue no gelo.
  2. Use pinça estéril para colocar uma pastilha de cultura de células transparente de 0,4 μm em um único poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços (Tabela de Materiais). Pegue um pino de canto da pastilha e transfira-a para o poço. Repetir até que o número apropriado de inserções de cultura celular esteja disponível para cultura.
    NOTA: Certifique-se de revestir um poço de controle adicional apenas com a matriz da membrana basal. Esta inserção de cultura celular será usada para medir a resistência de fundo da inserção de cultura celular sem células presentes, conforme descrito na etapa subsequente (etapa 6.3).
  3. Usando uma pipeta P200, cubra a superfície apical (superior) de cada pastilha de cultura celular com 150 μL de matriz de membrana basal diluída. Coloque a ponta da pipeta no centro da inserção sem tocar na membrana da inserção e expulse suavemente a solução. Coloque a placa em uma incubadora estéril a 37°C com 5% de CO2 por pelo menos 1 h.
  4. Remova suavemente a matriz da membrana basal antes do uso e deixe as inserções de cultura celular secarem em um gabinete de segurança biológica por um mínimo de 10 min.
    1. Para remover a matriz da membrana basal, gire a placa de 24 poços em um ângulo de 45°. Coloque um único dedo no canto da pinça para estabilizar a inserção e, usando uma pipeta P200, coloque suavemente a ponta da pipeta ao longo do lado inferior da pastilha e remova a matriz.
    2. Remova qualquer resíduo em excesso lavando cada pastilha de cultura celular com 150 μL de DPBS estéril sem Ca 2+ ou Mg2+.
  5. Após 10 min de secagem, adicionar 400 μL do meio monocamada murino ao fundo da pastilha de cultura celular e 75 μL por cima. Repita até que todas as inserções de cultura celular estejam imersas. Deixe a placa no armário de segurança biológica ou coloque-a de volta na incubadora até que seja necessário.
  6. Remova a placa de 24 poços de colonoides intestinais maduros (organoides no Dia 3-5 de crescimento) da incubadora de 37°C, 5% CO2 e coloque-a sob o gabinete de segurança biológica. Retire o meio com pontas estéreis e lave bem cada um com 1 mL de RT DPBS estéril (sem Ca 2+ ou Mg2+).
    NOTA: Um poço individual de 75-125 colonóides maduros é dividido em uma proporção de 1:4.
  7. Remover a DPBS sem Ca 2+ ou Mg2+ usando pontas estéreis e digerir cada plugue da matriz da membrana basal colocando 500 μL do reagente de dissociação enzimática RT em cada poço a ser passado.
  8. Pipete cada poço para cima e para baixo aproximadamente 6-10 vezes para quebrar o plugue. Não risque o fundo da placa para remover o plugue. Em vez disso, gire a placa de 24 poços em um ângulo de 45°, coloque a ponta da tubulação na borda do plugue e desaloje-a suavemente.
  9. Coloque a placa de 24 poços de volta em uma incubadora estéril a 37°C, 5% CO2 por 3-4 min.
  10. Remova a placa e pipete o reagente de dissociação enzimática para cima e para baixo cinco a sete vezes para cada poço sob um armário de segurança biológica. Transfira os colonoides dissociados de cada poço para um tubo cônico estéril de 15 mL. Levar até um volume de 10 mL com meio de lavagem gelado do rato.
  11. Centrifugar os colonóides parcialmente digeridos a 300 x g a 4°C por 5 min em uma centrífuga de balde oscilante.
  12. Sob o gabinete de segurança biológica, remova o sobrenadante do pellet usando uma pipeta de 10 mL. Remova qualquer meio restante usando um pipet P200. Ressuspender o pellet colonóide em meio monocamada murina. Adicionar 75 μL de meio por cada cultura celular inserida de colonóides fragmentados a serem plaqueados.
  13. Adicionar 75 μL de suspensão colonóide ao centro de cada inserção de cultura celular. Antes de adicionar a suspensão colonóide a cada poço, pipete suavemente para cima e para baixo uma ou duas vezes antes de remover os 75 μL, o que permite um revestimento mais uniforme.
  14. Coloque a placa de 24 poços com inserções de cultura celular em uma plataforma giratória por 10 min para permitir uma dispersão uniforme através da inserção de cultura celular.
  15. Coloque a placa em uma incubadora estéril a 37°C, 5% CO2 .
  16. No dia seguinte (Dia 1), desalojar os fragmentos colonoides não aderidos pipetando o meio para cima e para baixo três a cinco vezes com uma pipeta P200. Coloque suavemente a ponta ao lado do interior da inserção da cultura celular para não perturbar as células intestinais anexadas. Não introduza bolhas no meio, pois isso impede a remoção de todos os fragmentos não anexados.
  17. Retire imediatamente a mistura de meio e colonóide. Repita até que todas as pastilhas de cultura celular tenham sido limpas.
  18. Adicionar suavemente 150 μL de meio monocamada murino pré-aquecido ao lado apical de cada inserção de cultura celular. Adicionar 400 μL de meio monocamada murino aquecido a cada poço de uma nova placa de 24 poços. Transfira a pastilha de cultura celular para a nova placa agarrando sua pinça usando pinça estéril. Troque o meio a cada dois dias até a confluência.
    NOTA: Os fragmentos colonoides devem formar uma monocamada confluente 3-5 dias após o plaqueamento.

7. Mensuração da resistência líquida das monocamadas epiteliais utilizando um voltômetro nos dias 3 - 5 de cultura da monocamada

NOTA: Os eletrodos de pauzinho assemelham-se a pinças e são assimétricos em comprimento. O braço mais longo da sonda é o eletrodo basolateral e o braço mais curto é o eletrodo apical. A sonda pode ser difícil de inserir entre o interior e o exterior da inserção da cultura celular. Colocar a sonda em um leve ângulo após a inserção, seguido de retificação vertical da sonda, evitará que a sonda fique presa. Certifique-se de ler a resistência líquida de cada inserção de cultura de células em um ângulo semelhante, pois isso pode afetar os valores.

  1. Coloque o voltohmímetro e todos os reagentes dentro de um armário de segurança biológica.
    1. Conecte o voltohmímetro à tomada CA mais próxima e conecte o conector modular de plástico da sonda do eletrodo ao conector INPUT no visor frontal.
    2. Para colocar o voltômetro em um ângulo de 45°, gire o braço de metal na parte traseira do equipamento para fora até que ele trave no lugar.
    3. Agora, ligue o voltômetro acionando o interruptor de energia UP no display frontal. Por fim, vire o interruptor para cima em direção ao OHMS para exibir a leitura nessa métrica.
  2. Remova a placa de 24 poços da incubadora de 37°C, 5% de CO2 e coloque a placa plana no armário de segurança biológica. A resistência elétrica transepitelial (TEER) é sensível à temperatura. Apenas remova a placa imediatamente antes da leitura do TESE.
  3. Esterilizar a sonda do eletrodo em etanol 70% pré-aquecido por 30 s a 1 min. Retire a sonda, inverta e mexa-a uma a duas vezes para remover o excesso de etanol. Deixe a sonda secar ao ar por aproximadamente 30 s.
  4. Lave o etanol restante deixado na sonda com meio de lavagem pré-aquecido do rato.
    CUIDADO: Não deixe que nenhuma das gotículas de etanol restantes mais acima na sonda caia na inserção da cultura celular. Ao lavar o etanol com meio, não deixe o meio passar acima do campo de etanol estéril. Isso poderia fazer com que o meio contaminado entrasse na inserção da cultura celular.
  5. Segure a sonda perpendicularmente à inserção da cultura celular. Insira o eletrodo basolateral (extremidade mais longa da sonda) na parte externa da pastilha de cultura celular até que ele toque a base da placa de 24 poços. Deslize o eletrodo apical (extremidade mais curta da sonda) para dentro do inserto de cultura celular. Não varie a distância dos dois eletrodos de poço para poço. Isso impactará a medição TESE.
  6. Verifique se o eletrodo apical não está tocando a base da inserção de cultura celular antes de ler o TEER. Comece com a inserção da cultura de célula de controle em segundo plano e registre o valor. O valor será exibido automaticamente digitalmente na parte frontal do voltômetro.
  7. Repita as etapas 7.5-7.6 para cada inserção de cultura celular.
    NOTA: Se existirem condições experimentais diferentes entre as inserções de cultura celular, esterilizar a sonda entre cada nova condição. Comece na etapa 7.1 e prossiga numericamente pelas etapas.
  8. Coloque a placa de 24 poços de volta na incubadora depois que todas as medições TEER tiverem sido registradas.
  9. Os valores líquidos a 350 Ω ou mais são indicativos de formação de monocamadas. Repetir novamente nos dias subsequentes até que a formação de monocamada tenha sido alcançada.
    NOTA: Geralmente, valores de 1.000 Ω ou mais podem ser capturados no Dia 3, mas com o tempo, todos eles convergirão para um número menor em torno de 350 Ω.

8. Cálculo do TEER utilizando medidas de resistência líquida do voltômetro

NOTA: A formação bem sucedida de monocamada dos colonóides dará medidas TEER superiores a 115 Ω·cm2.

  1. Pegue os valores individuais de resistência líquida e subtraia bem a resistência líquida do plano de fundo. As inserções de cultura celular revestidas com a membrana da matriz basal darão uma leitura líquida de cerca de 100 Ω.
  2. Pegue as medidas de resistência líquida subtraídas em segundo plano e multiplique-as pela área de superfície da inserção de cultura celular. Uma pastilha de cultura celular de 24 poços tem uma área de superfície de 0,33cm2.
  3. Se os valores forem iguais ou superiores a 115 Ω·cm2 , proceder aos ensaios experimentais a jusante.

9. Indução de inflamação nas monocamadas epiteliais com mediadores inflamatórios

  1. Uma vez formadas as monocamadas bem-sucedidas, adicione mediadores inflamatórios à cultura no lado basal da cultura. Preparar o meio monocamada mediador da inflamação, conforme descrito na etapa 1.9, e adicionar 400 μL a cada poço em uma nova placa de 24 poços.
  2. Remova o meio do lado apical da inserção de cultura celular e adicione 150 μL do meio monocamada murino sem Y-27632. Não complemente este lado com mediadores inflamatórios. No entanto, se a morte celular parecer excessiva, deixe o Y-27632 na mídia. Isso deve ser determinado pelo usuário final.
  3. Transfira as pastilhas de cultura celular para uma nova placa de 24 poços e coloque-as nos poços suplementados com o meio monocamada mediador da inflamação.
  4. Estimular as monocamadas com mediadores inflamatórios por 24-72 h, dependendo do experimento.
  5. Para testar as respostas a drogas usando este modelo inflamatório, suplemente o meio monocamada no lado apical da inserção de cultura celular com a droga de escolha. O fármaco pode ser adicionado em qualquer ponto do experimento, dependendo do mecanismo de ação do fármaco e dos parâmetros a jusante a serem avaliados.

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Representative Results

O sistema de cultura colonóide intestinal 3D é uma ferramenta valiosa para estudar a contribuição intrínseca do epitélio para a homeostase da mucosa intestinal. O protocolo descrito fornece instruções detalhadas sobre como isolar criptas de camundongos C57BL/6J (WT) com 8 semanas de idade e estabelecer um sistema de cultura de colonoides de longo prazo que pode ser manipulado para múltiplas aplicações a jusante. Após o isolamento e plaqueamento das criptas na matriz da membrana basal, as criptas apresentam-se densas e multicelulares em estrutura quando visualizadas por microscopia de campo claro. Podem ser esféricos ou alongados e cilíndricos, assemelhando-se à estrutura única, semelhante a cripta, normalmente observada dentro da arquitetura intestinal in vivo (Figura 1A). No Dia 1, a maioria das criptas forma uma estrutura esférica compacta, com alguns colonóides começando a desenvolver um lúmen interior (espaço vazio) desprovido de células epiteliais (Figura 1B). À medida que continuam a crescer nos próximos dias, os diâmetros dos colonóides continuam a aumentar, e os lúmens dos colonóides tornam-se mais definidos (Figura 1C). No 5º dia, cada colonóide tem aproximadamente 100-250 μm de diâmetro, formando uma grande e proeminente luz circundada por uma fina camada de células-tronco epiteliais (Figura 1D). Neste ponto, os colonóides são enzimaticamente e mecanicamente interrompidos para a passagem. Após duas passagens, eles podem ser usados para experimentação a jusante.

Para avaliar se as alterações metabólicas observadas nas raspagens colônicas de camundongos tratados com DSS são retidas em colonóides derivados de camundongos no mesmo regime de DSS, camundongos WT de 8 semanas de idade foram tratados com DSS a 2% em água potável ad libitum. Animais controles pareados por idade e sexo foram submetidos a água potável ad libitum sem ESD. Após 7 dias, os camundongos foram sacrificados, e criptas foram isoladas dos cólons dos animais controle (n = 3, macho) e tratados com DSS (n = 3, macho) para estabelecer colonóides. Após duas passagens, a proteína foi isolada de cada conjunto de colonóides, e a expressão do coativador do receptor ativador do peroxissoma gama-1α (PGC1α), a proteína reguladora mestre da biogênese mitocondrial, foi avaliada por meio da análise de western blot (Figura 1 suplementar). Não houve diferença significativa na expressão de PGC1α quando comparados os colonóides estabelecidos a partir dos camundongos tratados com DSS versus os colonoides estabelecidos a partir dos camundongos controle, sugerindo que esta metodologia de cultura de colonóides não reflete adequadamente as alterações metabólicas in vivo que são observadas em camundongos15.

A falha da PGC1α em iniciar a biogênese mitocondrial durante um insulto inflamatório intestinal localiza-se primariamente no epitélio colônico diferenciado15,19. Para espelhar as alterações observadas in vivo, decidimos direcionar os colonóides para um estado mais diferenciado. Para induzir essa mudança, os colonóides foram inicialmente incubados com meio colonóide tradicional. Após 24 h a 48 h, os colonóides foram trocados para meio de diferenciação por mais 48 h. Durante a diferenciação, uma pequena porcentagem de colonóides transitou de uma arquitetura esférica para estruturas brotadas enriquecidas com células caliciformes e colonócitos17 (Figura 2A,B). Os colonóides crescidos em meio WRN-suplementado foram enriquecidos com células-tronco Lgr5+ de divisão rápida. Para confirmar que tanto as células-tronco Lgr5+ quanto outras células em proliferação saíram do ciclo celular durante a diferenciação, os níveis de RNAm foram analisados via qPCR. Downregulation significativo nos níveis de Lgr5 (97%, p = 0,0023) e Ki67 (75%, p = 0,0007) foi observado nos colonóides diferenciados (n = 6) em comparação com os colonóides cultivados em ambiente de cultura tradicional (n = 6; Figura suplementar 2A,B). Seria também de esperar que os colonóides diferenciados fossem primariamente constituídos por células caliciformes secretoras de muco. Além disso, de fato, a MUC2 foi aumentada quase duas vezes nos colonoides diferenciados em comparação com seus homólogos tradicionalmente cultivados (n = 3, p = 0,0433, Figura Suplementar 3). Quando tomados em conjunto, esses dados sugerem que os colonóides foram diferenciados com sucesso e estavam prontos para experimentação a jusante. Em seguida, mediadores inflamatórios foram adicionados ao meio de diferenciação, conforme descrito na seção 5 do protocolo. Proteína e RNA foram coletados até 72 h após a introdução dos mediadores inflamatórios para análise. No entanto, às 72 h, ocasionalmente foi observado aumento da morte celular.

Para avaliar se a introdução de mediadores inflamatórios em colonoides diferenciados poderia mimetizar a falha na biogênese mitocondrial observada tanto na DII humana quanto em um modelo agudo de colite murina, a expressão proteica de PGC1α e fator de transcrição A, mitocôndrias (TFAM) foi avaliada através da análise de western blot em colonóides diferenciados (n = 5) tratados com mediadores inflamatórios ao longo de 72 h. A expressão de PGC1α demonstrou estar diminuída em modelos murinos de colite, bem como na DIIhumana 15. A TFAM, uma proteína que conduz tanto a transcrição quanto a replicação do genoma mitocondrial, também demonstrou estar diminuída em modelos murinos de colite, e sua expressão gênica demonstrou estar diminuída na DII humana15,20. Observamos uma diminuição semelhante na expressão de PGC1α (50,4%, p = 0,0442) e TFAM (88,9%, p = 0,004) nos colonoides diferenciados após 72 h de exposição a esses mediadores inflamatórios (Figura 3). Coletivamente, isso sugere que o tratamento de colonoides diferenciados com citocinas é um modelo ideal para estudar a dinâmica mitocondrial in vitro.

Enquanto várias funções celulares e moleculares podem ser examinadas em ambientes de cultura de colonoides 3D, os sistemas de cultura de monocamada 2D são superiores quando se avalia a função de barreira, as interações patógeno-hospedeiro e o impacto da terapêutica absorvida por via oral na inflamação21,22. A formação de uma camada contínua de células confluentes com uma barreira intacta permite que diferentes agentes biológicos ou químicos sejam colocados no lado apical e/ou basal das células com facilidade. Este protocolo permite que culturas de monocamada 2D sejam estabelecidas a partir de colonóides WT pré-existentes que foram passados duas vezes. Os colonóides que foram enzimaticamente e mecanicamente rompidos são plaqueados em inserções de cultura celular revestidas com matriz de membrana basal. Após o plaqueamento inicial, os colonóides fragmentados aparecem em aglomerados celulares que variam de 15 a 150 células (Figura 4A). No Dia 3, as células começaram a se achatar e cobrir lentamente a inserção da cultura celular, geralmente atingindo confluência (Figura 4B). Nos próximos dias, as monocamadas continuam a crescer e formam uma barreira contínua que pode ser medida quantitativamente por TEER (Figura 4C,D). Curiosamente, as medidas TEER flutuam ao longo do Dia 3 ao Dia 5. As monocamadas têm valores mais altos anteriormente com uma ampla faixa (200-800 Ω·cm 2), mas esses valores convergem lentamente para um número menor no Dia 5 (115-150 Ω·cm2, Figura 5A). Quando as monocamadas atingem um estado estacionário, elas podem ser usadas para experimentação a jusante.

Para caracterizar a resposta epitelial das monocamadas derivadas do colonóide à inflamação, mediadores inflamatórios foram colocados no lado basal (parte externa da inserção) das células por 48 h. O RNA foi extraído, e os níveis de RNAm de vários marcadores de diferenciação de células-tronco e células, bem como proteínas juncionais, foram analisados via qPCR. Lgr5 não foi detectado em nenhuma das condições, mas outro marcador de células-tronco, o mTERT, foi reduzido em quase 60% nas monocamadas inflamadas em comparação com o controle não tratado (Figura 4A suplementar). Em seguida, analisou-se a expressão de dois marcadores de tipos celulares diferenciados, Muc2 e fosfatase alcalina (Alpi). Ambos os transcritos de RNAm foram menores nas monocamadas inflamadas em comparação com as células controle (Figura 4A suplementar). Tanto as células-tronco quanto as pós-mitóticas estão comumente diminuídas durante a inflamação colônica23,24,25, e resposta semelhante foi observada no modelo de monocamada obtido neste estudo.

Um benefício do sistema monocamada é a capacidade de avaliar a resposta da barreira. Para determinar se a barreira estava comprometida na condição imunoestimulada, medimos os valores de TEER após 48 h. Os valores TEER para as monocamadas controle (n = 2) foram, em média, de 129,16 Ω·cm2 , mas caíram significativamente (p = 0,0087) para uma média de 98,54 Ω·cm2 nas monocamadas inflamadas (Figura 5B). Para confirmar ainda mais que a barreira estava comprometida na condição inflamatória, avaliamos os níveis de RNAm para três diferentes marcadores de tight junction, Zo-1, Occludin, e Claudin. Todos os três marcadores apresentaram níveis reduzidos na condição inflamada em comparação com seus homólogos não inflamados (Figura 4B suplementar). Coletivamente, esses dados mostram que a disfunção de barreira está presente nas monocamadas inflamadas e mimetiza a disfunção de barreira observada durante a patogênese das DII.

Figure 1
Figura 1: Isolamento inicial das criptas murinas para o estabelecimento da cultura colonóide a longo prazo. (A) No Dia 0, 300-500 criptas foram plaqueadas em matriz de membrana basal (foto obtida 5 h após o plaqueamento), e o crescimento dos colonóides foi capturado no (B) Dia 1, (C) Dia 3 e (D) Dia 5. No dia 5, os colonoides estavam prontos para serem passados. Ampliação = 10x; barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Estabelecimento de colonóides terminalmente diferenciados a partir da cultura colonóide tradicional. O meio de diferenciação foi colocado nos colonóides 48 h após a passagem dos colonóides murinos. Após (A) 24 h e (B) 48 h, os colonóides tornam-se enriquecidos com células terminalmente diferenciadas. Ampliação = 10x; barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Expressão das proteínas PGC1α e TFAM em colonóides murinos diferenciados tratados com mediadores inflamatórios. Meio suplementado com mediadores inflamatórios foi colocado sobre os colonoides diferenciados, e proteína foi coletada 0 h, 24 h, 48 h e 72 h após a exposição. (A) A expressão proteica de PGC1α mostrou uma diminuição global significativa (p = 0,0442) ao longo de 72 h. TFAM foi significativamente downregulated (p = 0,004) após exposição a mediadores inflamatórios em 72 h, e (B) houve uma tendência de queda na expressão proteica em 24 h, 48 h e 72 h quando analisada por ANOVA. Dados apresentados como média ± desvio padrão. *p < 0,05, **p < 0,005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Estabelecimento e crescimento de monocamadas a partir de colonóides pré-existentes. Os colonóides que haviam sido enzimaticamente e mecanicamente interrompidos foram plaqueados em pastilhas de cultura celular revestidas com uma matriz de membrana basal. Após o plaqueamento inicial, os colonoides fragmentados apareceram em (A) aglomerados celulares e, no (B) Dia 3, eles começaram a se achatar e cobrir lentamente a inserção da cultura celular. (C) No Dia 5 e (D) Dia 7, as monocamadas continuaram a crescer para formar uma barreira contínua que poderia ser medida quantitativamente pelo TEER. Ampliação = 10x; barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Valores TEER para o estabelecimento das monocamadas derivadas de colonóides e das monocamadas inflamadas. (A) Os valores de TEER foram medidos usando um voltômetro do Dia 3 ao Dia 5. As monocamadas tiveram valores mais altos mais cedo com uma ampla amplitude, mas lentamente convergiram para um número menor no Dia 5. Uma vez que as monocamadas atingem um estado estacionário, elas podem ser usadas para experimentação a jusante. (B) Os valores TEER foram menores nas monocamadas inflamadas (n = 2) em relação aos controles não inflamados (n = 2). As monocamadas controle apresentaram TEER médio de 129,16 ohms·cm 2, e o TEER das monocamadas inflamadas foi significativamente menor (p = 0,0087), com média de 98,54 Ω·cm2, quando analisadas pelo teste t. **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tabela de composição da solução. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar 1: Expressão da proteína PGC1α em colonóides murinos cultivados em meio colonóide tradicional isolado de controles WT e camundongos tratados com 2% de DSS. Os colonóides foram derivados de camundongos controle WT com 8 semanas de idade e 2% tratados com DSS após 7 dias. A proteína foi isolada de colonóides passados duas vezes e no Dia 4 após o plaqueamento. Não houve diferença na expressão da proteína PGC1α (p = 0,9996) nos colonóides derivados dos camundongos controle em comparação com os camundongos expostos a 2% de DSS por 7 dias quando analisados pelo teste t não pareado. Dados apresentados como média ± desvio padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Expressão reduzida do mRNA de Lgr5 e Ki67 em colonóides diferenciados. Colonóides murinos passados 48 h antes foram expostos ao meio de diferenciação por 48 h antes de isolar a síntese de RNA e cDNA. Os níveis de RNAm foram determinados por qPCR e analisados pelo método de TC comparativo. (A) Lgr5 e (B) Ki67 diminuíram significativamente nos colonóides diferenciados quando analisados estatisticamente pelo teste t (p = 0,0023, p = 0,0007). Dados apresentados como média ± desvio padrão.**p < 0,005. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Aumento das células caliciformes secretoras de mucina em colonóides murinos diferenciados. Colonóides murinos passados 48 h antes foram expostos ao meio de diferenciação por 48 h. As células foram lisadas em tampão RIPA, e a proteína foi visualizada pela análise de western blot. (A) A expressão de MUC2 foi aumentada em cada conjunto de colonóides diferenciados em comparação com os colonóides indiferenciados. (B) Observou-se alteração de quase duas vezes na proteína MUC2 nas condições de diferenciação, o que foi significativo quando analisado pelo teste t (p = 0,0433). Dados apresentados como média ± desvio padrão. *p < 0,05. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Expressão reduzida de marcadores caulinares e de diferenciação, bem como de marcadores juncionais apertados, em monocamadas tratadas com mediadores inflamatórios. Monocamadas derivadas de colonoides murinos (Dia 5) foram expostas a mediadores inflamatórios por 48 h, RNA foi posteriormente coletado e cDNA foi sintetizado (n = 2). Os níveis de RNAm dos marcadores caulinares, de diferenciação e juncionais foram determinados por qPCR e analisados pelo método de TC comparativo. (A) O marcador de células-tronco, Lgr5, não foi detectado em nenhuma das condições, mas o mTERT foi substancialmente reduzido em condições inflamatórias. O marcador de células caliciformes, Muc2, e o marcador de colonócitos, Alpi, estavam ambos diminuídos nas monocamadas inflamadas em comparação com as monocamadas não tratadas. (B) Os marcadores de tight junction, Zo-1, Occludin, e Claudin, foram todos menores nas monocamadas tratadas com inflamação em comparação com o controle. Dados apresentados como média ± desvio padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Lista de cartilhas. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O desenvolvimento de organoides revolucionou a forma como a comunidade científica estuda sistemas orgânicos in vitro com a capacidade de recapitular parcialmente a estrutura e a função celular de um animal ou humano em um prato. Além disso, sistemas organoides derivados de humanos com doenças oferecem uma ferramenta promissora para a medicina personalizada que pode orientar a tomada de decisões terapêuticas. Aqui, descrevemos um protocolo de isolamento de cripta que funciona bem e introduz etapas importantes que permitem limpar o excesso de detritos no isolamento antes do revestimento. Além disso, explicamos um detalhe fundamental que muitas vezes é negligenciado no processo: a capacidade de contar com precisão as criptas para chapeamento. Uma vez que os colonóides estão estabelecidos, delineamos manipulações chave que permitem sua diferenciação celular ou formação de monocamadas, o que poderia aumentar a capacidade de estudar alterações no epitélio intestinal durante a DII.

O eixo cripta-vilosidade no epitélio colônico em mamíferos é uma estrutura complexa composta por diferentes tipos celulares com diferentes funções. A manutenção desse eixo depende de fatores celulares intrínsecos e extrínsecos que, em conjunto, ajudam a manter a homeostase epitelial18. Observamos que os colonoides murinos cultivados em meio tradicional refletem principalmente células-tronco, em oposição à conglomeração de células-tronco e células terminalmente diferenciadas que é vista in vivo. Além disso, colonóides murinos crescidos e mantidos dessa maneira são estruturas circulares em oposição a monocamadas planas. Essas diferenças têm implicações potenciais para nossas tentativas de estudar doenças intestinais in vitro. Especificamente, somos limitados em nossa capacidade de usar organoides para estudar mudanças na função de barreira, bem como os efeitos da inflamação em células epiteliais intestinais terminalmente diferenciadas.

Aqui, descrevemos protocolos não apenas para o isolamento de criptas murinas para crescimento de colonoides, mas também para a manipulação desses colonoides para estudar a fisiologia epitelial intestinal e a resposta epitelial à inflamação. Entre os vários fatores extrínsecos que promovem o gradiente de células-tronco pluripotentes e células terminalmente diferenciadas está a via canônica Wnt, que é rica em criptas e promove a saúde das células-tronco. A sinalização Wnt diminui na ponta do eixo das criptas, coincidindo com a evolução das células-tronco para células terminalmente diferenciadas26. Descrevemos um protocolo que permite a diferenciação terminal de células colonoides. Como outros, diferenciamos removendo Wnt do meio de crescimento, mas usamos uma concentração menor de R-spondin (500 ng/mL versus 1 μg/mL R-spondin)17. Surpreendentemente, uma redução de 50% na R-espondina não afeta a diferenciação bem-sucedida dos organoides. A capacidade de se diferenciar com uma concentração menor ajuda a estabelecer um sistema menos artificial que pode se assemelhar mais ao ambiente fisiológico in vivo. Embora esse protocolo resulte em diferenciação terminal finita (Figura 2 Suplementar e Figura 3 Suplementar) e incapacidade de manter a imortalidade celular, não deixa de ser um método útil para melhor compreender a contribuição fisiológica do epitélio terminalmente diferenciado, incluindo colonócitos, células enteroendócrinas e células caliciformes, para a DII e outros estados patológicos. Além disso, mostramos que a suplementação de citocinas específicas nesse meio, tradicionalmente elevadas em pacientes com DII, direciona o sistema organoide diferenciado para um estado inflamatório. Ao longo de 72 h, colonoides diferenciados tratados com citocinas inflamatórias refletem mais de perto alguns dos achados metabólicos mostrados em outros modelos estabelecidos de colite e DII humana (Figura 3). Além disso, colonóides diferenciados tratados dessa maneira são provavelmente mais reflexos dos efeitos da inflamação na homeostase celular sobre o epitélio diferenciado. Também delineamos um protocolo para o desenvolvimento de monocamadas, que permite a formação de uma face apical e basal do epitélio, permitindo uma análise da função de barreira in vivo. Este sistema é útil no estudo de mecanismos de disfunção de barreiras sem a necessidade de diferenciação e no cultivo de novos alvos terapêuticos para o tratamento.

Várias limitações e possíveis armadilhas em relação aos protocolos descritos acima devem ser observadas. O isolamento bem-sucedido de criptas e o desenvolvimento de colonoides podem ser limitados pelo rendimento de criptas de cada animal, a precisão da contagem das criptas e a limpeza da preparação. A velocidade de contagem das criptas isoladas após a ressuspensão, as variações na dissociação mecânica das criptas da musculatura subjacente e o número de lavagens e spins centrífugos contribuem para o sucesso da cultura colonóide. Além disso, é fundamental não dissociar totalmente os organoides em células únicas durante a passagem ou plaqueamento para cultura de monocamada 2D. Aglomerados de 30 a 50 células são ideais para permitir que a cultura se propague para cultura de longo prazo. Os protocolos acima observam áreas de possíveis armadilhas e etapas adicionais opcionais para solucionar esses problemas. Em última análise, o protocolo pode exigir otimização por parte do indivíduo que realiza o isolamento devido à variabilidade inerente no conjunto de habilidades e manobras (i.e., agitação), bem como a variação em cada animal. Otimização adicional pode ser necessária pelo usuário final para capturar a diversidade genética e molecular encontrada na DII.

Em última análise, enquanto o sistema colonóide é uma ferramenta altamente útil para recapitular aspectos-chave da fisiologia humana e da doença in vivo, este sistema é, em última análise, limitado em sua capacidade de estudar todos os aspectos da doença humana. Métodos tradicionais para o desenvolvimento de colonóides têm elucidado aspectos-chave da dinâmica das células-tronco; no entanto, esses achados muitas vezes não refletem adequadamente os achados em células terminalmente diferenciadas dentro do epitélio do hospedeiro. As estratégias delineadas neste estudo fornecem aos investigadores um modelo relativamente rápido e barato para manipulação de organoides que, quando empregado adequadamente, pode esclarecer aspectos-chave da estrutura e função epitelial intestinal durante a inflamação.

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Disclosures

Os autores contribuintes não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants R01DK120986 (para K.P.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

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References

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Biologia Edição 196
Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação <em>Intestinal In Vitro</em> em Colonóides Murinos Estabelecidos
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Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, … More

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

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