Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Изучение эпителиальных эффектов воспаления кишечника in vitro на установленных колоноидах мышей

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64804
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 2,3
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем протокол, подробно описывающий изоляцию крипт толстой кишки мышей для развития трехмерных колоноидов. Затем сформированные колоноиды могут быть терминально дифференцированы, чтобы отразить клеточный состав эпителия хозяина до того, как они получат воспалительную инструкцию или будут направлены на создание эпителиального монослоя.

Abstract

Кишечный эпителий играет важнейшую роль в здоровье человека, обеспечивая барьер между хозяином и внешней средой. Этот высокодинамичный клеточный слой обеспечивает первую линию защиты между микробными и иммунными популяциями и помогает модулировать иммунный ответ кишечника. Нарушение эпителиального барьера является отличительным признаком воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и представляет интерес для терапевтического таргетирования. 3-мерная колоноидная культуральная система является чрезвычайно полезной моделью in vitro для изучения динамики стволовых клеток кишечника и физиологии эпителиальных клеток в патогенезе ВЗК. В идеале, создание колоноидов из воспаленной эпителиальной ткани животных было бы наиболее полезным для оценки генетического и молекулярного влияния на заболевание. Однако мы показали, что эпителиальные изменения in vivo не обязательно сохраняются у колоноидов, полученных от мышей с острым воспалением. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали протокол лечения колоноидов коктейлем медиаторов воспаления, которые обычно повышены во время ВЗК. Несмотря на то, что эта система может применяться повсеместно в различных условиях культивирования, этот протокол делает акцент на обработке как дифференцированных колоноидов, так и двухмерных монослоев, полученных из установленных колоноидов. В условиях традиционной культуры колоноиды обогащаются стволовыми клетками кишечника, обеспечивая идеальную среду для изучения ниши стволовых клеток. Однако эта система не позволяет провести анализ особенностей физиологии кишечника, таких как барьерная функция. Кроме того, традиционные колоноиды не дают возможности изучать клеточный ответ терминально дифференцированных эпителиальных клеток на провоспалительные раздражители. Методы, представленные здесь, представляют собой альтернативную экспериментальную основу для устранения этих ограничений. Двухмерная монослойная культуральная система также дает возможность проведения терапевтического скрининга лекарственных средств ex vivo. Этот поляризованный слой клеток может быть обработан медиаторами воспаления на базальной стороне клетки и одновременно с предполагаемой терапией апикально, чтобы определить их полезность в лечении ВЗК.

Introduction

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) — это хроническое, ремиттирующее и рецидивирующее заболевание, характеризующееся эпизодами воспаления и клиническим покоем. Этиология ВЗК является многофакторной, но ключевыми характерными особенностями заболевания являются дефектная барьерная функция и повышенная проницаемость кишечного эпителия, а также провоспалительные сигнальные каскады, активированные в эпителиальном компартменте 1,2. Для повторения эпителиального ответа во время ВЗК было использовано несколько моделей in vitro и in vivo, включая клеточные культуры и мышиные модели воспаления3. Однако все эти системы имеют существенные недостатки, которые ограничивают их способность повторять эпителиальные изменения во время ВЗК4. Большинство клеточных линий, используемых для изучения ВЗК, трансформируются, обладают способностью образовывать монослой и могут дифференцироваться3, но по своей природе размножаются иначе, чем нетрансформированные эпителиальные клетки кишечника в организме хозяина. Для изучения ВЗК используется несколько различных мышиных моделей воспаления, некоторые из которых включают нокаутные модели, инфекционные модели, химические воспалительные модели и модели переноса Т-клеток 5,6,7,8. Хотя каждый из них может изучать определенные этиологические аспекты ВЗК, такие как генетическая предрасположенность, барьерная дисфункция, иммунная дерегуляция и микробиом, они ограничены в своих возможностях изучать многофакторную природу заболевания.

За последнее десятилетие было установлено, что кишечные органоиды, включая энтероиды и колоноиды, являются полезной моделью in vitro для изучения не только динамики кишечных стволовых клеток, но и их роли, барьерной целостности и функции кишечного эпителия в кишечном гомеостазе и заболевании. Эти сущности внесли значительный вклад в наше понимание патогенеза ВЗК9 и открыли новые возможности для персонализированной медицины. Колоноиды, или самоорганизующиеся культуры тканей толстой кишки, полученные из стволовых клеток, были выведены как из мышиных, так и из человеческих тканей в процессе, который позволяет стволовым клеткам, находящимся в кишечных криптах, размножаться и поддерживаться втечение неопределенного времени. Ниша стволовых клеток in vivo зависит от внеклеточных факторов для поддержки их роста, в частности, канонических сигнальных путей Wnt и сигнальных путей костного морфогенного белка11. Добавление этих факторов способствует здоровью и долголетию колоноидов, но также приводит культуру к состоянию, подобному стволовым клеткам, которое не отражает клеточную архитектуру эпителия in vivo, которая состоит как из самообновляющихся, так и из терминально дифференцированных клеток12,13. В то время как функциональность кишечного эпителия зависит от постоянных перекрестных помех между компартментом стволовых клеток и дифференцированными клетками, возможность иметь и то, и другое в системе колоноидных культур довольно ограничена. Несмотря на эти ограничения, система органоидных культур остается золотым стандартом для изучения внутренних свойств эпителия ex vivo. Тем не менее, для ответа на поставленный научный вопрос, возможно, потребуется рассмотреть альтернативные культурные стратегии.

Было показано, что у мышей, получающих непрерывный 7-дневный режим приема декстрана сульфата натрия (DSS), развивается как воспаление эпителия, так и барьерная дисфункция14. Кроме того, сбой митохондриального биогенеза и метаболическое перепрограммирование в кишечном эпителии, которые, как было показано, проявляются при ВЗК человека, также были учтены в этой DSS-модели колита15. Тем не менее, наши предварительные данные показывают, что характеристики недостаточности митохондриального биогенеза не сохраняются у колоноидов, полученных из крипт животных, обработанных DSS (дополнительный рисунок 1). Таким образом, при изучении того, как воспаление приводит к эпителиальным изменениям при воспалении кишечника мышей, необходимо использовать альтернативные методы культивирования. Здесь мы излагаем разработанный нами протокол, который описывает: 1) как изолировать крипты от всей ткани толстой кишки для создания мышиных колоноидов, 2) как терминально дифференцировать эту клеточную популяцию, чтобы отразить клеточную популяцию в том виде, в каком она существует in vivo, и 3) как индуцировать воспаление в этой модели in vitro . Для изучения лекарственных взаимодействий в воспаленном эпителии мы разработали протокол для создания 2-мерных (2D) монослоев из мышиных колоноидов, которые могут быть базально обработаны медиаторами воспаления и апикально обработаны лекарственной терапией.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с использованием мышиных тканей, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга и проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по исследованиям и уходу за животными в Университете Питтсбурга и UPMC.

1. Подготовка к культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты перечислены в разделе «Таблица материалов », а все составы растворов можно найти в таблице состава растворов (Таблица 1).

  1. Приготовьте средство для мытья мышей, как описано в таблице 1. Хранить при температуре 4°C до 2 месяцев.
  2. Подготовьте буфер изоляции крипты 1 (CIB1), как описано в таблице 1. Хранить при температуре 4°C до 2 месяцев.
    ВНИМАНИЕ: Дитиотрейтол (DTT) считается опасным в соответствии со стандартом OSHA Hazard Communication Standard из-за потенциальной острой токсичности при проглатывании и повреждения кожи и глаз при его воздействии на эти области. При работе с этим химическим веществом следует использовать защитные перчатки, средства защиты глаз и лица.
  3. Подготовьте буфер изоляции крипты 2 (CIB2), как описано в таблице 1. Хранить при температуре 4°C до 2 месяцев.
  4. Готовят L-WRN-кондиционированную среду в соответствии с ранее опубликованным протоколом16.
  5. Подготовьте полную колоноидную среду, как описано в таблице 1. Полная колоноидная питательная среда может храниться до 5 дней при 4°C без потери активности.
  6. Приготовьте дифференцирующую среду, как описано в таблице 1. Этот протокол был изменен по сравнению с ранее опубликованной статьей17. Дифференцирующая среда может храниться до 5 дней при 4°C без потери активности.
  7. Приготовьте медиаторную среду воспаления, как описано в таблице 1. Этот протокол был изменен по сравнению с ранее опубликованной статьей18. Медиаторная среда воспаления может храниться до 5 дней при температуре 4°C без потери активности.
  8. Приготовьте мышиную монослойную среду. Опустите Y-27632 при воздействии на монослои воспалительных факторов и/или лекарств. Монослойная среда для мышей может храниться до 5 дней при температуре 4°C без потери активности.
  9. Приготовьте медиатор воспаления однослойной средой. Однослойная среда медиатора воспаления может храниться до 5 дней при температуре 4°С без потери активности.

2. Выделение крипты из ткани толстой кишки мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Переложите салфетку на лед. Выньте необходимое количество мембранной матрицы основания из хранилища при температуре −20 °C и разморозьте на льду. Каждая 24-луночная мембрана покрыта 15 мкл матрицы базальной мембраны. Подготовьте CIB1, CIB2 и полную питательную среду, как описано в разделе 1.

  1. Усыпите мышь C57BL/6J (в возрасте 6-8 недель) в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию, и извлеките дистальный конец толстой кишки (примерно 5-7 см) с помощью чистого пинцета и ножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании испытуемых усыпляли с помощью инкубации в углекислотной камере в течение 2-3 мин с последующим вывихом шейки матки.
    1. Для этого положите мышь на спину, сделайте горизонтальный разрез чуть ниже грудной клетки, а затем вертикальный разрез от середины горизонтального разреза к основанию хвоста, чтобы обнажить брюшную полость.
    2. С помощью пинцета переместите тонкую кишку из поля, определите толстую кишку и проследите за ней вниз до основания хвоста. При необходимости разбейте таз ножницами, чтобы полностью обнажить дистальный отдел толстой кишки. Ножницами отрежьте самые дистальные 5-7 см толстой кишки.
  2. Положите ткань толстой кишки на чистую поверхность. Удалите избыток серозного жира, который окружает толстую кишку. Удалите фекалии, промыв просветное содержимое толстой кишки фосфатно-солевым буфером (DPBS) Dulbecco с помощью шприца, прикрепленного к игле 18 G 1 1/2. Затем поместите толстую кишку в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл ледяного DPBS, и поместите ее на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы изолируете толстую кишку от более чем одного животного, положите ткань на лед, прежде чем перейти к следующему животному.
  3. Перенесите ткань толстой кишки в чашку Петри с 10 мл ледяного DPBS и дважды промойте просвет DPBS с помощью пипетки P1000.
  4. Откройте толстую кишку продольно с помощью ножниц и осторожно встряхните пинцетом в течение ~30 с в DPBS, чтобы удалить оставшееся фекальное содержимое.
  5. Перенесите ткань в новую чашку Петри с 10 мл ледяного DPBS и снова осторожно встряхните пинцетом, прежде чем разрезать толстую кишку на кусочки по 2 см ножницами и поместить их в коническую пробирку объемом 50 мл с 7 мл ледяного CIB1. Инкубируют ткань в CIB1 на льду в течение 20 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные шаги выполняются в шкафу биологической безопасности.
  6. Переложите ткань пинцетом в предварительно нагретую коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 7 мл CIB2, и инкубируйте на водяной бане при температуре 37°C в течение 5 минут.
  7. Извлеките CIB2 из конической пробирки объемом 50 мл, дав ткани осесть на дне конической пробирки, а затем пипетируя CIB2. Затем добавьте 10 мл ледяного средства для мытья мышей в ту же коническую пробирку.
  8. Возьмите новую коническую пробирку объемом 50 мл и поместите фильтр 70 мкм поверх открытой пробирки.
  9. Удерживая пробирку с содержимым толстой кишки, поверните руку примерно на 45°. Встряхните трубку, покачиваясь и энергично, в течение 45 секунд, чтобы освободить крипты. Затем перелейте суспензию крипты через ситечко с ячейками 70 мкм в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
  10. С помощью пинцета поместите ткань толстой кишки обратно в пустую коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте 10 мл ледяного средства для мытья мышей. Возьмите новый сетчатый фильтр для клеток размером 70 мкм и поместите его на коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую предыдущий отфильтрованный раствор.
  11. Снова возьмите пробирку объемом 50 мл, содержащую фрагменты крипты, и встряхните ее идентично, как в шаге 2.9. Отфильтруйте среду через ситечко с ячейками 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы соединить ее с ранее отфильтрованными криптами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если выход крипты низкий, встряхните ткань толстой кишки еще один раз, поместив ткань в пустую коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл средства для промывки мышей. Встряхните ткань в течение 45-50 с, чтобы освободить крипты. Также, если доходность крипты низкая, то увеличьте энергичность встряхивания. Наконец, если общий выход крипт низкий, пипетки и пробирки могут быть покрыты фетальной бычьей сывороткой (FBS), чтобы предотвратить прилипание ткани к пластику.
  12. Центрифугу в конической пробирке объемом 50 мл, содержащей отфильтрованные крипты, в концентрации 300 x g в течение 5 мин при 4°C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На дне конической пробирки объемом 50 мл должна находиться гранула.
  13. Сцедите среду с помощью пипетирования, повторно суспендируйте крипты, пипетируя вверх и вниз 10 мл ледяного средства для промывки мышей, и перелейте в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4°C.
  14. Чтобы получить более чистый препарат, промойте крипты дополнительными 10 мл средства для мытья мышей. Сцедите предыдущую среду и снова суспендируйте крипты, пипетируя вверх и вниз в 10 мл средства для мытья мышей. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4°C с помощью конической пробирки объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при пипетировании среды, так как иногда гранулы центрифугируются неплотно. Если гранула не плотная, удалите пипеткой большую часть среды, оставив от 500 мкл до 1 мл. Затем повторно суспендируйте гранулу путем пипетирования в 10 мл средства для мытья мыши и перелейте раствор в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугирование в конической пробирке меньшего размера может улучшить герметичность гранулы.
  15. Сцедите среду и снова суспендируйте крипты, пипетируя вверх и вниз 10 мл ледяного средства для мытья мышей. После ресуспендирования подсчитайте крипты под светлопольным микроскопом, немедленно пипетируя 10 мкл среды на предметное стекло.
    1. Поместите две капли по 10 мкл на отдельные концы предметного стекла и подсчитайте количество крипт в каждой капле. Усредните числа между двумя каплями, чтобы определить количество крипт на 10 мкл. Умножьте это число на 100, чтобы получить количество крипт в 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для точного подсчета 10 мкл суспензии крипт должны быть немедленно удалены после ресуспензии. В противном случае крипты упадут на дно трубы, что приведет к нетточному подсчету.
  16. С целью покрытия 300-500 крипт на лунку, переложите соответствующий объем крипт, ресуспендированных в промывочной среде для мыши, в новую коническую пробирку объемом 15 мл и доведите до 10 мл ледяной промывочной средой для мыши. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 минут при 4°C. На дне тюбика должна быть видна маленькая гранула.
  17. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Используйте пипетку P200, чтобы осторожно удалить остатки среды, оставив только гранулы.
  18. Ресуспендируйте гранулу в соответствующем количестве ледяной мембранной матрицы, медленно пипетируя вверх и вниз. Будьте осторожны, чтобы не занести пузырьки при повторном суспендировании гранулы крипты. Планшет 300-500 крипт/15 мкл матрицы базальной мембраны в каждой лунке планшета. После нанесения покрытия переверните планшет для культуры тканей и поместите его в инкубатор при температуре 37°C на 10-20 минут.
  19. Переверните планшет и добавьте 500 мкл полной колоноидной среды мыши в каждую лунку. Меняйте носители через день, пока они не будут готовы к прохождению. Отсаживают колоноиды каждые 3-5 дней.

3. Пассаж колоноидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина, как правило, может быть проходима от 1:4 до 1:6 в зависимости от плотности исходной скважины. Выньте необходимое количество матрицы базальной мембраны при температуре −20°C и поместите ее на лед, чтобы она оттаяла. Колоноиды можно использовать для экспериментов после двух проходов. При прохождении колоноидов этапы выполняются в шкафу биологической безопасности для предотвращения загрязнения.

  1. Удалите среду из лунок, которые необходимо пройти.
    1. Если в матрице базальной мембраны есть мусор, что может произойти во время первоначальной изоляции, для очистки от мусора можно использовать следующий протокол:
      1. Добавьте 1 мл ледяного 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в DPBS без Ca 2+ или Mg2+ в каждую лунку. Оставьте на 5 минут в шкафу биологической безопасности.
      2. Проведите пипеткой вверх и вниз от трех до семи раз с помощью пипетки P1000, чтобы нарушить матрицу базальной мембраны, и соберите содержимое лунок в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируют колоноиды в общей сложности 5-10 мл 0,1% БСА в DPBS без Ca 2+ или Mg2+. Доведите до соответствующего объема 0,1% BSA.
      3. Центрифуга при 150 x g в течение 5 минут при 4°C, чтобы гранулировать колоноиды, но не мусор.
      4. Декантировать DPBS путем пипетирования, оставляя гранулы. Добавьте 1 мл реагента для ферментативной диссоциации комнатной температуры (RT) и пипетку три-пять раз.
      5. Поместите коническую пробирку объемом 15 мл с реагентом для ферментативной диссоциации и разрушенными колоноидами на водяную баню с температурой 37°C на 3-4 минуты.
      6. Снимите тюбик с водяной бани, пипеткой 3-5 раз, а затем доведите до 10 мл со средством для мытья мыши. Перейдите к шагу 3.6.
  2. Поместите 500 мкл реагента для ферментативной диссоциации RT в каждую лунку и дайте ему постоять примерно 1 минуту, прежде чем пипетировать вверх и вниз от трех до семи раз, чтобы разрушить матрицу базальной мембраны.
  3. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37°C на 3-4 минуты.
  4. Извлеките планшет из инкубатора и проведите пипеткой вверх и вниз от трех до семи раз, используя пипетку P1000, чтобы диссоциировать колоноиды.
  5. Перелейте содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте до 10 мл ледяного средства для мытья мышей.
  6. Центрифугируют образец при 300 x g в течение 5 мин при 4°C.
  7. При необходимости удалите среду с помощью силовой пипетки и пипетки P200 так, чтобы в конической пробирке осталась только гранула.
  8. Ресуспендируйте в соответствующем количестве ледяной мембранной матрицы основания, осторожно пипетируя вверх и вниз в зависимости от того, сколько лунок должно быть покрыто. Не вводите пузырьки при пипетировании. Поместите фрагменты колоноида в 15 мкл капель матрицы базальной мембраны на лунку.
  9. Протащите крипты, переверните планшет для культуры тканей, а затем поместите планшет в инкубатор при температуре 37°C на 10-20 минут.
  10. Наконец, переверните пластину и добавьте 500 мкл полной колоноидной среды мыши в каждую лунку. Меняйте среду через день, пока они не станут достаточно большими, чтобы их можно было снова пропустить примерно через 3-5 дней.

4. Терминальная дифференцировка клеток толстой кишки

  1. Пропустите колоноиды, как указано выше, и добавьте 500 мкл полной колоноидной среды мыши в каждую лунку.
  2. Не менее чем через 48 ч после пассажа удалите всю колоноидную среду мыши и добавьте 500 мкл дифференцирующей среды в каждую лунку (см. раздел 1).
  3. Инкубируют колоноиды с дифференцирующими средами в течение 48 ч, после чего их можно использовать в экспериментах, в том числе для сбора РНК и белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колоноиды могут быть оценены на дифференцировку путем сбора РНК и оценки экспрессии Lgr5 и Ki67, маркера стволовых клеток и маркера пролиферации клеток, соответственно, с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (кПЦР). Терминально дифференцированные клетки должны иметь относительно низкую экспрессию Lgr5 и Ki67 по сравнению с колоноидами, выращенными в традиционной колоноидной среде, где клетки более стволовые. Продолжительность времени, в течение которого колоноиды должны инкубироваться в дифференцирующей среде, может быть оптимизирована для каждой отдельной лаборатории. Список грунтовок см. в Дополнительной таблице 1 .

5. Индуцирование воспаления в дифференцированных колоноидах с медиаторами воспаления

  1. После инкубации колоноидов в течение 2-3 суток с дифференцирующей средой существующую среду удаляют и добавляют в каждую лунку по 500 мкл медиаторной среды воспаления.
  2. Дайте лункам инкубироваться в течение 24-72 ч, прежде чем собирать РНК и белок (или оценивать другие последующие параметры). Меняйте носитель каждый день.

6. Монослои кишечного эпителия, полученные из установленных мышиных колоноидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Монослои кишечника мышей получены из мышиных колоноидов, которые были пассированы не менее двух раз. Чтобы обеспечить успешное формирование монослоя за 3-5 дней, крайне важно не разделять колоноиды на отдельные клетки. Фрагментированные органоиды, которые были ферментативно диссоциированы в клеточные кластеры, идеально подходят для роста.

  1. Подготовьте все реактивы перед началом эксперимента. Разморозьте матрицу базальной мембраны на льду. Приготовьте монослойную среду для мышей, как описано в разделе 1. Разбавьте оттаявшую базальную мембрану в соотношении 1:20 холодной мышиной монослойной средой. Держите на льду.
  2. С помощью стерильных щипцов поместите прозрачную вставку клеточной культуры размером 0,4 мкм в одну лунку 24-луночного планшета для культуры тканей (таблица материалов). Возьмитесь за угловой зубец вкладыша и перенесите его в колодец. Повторяйте до тех пор, пока не будет доступно соответствующее количество вставок для культуры клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что дополнительная контрольная яма покрыта только матрицей базовой мембраны. Эта вставка для клеточной культуры будет использоваться для измерения фонового сопротивления вставки клеточной культуры без присутствующих клеток, как описано в следующем шаге (шаг 6.3).
  3. С помощью пипетки P200 покройте апикальную (верхнюю) поверхность каждой вставки для клеточной культуры 150 мкл разбавленной матрицы базальной мембраны. Поместите наконечник пипетки в центр вкладыша, не касаясь мембраны вкладыша, и осторожно выдавите раствор. Поместите планшет в стерильный инкубатор с температурой 37°C с 5% CO2 не менее чем на 1 ч.
  4. Перед использованием осторожно снимите матрицу базальной мембраны и дайте вставкам клеточных культур высохнуть в шкафу биологической безопасности в течение не менее 10 минут.
    1. Чтобы удалить матрицу базальной мембраны, поверните 24-луночную пластину под углом 45°. Поместите один палец на угол штыря, чтобы стабилизировать пластину, и с помощью пипетки P200 осторожно поместите наконечник пипетки вдоль нижней стороны вставки и снимите матрицу.
    2. Удалите излишки остатков, промыв каждую вставку клеточной культуры 150 мкл стерильного DPBS без Ca 2+ или Mg2+.
  5. После 10 мин сушки добавьте 400 мкл мышиной монослойной среды на дно вставки для клеточной культуры и 75 мкл сверху. Повторяйте до тех пор, пока все вкладыши для клеточных культур не будут погружены. Оставьте планшет в шкафу биологической безопасности или поместите его обратно в инкубатор до тех пор, пока он не понадобится.
  6. Извлеките 24-луночную пластину зрелых (органоиды на 3-5 день роста) кишечных колоноидов из инкубатора с температурой 37°C, 5%CO2 и поместите ее под шкаф биологической безопасности. Удалите среду стерильными наконечниками и промойте каждую лунку 1 мл стерильного DPBS RT (без Ca 2+ или Mg2+).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельная лунка из 75-125 зрелых колоноидов разбивается в соотношении 1:4.
  7. Удалите DPBS без Ca 2+ или Mg2+ с помощью стерильных наконечников и расщепите каждую пробку матрицы базальной мембраны, поместив 500 мкл реагента для ферментативной диссоциации RT в каждую лунку, которую необходимо пройти.
  8. Пропитывайте каждую лунку вверх и вниз примерно 6-10 раз, чтобы разбить пробку. Не царапайте нижнюю часть пластины, чтобы снять заглушку. Вместо этого поверните 24-луночную пластину под углом 45°, поместите наконечник пипетки на край пробки и осторожно сдвиньте ее.
  9. Поместите 24-луночный планшет обратно в стерильный инкубатор с температурой 37°C, 5%CO2 на 3-4 минуты.
  10. Снимите планшет и протрите реагент для ферментативной диссоциации вверх и вниз пять-семь раз для каждой лунки под шкафом биологической безопасности. Переложите диссоциированные колоноиды из каждой лунки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Доведите объем до 10 мл ледяным средством для мытья мыши.
  11. Центрифугируйте частично переваренные колоноиды при 300 x g при 4°C в течение 5 мин в центрифуге с качающимся ковшом.
  12. Под шкафом биологической безопасности удалите надосадочную жидкость из гранулы с помощью пипетки объемом 10 мл. Удалите оставшуюся среду с помощью пипетки P200. Ресуспендируйте колоноидную гранулу в мышиной однослойной среде. Добавляют 75 мкл среды на каждую вставку клеточной культуры фрагментированных колоноидов, подлежащих нанесению.
  13. Добавьте 75 мкл колоноидной суспензии в центр каждой вставки для клеточной культуры. Перед добавлением колоноидной суспензии в каждую лунку осторожно пропитывайте вверх и вниз один или два раза, прежде чем удалить 75 мкл, что обеспечивает более равномерное покрытие.
  14. Поместите 24-луночный планшет со вставками для клеточных культур на вращающуюся платформу на 10 минут, чтобы обеспечить равномерное диспергирование по всей вставке для клеточной культуры.
  15. Поместите планшет в стерильный инкубатор с 5%СО2 при температуре 37°C.
  16. На следующий день (день 1) сместите неприкрепленные фрагменты толстой кишки, пипетируя среду вверх и вниз три-пять раз пипеткой P200. Осторожно поместите наконечник рядом с внутренней стороной вкладыша для клеточной культуры, чтобы не нарушить прикрепленные клетки кишечника. Не вводите пузырьки в среду, так как это препятствует удалению всех неприкрепленных фрагментов.
  17. Сразу же удалите смесь среды и колоноида. Повторяйте до тех пор, пока все вкладыши для клеточных культур не будут очищены.
  18. Осторожно добавьте 150 мкл предварительно подогретой мышиной монослойной среды на апикальную сторону каждой вставки для клеточной культуры. Добавьте 400 мкл нагретой мышиной монослойной среды в каждую лунку новой 24-луночной планшета. Перенесите вкладыш с клеточной культурой на новую пластину, захватив ее штырь стерильными щипцами. Меняйте носитель через день до слияния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты колоноида должны образовать сливающийся монослой через 3-5 дней после нанесения покрытия.

7. Измерение чистого сопротивления эпителиальных монослоев с помощью вольтомметра на 3 - 5 сутки культивирования монослоя

ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды для еды напоминают щипцы и имеют асимметричную длину. Более длинное плечо зонда является базолатеральным электродом, а более короткое плечо — апикальным электродом. Зонд может быть трудно вставить между внутренней и внешней стороной вставки для клеточной культуры. Размещение зонда под небольшим углом при введении с последующим вертикальным выпрямлением зонда предотвратит застревание зонда. Убедитесь, что нетто-сопротивление каждой вставки для клеточной культуры находится под одинаковым углом, так как это может повлиять на значения.

  1. Поместите вольтомметр и все реактивы в шкаф биологической безопасности.
    1. Подключите вольтомметр к ближайшей розетке переменного тока, а пластиковый модульный разъем электродного щупа — к разъему INPUT на переднем дисплее.
    2. Чтобы расположить вольтомметр под углом 45°, поверните металлический кронштейн на задней стороне оборудования наружу, пока он не зафиксируется на месте.
    3. Теперь включите вольтомметр, повернув выключатель питания вверх на переднем дисплее. Наконец, переместите переключатель вверх в сторону OHMS, чтобы отобразить показания в этой метрике.
  2. Извлеките 24-луночную пластину из инкубатора с содержанием CO2 при температуре 37 °C, 5%CO2 и положите ее в шкаф биологической безопасности. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) чувствительно к температуре. Снимайте пластину только непосредственно перед считыванием TEER.
  3. Стерилизовать электродный зонд в предварительно нагретом 70% этаноле в течение от 30 с до 1 мин. Снимите зонд, переверните и проведите им один-два раза, чтобы удалить излишки этанола. Дайте зонду высохнуть на воздухе в течение примерно 30 секунд.
  4. Смойте оставшийся на зонде этанол предварительно подогретым средством для мытья мышей.
    ВНИМАНИЕ: Не допускайте, чтобы оставшиеся капли этанола, расположенные выше на зонде, попали во вставку с клеточной культурой. При смывании этанола со средой не позволяйте среде подниматься выше стерильного поля этанола. Это может привести к попаданию загрязненной среды во вставку клеточной культуры.
  5. Держите зонд перпендикулярно вставке для клеточной культуры. Вставьте базолатеральный электрод (более длинный конец зонда) на внешнюю сторону вкладыша для клеточной культуры, пока он не коснется основания 24-луночного планшета. Вставьте апикальный электрод (более короткий конец зонда) во вставку для клеточной культуры. Не изменяйте расстояние между двумя электродами от лунки к лунке. Это повлияет на измерение TEER.
  6. Убедитесь, что апикальный электрод не касается основания вкладыша для клеточной культуры, прежде чем считывать TEER. Начните с фоновой вставки культуры и запишите значение. Значение будет автоматически отображаться в цифровом виде на передней панели вольтомметра.
  7. Повторите шаги 7.5-7.6 для каждой вставки клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если между вставками для клеточных культур существуют различные экспериментальные условия, стерилизуйте зонд между каждым новым состоянием. Начните с шага 7.1 и пройдите шаги в числовом исчислении.
  8. Поместите 24-луночный планшет обратно в инкубатор после того, как все измерения TEER будут записаны.
  9. Нетто-значения на уровне 350 Ω и более указывают на образование монослоя. Повторяйте снова в последующие дни до тех пор, пока не будет достигнуто образование монослоя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, значения 1 000 Ω или больше могут быть зафиксированы на 3-й день, но со временем все они сойдутся к меньшему числу около 350 Ω.

8. Расчет TEER с помощью измерений чистого сопротивления с помощью вольтомметра

ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное формирование монослоя колоноидов даст измерения TEER более 115 Ω·см2.

  1. Возьмите отдельные значения чистого сопротивления и вычтите чистое сопротивление из фонового колодца. Вставки для клеточных культур, покрытые мембраной базального матрикса, дают нетто-показания около 100 Ω.
  2. Возьмите измерения чистого сопротивления с вычитанием фона и умножьте их на площадь поверхности вставки для клеточной культуры. 24-луночная вставка для клеточных культур имеет площадь поверхности 0,33 см2 .
  3. Если значения составляют 115 Ω·см2 или более, переходите к последующему экспериментальному анализу.

9. Индуцирование воспаления в эпителиальных монослоях с помощью медиаторов воспаления

  1. После того, как успешные монослои сформировались, добавьте медиаторы воспаления в культуру на базальной стороне культуры. Приготовьте монослойную среду медиатора воспаления, как описано на шаге 1.9, и добавьте 400 мкл в каждую лунку в новой 24-луночной планшете.
  2. Удалите среду с апикальной стороны вкладыша для клеточной культуры и добавьте 150 мкл мышиной монослойной среды без Y-27632. Не дополняйте эту сторону медиаторами воспаления. Однако, если гибель клеток кажется чрезмерной, оставьте Y-27632 в СМИ. Это должен определить конечный пользователь.
  3. Переносят вкладыши клеточных культур на новую 24-луночную пластину и помещают их в лунки, дополненные монослойной средой медиатора воспаления.
  4. Стимулируют монослои медиаторами воспаления в течение 24-72 ч, в зависимости от эксперимента.
  5. Чтобы протестировать лекарственные реакции с использованием этой модели воспаления, добавьте монослойную среду на апикальной стороне вкладыша в клеточную культуру препаратом выбора. Препарат может быть добавлен в любой момент эксперимента, в зависимости от механизма действия препарата и последующих параметров, подлежащих оценке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D система культивирования кишечных колоноидов является бесценным инструментом для изучения внутреннего вклада эпителия в гомеостаз слизистой оболочки кишечника. Описанный протокол содержит подробные инструкции о том, как изолировать крипты от мышей C57BL/6J (WT) в возрасте 8 недель и создать долгосрочную систему культивирования колоноидов, которой можно манипулировать для нескольких последующих применений. При выделении и покрытии крипт в базальном мембранном матриксе крипты выглядят плотными и многоклеточными по структуре при визуализации с помощью светлопольной микроскопии. Они могут быть сферической формы или удлиненными и цилиндрическими, напоминая единую криптическую структуру, которая обычно наблюдается в архитектуре кишечника in vivo (рис. 1A). К первому дню большинство крипт образуют компактную сферическую структуру, а у нескольких колоноидов начинает развиваться внутренний просвет (пустое пространство), лишенный эпителиальных клеток (рис. 1B). По мере того, как они продолжают расти в течение следующих нескольких дней, диаметры колоноидов продолжают увеличиваться, а просветы колоноидов становятся более четкими (рис. 1C). К 5-му дню каждый колоноид достигает примерно 100-250 мкм в диаметре, образуя большой, выступающий просвет, окруженный тонким слоем эпителиальных стволовых клеток (рис. 1D). В этот момент колоноиды как ферментативно, так и механически нарушаются для пассажа. После двух проходов их можно использовать для последующих экспериментов.

Чтобы оценить, сохраняются ли метаболические изменения, наблюдаемые в соскобах толстой кишки мышей, получавших DSS, в колоноидах, полученных от мышей, получавших тот же режим DSS, 8-недельных мышей WT обрабатывали 2% DSS в питьевой воде ad libitum. Животным контрольной группы WT соответствующего возраста и пола давали питьевую воду вволю без DSS. Через 7 дней мышей приносили в жертву, а крипты выделяли из толстой кишки как контрольных (n = 3, самец), так и обработанных DSS животных (n = 3, самец) для установления колоноидов. После двух пассажей белок выделяли из каждого набора колоноидов, а экспрессию пролифератора-активатора пероксисом рецептора-гамма-коактиватора-1α (PGC1α), главного белка-регулятора митохондриального биогенеза, оценивали с помощью вестерн-блоттинг-анализа (дополнительный рисунок 1). Не было существенной разницы в экспрессии PGC1α при сравнении колоноидов, полученных от мышей, получавших DSS, с колоноидами, полученными от контрольных мышей, что позволяет предположить, что эта методология культивирования колоноидов не отражает должным образом метаболические изменения in vivo , которые наблюдаются у мышей15.

Неспособность PGC1α инициировать митохондриальный биогенез во время воспалительного инсульта кишечника в первую очередь локализуется в дифференцированном эпителии толстой кишки15,19. Чтобы отразить изменения, наблюдаемые in vivo, мы решили направить колоноидов в более дифференцированное состояние. Чтобы вызвать этот сдвиг, колоноиды первоначально инкубировали с традиционной колоноидной средой. Через 24-48 ч колоноиды переводили на дифференцировочную среду еще на 48 ч. Во время дифференцировки небольшой процент колоноидов перешел из сферической архитектуры в почечные структуры, обогащенные бокаловидными клетками и колоноцитами17 (рис. 2A,B). Колоноиды, выращенные в среде с добавлением WRN, были обогащены быстро делящимися стволовыми клетками Lgr5+. Чтобы подтвердить, что стволовые клетки Lgr5+ и другие пролиферирующие клетки вышли из клеточного цикла во время дифференцировки, уровни мРНК были проанализированы с помощью кПЦР. Значительное снижение уровня Lgr5 (97%, p = 0,0023) и Ki67 (75%, p = 0,0007) наблюдалось у дифференцированных колоноидов (n = 6) по сравнению с колоноидами, выращенными в условиях традиционной культуры (n = 6; Дополнительный рисунок 2А,Б). Можно было бы также ожидать, что дифференцированные колоноиды будут в основном состоять из бокаловидных клеток, секретирующих слизь. Кроме того, фактически, MUC2 был повышен почти в два раза у дифференцированных колоноидов по сравнению с их традиционно выращенными собратьями (n = 3, p = 0,0433, дополнительный рисунок 3). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что колоноиды были успешно дифференцированы и были готовы к последующим экспериментам. Далее в дифференцировочную среду добавляли медиаторы воспаления, как описано в разделе 5 протокола. Белок и РНК собирали в течение 72 ч после введения медиаторов воспаления для анализа. Однако через 72 ч иногда наблюдалась повышенная гибель клеток.

Чтобы оценить, может ли введение медиаторов воспаления к дифференцированным колоноидам имитировать сбой митохондриального биогенеза, наблюдаемый как при ВЗК у человека, так и при острой модели мышиного колита, экспрессия белков PGC1α и фактора транскрипции А, митохондрий (TFAM) была оценена с помощью вестерн-блоттинг-анализа у дифференцированных колоноидов (n = 5), получавших медиаторы воспаления в течение 72 ч. Было показано, что экспрессия PGC1α снижена на мышиных моделях колита, а также у человека с ВЗК15. TFAM, белок, который управляет как транскрипцией, так и репликацией митохондриального генома, также был снижен в мышиных моделях колита, а экспрессия его генов была снижена при ВЗКчеловека 15,20. Мы наблюдали аналогичное снижение экспрессии PGC1α (50,4 %, p = 0,0442) и TFAM (88,9%, p = 0,004) у дифференцированных колоноидов после 72 ч воздействия этих медиаторов воспаления (рис. 3). В совокупности это говорит о том, что лечение дифференцированных колоноидов цитокинами является идеальной моделью для изучения митохондриальной динамики in vitro.

В то время как различные клеточные и молекулярные функции могут быть исследованы в условиях 3D-колоноидной культуры, двухмерные монослойные системы культивирования превосходят при оценке барьерной функции, взаимодействий между хозяином и патогеном и влияния перорально абсорбируемых терапевтических средств на воспаление21,22. Образование непрерывного слоя сливающихся клеток с неповрежденным барьером позволяет легко размещать различные биологические или химические агенты на апикальной и/или базальной стороне клеток. Этот протокол позволяет создавать 2D-монослойные культуры из ранее существовавших колоноидов WT, которые были пассированы дважды. Колоноиды, которые были ферментативно и механически разрушены, наносятся на вставки клеточных культур, покрытые матрицей базальной мембраны. При первичном покрытии фрагментированные колоноиды образуются в клеточные кластеры размером от 15 до 150 клеток (рис. 4А). К 3-му дню клетки начинают уплощаться и медленно покрывать вставку клеточной культуры, как правило, достигая слияния (рис. 4B). В течение следующих нескольких дней монослои продолжают расти и образуют непрерывный барьер, который может быть количественно измерен с помощью TEER (рис. 4C, D). Интересно, что измерения TEER колеблются от 3-го до 5-го дня. Монослои имеют более высокие значения на ранних стадиях с широким диапазоном (200-800 Ω·см2), но эти значения медленно сходятся к более низкому числу к 5-му дню (115-150 Ω·см2, рис. 5А). Когда монослои достигают стационарного состояния, их можно использовать для последующих экспериментов.

Для характеристики эпителиального ответа колоноидных монослоев на воспаление медиаторы воспаления помещали на базальную сторону (внешнюю сторону вставки) клеток в течение 48 ч. Выделение РНК и анализ уровней мРНК различных маркеров дифференцировки стволовых и клеточных клеток, а также соединительных белков с помощью кПЦР. Lgr5 не был обнаружен ни в одном из этих состояний, но другой маркер стволовых клеток, mTERT, был снижен почти на 60% в воспаленных монослоях по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения (дополнительный рисунок 4A). Далее мы проанализировали экспрессию двух маркеров дифференцированных типов клеток: Muc2 и щелочной фосфатазы (Alpi). Оба транскрипта мРНК были ниже в воспаленных монослоях по сравнению с контрольными клетками (дополнительный рисунок 4A). Как стволовые, так и постмитотические клетки обычно уменьшаются во время воспаления толстой кишки23,24,25, и аналогичная реакция наблюдалась в монослойной модели, полученной в этом исследовании.

Преимуществом однослойной системы является возможность оценки барьерной характеристики. Чтобы определить, был ли нарушен барьер в иммуностимулируемом состоянии, мы измерили значения TEER через 48 часов. Значения TEER для контрольных монослоев (n = 2) составляли в среднем 129,16 Ω·см2, но значительно снижались (p = 0,0087) до среднего значения 98,54 Ω·см2 в воспаленных монослоях (рис. 5B). Чтобы еще больше подтвердить, что барьер был нарушен при воспалительном состоянии, мы оценили уровни мРНК для трех различных маркеров плотных соединений: Zo-1, Окклюдина и Клаудина. Все три маркера имели более низкие уровни в воспаленном состоянии по сравнению с их невоспаленными аналогами (дополнительный рисунок 4B). В совокупности эти данные показывают, что барьерная дисфункция присутствует в воспаленных монослоях и имитирует барьерную дисфункцию, наблюдаемую во время патогенеза ВЗК.

Figure 1
Рисунок 1: Первичная изоляция мышиных крипт для установления долговременной колоноидной культуры. (А) На 0-й день 300-500 крипт были помещены в матрицу базальной мембраны (снимок получен через 5 ч после нанесения покрытия), а рост колоноидов был зафиксирован на 1-й день, 3-й день и 5-й день (D). На 5-й день колоноиды были готовы к прохождению. Увеличение = 10х; Масштабная линейка = 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Установление терминально дифференцированных колоноидов из традиционной колоноидной культуры. Дифференцировочную среду помещали на колоноиды через 48 ч после пассажа мышиных колоноидов. Через (А) 24 ч и (В) 48 ч колоноиды обогащаются терминально дифференцированными клетками. Увеличение = 10х; Масштабная линейка = 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Экспрессия белков PGC1α и TFAM у мышей дифференцированных колоноидов, обработанных медиаторами воспаления. Среду, дополненную медиаторами воспаления, помещали на дифференцированные колоноиды, а белок собирали через 0 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после воздействия. (A) Экспрессия белка PGC1α показала общее значимое снижение (p = 0,0442) в течение 72 ч. TFAM был значительно снижен (p = 0,004) после воздействия медиаторов воспаления через 72 ч, и (B) наблюдалась тенденция к снижению экспрессии белка через 24 ч, 48 ч и 72 ч при анализе с помощью ANOVA. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. *p < 0,05, **p < 0,005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Образование и рост монослоев из ранее существовавших колоноидов. Колоноиды, которые были ферментативно и механически разрушены, были нанесены на вставки клеточных культур, покрытые матрицей базальной мембраны. При первоначальном покрытии фрагментированные колоноиды появились в (А) клеточных кластерах, а к (Б) 3-му дню они начали сплющиваться и медленно покрывать вставку клеточной культуры. (C) На 5-й и (D) 7-й день монослои продолжали расти, образуя непрерывный барьер, который можно было количественно измерить с помощью TEER. Увеличение = 10х; Масштабная линейка = 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Значения TEER для создания монослоев, полученных из колоноидов, и воспаленных монослоев. (A) Значения TEER измеряли с помощью вольтомметра с 3-го по 5-й день. Монослои имели более высокие значения ранее с широким диапазоном, но медленно сходились к более низкому числу к 5-му дню. Как только монослои достигают устойчивого состояния, их можно использовать для последующих экспериментов. (B) Значения TEER были ниже в воспаленных монослоях (n = 2) по сравнению с невоспаленными контрольными группами (n = 2). Контрольные монослои имели среднее значение TEER 129,16 Ом·см2, а TEER воспаленных монослоев было значительно ниже (p = 0,0087), со средним значением 98,54 Ω·см2, при анализе с помощью t-критерия. **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Таблица состава раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Экспрессия белка PGC1α в мышиных колоноидах, выращенных в традиционной колоноидной среде, выделенной из контрольной группы WT и 2% мышей, получавших DSS. Колоноиды были получены как от 8-недельных мышей контрольной группы WT, так и от 2% мышей, получавших DSS, через 7 дней. Белок выделяли из колоноидов, пассированных дважды и на 4-е сутки после нанесения покрытия. Не было выявлено различий в экспрессии белка PGC1α (p = 0,9996) у колоноидов, полученных от контрольных мышей, по сравнению с мышами, получавшими 2% DSS в течение 7 дней при анализе с помощью непарного t-критерия. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Снижение экспрессии мРНК Lgr5 и Ki67 у дифференцированных колоноидов. Мышиные колоноиды, пассированные за 48 ч до этого, подвергались воздействию дифференцировочной среды в течение 48 ч перед выделением синтеза РНК и кДНК. Уровни мРНК определяли методом кПЦР и анализировали методом сравнительной КТ. (A) Lgr5 и (B) Ki67 были достоверно снижены у дифференцированных колоноидов при статистическом анализе с помощью t-критерия (p = 0,0023, p = 0,0007). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения.**p < 0,005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Увеличение количества бокаловидных клеток, секретирующих муцин, у дифференцированных мышиных колоноидов. Мышиные колоноиды, пассированные за 48 ч до этого, подвергались воздействию дифференцировочной среды в течение 48 ч. Клетки лизировали в буфере RIPA, а белок визуализировали с помощью вестерн-блоттинг-анализа. (А) Экспрессия MUC2 была увеличена в каждом наборе дифференцированных колоноидов по сравнению с недифференцированными колоноидами. (Б) В условиях дифференцировки наблюдалось почти двукратное изменение белка MUC2, что было значимым при анализе с помощью t-критерия (p = 0,0433). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Снижение экспрессии маркеров стержня и дифференцировки, а также маркеров плотных соединений в монослоях, обработанных медиаторами воспаления. Монослои колоноидов мышей (5-й день) подвергали воздействию медиаторов воспаления в течение 48 ч, затем собирали РНК и синтезировали кДНК (n = 2). Уровни мРНК маркеров ствола, дифференцировки и соединений определяли методом кПЦР и анализировали методом сравнительной КТ. (A) Маркер стволовых клеток, Lgr5, не был обнаружен ни при одном из состояний, но mTERT был существенно снижен при воспалительных состояниях. Маркер бокаловидных клеток, Muc2, и маркер колоноцитов, Alpi, были снижены в воспаленных монослоях по сравнению с необработанными монослоями. (B) Маркеры плотных соединений, Zo-1, Окклюдин и Клаудин, были ниже в монослоях, обработанных воспалением, по сравнению с контрольной группой. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Перечень грунтовок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разработка органоидов произвела революцию в том, как научное сообщество изучает системы органов in vitro , с возможностью частичного повторения клеточной структуры и функции животного или человека в чашке. Кроме того, органоидные системы, полученные от людей с заболеваниями, предлагают многообещающий инструмент для персонализированной медицины, который может направлять принятие терапевтических решений. В этой статье мы опишем хорошо работающий протокол изоляции крипт и познакомим вас с ключевыми шагами, позволяющими очистить изоляцию от лишнего мусора перед нанесением покрытия. Кроме того, мы объясняем ключевую деталь, которую часто упускают из виду в процессе — возможность точного подсчета крипт для обшивки. После того, как колоноиды сформированы, мы описываем основные манипуляции, которые позволяют их клеточной дифференцировке или формированию монослоя, что может улучшить способность изучать изменения в эпителии кишечника при ВЗК.

Ось крипт-ворсинка в эпителии толстой кишки у млекопитающих представляет собой сложную структуру, состоящую из различных типов клеток с разными функциями. Поддержание этой оси зависит как от внутренних, так и от внешних клеточных факторов, которые вместе помогают поддерживать гомеостаз эпителия18. Мы отметили, что мышиные колоноиды, выращенные в традиционной среде, в первую очередь отражают стволовые клетки, в отличие от конгломерата стволовых клеток и терминально дифференцированных клеток, который наблюдается in vivo. Более того, мышиные колоноиды, выращенные и поддерживаемые таким образом, представляют собой круглые структуры, а не плоские монослои. Эти различия имеют потенциальные последствия для наших попыток изучить кишечные заболевания in vitro. В частности, мы ограничены в наших возможностях использовать органоиды для изучения изменений барьерной функции, а также влияния воспаления на терминально дифференцированные эпителиальные клетки кишечника.

Здесь мы опишем протоколы не только для изоляции мышиных крипт для выращивания колоноидов, но и для манипуляций с этими колоноидами для изучения физиологии кишечного эпителия и эпителиальной реакции на воспаление. Среди нескольких внешних факторов, способствующих градиенту плюрипотентных стволовых клеток и терминально дифференцированных клеток, есть канонический путь Wnt, который богат криптами и способствует здоровью стволовых клеток. Передача сигналов Wnt уменьшается на кончике оси крипты, что совпадает с эволюцией стволовых клеток в терминально дифференцированные клетки26. Мы описали протокол, который позволяет осуществлять терминальную дифференцировку колоноидных клеток. Как и другие, мы дифференцируем удаление Wnt из питательной среды, но используем более низкую концентрацию R-спондина (500 нг/мл против 1 мкг/мл R-спондина)17. Удивительно, но снижение R-спондина на 50% не влияет на успешную дифференцировку органоидов. Способность к дифференциации с более низкой концентрацией помогает создать менее искусственную систему, которая может быть более похожа на физиологическую среду in vivo. Несмотря на то, что этот протокол приводит к конечной терминальной дифференцировке (дополнительный рисунок 2 и дополнительный рисунок 3) и неспособности поддерживать клеточное бессмертие, он, тем не менее, является полезным методом для лучшего понимания физиологического вклада терминально дифференцированного эпителия, включая колоноциты, энтероэндокринные клетки и бокаловидные клетки, в ВЗК и другие болезненные состояния. Кроме того, мы показываем, что добавление в эту среду специфических цитокинов, которые традиционно повышены у пациентов с ВЗК, направляет дифференцированную органоидную систему к воспалительному состоянию. В течение 72 ч дифференцированные колоноиды, обработанные воспалительными цитокинами, более точно отражают некоторые метаболические результаты, показанные в других установленных моделях колита и ВЗК человека (рис. 3). Кроме того, дифференцированные колоноиды, обработанные таким образом, вероятно, в большей степени отражают влияние воспаления на клеточный гомеостаз дифференцированного эпителия. Мы также описали протокол разработки монослоев, который позволяет формировать как апикальную, так и базальную сторону эпителия, что позволяет анализировать барьерную функцию in vivo. Эта система полезна для изучения механизмов барьерной дисфункции без необходимости дифференциации и культивирования новых терапевтических мишеней для лечения.

Следует отметить несколько ограничений и потенциальных подводных камней, связанных с описанными выше протоколами. Успешная изоляция крипт и развитие колоноидов могут быть ограничены выходом крипт от каждого животного, точностью подсчета крипт и чистотой приготовления. Скорость подсчета изолированных крипт после ресуспензии, вариации механической диссоциации крипт от нижележащих мускуляров, а также количество промывок и центробежных спинов способствуют успешному культивированию колоноидов. Кроме того, крайне важно не допустить полного разделения органоидов на отдельные клетки во время пассажа или нанесения покрытия для 2D-монослойной культуры. Кластеры от 30 до 50 клеток идеально подходят для того, чтобы культура могла размножаться для длительного культивирования. В приведенных выше протоколах указаны области потенциальных подводных камней и необязательные дополнительные шаги для устранения этих проблем. В конечном счете, протокол может потребовать оптимизации со стороны индивидуума, выполняющего изоляцию, из-за присущей ему вариативности в наборе навыков и маневров (т.е. встряхивании), а также вариаций у каждого животного. Конечному пользователю может потребоваться дополнительная оптимизация, чтобы зафиксировать генетическое и молекулярное разнообразие, обнаруженное при ВЗК.

В конечном счете, несмотря на то, что колоноидная система является очень полезным инструментом для повторения ключевых аспектов физиологии человека и болезней in vivo, эта система, в конечном счете, ограничена в своих возможностях изучать все аспекты болезней человека. Традиционные методы развития колоноидов прояснили ключевые аспекты динамики стволовых клеток; Однако эти данные часто не отражают адекватно результаты в терминально дифференцированных клетках эпителия хозяина. Стратегии, описанные в этом исследовании, предоставляют исследователям относительно быструю и недорогую модель манипуляций с органоидами, которая при правильном использовании может пролить свет на ключевые аспекты структуры и функции кишечного эпителия во время воспаления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам, участвовавшим в проекте, нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01DK120986 (K.P.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

Tags

Биология выпуск 196
Изучение эпителиальных эффектов воспаления кишечника <em>in vitro</em> на установленных колоноидах мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, … More

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter