Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64804
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 2,3
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.

Abstract

אפיתל המעי ממלא תפקיד חיוני בבריאות האדם, ומספק מחסום בין המארח לסביבה החיצונית. שכבת תאים דינמית מאוד זו מספקת את קו ההגנה הראשון בין אוכלוסיות מיקרוביאליות וחיסוניות ומסייעת לווסת את התגובה החיסונית של המעי. הפרעה במחסום האפיתל היא סימן היכר של מחלות מעי דלקתיות (IBD) והיא מעניינת למיקוד טיפולי. מערכת תרבית המעי הגס התלת-ממדית היא מודל שימושי ביותר במבחנה לחקר דינמיקה של תאי גזע במעי ופיזיולוגיה של תאי אפיתל בפתוגנזה של IBD. באופן אידיאלי, הקמת קולונואידים מרקמת אפיתל דלקתית של בעלי חיים תהיה מועילה ביותר בהערכת ההשפעות הגנטיות והמולקולריות על מחלות. עם זאת, הראינו כי שינויים באפיתל in vivo אינם נשמרים בהכרח בקולונואידים שנוצרו מעכברים עם דלקת חריפה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו פרוטוקול לטיפול בקולונואידים עם קוקטייל של מתווכי דלקת שבדרך כלל מוגברים במהלך IBD. בעוד שמערכת זו יכולה להיות מיושמת בכל מקום בתנאי תרבית שונים, פרוטוקול זה שם דגש על טיפול הן בקולונואידים מובחנים והן במונושכבות דו-ממדיות הנגזרות מקולונואידים מבוססים. בסביבת תרבית מסורתית, קולונואידים מועשרים בתאי גזע של המעי, ומספקים סביבה אידיאלית לחקר נישת תאי הגזע. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת ניתוח של התכונות של הפיזיולוגיה של המעי, כגון תפקוד המחסום. יתר על כן, קולונואידים מסורתיים אינם מציעים את ההזדמנות לחקור את התגובה התאית של תאי אפיתל ממוינים סופניים לגירויים מעודדי דלקת. השיטות המוצגות כאן מספקות מסגרת ניסויית חלופית להתמודדות עם מגבלות אלה. מערכת התרבית החד-שכבתית הדו-ממדית מציעה גם הזדמנות לבדיקת תרופות טיפוליות ex vivo. שכבת תאים מקוטבת זו יכולה להיות מטופלת עם מתווכי דלקת בצד הבסיסי של התא ובמקביל עם טיפולים משוערים כדי לקבוע את התועלת שלהם בטיפול ב- IBD.

Introduction

מחלת מעי דלקתית (IBD) היא מחלה כרונית, הפוגתית והתקפית המאופיינת באפיזודות של דלקת ושקט קליני. האטיולוגיה של IBD היא רב-גורמית, אך מאפיינים אופייניים עיקריים של המחלה כוללים תפקוד מחסום פגום וחדירות מוגברת של אפיתל המעי, בנוסף למפל איתות פרו-דלקתי המופעל בתוך תא האפיתל 1,2. מספר מודלים במבחנה ו-in vivo שימשו לשחזור תגובת האפיתל במהלך IBD, כולל תרבית תאים ומודלים של דלקת3. עם זאת, לכל המערכות הללו יש חסרונות חשובים המגבילים את יכולתן לשחזר את שינויי האפיתל במהלך IBD4. רוב קווי התאים המשמשים לחקר IBD עוברים טרנספורמציה, יש להם את היכולת ליצור monolayer, והוא יכול להתמיין3 אבל באופן מהותי להתפשט באופן שונה מאשר תאי אפיתל מעיים שאינם מותמרים בפונדקאי. מספר מודלים שונים של דלקת משמשים לחקר IBD, חלקם כוללים מודלים נוקאאוט, מודלים זיהומיים, מודלים דלקתיים כימיים, ומודלים להעברת תאי T 5,6,7,8. בעוד שכל אחד מהם יכול לחקור היבטים אטיולוגיים מסוימים של IBD, כגון נטייה גנטית, תפקוד לקוי של מחסומים, דה-רגולציה חיסונית והמיקרוביום, הם מוגבלים ביכולתם לחקור את האופי הרב-גורמי של המחלה.

אורגנואידים במעי, כולל אנטרואידים וקולונואידים, הוקמו בעשור האחרון כמודל מבחנה שימושי לחקר לא רק הדינמיקה של תאי גזע במעי, אלא גם תפקידם, שלמות המחסום ותפקודו של אפיתל המעי לשחק בהומאוסטזיס מעיים ומחלות. גופים אלה תרמו באופן משמעותי להבנתנו את הפתוגנזה של IBD9 ופתחו הזדמנויות חדשות לרפואה מותאמת אישית. קולונואידים, או תרביות רקמה שמקורן בתאי גזע ומארגנות את עצמן מהמעי הגס, פותחו הן מרקמת מורין והן מרקמה אנושית בתהליך המאפשר לתאי גזע הממוקמים בתוך קריפטות מעיים להתרבות ולהישמר ללא הגבלת זמן10. נישת תאי הגזע in vivo מסתמכת על גורמים חוץ-תאיים כדי לתמוך בצמיחתה, בעיקר איתות Wnt הקנוני ומסלולי איתות חלבונים מורפוגנייםעצם 11. התוספת של גורמים אלה מקדמת את בריאותם ואריכות ימיהם של קולונואידים, אך גם מניעה את התרבית לעבר מצב דמוי תאי גזע שאינו משקף את ארכיטקטורת תאי האפיתל in vivo, המורכבת מתאים המתחדשים מעצמם וממוינים סופניים12,13. בעוד שהפונקציונליות של אפיתל המעי תלויה ביחסי הגומלין המתמשכים בין תא תאי הגזע לבין תאים ממוינים, היכולת להחזיק את שניהם במערכת תרבית קולונואידים מוגבלת למדי. למרות מגבלות אלה, מערכת תרבית האורגנואידים נותרה תקן הזהב לחקר התכונות המהותיות של אפיתל ex vivo. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לשקול אסטרטגיות תרבות חלופיות כדי לענות על השאלה המדעית שעל הפרק.

הוכח כי עכברים במשטר מתמשך של 7 ימים של דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) מפתחים דלקת אפיתל ותפקוד לקוי של מחסום14. יתר על כן, כישלון ביוגנזה מיטוכונדריאלית ותכנות מחדש מטבולי בתוך אפיתל המעי, אשר הוכחו כניכרים ב- IBD אנושי, נלכדו גם במודל DSS זה של קוליטיס15. אולם הנתונים הראשוניים שלנו מראים שהמאפיינים של כשל ביוגנזה מיטוכונדריאלית אינם נשמרים בקולונואידים שמקורם בקריפטות של חיות שטופלו ב-DSS (איור משלים 1). לכן, יש להשתמש בשיטות תרבית חלופיות כאשר בוחנים כיצד דלקת מניעה שינויים אפיתל במהלך דלקת מעיים מורין. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפיתחנו המתאר 1) כיצד לבודד קריפטות מרקמת המעי הגס כולה לצורך הקמת קולונואידים מורינים, 2) כיצד להבדיל אוכלוסיית תאים זו באופן סופי כך שתשקף את אוכלוסיית התאים כפי שהיא עומדת in vivo, ו-3) כיצד לגרום לדלקת במודל זה במבחנה . כדי לחקור אינטראקציות בין תרופתיות בתוך האפיתל המודלק, פיתחנו פרוטוקול לביסוס מונושכבות דו-ממדיות (2-dimensonal) מקולונואידים מורינים שניתן לטפל בהם באופן בסיסי עם מתווכים דלקתיים ולטפל בהם באופן אפי באמצעות טיפולים תרופתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים ברקמות מורין המתוארים כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית באוניברסיטת פיטסבורג ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה למחקר וטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג ו- UPMC.

1. הכנה לתרבות

הערה: כל הריאגנטים מפורטים בסעיף 'טבלת חומרים ' וניתן למצוא את כל הרכבי הפתרונות בטבלת הרכב הפתרונות (טבלה 1).

  1. הכן אמצעי שטיפת עכבר כמתואר בטבלה 1. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
  2. הכן מאגר בידוד קריפטה 1 (CIB1) כמתואר בטבלה 1. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
    זהירות: Dithiothreitol (DTT) נחשב מסוכן על ידי תקן OSHA Hazard Communication בשל רעילות חריפה פוטנציאלית אם הוא נבלע ונזק לעור ולעיניים אם אזורים אלה נחשפים אליו. יש להשתמש בכפפות מגן, הגנה על העיניים והגנה על הפנים בעת הטיפול בכימיקל זה.
  3. הכן מאגר בידוד קריפטה 2 (CIB2) כמתואר בטבלה 1. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
  4. הכינו מדיום מותנה L-WRN על פי פרוטוקול16 שפורסם בעבר.
  5. הכינו תווך קולונואידי שלם כמתואר בטבלה 1. ניתן לאחסן מדיום גידול קולונואיד מלא עד 5 ימים בטמפרטורה של 4°C ללא אובדן פעילות.
  6. הכן את אמצעי הבידול כמתואר בטבלה 1. פרוטוקול זה שונה ממאמר17 שפורסם בעבר. ניתן לאחסן את מדיום הבידול למשך עד 5 ימים בטמפרטורה של 4°C ללא אובדן פעילות.
  7. הכינו את המדיום המתווך לדלקת כמתואר בטבלה 1. פרוטוקול זה שונה ממאמר18 שפורסם בעבר. ניתן לאחסן את מדיום מתווך הדלקת למשך עד 5 ימים בטמפרטורה של 4°C ללא אובדן פעילות.
  8. מכינים את המדיום monolayer murine. השמיט את Y-27632 כאשר אתה מאתגר את החד-שכבות עם גורמים דלקתיים ו/או תרופות. ניתן לאחסן את התווך החד-שכבתי של מורין למשך עד 5 ימים בטמפרטורה של 4°C ללא אובדן פעילות.
  9. הכן את מתווך דלקת monolayer בינוני. ניתן לאחסן את התווך החד-שכבתי מתווך הדלקת למשך עד 5 ימים בטמפרטורה של 4°C ללא אובדן פעילות.

2. בידוד קריפטה מרקמת המעי הגס מורין

הערה: העבירו את הרקמה על קרח. הוציאו את הכמות המתאימה של מטריצת קרום המרתף מהאחסון בטמפרטורה של 20°C- והפשירו על קרח. כל באר 24 מצופה 15 μL של מטריצת קרום מרתף. הכינו CIB1, CIB2 ואמצעי גידול קולונואידים מלאים כמתואר בסעיף 1.

  1. יש להרדים עכבר C57BL/6J (בן 6-8 שבועות) בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים, ולחלץ את הקצה הדיסטלי (כ-5-7 ס"מ) של המעי הגס באמצעות פינצטה נקייה ומספריים.
    הערה: במחקר זה, הנבדקים הומתו באמצעות דגירה של תא פחמן דו חמצני במשך 2-3 דקות ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
    1. לשם כך, מניחים את העכבר על גבו, מבצעים חתך אופקי ממש מתחת לכלוב הצלעות ולאחר מכן חתך אנכי מאמצע החתך האופקי לכיוון בסיס הזנב כדי לחשוף את חלל הבטן.
    2. בעזרת פינצטה הוציאו את המעי הדק מהשדה, זהו את המעי הגס ועקבו אחריו עד לבסיס הזנב. שברו את האגן עם מספריים כדי לחשוף באופן מלא את המעי הגס הדיסטלי במידת הצורך. השתמש במספריים כדי לחתוך את 5-7 ס"מ הדיסטלי ביותר של המעי הגס.
  2. הניחו את רקמת המעי הגס על משטח נקי. הסר את עודפי השומן הסרוסלי המקיף את המעי הגס. הסר את החומר הצואתי על ידי שטיפת התוכן הלומינלי של המעי הגס עם מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) באמצעות מזרק המחובר למחט 18 G 1 1/2. לאחר מכן, הניחו את המעי הגס בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של DPBS קר כקרח, והניחו אותו על קרח.
    הערה: אם מבודדים את המעי הגס מיותר מחיה אחת, הניחו את הרקמה על קרח לפני שתמשיכו לחיה הבאה.
  3. העבירו את רקמת המעי הגס לצלחת פטרי עם 10 מ"ל DPBS קרים כקרח, והשקו את הלומן פעמיים עם DPBS באמצעות פיפטה P1,000.
  4. פתח את המעי הגס לאורכו באמצעות מספריים, ונער בעדינות באמצעות פינצטה במשך ~ 30 שניות ב- DPBS כדי להסיר את תוכן הצואה שנותר.
  5. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי חדשה עם 10 מ"ל DPBS קרים כקרח, ושוב מנערים בעדינות באמצעות פינצטה לפני חיתוך המעי הגס לחתיכות של 2 ס"מ באמצעות מספריים ומניחים אותם בצינור חרוטי 50 מ"ל עם 7 מ"ל CIB1 קר כקרח. יש לדגור על הרקמה ב-CIB1 על קרח למשך 20 דקות.
    הערה: שאר השלבים מבוצעים בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
  6. מעבירים את הרקמה באמצעות פינצטה לצינור חרוטי מחומם מראש של 50 מ"ל המכיל 7 מ"ל CIB2, ודגורים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  7. הסר את CIB2 מהצינור החרוטי 50 מ"ל על ידי מתן הרקמה להתיישב בתחתית הצינור החרוטי ולאחר מכן pipeting החוצה את CIB2. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל של מדיום שטיפת עכבר קר כקרח לאותו צינור חרוט.
  8. השג צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל, ומקם מסנן 70 מיקרומטר על גבי הצינור הפתוח.
  9. תוך כדי החזקת הצינורית עם תכולת המעי הגס, סובב את היד כ-45°. נערו את הצינור בצורה מתנדנדת ונמרצת במשך 45 שניות כדי לשחרר את הקריפטות. לאחר מכן, שפכו את מתלה הקריפטה דרך מסננת התאים 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
  10. באמצעות פינצטה, מניחים את רקמת המעי הגס בחזרה בצינור החרוטי הריק של 50 מ"ל, ומוסיפים 10 מ"ל של מדיום שטיפת עכבר קר כקרח. השג מסננת תאים חדשה של 70 מיקרומטר, והנח אותה על גבי הצינור החרוטי של 50 מ"ל המכיל את התמיסה המסוננת הקודמת.
  11. שוב, להרים את צינור 50 מ"ל המכיל את שברי קריפטה, ולנער אותו באופן זהה כמו בשלב 2.9. סנן את התווך דרך מסננת התא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל כדי לשלב עם crypts מסונן בעבר.
    הערה: אם תפוקת הקריפטה נמוכה, נער את רקמת המעי הגס פעם נוספת על ידי מיקום הרקמה בצינור חרוטי ריק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום שטיפת עכבר. נערו את הרקמה במשך 45-50 שניות כדי לשחרר את הקריפטות. כמו כן, אם תשואת הקריפטה נמוכה, ואז להגביר את הנמרצות של רעידות. לבסוף, אם תפוקת הקריפטה הכוללת נמוכה, ניתן לצפות הן את הפיפטים והן את הצינורות בסרום בקר עוברי (FBS) כדי למנוע את היצמדות הרקמה לפלסטיק.
  12. צנטריפוגה את הצינור החרוטי 50 מ"ל המכיל את הקריפטות המסוננות ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש לראות גלולה בתחתית הצינור החרוטי 50 מ"ל.
  13. דקרו את המדיום על ידי פיפטציה, השהו מחדש את הקריפטים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם 10 מ"ל של מדיום שטיפת עכבר קר כקרח, והעבירו לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
  14. כדי להשיג הכנה נקייה יותר, לשטוף את crypts עם תוספת 10 מ"ל של מדיום שטיפת עכבר. דקנט את המדיום הקודם, והשהה מחדש את הקריפטים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה ב -10 מ"ל של מדיום שטיפת עכבר. צנטריפוגה במהירות 300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C באמצעות צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל.
    הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת הורדת התווך מכיוון שלעיתים הגלולה אינה צנטריפוגה בחוזקה. אם הגלולה אינה הדוקה, פיפטה את רוב המדיום, משאיר 500 μL עד 1 מ"ל. לאחר מכן, להשעות מחדש את הגלולה על ידי pipetting ב 10 מ"ל של מדיום לשטוף עכבר, ולהעביר את הפתרון צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה בצינור חרוטי קטן יותר יכולה לשפר את הידוק הכדור.
  15. דקרו את המדיום, והשעו מחדש את הקריפטים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם 10 מ"ל של מדיום שטיפת עכבר קר כקרח. לאחר השהייה מחדש, ספרו את הקריפטים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר על ידי הדבקה מיידית של 10 μL של המדיום על מגלשת זכוכית.
    1. הניחו שתי טיפות של 10 μL בקצוות נפרדים של השקופית, וספרו את מספר הקריפטים בכל טיפה. ממוצע המספרים בין שתי הטיפות כדי לקבוע את מספר הקריפטים לכל 10 מיקרוליטר. הכפל מספר זה ב- 100 כדי לקבל את מספר הקריפטות ב- 1 מ"ל.
      הערה: לספירה מדויקת, יש להסיר מיד 10 μL של מתלה הקריפטה לאחר ההשעיה. אם לא, הקריפטים ייפלו לתחתית הצינור, מה שיגרום לספירה לא מדויקת.
  16. במטרה לצפות 300-500 קריפטים לכל באר, להעביר את הנפח המתאים של crypts resuspended במדיום שטיפת העכבר לצינור חרוטי חדש 15 מ"ל ולהביא 10 מ"ל עם מדיום שטיפת עכבר קר כקרח. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. גלולה קטנה צריכה להיות גלויה בתחתית הצינור.
  17. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה חשמלית. השתמש בצינור P200 כדי להסיר בזהירות כל מדיום שיורית, ולהשאיר רק את הכדור.
  18. השהה מחדש את הגלולה בכמות המתאימה של מטריצת קרום מרתף קרה כקרח על ידי פיפטציה איטית למעלה ולמטה. היזהר לא להציג בועות בעת השעיית גלולת הקריפטה. צלחת 300-500 crypts / 15 μL של מטריצת קרום מרתף בכל באר של צלחת. לאחר הציפוי, הופכים את צלחת תרבית הרקמה, ומניחים אותה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות.
  19. הפוך את הצלחת, והוסף 500 μL של מדיום קולונואיד העכבר המלא לכל באר. החליפו את המדיום כל יומיים עד שהם מוכנים למעבר. עוברים את הקולונואידים כל 3-5 ימים.

3. העברת הקולונואידים

הערה: בדרך כלל ניתן להעביר כל באר ביחס של 1:4 עד 1:6 בהתאם לצפיפות הבאר המקורית. הוציאו את הכמות המתאימה של מטריצת קרום המרתף מ-20°C, והניחו אותה על קרח להפשרה. קולונואידים יכולים לשמש לניסויים לאחר שני מעברים. כאשר עוברים קולונואידים, השלבים מבוצעים בארון בטיחות ביולוגי כדי למנוע זיהום.

  1. הסר את המדיום מהבארות למעבר.
    1. אם יש פסולת בתוך מטריצת קרום המרתף, אשר יכול לקרות במהלך הבידוד הראשוני, ניתן להשתמש בפרוטוקול הבא כדי לנקות את הפסולת:
      1. יש להוסיף 1 מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA) קר כקרח (BSA) ב-DPBS ללא Ca 2+ או Mg2+ לכל באר. תן לו לשבת במשך 5 דקות בארון הבטיחות הביולוגי.
      2. פיפטה למעלה ולמטה שלוש עד שבע פעמים באמצעות פיפטה P1000 כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף, ולאסוף את תכולת הבארות בצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את הקולונואידים בסך הכל 5-10 מ"ל של 0.1% BSA ב- DPBS ללא Ca 2+ או Mg2+. לפצות עד עוצמת הקול המתאימה עם 0.1% BSA.
      3. צנטריפוגה במהירות של 150 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגרש את הקולונואידים אך לא את הפסולת.
      4. דקר את DPBS על ידי pipetting, עוזב את הכדור. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה אנזימטי בטמפרטורת החדר (RT), ופיפטה שלוש עד חמש פעמים.
      5. הניחו את הצינור החרוטי בנפח 15 מ"ל עם מגיב הדיסוציאציה האנזימטית והקולונואידים המשובשים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-4 דקות.
      6. הסר את הצינור מאמבט המים, פיפטה 3-5 פעמים, ולאחר מכן להביא ל 10 מ"ל עם מדיום שטיפת עכבר. המשך לשלב 3.6.
  2. הניחו 500 μL של מגיב דיסוציאציה אנזימטי RT בכל באר, ותנו לו לשבת כדקה אחת לפני שהוא עולה ויורד שלוש עד שבע פעמים כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף.
  3. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 3-4 דקות.
  4. הסר את הצלחת מהאינקובטור, ופיפטה למעלה ולמטה שלוש עד שבע פעמים באמצעות פיפטה P1000 כדי לנתק את הקולונואידים.
  5. להעביר את התוכן לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ולעשות עד 10 מ"ל עם מדיום שטיפת עכבר קר כקרח.
  6. צנטריפוגה את הדגימה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
  7. הסר את המדיום באמצעות פיפטה חשמלית ופיפטה P200 לפי הצורך, כך שרק כדור נשאר בצינור החרוט.
  8. יש להשהות מחדש בכמות מתאימה של מטריצת קרום מרתף קרה כקרח על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה בהתאם למספר הבארות שיש לצפות. אין להכניס בועות בעת פיפט. מניחים את שברי הקולונואיד ב 15 μL של טיפות מטריצת קרום מרתף לכל באר.
  9. לוחצים את הקריפטים, הופכים את צלחת תרבית הרקמה, ואז מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות.
  10. לבסוף, להחזיר את הצלחת, ולהוסיף 500 μL של מדיום קולונואיד עכבר שלם לכל באר. שנה את המדיום כל יומיים עד שהם גדלו מספיק כדי לעבור שוב בערך 3-5 ימים.

4. התמיינות סופנית של תאי קולונואיד

  1. עוברים את הקולונואידים כנ"ל, ומוסיפים 500 μL של מדיום הקולונואיד השלם של העכבר לכל באר.
  2. לפחות 48 שעות לאחר המעבר, הסר את מדיום הקולונואיד המלא של העכבר והוסף 500 μL של התווך המבדיל לכל באר (ראה סעיף 1).
  3. לדגור על קולונואידים עם מדיה התמיינות במשך 48 שעות, ולאחר מכן הם יכולים לשמש בניסויים, כולל איסוף של RNA וחלבון.
    הערה: ניתן להעריך קולונואידים להתמיינות על ידי איסוף RNA והערכת הביטוי של Lgr5 ו- Ki67, סמן תאי גזע וסמן התפשטות תאים, בהתאמה, באמצעות תגובת שרשרת כמותית של שעתוק לאחור-פולימראז (qPCR). תאים ממוינים סופניים צריכים להיות בעלי ביטוי נמוך יחסית של Lgr5 ו - Ki67 בהשוואה לקולונואידים הגדלים בתווך קולונואיד מסורתי, שם התאים דומים יותר לגזע. משך הזמן שהקולונואידים צריכים לדגור בתווך ההתמיינות עשוי להיות מותאם לכל מעבדה בנפרד. עיין בטבלה משלימה 1 לרשימת הפריימרים.

5. גרימת דלקת בקולונואידים ממוינים עם מתווכי דלקת

  1. לאחר שהקולונואידים הודגרו במשך 2-3 ימים עם מדיום ההתמיינות, הסירו את התווך הקיים, והוסיפו 500 מיקרוליטר של המדיום המתווך הדלקתי לכל באר.
  2. אפשרו לבארות לדגור במשך 24-72 שעות לפני איסוף הרנ"א והחלבון (או הערכת פרמטרים אחרים במורד הזרם). שנה את המדיום כל יום.

6. חד-שכבות אפיתל במעי שמקורן בקולונואידים מורינים מבוססים

הערה: מונושכבות אפיתל של המעי המורין נגזרות מקולונואידים מורינים שעברו לפחות פעמיים. כדי לאפשר היווצרות חד-שכבתית מוצלחת תוך 3-5 ימים, חובה לא להפריד את הקולונואידים לתאים בודדים. אורגנואידים מקוטעים שנותקו אנזימטית לצבירים תאיים הם אידיאליים לגדילה.

  1. הכינו את כל הריאגנטים לפני תחילת הניסוי. הפשירו את מטריצת קרום המרתף על קרח. הכינו את המדיום החד-שכבתי של מורין כמתואר בסעיף 1 . מדללים את קרום המרתף המופשר ביחס 1:20 בתווך החד-שכבתי הקר. שמור על קרח.
  2. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח תרבית תאים שקופה בגודל 0.4 מיקרומטר המוחדרת לבאר אחת של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות (טבלה של חומרים). תפוס חוט פינתי של העלון, ומעביר אותו לתוך הבאר. חזור על הפעולה עד שהמספר המתאים של תוספות תרבית תאים יהיה זמין לתרבית.
    הערה: הקפד לצפות היטב בקרה נוספת במטריצת קרום המרתף בלבד. עלון תרבית תאים זה ישמש למדידת התנגדות הרקע של עלון תרבית התא ללא נוכחות תאים, כמתואר בשלב הבא (שלב 6.3).
  3. באמצעות פיפט P200, כסו את פני השטח האפיקליים (העליונים) של כל תוספת תרבית תאים ב-150 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף מדוללת. מניחים את קצה הצינור במרכז האינסרט מבלי לגעת בקרום האינסרט ומוציאים בעדינות את התמיסה. מניחים את הצלחת באינקובטור סטרילי של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך שעה לפחות.
  4. הסירו בעדינות את מטריצת קרום המרתף לפני השימוש, ואפשרו לתוספות תרבית התאים להתייבש בארון בטיחות ביולוגי למשך 10 דקות לפחות.
    1. כדי להסיר את מטריצת קרום המרתף, סובב את הצלחת בת 24 הבארות בזווית של 45 מעלות. הניחו אצבע בודדת על פינת השן כדי לייצב את ההכנסה, ובעזרת פיפט P200 הניחו בעדינות את קצה הפייפ לאורך הצד התחתון של האינסרט והוציאו את המטריצה.
    2. הסר שאריות עודפות על ידי שטיפת כל תוספת תרבית תאים עם 150 μL של DPBS סטרילי ללא Ca 2+ או Mg2+.
  5. לאחר 10 דקות של ייבוש, להוסיף 400 μL של המדיום monolayer murine לתחתית תרבית התא להוסיף 75 μL על גבי. חזור על הפעולה עד שכל תוספות תרבית התאים שקועות. השאירו את הצלחת בארון הבטיחות הביולוגי, או החזירו אותה לאינקובטור עד לצורך.
  6. הסר את צלחת 24 בארות של קולונואידים בוגרים (אורגנואידים ביום 3-5 לגדילה) מעי מאינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 , והנח אותו מתחת לארון הבטיחות הביולוגי. הסר את המדיום באמצעות קצוות סטריליים, ושטוף כל באר עם 1 מ"ל של DPBS סטרילי RT (ללא Ca2 + או Mg2+).
    הערה: באר בודדת של 75-125 קולונואידים בוגרים מפוצלת ביחס של 1:4.
  7. הסר את ה- DPBS ללא Ca 2+ או Mg2+ באמצעות קצוות סטריליים, ועכל כל תקע של מטריצת קרום המרתף על ידי הנחת 500 μL של מגיב דיסוציאציה אנזימטי RT בכל באר שיש לעבור.
  8. Pipet כל באר למעלה ולמטה בערך 6-10 פעמים כדי לשבור את התקע. אין לגרד את תחתית הצלחת כדי להסיר את התקע. במקום זאת, סובב את הצלחת בעלת 24 הבארות בזווית של 45°, מקם את קצה הצינור בקצה התקע והזז אותו בעדינות.
  9. מחזירים את הצלחת בעלת 24 הקידוחים לאינקובטור סטרילי של 37°C, 5% CO2 למשך 3-4 דקות.
  10. מוציאים את הצלחת, ומזרימים את מגיב הדיסוציאציה האנזימטית למעלה ולמטה חמש עד שבע פעמים עבור כל באר מתחת לארון בטיחות ביולוגי. מעבירים את הקולונואידים המנותקים מכל באר לצינור חרוטי סטרילי בנפח 15 מ"ל. להביא עד נפח של 10 מ"ל עם מדיום שטיפת עכבר קר כקרח.
  11. צנטריפוגה את הקולונואידים המעוכלים חלקית ב 300 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות בצנטריפוגת דלי מתנדנדת.
  12. מתחת לארון הבטיחות הביולוגי, הוציאו את הסופרנאטנט מהגלולה באמצעות פיפט 10 מ"ל. הסר את כל המדיום שנותר באמצעות פיפט P200. להשהות מחדש את גלולת הקולונואיד בתווך חד-שכבתי מורין. הוסף 75 μL של מדיום לכל תוספת תרבית תא של קולונואידים מקוטעים כדי להיות מצופה.
  13. הוסף 75 μL של תרחיף קולונואיד למרכז כל תוספת תרבית תא. לפני הוספת מתלה הקולונואיד לכל באר, יש לזלף בעדינות למעלה ולמטה פעם או פעמיים לפני הסרת 75 μL, מה שמאפשר ציפוי אחיד יותר.
  14. הניחו את הצלחת בעלת 24 הקידוחים עם תוספות תרבית תאים על פלטפורמה מסתובבת למשך 10 דקות כדי לאפשר פיזור אחיד על פני תוספת תרבית התא.
  15. מניחים את הצלחת באינקובטור סטרילי של 37°C, 5% CO2 .
  16. למחרת (יום 1), עקרו את שברי הקולונואידים הלא מחוברים על ידי פיפטציה של התווך למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים עם פיפט P200. הניחו בעדינות את הקצה לצד החלק הפנימי של תרבית התא כדי לא להפריע לתאי המעי המחוברים. אין להכניס בועות למדיום, שכן זה מונע את הסרת כל השברים שאינם מחוברים.
  17. הסר מיד את תערובת המדיום והקולונואידים. חזור על הפעולה עד לניקוי כל תוספות תרבית התא.
  18. הוסיפו בעדינות 150 μL של מדיום חד-שכבתי מורין שחומם מראש לצד האפי של כל תוספת תרבית תאים. הוסף 400 μL של מורין מחומם monolayer בינוני לכל באר של צלחת חדשה 24 באר. מעבירים את תרבית התא לצלחת החדשה על ידי תפיסת השיניים שלה באמצעות מלקחיים סטריליים. החליפו את המדיום כל יומיים עד למפגש.
    הערה: שברי הקולונואידים צריכים ליצור שכבה מונו-שכבתית מתמזגת 3-5 ימים לאחר הציפוי.

7. מדידת ההתנגדות נטו של חד-שכבות האפיתל באמצעות מד וולטוהמטר בימים 3-5 של תרבית חד-שכבתית

הערה: אלקטרודות מקל האכילה דומות למלקחיים ואורכן אינו סימטרי. הזרוע הארוכה יותר של הגשושית היא האלקטרודה הבזולטרלית, והזרוע הקצרה יותר היא האלקטרודה האפיקאלית. הגשושית יכולה להיות קשה להחדרה בין החלק הפנימי והחיצוני של תרבית התא. הצבת הגשושית בזווית קלה עם החדרתה, ולאחריה יישור אנכי של הגשוש, תמנע מהגשושית להיתקע. הקפד לקרוא את ההתנגדות נטו של כל תוספת תרבית תאים בזווית דומה, שכן זה יכול להשפיע על הערכים.

  1. הניחו את מד המתח ואת כל הריאגנטים בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
    1. חבר את מד המתח לשקע החשמל הקרוב ביותר, וחבר את מחבר הפלסטיק המודולרי של בדיקת האלקטרודות לשקע הקלט בצג הקדמי.
    2. כדי למקם את מד הנפח בזווית של 45°, הניפו את זרוע המתכת בחלק האחורי של הציוד החוצה עד שהיא ננעלת במקומה.
    3. כעת, הפעל את מד המתח על-ידי הפיכת מתג ההפעלה UP בתצוגה הקדמית. לבסוף, הפוך את המתג כלפי מעלה לכיוון OHMS כדי להציג את הקריאה במדד זה.
  2. הסר את הצלחת בעלת 24 הקידוחים מאינקובטור 37°C, 5% CO2 , והנח את הצלחת שטוחה בארון הבטיחות הביולוגי. ההתנגדות החשמלית הטרנסאפיתל (TEER) רגישה לטמפרטורה. הסר את הצלחת רק מיד לפני קריאת ה- TEER.
  3. יש לעקר את בדיקת האלקטרודות באתנול 70% שחומם מראש למשך 30 שניות עד דקה. הסירו את הבדיקה, הפכו אותה וסובבו אותה פעם או פעמיים כדי להסיר את עודפי האתנול. הניחו לבדיקה להתייבש באוויר למשך כ-30 שניות.
  4. שטפו את שאריות האתנול שנותרו על הגשושית עם אמצעי שטיפת עכבר שחומם מראש.
    אזהרה: אין לתת לאף אחת מטיפות האתנול הנותרות הגבוהות יותר על הגשושית ליפול לתוך תרבית התא. כאשר שוטפים את האתנול עם מדיום, לא נותנים למדיום לעבור מעל שדה האתנול הסטרילי. זה עלול לגרום למדיום מזוהם להיכנס לעלון תרבית התא.
  5. החזק את הבדיקה בניצב לתוספת תרבית התא. הכנס את האלקטרודה הבזולטרלית (הקצה הארוך יותר של הבדיקה) בצד החיצוני של תרבית התא עד שהיא נוגעת בבסיס של צלחת 24 בארות. החלק את האלקטרודה האפיקלית (הקצה הקצר יותר של הבדיקה) לתוך תוספת תרבית התא. אין לשנות את המרחק של שתי האלקטרודות מבאר לבאר. זה ישפיע על מדידת TEER.
  6. ודא שהאלקטרודה האפיקלית אינה נוגעת בבסיס תרבית התא לפני קריאת ה- TEER. התחל עם הוספת תרבית התא של פקד הרקע והקלט את הערך. הערך יוצג באופן אוטומטי באופן דיגיטלי בחזית מד הוולטומטר.
  7. חזור על שלבים 7.5-7.6 עבור כל תוספת תרבית תאים.
    הערה: אם קיימים תנאי ניסוי שונים בין תוספות תרבית התא, יש לעקר את הגשושית בין כל מצב חדש. התחל בשלב 7.1 והמשך באופן מספרי לאורך השלבים.
  8. החזירו את צלחת 24 הקידוחים לאינקובטור לאחר שכל מדידות TEER נרשמו.
  9. הערכים נטו ב 350 Ω ומעלה מעידים על היווצרות monolayer. חזור על הפעולה שוב בימים שלאחר מכן עד להשגת היווצרות חד-שכבתית.
    הערה: בדרך כלל, ניתן ללכוד ערכים של 1,000 Ω ומעלה ביום השלישי, אך עם הזמן, כולם יתכנסו למספר נמוך יותר בסביבות 350 Ω.

8. חישוב ה-TEER באמצעות מדידות התנגדות נטו ממד הוולטוהמטר

הערה: היווצרות חד-שכבתית מוצלחת של הקולונואידים תיתן מדידות TEER גדולות מ-115 Ω·cm2.

  1. קח ערכי התנגדות נטו בודדים, והחסר היטב את התנגדות הרשת מהרקע. תוספות תרבית התאים המצופות בקרום מטריצת המרתף יתנו קריאה נטו של כ-100 Ω.
  2. קח את מדידות ההתנגדות נטו שהוחסרו ברקע, והכפיל אותן בשטח הפנים של תוספת תרבית התא. תוספת תרבית תאים של 24 בארות היא בעלת שטח פנים של 0.33 ס"מ2.
  3. אם הערכים הם 115 Ω·cm2 או יותר, המשך לבדיקות הניסוי במורד הזרם.

9. גרימת דלקת בחד-שכבות האפיתל עם מתווכי דלקת

  1. לאחר שנוצרו מונושכבות מוצלחות, הוסיפו מתווכים דלקתיים לתרבית בצד הבסיסי של התרבית. הכינו את המדיום החד-שכבתי של מתווך הדלקת, כמתואר בשלב 1.9, והוסיפו 400 μL לכל באר בצלחת חדשה בת 24 בארות.
  2. הסר את התווך מהצד האפי של תוספת תרבית התא, והוסף 150 μL של המדיום החד-שכבתי של מורין ללא Y-27632. אין להשלים צד זה עם מתווכי דלקת. עם זאת, אם המוות התא נראה מוגזם, להשאיר את Y-27632 בתקשורת. זה חייב להיקבע על ידי משתמש הקצה.
  3. מעבירים את תוספות תרבית התאים לצלחת חדשה בת 24 בארות, ומניחים אותן בבארות בתוספת המדיום החד-שכבתי מתווך הדלקת.
  4. לעורר את monolayers עם מתווכים דלקתיים במשך 24-72 שעות, בהתאם לניסוי.
  5. כדי לבדוק תגובות לתרופות באמצעות מודל דלקתי זה, יש להוסיף את המדיום החד-שכבתי בצד האפי של תרבית התא עם התרופה המועדפת. ניתן להוסיף את התרופה בכל שלב בניסוי, בהתאם למנגנון הפעולה של התרופה ולפרמטרים במורד הזרם שיש להעריך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערכת תרבית המעי הגס התלת-ממדית היא כלי רב ערך לחקר התרומה הפנימית של האפיתל להומאוסטזיס רירית המעי. הפרוטוקול המתואר מספק הוראות מפורטות כיצד לבודד קריפטות מעכברי C57BL/6J (WT) בגיל 8 שבועות ולהקים מערכת תרבית קולונואידים ארוכת טווח שניתן לתפעל עבור יישומים מרובים במורד הזרם. עם הבידוד והציפוי של הקריפטות במטריצת קרום המרתף, הקריפטים נראים צפופים ורב-תאיים במבנה כאשר הם מוצגים על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. הם יכולים להיות כדוריים בצורתם או מוארכים וגליליים, בדומה למבנה יחיד דמוי קריפטה שנצפה בדרך כלל בתוך ארכיטקטורת המעי in vivo (איור 1A). ביום הראשון, רוב הקריפטות יוצרות מבנה קומפקטי וכדורי, כאשר כמה קולונואידים מתחילים לפתח לומן פנימי (חלל ריק) נטול תאי אפיתל (איור 1B). ככל שהם ממשיכים לגדול במהלך הימים הבאים, הקטרים של הקולונואידים ממשיכים לגדול, והלומן של הקולונואידים נעשה מוגדר יותר (איור 1C). ביום 5, קוטרו של כל קולונואיד הוא בערך 100-250 מיקרומטר, והוא יוצר לומן גדול ובולט מוקף בשכבה דקה של תאי גזע אפיתליאליים (איור 1D). בשלב זה, הקולונואידים משובשים הן מבחינה אנזימטית והן מבחינה מכנית למעבר. לאחר שני קטעים, הם יכולים לשמש לניסויים במורד הזרם.

כדי להעריך אם השינויים המטבוליים שנצפו בשאריות המעי הגס של עכברים שטופלו ב-DSS נשמרים בקולונואידים שמקורם בעכברים באותו משטר DSS, עכברי WT בני 8 שבועות טופלו ב-2% DSS במי השתייה אד ליביטום. חיות ביקורת WT תואמות גיל ומגדר קיבלו מי שתייה ללא DSS. לאחר 7 ימים, העכברים הוקרבו, וקריפטות בודדו מהמעי הגס הן של קבוצת הביקורת (n = 3, זכר) והן של בעלי חיים שטופלו ב- DSS (n = 3, זכר) כדי לבסס קולונואידים. לאחר שני מעברים, חלבון בודד מכל קבוצה של קולונואידים, והביטוי של peroxisome proliferator-activator receptor-gamma coactivator-1α (PGC1α), חלבון המווסת הראשי של ביוגנזה מיטוכונדריאלית, הוערך באמצעות ניתוח כתמים מערביים (איור משלים 1). לא היה הבדל משמעותי בביטוי PGC1α כאשר השוו את הקולונואידים שנוצרו מהעכברים שטופלו ב- DSS לעומת הקולונואידים שנוצרו מעכברי הביקורת, דבר המצביע על כך שמתודולוגיית תרבית קולונואידים זו אינה משקפת כראוי את השינויים המטבוליים in vivo שנצפו בעכברים15.

הכישלון של PGC1α ליזום ביוגנזה מיטוכונדריאלית במהלך פגיעה דלקתית במעי הוא בעיקר מקומי לאפיתל המעי הגס המובחן15,19. כדי לשקף את השינויים שנצפו in vivo, החלטנו לכוון את הקולונואידים למצב מובחן יותר. כדי לגרום לשינוי זה, הקולונואידים הודגרו בתחילה בתווך קולונואיד מסורתי. לאחר 24 שעות עד 48 שעות, הקולונואידים הוחלפו למדיום התמיינות למשך 48 שעות נוספות. במהלך ההתמיינות, אחוז קטן של קולונואידים עברו מארכיטקטורה כדורית למבנים ניצנים מועשרים בתאי גביע וקולונוציטים17 (איור 2A,B). הקולונואידים שגדלו בתווך בתוספת WRN הועשרו בתאי גזע Lgr5+ המתחלקים במהירות. כדי לאשר שגם תאי גזע Lgr5+ וגם תאים אחרים שמתרבים יצאו ממחזור התא במהלך ההתמיינות, רמות ה-mRNA נותחו באמצעות qPCR. ירידה משמעותית ברמות Lgr5 (97%, p = 0.0023) ו- Ki67 (75%, p = 0.0007) נצפתה בקולונואידים המובחנים (n = 6) בהשוואה לקולונואידים שגדלו בסביבת תרבות מסורתית (n = 6; איור משלים 2א,ב). ניתן היה גם לצפות שהקולונואידים המתמיינים יהיו מורכבים בעיקר מתאי גביע מפרישי ריר. נוסף על כך, למעשה, MUC2 היה מווסת כמעט פי שניים בקולונואידים המובחנים בהשוואה לעמיתיהם שגודלו באופן מסורתי (n = 3, p = 0.0433, איור משלים 3). כאשר נלקחים יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שהקולונואידים התמינו בהצלחה והיו מוכנים לניסויים במורד הזרם. לאחר מכן, מתווכים דלקתיים נוספו למדיום ההבחנה, כמתואר בסעיף 5 לפרוטוקול. חלבון ו- RNA נאספו עד 72 שעות לאחר כניסתה של מתווכי דלקת לניתוח. עם זאת, בשעה 72 נצפתה מדי פעם מוות תאי מוגבר.

כדי להעריך אם הכנסת מתווכי דלקת לקולונואידים ממוינים יכולה לחקות את כשל הביוגנזה המיטוכונדריאלית שנצפתה הן ב- IBD אנושי והן במודל חריף של קוליטיס מורין, ביטוי החלבונים של PGC1α וגורם שעתוק A, מיטוכונדריה (TFAM) הוערך באמצעות ניתוח כתמים מערביים בקולונואידים ממוינים (n = 5) שטופלו במתווכי דלקת במשך 72 שעות. ביטוי PGC1α הוכח כמופחת במודלים מורינים של קוליטיס, כמו גם ב- IBD15 בבני אדם. TFAM, חלבון המניע הן את השעתוק והן את השכפול של הגנום המיטוכונדריאלי, הוכח גם כמופחת במודלים מורינים של קוליטיס, וביטוי הגנים שלו הוכח כמופחת ב- IBD15,20 בבני אדם. ראינו ירידה דומה הן בביטוי PGC1α (50.4%, p = 0.0442) והן בביטוי TFAM (88.9%, p = 0.004) בקולונואידים המובחנים לאחר 72 שעות של חשיפה למתווכי דלקת אלה (איור 3). באופן קולקטיבי, זה מצביע על כך שהטיפול בקולונואידים מובחנים עם ציטוקינים הוא מודל אידיאלי לחקר דינמיקה מיטוכונדריאלית במבחנה.

בעוד שניתן לבחון תפקודים תאיים ומולקולריים שונים בתרבית קולונואידים תלת-ממדית, מערכות תרבית חד-שכבתיות דו-ממדיות עדיפות בעת הערכת תפקוד המחסום, אינטראקציות מארח-פתוגן וההשפעה של טיפולים נספגים דרך הפה על דלקת21,22. היווצרות שכבה רציפה של תאים מתמזגים עם מחסום שלם מאפשרת למקם בקלות חומרים ביולוגיים או כימיים שונים בצד האפי ו/או הבסיסי של התאים. פרוטוקול זה מאפשר לבסס תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות מקולונואידים קיימים של WT שעברו פעמיים. קולונואידים ששובשו אנזימטית ומכנית מצופים על תוספות תרבית תאים מצופות במטריצת קרום מרתף. לאחר הציפוי הראשוני, הקולונואידים המפוצלים מופיעים בצבירי תאים בטווח שבין 15 ל-150 תאים (איור 4A). ביום 3 התאים כבר התחילו להשתטח ולכסות לאט לאט את תרבית התא, ובדרך כלל הגיעו למפגש (איור 4B). במהלך הימים הבאים, חד-שכבות ממשיכות לגדול ויוצרות מחסום רציף שניתן למדוד כמותית באמצעות TEER (איור 4C,D). באופן מעניין, מדידות TEER משתנות בין יום 3 ליום 5. לחד-שכבות יש ערכים גבוהים יותר בשלב מוקדם יותר עם טווח רחב (200-800 Ω·cm 2), אולם ערכים אלה מתכנסים לאט למספר נמוך יותר ביום 5 (115-150 Ω·cm2, איור 5A). כאשר החד-שכבות מגיעות למצב יציב, ניתן להשתמש בהן לניסויים במורד הזרם.

כדי לאפיין את תגובת האפיתל של חד-שכבות שמקורן בקולונואידים לדלקת, הונחו מתווכי דלקת בצד הבסיסי (החלק החיצוני של העלון) של התאים למשך 48 שעות. הרנ"א הופק, ורמות ה-mRNA של סמני התמיינות גזע ותאים שונים, כמו גם חלבונים צומתיים, נותחו באמצעות qPCR. Lgr5 לא זוהה באף אחד מהתנאים, אולם סמן תאי גזע אחר, mTERT, הופחת בכמעט 60% בחד-שכבות המודלקות בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא טופלה (איור משלים 4A). לאחר מכן, ניתחנו את הביטוי של שני סמנים של סוגי תאים ממוינים, Muc2 ו phosphatase אלקליין (Alpi). שני תעתיקי ה-mRNA היו נמוכים יותר בחד-שכבות המודלקות בהשוואה לתאי הביקורת (איור משלים 4A). הן תאי גזע והן תאים פוסט-מיטוטיים בדרך כלל מופחתים במהלך דלקת המעי הגס23,24,25, ותגובה דומה נצפתה במודל החד-שכבתי שהתקבל במחקר זה.

יתרון של המערכת החד-שכבתית הוא היכולת להעריך את תגובת המחסום. כדי לקבוע אם המחסום נפגע במצב המגורה על ידי מערכת החיסון, מדדנו את ערכי TEER לאחר 48 שעות. ערכי TEER עבור שכבות הבקרה (n = 2) היו בממוצע 129.16 Ω·cm 2 אך ירדו באופן משמעותי (p = 0.0087) לממוצע של 98.54 Ω·cm2 בחד-שכבות המודלקות (איור 5B). כדי לאשר עוד יותר שהמחסום נפגע במצב הדלקתי, הערכנו את רמות ה-mRNA עבור שלושה סמני צומת הדוקים שונים, Zo-1, Occludin, ו-Claudin. לכל שלושת הסמנים היו רמות נמוכות יותר במצב המודלק בהשוואה לעמיתיהם הלא דלקתיים (איור משלים 4B). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים כי תפקוד לקוי של מחסום קיים בחד-שכבות המודלקות ומחקה את תפקוד המחסום שנצפה במהלך פתוגנזה של IBD.

Figure 1
איור 1: בידוד ראשוני של קריפטים מורינים לצורך הקמת תרבית קולונואידים ארוכת טווח. (A) ביום 0, 300-500 קריפטות צופו במטריצת קרום מרתף (התמונה התקבלה 5 שעות לאחר הציפוי), וצמיחת הקולונואידים תועדה ביום (B) 1, (C) יום 3 ו-(D) יום 5. ביום החמישי, הקולונואידים היו מוכנים למעבר. הגדלה = פי 10; סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התבססות של קולונואידים ממוינים סופניים מתרבות קולונואידים מסורתית. מדיום התמיינות הונח על הקולונואידים 48 שעות לאחר שעבר את הקולונואידים של מורין. לאחר (A) 24 שעות ו-(B) 48 שעות, הקולונואידים מועשרים בתאים ממוינים סופניים. הגדלה = פי 10; סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ביטוי חלבוני PGC1α ו-TFAM בקולונואידים ממוינים של מורין שטופלו במתווכי דלקת. תוספת בינונית עם מתווכי דלקת הונחה על הקולונואידים המובחנים, והחלבון נאסף 0 שעות, 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר החשיפה. (A) ביטוי החלבון של PGC1α הראה ירידה משמעותית כוללת (p = 0.0442) במשך 72 שעות. TFAM היה מופחת באופן משמעותי (p = 0.004) לאחר חשיפה למתווכי דלקת ב 72 שעות, ו (B) הייתה מגמת ירידה בביטוי חלבון ב 24 שעות, 48 שעות, ו 72 שעות כאשר נותח על ידי ANOVA. הנתונים המוצגים כממוצע ± סטיית תקן. *p < 0.05, **p < 0.005. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התבססות וצמיחה של חד-שכבות מקולונואידים קיימים. קולונואידים ששובשו אנזימטית ומכנית צופו על תוספות תרבית תאים שצופו במטריצת קרום מרתף. עם הציפוי הראשוני, הופיעו הקולונואידים המפוצלים בצבירי תאים (A), וביום 3 (B) הם החלו להשתטח ולכסות לאט לאט את החדרת תרבית התא. (C) ביום 5 וביום (D) ביום 7, החד-שכבות המשיכו לגדול ויצרו מחסום רציף שניתן למדוד כמותית באמצעות TEER. הגדלה = פי 10; סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ערכי TEER ליצירת חד-שכבות שמקורן בקולונואידים וחד-שכבות מודלקות. (A) ערכי TEER נמדדו באמצעות מד מתח מיום 3 ליום 5. לחד-שכבות היו ערכים גבוהים יותר מוקדם יותר עם טווח רחב, אך לאט לאט התכנסו למספר נמוך יותר ביום 5. ברגע שהחד-שכבות מגיעות למצב יציב, ניתן להשתמש בהן לניסויים במורד הזרם. (B) ערכי ה-TEER היו נמוכים יותר בחד-שכבות המודלקות (n = 2) בהשוואה לבקרות הלא דלקתיות (n = 2). לחד-שכבות הבקרה היה TEER ממוצע של 129.16 אוהם·cm 2, וה-TEER של החד-שכבות המודלקות היה נמוך משמעותית (p = 0.0087), עם ממוצע של 98.54 Ω·cm2, כאשר נותח באמצעות מבחן t. **P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: טבלת הרכב פתרונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור משלים 1: ביטוי חלבון PGC1α בקולונואידים מורינים שגודלו בתווך קולונואיד מסורתי שבודד מבקרות WT ו-2% עכברים שטופלו ב-DSS. הקולונואידים נלקחו הן מעכברי ביקורת WT בני 8 שבועות והן מעכברים שטופלו ב-2% DSS לאחר 7 ימים. החלבון בודד מקולונואידים שעברו פעמיים וביום 4 לאחר הציפוי. לא היה הבדל בביטוי חלבון PGC1α (p = 0.9996) בקולונואידים שמקורם בעכברי הביקורת בהשוואה לעכברים שנחשפו ל-2% DSS במשך 7 ימים כאשר נותחו על ידי מבחן t לא מזווג. הנתונים המוצגים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: ביטוי מופחת של Lgr5 ו-Ki67 mRNA בקולונואידים ממוינים. קולונואידים מורינים שעברו 48 שעות קודם לכן נחשפו למדיום התמיינות במשך 48 שעות לפני שבודדו את סינתזת הרנ"א וה-cDNA. רמות ה-mRNA נקבעו באמצעות qPCR ונותחו בשיטת CT השוואתית. (A) Lgr5 ו-(B) Ki67 ירדו באופן משמעותי בקולונואידים המובחנים כאשר נותחו סטטיסטית באמצעות מבחן t (p = 0.0023, p = 0.0007). הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן.**p < 0.005. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: עלייה בתאי גביע מפרישי מוצין בקולונואידים ממוינים. קולונואידים מורינים שעברו 48 שעות קודם לכן נחשפו למדיום התמיינות במשך 48 שעות. התאים עברו ליזה במאגר RIPA, והחלבון הודגם על ידי ניתוח כתמים מערביים. (A) ביטוי MUC2 היה מוגבר בכל קבוצה של קולונואידים מובחנים בהשוואה לקולונואידים הבלתי ממוינים. (B) שינוי כמעט כפול בחלבון MUC2 נצפה בתנאי ההתמיינות, שהיה משמעותי כאשר נותח באמצעות מבחן t (p = 0.0433). הנתונים המוצגים כממוצע ± סטיית תקן. *P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 4: ביטוי מופחת של סמני גזע והתמיינות, כמו גם סמני צומת הדוקים, בחד-שכבות שטופלו במתווכי דלקת . חד-שכבות שמקורן בקולונואידים מורין (יום 5) נחשפו למתווכי דלקת במשך 48 שעות, RNA נאסף לאחר מכן, ו-cDNA סונתז (n = 2). רמות ה-mRNA של סמני גזע, התמיינות וצמתים נקבעו באמצעות qPCR ונותחו בשיטת CT השוואתית. (A) סמן תאי הגזע, Lgr5, לא זוהה באף אחד מהתנאים, אך mTERT הופחת באופן משמעותי במצבים דלקתיים. סמן תאי הגביע, Muc2, וסמן הקולונוציט, Alpi, ירדו שניהם בחד-שכבות המודלקות בהשוואה לחד-שכבות שלא טופלו. (B) סמני הצומת ההדוקים, Zo-1, Occludin, ו-Claudin, היו כולם נמוכים יותר בחד-שכבות שטופלו בדלקת בהשוואה לקבוצת הביקורת. הנתונים המוצגים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: רשימת פריימרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתוח אורגנואידים חולל מהפכה באופן שבו הקהילה המדעית חוקרת מערכות איברים במבחנה עם היכולת לשחזר חלקית את המבנה והתפקוד התאי מבעל חיים או אדם בצלחת. יתר על כן, מערכות אורגנואידים שמקורן בבני אדם עם מחלות מציעות כלי מבטיח לרפואה מותאמת אישית שיכול להנחות קבלת החלטות טיפוליות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול בידוד קריפטה שעובד היטב ומציג שלבים מרכזיים המאפשרים ניקוי עודפי לכלוך בבידוד לפני הציפוי. בנוסף, אנו מסבירים פרט מפתח שלעתים קרובות מתעלמים ממנו בתהליך – היכולת לספור במדויק את הקריפטים לציפוי. לאחר התבססות הקולונואידים, אנו מתארים מניפולציות מרכזיות המאפשרות התמיינות תאית שלהם או היווצרות חד-שכבתית, אשר יכולות לשפר את היכולת לחקור שינויים באפיתל המעי במהלך IBD.

ציר הקריפט-וילוס באפיתל המעי הגס ביונקים הוא מבנה מורכב המורכב מסוגי תאים שונים בעלי תפקידים שונים. תחזוקת ציר זה תלויה בגורמים תאיים פנימיים וחיצוניים כאחד, אשר יחד מסייעים בשמירה על הומאוסטזיס אפיתל18. ציינו כי קולונואידים מורינים הגדלים בתווך מסורתי משקפים בעיקר תאי גזע, בניגוד להצטברות של תאי גזע ותאים ממוינים סופניים הנראית in vivo. יתר על כן, קולונואידים מורינים שגדלו ומתוחזקים באופן זה הם מבנים מעגליים בניגוד למונושכבות שטוחות. להבדלים אלה יש השלכות פוטנציאליות על ניסיונותינו לחקור מחלות מעיים במבחנה. באופן ספציפי, אנו מוגבלים ביכולתנו להשתמש באורגנואידים כדי לחקור שינויים בתפקוד המחסום, כמו גם את ההשפעות של דלקת על תאי אפיתל מעי ממוינים סופניים.

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לא רק לבידוד של קריפטים מורינים כדי לגדל קולונואידים, אלא גם למניפולציה של קולונואידים אלה כדי לחקור את הפיזיולוגיה של אפיתל המעי ואת תגובת האפיתל לדלקת. בין מספר גורמים חיצוניים המקדמים את השיפוע של תאי גזע פלוריפוטנטיים ותאים ממוינים סופניים הוא המסלול הקנוני Wnt, העשיר בקריפטות ומקדם את בריאות תאי הגזע. איתות Wnt פוחת בקצה ציר הקריפטה, במקביל לאבולוציה של תאי גזע לתאים ממוינים סופניים26. תיארנו פרוטוקול המאפשר התמיינות סופנית של תאי קולונואידים. כמו אחרים, אנו מבדילים על ידי הסרת Wnt ממדיום הגידול, אך אנו משתמשים בריכוז נמוך יותר של R-spondin (500 ng/mL לעומת 1 μg/mL R-spondin)17. באופן מפתיע, ירידה של 50% ב-R-ספונדין אינה משפיעה על ההתמיינות המוצלחת של האורגנואידים. היכולת להתמיין עם ריכוז נמוך יותר מסייעת בהקמת מערכת פחות מלאכותית שעשויה להיות דומה יותר לסביבה הפיזיולוגית in vivo. אף על פי שפרוטוקול זה גורם להתמיינות סופית (איור משלים 2 ואיור משלים 3) ולחוסר יכולת לשמור על אלמוות תאי, הוא בכל זאת שיטה שימושית להבנה טובה יותר של התרומה הפיזיולוגית של אפיתל ממוין סופני, כולל קולונוציטים, תאים אנטרואנדוקריניים ותאי גביע, למחלות מעי דלקתיות ולמצבי מחלה אחרים. יתר על כן, אנו מראים כי תוספת ציטוקינים ספציפיים למדיום זה, אשר באופן מסורתי גבוהים יותר בחולים עם IBD, מכוונת את מערכת האורגנואידים המובחנת למצב דלקתי. במהלך 72 שעות, קולונואידים ממוינים שטופלו בציטוקינים דלקתיים משקפים באופן הדוק יותר חלק מהממצאים המטבוליים שהוצגו במודלים מבוססים אחרים של קוליטיס ומחלות מעי דלקתיות בבני אדם (איור 3). יתר על כן, קולונואידים ממוינים המטופלים באופן זה ככל הנראה משקפים יותר את השפעות הדלקת על הומאוסטזיס תאי על האפיתל המובחן. כמו כן, התווינו פרוטוקול לפיתוח חד-שכבות, המאפשר יצירת צד אפיקלי ובסיסי של האפיתל, המאפשר ניתוח של תפקוד המחסום in vivo. מערכת זו שימושית בחקר מנגנונים של תפקוד לקוי של מחסום ללא צורך בהבחנה ובטיפוח מטרות טיפוליות חדשות לטיפול.

יש לציין מספר מגבלות ומלכודות אפשריות בנוגע לפרוטוקולים המתוארים לעיל. הבידוד המוצלח של הקריפטות ופיתוח הקולונואידים יכול להיות מוגבל על ידי תפוקת הקריפטה מכל חיה, הדיוק של ספירת הקריפטים, וניקיון ההכנה. מהירות ספירת הקריפטים המבודדים לאחר השעיה, שינויים בדיסוציאציה המכנית של הקריפטים מהשרירים שמתחתיהם, ומספר השטיפות והספינים הצנטריפוגליים תורמים לתרבית קולונואידים מוצלחת. יתר על כן, זה קריטי לא לנתק לחלוטין את האורגנואידים לתאים בודדים במהלך המעבר או ציפוי עבור תרבית חד-שכבתית דו-ממדית. אשכולות של 30 עד 50 תאים הם אידיאליים כדי לאפשר לתרבית להתפשט לתרבית לטווח ארוך. הפרוטוקולים לעיל מציינים אזורים של מלכודות פוטנציאליות וצעדים אופציונליים נוספים לפתרון בעיות אלה. בסופו של דבר, הפרוטוקול עשוי לדרוש אופטימיזציה על ידי הפרט המבצע את הבידוד בשל שונות מובנית במערך הכישורים והתמרונים (כלומר, טלטול), כמו גם שונות בכל חיה. אופטימיזציה נוספת עשויה להידרש על ידי משתמש הקצה כדי ללכוד את המגוון הגנטי והמולקולרי שנמצא ב- IBD.

בסופו של דבר, בעוד שמערכת הקולונואידים היא כלי שימושי ביותר לסיכום היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה האנושית ומחלות in vivo, מערכת זו מוגבלת בסופו של דבר ביכולתה לחקור את כל ההיבטים של מחלות אנושיות. שיטות מסורתיות להתפתחות קולונואידים הבהירו היבטים מרכזיים של דינמיקה של תאי גזע; עם זאת, ממצאים אלה לעתים קרובות אינם משקפים כראוי את הממצאים בתאים ממוינים סופניים בתוך אפיתל המארח. האסטרטגיות המתוארות במחקר זה מספקות לחוקרים מודל מהיר יחסית וזול למניפולציה אורגנואידית, שכאשר משתמשים בו כראוי, יכול לשפוך אור על היבטים מרכזיים של מבנה אפיתל המעי ותפקודו במהלך דלקת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לכותבים התורמים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים למענקי בריאות R01DK120986 (ל- K.P.M).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

Tags

ביולוגיה גיליון 196
חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת <em>מעיים במבחנה</em> על קולונואידים מורינים מבוססים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, … More

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter