Мы описываем протокол, подробно описывающий изоляцию крипт толстой кишки мышей для развития трехмерных колоноидов. Затем сформированные колоноиды могут быть терминально дифференцированы, чтобы отразить клеточный состав эпителия хозяина до того, как они получат воспалительную инструкцию или будут направлены на создание эпителиального монослоя.
Кишечный эпителий играет важнейшую роль в здоровье человека, обеспечивая барьер между хозяином и внешней средой. Этот высокодинамичный клеточный слой обеспечивает первую линию защиты между микробными и иммунными популяциями и помогает модулировать иммунный ответ кишечника. Нарушение эпителиального барьера является отличительным признаком воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и представляет интерес для терапевтического таргетирования. 3-мерная колоноидная культуральная система является чрезвычайно полезной моделью in vitro для изучения динамики стволовых клеток кишечника и физиологии эпителиальных клеток в патогенезе ВЗК. В идеале, создание колоноидов из воспаленной эпителиальной ткани животных было бы наиболее полезным для оценки генетического и молекулярного влияния на заболевание. Однако мы показали, что эпителиальные изменения in vivo не обязательно сохраняются у колоноидов, полученных от мышей с острым воспалением. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали протокол лечения колоноидов коктейлем медиаторов воспаления, которые обычно повышены во время ВЗК. Несмотря на то, что эта система может применяться повсеместно в различных условиях культивирования, этот протокол делает акцент на обработке как дифференцированных колоноидов, так и двухмерных монослоев, полученных из установленных колоноидов. В условиях традиционной культуры колоноиды обогащаются стволовыми клетками кишечника, обеспечивая идеальную среду для изучения ниши стволовых клеток. Однако эта система не позволяет провести анализ особенностей физиологии кишечника, таких как барьерная функция. Кроме того, традиционные колоноиды не дают возможности изучать клеточный ответ терминально дифференцированных эпителиальных клеток на провоспалительные раздражители. Методы, представленные здесь, представляют собой альтернативную экспериментальную основу для устранения этих ограничений. Двухмерная монослойная культуральная система также дает возможность проведения терапевтического скрининга лекарственных средств ex vivo. Этот поляризованный слой клеток может быть обработан медиаторами воспаления на базальной стороне клетки и одновременно с предполагаемой терапией апикально, чтобы определить их полезность в лечении ВЗК.
Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) — это хроническое, ремиттирующее и рецидивирующее заболевание, характеризующееся эпизодами воспаления и клиническим покоем. Этиология ВЗК является многофакторной, но ключевыми характерными особенностями заболевания являются дефектная барьерная функция и повышенная проницаемость кишечного эпителия, а также провоспалительные сигнальные каскады, активированные в эпителиальном компартменте 1,2. Для повторения эпителиального ответа во время ВЗК было использовано несколько моделей in vitro и in vivo, включая клеточные культуры и мышиные модели воспаления3. Однако все эти системы имеют существенные недостатки, которые ограничивают их способность повторять эпителиальные изменения во время ВЗК4. Большинство клеточных линий, используемых для изучения ВЗК, трансформируются, обладают способностью образовывать монослой и могут дифференцироваться3, но по своей природе размножаются иначе, чем нетрансформированные эпителиальные клетки кишечника в организме хозяина. Для изучения ВЗК используется несколько различных мышиных моделей воспаления, некоторые из которых включают нокаутные модели, инфекционные модели, химические воспалительные модели и модели переноса Т-клеток 5,6,7,8. Хотя каждый из них может изучать определенные этиологические аспекты ВЗК, такие как генетическая предрасположенность, барьерная дисфункция, иммунная дерегуляция и микробиом, они ограничены в своих возможностях изучать многофакторную природу заболевания.
За последнее десятилетие было установлено, что кишечные органоиды, включая энтероиды и колоноиды, являются полезной моделью in vitro для изучения не только динамики кишечных стволовых клеток, но и их роли, барьерной целостности и функции кишечного эпителия в кишечном гомеостазе и заболевании. Эти сущности внесли значительный вклад в наше понимание патогенеза ВЗК9 и открыли новые возможности для персонализированной медицины. Колоноиды, или самоорганизующиеся культуры тканей толстой кишки, полученные из стволовых клеток, были выведены как из мышиных, так и из человеческих тканей в процессе, который позволяет стволовым клеткам, находящимся в кишечных криптах, размножаться и поддерживаться втечение неопределенного времени. Ниша стволовых клеток in vivo зависит от внеклеточных факторов для поддержки их роста, в частности, канонических сигнальных путей Wnt и сигнальных путей костного морфогенного белка11. Добавление этих факторов способствует здоровью и долголетию колоноидов, но также приводит культуру к состоянию, подобному стволовым клеткам, которое не отражает клеточную архитектуру эпителия in vivo, которая состоит как из самообновляющихся, так и из терминально дифференцированных клеток12,13. В то время как функциональность кишечного эпителия зависит от постоянных перекрестных помех между компартментом стволовых клеток и дифференцированными клетками, возможность иметь и то, и другое в системе колоноидных культур довольно ограничена. Несмотря на эти ограничения, система органоидных культур остается золотым стандартом для изучения внутренних свойств эпителия ex vivo. Тем не менее, для ответа на поставленный научный вопрос, возможно, потребуется рассмотреть альтернативные культурные стратегии.
Было показано, что у мышей, получающих непрерывный 7-дневный режим приема декстрана сульфата натрия (DSS), развивается как воспаление эпителия, так и барьерная дисфункция14. Кроме того, сбой митохондриального биогенеза и метаболическое перепрограммирование в кишечном эпителии, которые, как было показано, проявляются при ВЗК человека, также были учтены в этой DSS-модели колита15. Тем не менее, наши предварительные данные показывают, что характеристики недостаточности митохондриального биогенеза не сохраняются у колоноидов, полученных из крипт животных, обработанных DSS (дополнительный рисунок 1). Таким образом, при изучении того, как воспаление приводит к эпителиальным изменениям при воспалении кишечника мышей, необходимо использовать альтернативные методы культивирования. Здесь мы излагаем разработанный нами протокол, который описывает: 1) как изолировать крипты от всей ткани толстой кишки для создания мышиных колоноидов, 2) как терминально дифференцировать эту клеточную популяцию, чтобы отразить клеточную популяцию в том виде, в каком она существует in vivo, и 3) как индуцировать воспаление в этой модели in vitro . Для изучения лекарственных взаимодействий в воспаленном эпителии мы разработали протокол для создания 2-мерных (2D) монослоев из мышиных колоноидов, которые могут быть базально обработаны медиаторами воспаления и апикально обработаны лекарственной терапией.
Разработка органоидов произвела революцию в том, как научное сообщество изучает системы органов in vitro , с возможностью частичного повторения клеточной структуры и функции животного или человека в чашке. Кроме того, органоидные системы, полученные от людей с заболеваниями, предлаг?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01DK120986 (K.P.M.).
0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |