Undersøgelse af epitelvirkningerne af tarmbetændelse in vitro på etablerede murinkolonoider

Summary

Vi beskriver en protokol, der beskriver isoleringen af murinkolonkrypter til udvikling af 3-dimensionelle kolonoider. De etablerede kolonoider kan derefter differentieres terminalt for at afspejle den cellulære sammensætning af værtsepitelet, inden de modtager en inflammatorisk udfordring eller bliver instrueret til at etablere et epitelmonolag.

Abstract

Tarmepitelet spiller en væsentlig rolle i menneskers sundhed og giver en barriere mellem værten og det ydre miljø. Dette meget dynamiske cellelag giver den første forsvarslinje mellem mikrobielle og immune populationer og hjælper med at modulere tarmens immunrespons. Forstyrrelse af epitelbarrieren er et kendetegn ved inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og er af interesse for terapeutisk målretning. Det 3-dimensionelle kolonikultursystem er en yderst nyttig in vitro-model til undersøgelse af tarmstamcelledynamik og epitelcellefysiologi i IBD-patogenese. Ideelt set ville etablering af kolonier fra det betændte epitelvæv hos dyr være mest gavnligt ved vurderingen af de genetiske og molekylære påvirkninger på sygdom. Vi har imidlertid vist, at in vivo epitelændringer ikke nødvendigvis bevares i kolosider etableret fra mus med akut inflammation. For at imødegå denne begrænsning har vi udviklet en protokol til behandling af kolonier med en cocktail af inflammatoriske mediatorer, der typisk er forhøjet under IBD. Mens dette system kan anvendes allestedsnærværende på forskellige dyrkningsforhold, understreger denne protokol behandling af både differentierede kolonoider og 2-dimensionelle monolag afledt af etablerede kolonier. I en traditionel kulturindstilling er kolosider beriget med intestinale stamceller, hvilket giver et ideelt miljø til at studere stamcellenichen. Dette system tillader imidlertid ikke en analyse af funktionerne i tarmfysiologi, såsom barrierefunktion. Endvidere giver traditionelle kolonier ikke mulighed for at studere det cellulære respons af terminalt differentierede epitelceller til proinflammatoriske stimuli. De metoder, der præsenteres her, giver en alternativ eksperimentel ramme til at løse disse begrænsninger. Det 2-dimensionelle monolagskultursystem giver også mulighed for terapeutisk lægemiddelscreening ex vivo. Dette polariserede lag af celler kan behandles med inflammatoriske mediatorer på basalsiden af cellen og samtidig med formodede terapeutiske midler apisk for at bestemme deres anvendelighed i IBD-behandling.

Introduction

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en kronisk, remitterende og recidiverende sygdom karakteriseret ved episoder af betændelse og klinisk hvile. IBD's ætiologi er multifaktoriel, men nøglekarakteristika ved sygdommen inkluderer defekt barrierefunktion og øget permeabilitet af tarmepitelet ud over proinflammatoriske signalkaskader aktiveret i epitelrummet ^1,2. Flere in vitro og in vivo modeller er blevet anvendt til at rekapitulere epitelresponset under IBD, herunder cellekultur og murine modeller af inflammation³. Imidlertid har alle disse systemer vigtige mangler, der begrænser deres evne til at rekapitulere epitelændringerne under IBD⁴. De fleste cellelinjer, der bruges til at studere IBD, transformeres, har evnen til at danne et monolag og kan differentiere³, men forplanter sig iboende anderledes end ikke-transformerede tarmepitelceller i værten. Flere forskellige murinmodeller af inflammation bruges til at studere IBD, hvoraf nogle inkluderer knockout-modeller, infektiøse modeller, kemiske inflammatoriske modeller og T-celleoverførselsmodeller 5,6,7,8. Mens hver enkelt kan studere visse etiologiske aspekter af IBD, såsom genetiske dispositioner, barrieredysfunktion, immunderegulering og mikrobiomet, er de begrænsede i deres evne til at studere sygdommens multifaktorielle karakter.

Intestinale organoider, herunder enteroider og colonoider, er blevet etableret i løbet af det sidste årti som en nyttig in vitro-model til undersøgelse af ikke kun dynamikken i intestinale stamceller, men også deres rolle: barriereintegriteten og funktionen af tarmepitelspillet spiller i intestinal homeostase og sygdom. Disse enheder har bidraget væsentligt til vores forståelse af patogenesen af IBD⁹ og har åbnet nye muligheder for personlig medicin. Colonoider, eller stamcelleafledte, selvorganiserende vævskulturer fra tyktarmen, er blevet udviklet fra både murin og humant væv i en proces, der gør det muligt for stamceller placeret i tarmkrypter at formere sig og opretholdes på ubestemt tid¹⁰. Stamcellenichen in vivo er afhængig af ekstracellulære faktorer for at understøtte dens vækst, især de kanoniske Wnt-signalveje og knoglemorfogene proteinsignalveje¹¹. Tilføjelsen af disse faktorer fremmer kolonioidernes sundhed og levetid, men driver også kulturen mod en stamcellelignende tilstand, der ikke afspejler in vivo-epitelcellulær arkitektur, som består af både selvfornyende og terminalt differentierede celler^12,13. Mens funktionaliteten af tarmepitelet er afhængig af den kontinuerlige krydstale mellem stamcellerummet og differentierede celler, er evnen til at have begge dele i et kolonoidkultursystem ret begrænset. På trods af disse begrænsninger forbliver organoidkultursystemet guldstandarden for at studere epithelets iboende egenskaber ex vivo. Ikke desto mindre kan det være nødvendigt at overveje alternative kulturstrategier for at besvare det videnskabelige spørgsmål, der er til rådighed.

Det har vist sig, at mus på et kontinuerligt 7-dages regime af dextrannatriumsulfat (DSS) udvikler både epitelbetændelse og barrieredysfunktion¹⁴. Desuden er mitokondriel biogenesesvigt og metabolisk omprogrammering i tarmepitelet, som har vist sig at være tydelige i human IBD, også blevet fanget i denne DSS-model af colitis¹⁵. Vores foreløbige data viser imidlertid, at egenskaberne ved mitokondriel biogenesefejl ikke bevares i kolonier afledt af krypterne hos DSS-behandlede dyr (supplerende figur 1). Således skal alternative dyrkningsmetoder anvendes, når man undersøger, hvordan inflammation driver epitelændringer under murin tarmbetændelse. Her skitserer vi en protokol, vi har udviklet, der beskriver 1) hvordan man isolerer krypter fra hele tyktarmsvæv til etablering af murinkolonoider, 2) hvordan man terminalt differentierer denne cellepopulation for at afspejle cellepopulationen, som den står in vivo, og 3) hvordan man inducerer betændelse i denne in vitro-model . For at studere lægemiddelinteraktioner inden for det betændte epitel har vi udviklet en protokol til etablering af 2-dimensonale (2D) monolag fra murine colonoider, der grundlæggende kan behandles med inflammatoriske mediatorer og apisk behandles med lægemiddelterapier.

Protocol

Alle forsøg med murine væv beskrevet heri blev godkendt af Institutional Review Board ved University of Pittsburgh og udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Research and Care Committee ved University of Pittsburgh og UPMC.

1. Forberedelse til kultur

BEMÆRK: Alle reagenser er angivet i afsnittet Materialetabel , og alle opløsningssammensætninger findes i opløsningssammensætningstabellen (tabel 1).

1. Klargør musevaskemediet som beskrevet i tabel 1. Opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder.
2. Der udarbejdes kryptisolationsbuffer 1 (CIB1) som beskrevet i tabel 1. Opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder.
   FORSIGTIG: Dithiothreitol (DTT) betragtes som farlig af OSHA Hazard Communication Standard på grund af den potentielle akutte toksicitet, hvis den indtages, og hud- og øjenskader, hvis disse områder udsættes for det. Beskyttelseshandsker, øjenbeskyttelse og ansigtsbeskyttelse bør anvendes ved håndtering af dette kemikalie.
3. Der udarbejdes kryptisolationsbuffer 2 (CIB2) som beskrevet i tabel 1. Opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder.
4. Forbered L-WRN-konditioneret medium i henhold til en tidligere offentliggjort protokol¹⁶.
5. Der fremstilles et komplet kolonoidsubstrat som beskrevet i tabel 1. Komplet colonoid vækstmedium kan opbevares i op til 5 dage ved 4 °C uden tab af aktivitet.
6. Differentieringsmediet fremstilles som beskrevet i tabel 1. Denne protokol blev ændret fra en tidligere offentliggjort artikel¹⁷. Differentieringsmediet kan opbevares i op til 5 dage ved 4 °C uden tab af aktivitet.
7. Forbered inflammationsmediatormediet som beskrevet i tabel 1. Denne protokol blev ændret fra en tidligere offentliggjort artikel¹⁸. Inflammationsmediatormediet kan opbevares i op til 5 dage ved 4 °C uden tab af aktivitet.
8. Forbered murine monolagsmediet. Udelad Y-27632, når monolagene udfordres med inflammatoriske faktorer og/eller lægemiddel(er). Det murine monolagsmedium kan opbevares i op til 5 dage ved 4 °C uden tab af aktivitet.
9. Forbered inflammationsmediatorens monolagsmedium. Inflammationsmediatorens enkeltlagsmedium kan opbevares i op til 5 dage ved 4 °C uden tab af aktivitet.

2. Kryptisolering fra murin tyktarmsvæv

BEMÆRK: Overfør vævet på is. Tag den passende mængde kældermembranmatrix ud af -20 ° C-opbevaring, og tø op på is. Hver 24-brønd er belagt med 15 μL kældermembranmatrix. Forbered CIB1, CIB2 og komplet colonoid vækstmedium som beskrevet i punkt 1.

1. Aflive en C57BL/6J-mus (6-8 uger gammel) i henhold til den protokol, der er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee, og udtræk den distale ende (ca. 5-7 cm) af tyktarmen ved hjælp af ren pincet og saks.
   BEMÆRK: I denne undersøgelse blev forsøgspersonerne aflivet ved hjælp af kuldioxidkammerinkubation i 2-3 minutter efterfulgt af cervikal dislokation.
   1. For dette skal du placere musen på ryggen, lave et vandret snit lige under brystkassen og derefter et lodret snit fra midten af det vandrette snit mod bunden af halen for at udsætte bughulen.
   2. Med pincet skal du flytte tyndtarmen ud af marken, identificere tyktarmen og følge den ned til bunden af halen. Bryd bækkenet med en saks for at udsætte den distale tyktarm fuldt ud, hvis det er nødvendigt. Brug saksen til at klippe de mest distale 5-7 cm af tyktarmen.
2. Placer tyktarmsvævet på en ren overflade. Fjern overskydende serosalt fedt, der omgiver tyktarmen. Fjern fækalt stof ved at skylle tyktarmens luminale indhold med Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) ved hjælp af en sprøjte fastgjort til en 18 G 1 1/2 nål. Placer derefter tyktarmen i et 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml iskold DPBS, og læg det på is.
   BEMÆRK: Hvis du isolerer tyktarmen fra mere end et dyr, skal du lægge vævet på is, før du fortsætter til det næste dyr.
3. Overfør tyktarmsvævet til en petriskål med 10 ml iskold DPBS, og skyl lumen to gange med DPBS ved hjælp af en P1.000-pipette.
4. Åbn tyktarmen i længderetningen ved hjælp af en saks, og ryst forsigtigt med pincet i ~ 30 s i DPBS for at fjerne eventuelt resterende fækalindhold.
5. Overfør vævet til en ny petriskål med 10 ml iskold DPBS, og ryst igen forsigtigt med pincet, inden du skærer tyktarmen i stykker på 2 cm med en saks og læg dem i et 50 ml konisk rør med 7 ml iskold CIB1. Inkuber vævet i CIB1 på is i 20 min.
   BEMÆRK: De resterende trin udføres inde i et biologisk sikkerhedsskab.
6. Vævet overføres ved hjælp af en pincet til et forvarmet 50 ml konisk rør indeholdende 7 ml CIB2, og inkuberes i et vandbad ved 37 °C i 5 minutter.
7. Fjern CIB2 fra det 50 ml koniske rør ved at lade vævet sætte sig i bunden af det koniske rør og derefter pipettere CIB2 af. Tilsæt derefter 10 ml iskold musevaskemedium til det samme koniske rør.
8. Få et nyt 50 ml konisk rør, og placer et 70 μm filter oven på det åbne rør.
9. Mens du holder røret med tyktarmens indhold, drejes hånden ca. 45°. Ryst røret på en gyngende og kraftig måde i 45 s for at frigøre krypterne. Hæld derefter kryptsuspensionen gennem 70 μm cellesien i et nyt 50 ml konisk rør.
10. Brug en pincet til at placere tyktarmsvævet tilbage i det tomme 50 ml koniske rør, og tilsæt 10 ml iskoldt musevaskemedium. Få en ny 70 μm cellesi, og læg den oven på det 50 ml koniske rør, der indeholder den tidligere filtrerede opløsning.
11. Tag igen 50 ml røret med kryptfragmenterne op, og ryst det på samme måde som i trin 2.9. Filtrer mediet gennem 70 μm cellesilen ind i det 50 ml koniske rør for at kombinere med de tidligere filtrerede krypter.
    BEMÆRK: Hvis kryptudbyttet er lavt, rystes tyktarmsvævet yderligere ved at placere vævet i et tomt 50 ml konisk rør med 10 ml musevaskemedium. Ryst vævet i 45-50 s for at frigøre krypterne. Også, hvis kryptudbyttet er lavt, så øg rystelsens kraftighed. Endelig, hvis det samlede kryptudbytte er lavt, kan både pipetterne og rørene overtrækkes med føtalt bovint serum (FBS) for at forhindre vævets vedhæftning til plasten.
12. Det 50 ml koniske rør indeholdende de filtrerede krypter centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    BEMÆRK: En pellet skal overholdes i bunden af det 50 ml koniske rør.
13. Mediet dekanteres ved pipettering, krypterne resuspenderes ved pipettering op og ned med 10 ml iskold musevaskemedium, og overføres til et 15 ml konisk rør. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
14. For at opnå et renere præparat vaskes krypterne med yderligere 10 ml musevaskemedium. Det forrige medium dekanteres, og krypterne resuspenderes ved pipettering op og ned i 10 ml musevaskemedium. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C med et 15 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed ved pipettering af mediet, da pelleten til tider ikke centrifugeres tæt. Hvis pelleten ikke er tæt, pipetteres det meste af mediet af, så der efterlades 500 μL til 1 ml. Derefter resuspenderes pelleten ved pipettering i 10 ml musevaskemedium, og opløsningen overføres til et 15 ml konisk rør. Centrifugering i et mindre konisk rør kan forbedre pelletens tæthed.
15. Dekanter mediet, og ophæng krypterne igen ved pipettering op og ned med 10 ml iskold musevaskemedium. Når krypterne er resuspenderet, tælles de under et lysfeltmikroskop ved straks at pipettere 10 μL af substratet på et glasglas.
    1. Placer to 10 μL dråber i hver sin ende af diaset, og tæl antallet af krypter i hver dråbe. Gennemsnit tallene mellem de to dråber for at bestemme antallet af krypter pr. 10 μL. Multiplicer dette tal med 100 for at få antallet af krypter i 1 ml.
       BEMÆRK: For nøjagtig tælling skal 10 μL af kryptsuspensionen fjernes straks efter resuspension. Hvis ikke, vil krypterne falde til bunden af røret, hvilket vil resultere i en unøjagtig optælling.
16. Med et mål om at platte 300-500 krypter pr. brønd overføres den passende mængde krypter, der er resuspenderet i musevaskemediet, til et nyt 15 ml konisk rør og bringes til 10 ml med iskold musevaskemedium. Centrifuger glasset ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. En lille pellet skal være synlig i bunden af røret.
17. Supernatanten fjernes med en powerpipette. Brug en P200-pipet til forsigtigt at fjerne ethvert resterende medium, så kun pelleten efterlades.
18. Resuspender pellet i den passende mængde iskold kældermembranmatrix ved langsomt pipettering op og ned. Pas på ikke at indføre bobler, når du resuspenderer kryptpelleten. Plade 300-500 krypter/15 μL kældermembranmatrix i hver brønd på en plade. Efter plettering vendes vævskulturpladen på hovedet, og den anbringes i en 37 °C inkubator i 10-20 minutter.
19. Vend pladen tilbage, og tilsæt 500 μL af det komplette musekolonoide medium til hvert hul. Skift mediet hver anden dag, indtil de er klar til pasning. Passage colonoiderne hver 3-5 dage.

3. Passering af colonoiderne

BEMÆRK: Hver brønd kan generelt passeres 1: 4 til 1: 6 i henhold til densiteten af den oprindelige brønd. Tag den passende mængde kældermembranmatrix ud af -20 ° C, og læg den på is for at tø op. Colonoids kan bruges til eksperimenter efter to passager. Ved passage af kolonoider udføres trinene i et biologisk sikkerhedsskab for at forhindre forurening.

1. Fjern mediet fra brøndene, der skal passeres.
   1. Hvis der er snavs i kældermembranmatrixen, hvilket kan ske under den indledende isolering, kan følgende protokol bruges til at rydde op i affaldet:
      1. Tilsæt 1 ml iskold 0,1% bovin serumalbumin (BSA) i DPBS uden Ca 2+ eller Mg²⁺ til hvert hul. Lad det sidde i 5 minutter i det biologiske sikkerhedsskab.
      2. Pipetten pipetteres op og ned tre til syv gange ved hjælp af en P1000-pipette for at forstyrre kældermembranmatrixen, og indholdet af brøndene opsamles i et 15 ml konisk rør. Centrifuger kolonoiderne i alt 5-10 ml 0,1% BSA i DPBS uden Ca 2+ eller Mg²⁺. Der fyldes op til passende volumen med 0,1 % BSA.
      3. Der centrifugeres ved 150 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere colonoiderne, men ikke resterne.
      4. Dekanter DPBS ved pipettering og efterlader pelleten. Tilsæt 1 ml enzymatisk dissociationsreagens ved stuetemperatur (RT), og pipette tre til fem gange.
      5. Anbring det 15 ml koniske rør med det enzymatiske dissociationsreagens og forstyrrede koloider i et 37 °C vandbad i 3-4 minutter.
      6. Fjern røret fra vandbadet, pipetten 3-5 gange, og bring derefter til 10 ml med musevaskemedium. Fortsæt til trin 3.6.
2. Anbring 500 μL RT enzymatisk dissociationsreagens i hvert hul, og lad det sidde i ca. 1 minut, før det pipetteres op og ned tre til syv gange for at forstyrre kældermembranmatrixen.
3. Placer pladen i en 37 °C inkubator i 3-4 min.
4. Fjern pladen fra inkubatoren, og pipette op og ned tre til syv gange ved hjælp af en P1000-pipette til at adskille kolonoiderne.
5. Overfør indholdet til et 15 ml konisk rør og fyld op til 10 ml med iskold musevaskemedium.
6. Prøven centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
7. Fjern mediet ved hjælp af en strømpipette og en P200-pipette efter behov, så der kun er en pellet tilbage i det koniske rør.
8. Resuspender i en passende mængde iskold kældermembranmatrix ved forsigtigt pipettering op og ned i henhold til, hvor mange brønde der skal belægges. Indfør ikke bobler ved pipettering. Anbring colonoidfragmenterne i 15 μL kældermembranmatrixdråber pr. Brønd.
9. Plade krypterne, vend vævskulturpladen, og læg derefter pladen i en 37 ° C inkubator i 10-20 minutter.
10. Til sidst vendes pladen tilbage, og der tilsættes 500 μL komplet musekolonoidmedium til hvert hul. Skift mediet hver anden dag, indtil de har vokset sig store nok til at blive passeret igen om cirka 3-5 dage.

4. Terminalt differentiering af colonoidcellerne

1. Gennemfør kolonoiderne som ovenfor, og tilsæt 500 μL af det komplette musekoloroide medium til hvert hul.
2. Mindst 48 timer efter passage fjernes hele musekolonoidmediet, og der tilsættes 500 μL af differentieringssubstratet til hvert hul (se punkt 1).
3. Inkuber colonoiderne med differentieringsmedier i 48 timer, hvorefter de kan anvendes i forsøg, herunder indsamling af RNA og protein.
   BEMÆRK: Colonoider kan vurderes for differentiering ved at indsamle RNA og vurdere ekspressionen af Lgr5 og Ki67, henholdsvis en stamcellemarkør og celleproliferationsmarkør via kvantitativ revers transkriptase-polymerasekædereaktion (qPCR). Terminalt differentierede celler skal have et relativt lavt udtryk for Lgr5 og Ki67 sammenlignet med colonoider dyrket i traditionelt colonoidmedium, hvor cellerne er mere stammelignende. Den tid, som kolonierne skal inkubere i differentieringsmediet, skal muligvis optimeres for hvert enkelt laboratorium. Se supplerende tabel 1 for listen over primere.

5. Inducering af betændelse i differentierede koloider med inflammatoriske mediatorer

1. Efter at kolonoiderne er blevet inkuberet i 2-3 dage med differentieringsmediet, fjernes det eksisterende medium, og der tilsættes 500 μL af inflammationsmediatormediet til hver brønd.
2. Lad brøndene inkubere i 24-72 timer, før RNA og protein opsamles (eller andre nedstrømsparametre vurderes). Skift mediet hver dag.

6. Intestinale epitelmonolag afledt af etablerede murine colonoider

BEMÆRK: Murine intestinal epitelmonolag er afledt af murine colonoider, der har været passeret mindst to gange. For at muliggøre vellykket monolagsdannelse på 3-5 dage er det bydende nødvendigt ikke at adskille colonoiderne i enkeltceller. Fragmenterede organoider, der er blevet enzymatisk dissocieret i cellulære klynger, er ideelle til vækst.

1. Alle reagenserne klargøres, inden forsøget påbegyndes. Optø kældermembranmatrixen på is. Klargør murine monolagssubstratet som beskrevet i punkt 1 . Fortynd den optøede kældermembran 1:20 med det kolde murin monolagsmedium. Hold på is.
2. Brug sterile tang til at placere en 0,4 μm gennemsigtig cellekulturindsats i en enkelt brønd i en 24-brønds vævskulturplade (materialetabel). Tag fat i en hjørnestang af indsatsen, og overfør den til brønden. Gentag indtil det passende antal cellekulturindsatser er tilgængelige til dyrkning.
   BEMÆRK: Sørg for kun at belægge en ekstra kontrolbrønd med kældermembranmatrixen. Denne cellekulturindsats vil blive brugt til at måle baggrundsmodstanden af cellekulturindsatsen uden celler til stede, som beskrevet i det efterfølgende trin (trin 6.3).
3. Brug en P200-pipat til at dække den apikale (øverste) overflade af hver cellekulturindsats med 150 μL fortyndet kældermembranmatrix. Placer pipetspidsen i midten af indsatsen uden at røre ved skærets membran, og fjern forsigtigt opløsningen. Pladen anbringes i en steril 37 °C inkubator med 5 % CO₂ i mindst 1 time.
4. Fjern forsigtigt kældermembranmatrixen før brug, og lad cellekulturindsatserne tørre i et biologisk sikkerhedsskab i mindst 10 minutter.
   1. For at fjerne kældermembranmatrixen skal du dreje pladen med 24 brønde i en vinkel på 45 °. Placer en enkelt finger på hjørnet af stiften for at stabilisere indsatsen, og brug en P200-pipette til forsigtigt at placere pipetspidsen langs den nederste side af indsatsen og fjerne matrixen.
   2. Eventuelle overskydende rester fjernes ved at vaske hver cellekulturindsats med 150 μL steril DPBS uden Ca 2+ eller Mg²⁺.
5. Efter 10 minutters tørring tilsættes 400 μL af murine monolagsmediet til bunden af cellekulturindsatsen og 75 μL ovenpå. Gentag indtil alle cellekulturindsatserne er nedsænket. Lad pladen stå i det biologiske sikkerhedsskab, eller læg den tilbage i inkubatoren, indtil det er nødvendigt.
6. Fjern den 24-brønds plade af modne (organoider på dag 3-5 af vækst) tarmkolonoider fra 37 ° C, 5% CO₂ -inkubatoren, og læg den under det biologiske sikkerhedsskab. Fjern mediet ved hjælp af sterile spidser, og vask hvert hul med 1 ml RT steril DPBS (uden Ca 2+ eller Mg²⁺).
   BEMÆRK: En individuel brønd på 75-125 modne kolonoider opdeles i et forhold på 1:4.
7. DPBS fjernes uden Ca 2+ eller Mg²⁺ ved hjælp af sterile spidser, og fordøjes hvert stik i kældermembranmatrixen ved at placere 500 μL RT enzymatisk dissociationsreagens i hvert hul, der skal passeres.
8. Pipet hver brønd op og ned ca. 6-10 gange for at bryde stikket op. Rids ikke bunden af pladen for at fjerne stikket. Drej i stedet pladen med 24 brønde i en vinkel på 45°, placer pipettens spids ved kanten af stikket, og løsn den forsigtigt.
9. Pladen med 24 brønde anbringes tilbage i en steril 37 °C, 5 % CO₂ inkubator i 3-4 minutter.
10. Fjern pladen, og pipet det enzymatiske dissociationsreagens op og ned fem til syv gange for hvert hul under et biologisk sikkerhedsskab. Overfør de dissocierede koloider fra hver brønd til et sterilt, 15 ml konisk rør. Bring op til et volumen på 10 ml med iskold musevaskemedium.
11. De delvist fordøjede koloider centrifugeres ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter i en svingende spandcentrifuge.
12. Under det biologiske sikkerhedsskab fjernes supernatanten fra pelletten ved hjælp af en 10 ml pipør. Fjern eventuelt resterende medium ved hjælp af en P200-pipet. Resuspender colonoid pellet i murine monolagsmedium. Der tilsættes 75 μL medium pr. cellekulturindsats af fragmenterede colonoider, der skal belægges.
13. Der tilsættes 75 μL colonoid suspension til midten af hver cellekulturindsats. Før du tilsætter colonoidsuspensionen til hvert hul, pipetteres forsigtigt op og ned en eller to gange, før du fjerner 75 μL, hvilket giver mulighed for mere ensartet plettering.
14. Placer pladen med 24 brønde med cellekulturindsatser på en roterende platform i 10 minutter for yderligere at muliggøre ensartet spredning over cellekulturindsatsen.
15. Pladen anbringes i en steril 37 °C, 5 % CO₂ -inkubator.
16. Den næste dag (dag 1) løsnes de ikke-bundne tyktarmsfragmenter ved at pipettere mediet op og ned tre til fem gange med en P200-pipør. Placer forsigtigt spidsen langs indersiden af cellekulturindsatsen for ikke at forstyrre de vedhæftede tarmceller. Indfør ikke bobler i mediet, da dette forhindrer fjernelse af alle de ikke-vedhæftede fragmenter.
17. Fjern straks mediet og colonoidblandingen. Gentag indtil alle cellekulturindsatserne er renset.
18. Tilsæt forsigtigt 150 μL forvarmet murine monolagsmedium til den apikale side af hver cellekulturindsats. Der tilsættes 400 μL opvarmet murine monolagsmedium til hvert hul i en ny plade med 24 brønde. Overfør cellekulturindsatsen til den nye plade ved at gribe fat i dens ben ved hjælp af sterile pincet. Skift mediet hver anden dag indtil sammenløb.
    BEMÆRK: Colonoidfragmenterne skal danne et sammenflydende monolag 3-5 dage efter plettering.

7. Måling af epitelmonolagenes nettomodstand ved hjælp af et voltohmmeter på dag 3 - 5 i monolagskultur

BEMÆRK: Spisepindeelektroderne ligner pincet og er asymmetriske i længden. Sondens længere arm er den basolaterale elektrode, og den kortere arm er den apikale elektrode. Sonden kan være vanskelig at indsætte mellem indersiden og ydersiden af cellekulturindsatsen. Placering af sonden i en lille vinkel ved indsættelse efterfulgt af lodret udretning af sonden forhindrer sonden i at sidde fast. Sørg for at læse nettomodstanden for hver cellekulturindsats i en lignende vinkel, da dette kan påvirke værdierne.

1. Anbring voltohmmeteret og alle reagenserne i et biologisk sikkerhedsskab.
   1. Sæt voltohmmeteret i den nærmeste stikkontakt, og sæt elektrodesondens modulære plastikstik i INPUT-stikket på frontdisplayet.
   2. For at placere voltohmmeteret i en vinkel på 45° skal du svinge metalarmen på bagsiden af udstyret ud, indtil det låses på plads.
   3. Tænd nu voltohmmeteret ved at dreje afbryderen UP på frontdisplayet. Til sidst skal du dreje kontakten op mod OHMS for at få vist aflæsningen i denne metric.
2. Fjern pladen med 24 brønde fra inkubatoren med 37 °C, 5 % CO₂ , og læg pladen fladt i det biologiske sikkerhedsskab. Den transepitelielle elektriske modstand (TEER) er temperaturfølsom. Fjern kun pladen umiddelbart før TEER-aflæsningen.
3. Steriliser elektrodesonden i forvarmet 70% ethanol i 30 s til 1 min. Fjern sonden, vend den om, og svip den en til to gange for at fjerne overskydende ethanol. Sonden lufttørrer i ca. 30 sekunder.
4. Vask eventuel resterende ethanol tilbage på sonden med forvarmet musevaskemedium.
   FORSIGTIG: Lad ikke nogen af de resterende ethanoldråber højere på sonden falde ned i cellekulturindsatsen. Når du vasker ethanolen af med medium, må mediet ikke gå over det sterile ethanolfelt. Dette kan medføre, at forurenet medium kommer ind i cellekulturindsatsen.
5. Hold sonden vinkelret på cellekulturindsatsen. Indsæt den basolaterale elektrode (længere ende af sonden) på ydersiden af cellekulturindsatsen, indtil den berører bunden af 24-brøndpladen. Skub den apikale elektrode (kortere ende af sonden) ind i cellekulturindsatsen. Varier ikke afstanden mellem de to elektroder fra brønd til brønd. Dette vil påvirke TEER-målingen.
6. Kontroller, at den apikale elektrode ikke rører bunden af cellekulturindsatsen, før TEER læses. Start med indsættelsen af baggrundskontrolcellekultur, og registrer værdien. Værdien vises automatisk digitalt på forsiden af voltohmmeteret.
7. Gentag trin 7.5-7.6 for hver cellekulturindsats.
   BEMÆRK: Hvis der er forskellige eksperimentelle betingelser mellem cellekulturindsatserne, steriliseres sonden mellem hver ny tilstand. Start med trin 7.1, og fortsæt numerisk gennem trinnene.
8. Pladen med 24 brønde anbringes tilbage i inkubatoren, når alle TEER-målinger er registreret.
9. Nettoværdierne ved 350 Ω eller derover er tegn på enkeltlagsdannelse. Gentag igen de efterfølgende dage, indtil der er opnået monolagsdannelse.
   BEMÆRK: Generelt kan værdier på 1.000 Ω eller derover registreres på dag 3, men over tid vil de alle konvergere på et lavere tal omkring 350 Ω.

8. Beregning af TEER ved hjælp af nettomodstandsmålinger fra voltohmmeteret

BEMÆRK: Vellykket enkeltlagsdannelse af colonoiderne vil give TEER-målinger større end 115 Ω·cm².

1. Tag individuelle nettomodstandsværdier, og træk nettomodstanden fra baggrundsbrønden. Cellekulturindsatserne belagt med kældermatrixmembranen giver en nettoaflæsning på omkring 100 Ω.
2. Tag de baggrundssubtraherede nettomodstandsmålinger, og gang dem med overfladearealet af cellekulturindsatsen. En 24-brønds cellekulturindsats har et overfladeareal på 0,33 cm².
3. Hvis værdierne er 115 Ω cm² eller derover, fortsættes til downstream-forsøgsassays.

9. Inducering af betændelse i epitelmonolagene med inflammatoriske mediatorer

1. Når vellykkede monolag er dannet, tilsættes inflammatoriske mediatorer til kulturen på den basale side af kulturen. Forbered inflammationsmediatorens monolagsmedium, som beskrevet i trin 1.9, og tilsæt 400 μL til hvert hul i en ny plade med 24 huller.
2. Mediet fjernes fra den apikale side af cellekulturindsatsen, og der tilsættes 150 μL af det murine monolagsmedium uden Y-27632. Suppler ikke denne side med inflammatoriske mediatorer. Men hvis celledøden virker overdreven, skal du forlade Y-27632 i medierne. Dette skal bestemmes af slutbrugeren.
3. Overfør cellekulturindsatserne til en ny 24-brøndplade, og læg dem i brøndene suppleret med inflammationsmediator monolagsmedium.
4. Stimulere monolagene med inflammatoriske mediatorer i 24-72 timer afhængigt af eksperimentet.
5. For at teste lægemiddelresponser ved hjælp af denne inflammatoriske model skal du supplere monolagsmediet på den apikale side af cellekulturindsatsen med det valgte lægemiddel. Lægemidlet kan tilsættes på et hvilket som helst tidspunkt i eksperimentet afhængigt af lægemidlets virkningsmekanisme og de nedstrømsparametre, der skal vurderes.

Representative Results

3D-tarmkolonoidkultursystemet er et uvurderligt værktøj til at studere epithelets iboende bidrag til tarmslimhindehomeostase. Den beskrevne protokol giver detaljerede instruktioner om, hvordan man isolerer krypter fra C57BL/6J (WT) mus ved 8 ugers alderen og etablerer et langsigtet kolonikultursystem, der kan manipuleres til flere downstream-applikationer. Ved isolering og plettering af krypter i kældermembranmatrixen fremstår krypterne tætte og flercellede i struktur, når de visualiseres ved lysfeltmikroskopi. De kan være sfæriske i form eller aflange og cylindriske, der ligner den enkelte, kryptlignende struktur, der normalt observeres inden for in vivo-tarmarkitekturen (figur 1A). På dag 1 danner størstedelen af krypterne en kompakt, sfærisk struktur, hvor nogle få kolonoder begynder at udvikle et indre lumen (tomt rum) uden epitelceller (figur 1B). Da de fortsætter med at vokse i løbet af de næste flere dage, fortsætter koloniernes diametre med at stige, og lumen i colonoiderne bliver mere definerede (figur 1C). På dag 5 er hver colonoid ca. 100-250 μm i diameter og danner et stort, fremtrædende lumen omgivet af et tyndt lag epitelstamceller (figur 1D). På dette tidspunkt forstyrres koloiderne både enzymatisk og mekanisk til passering. Efter to passager kan de bruges til nedstrøms eksperimenter.

For at vurdere, om de metaboliske ændringer, der observeres i kolonskrabninger hos DSS-behandlede mus, bevares i kolonoider afledt af mus på samme DSS-regime, blev 8 uger gamle WT-mus behandlet med 2% DSS i drikkevand ad libitum. Aldersmatchede og kønsmatchede WT-kontroldyr fik drikkevand ad libitum uden DSS. Efter 7 dage blev musene ofret, og krypter blev isoleret fra tyktarmen hos både kontroldyrene (n = 3, han) og DSS-behandlede dyr (n = 3, han) for at etablere kolonier. Efter to passager blev protein isoleret fra hvert sæt kolonoider, og ekspressionen af peroxisom proliferator-aktivator receptor-gamma coactivator-1α (PGC1α), master regulator protein af mitokondriel biogenese, blev vurderet via western blot analyse (supplerende figur 1). Der var ingen signifikant forskel i PGC1α-ekspression, når man sammenlignede colonoiderne etableret fra de DSS-behandlede mus versus colonoiderne etableret fra kontrolmusene, hvilket tyder på, at denne colonoidkulturmetode ikke korrekt afspejler de in vivo metaboliske ændringer, der observeres hos mus¹⁵.

PGC1αs manglende evne til at initiere mitokondriel biogenese under en tarminflammatorisk fornærmelse er primært lokaliseret til det differentierede kolonepitel^15,19. For at afspejle de ændringer, der blev observeret in vivo, besluttede vi at lede koloiderne mod en mere differentieret tilstand. For at fremkalde dette skift blev colonoiderne oprindeligt inkuberet med traditionelt colonoidmedium. Efter 24 timer til 48 timer blev colonoiderne skiftet til differentieringsmedium i yderligere 48 timer. Under differentiering overgik en lille procentdel af colonoider fra en sfærisk arkitektur til knoppede strukturer beriget med bægerceller og colonocytter¹⁷ (figur 2A, B). Colonoiderne dyrket i WRN-suppleret medium blev beriget med hurtigt delende Lgr5⁺ stamceller. For at bekræfte, at både Lgr5⁺ stamceller og andre prolifererende celler forlod cellecyklussen under differentiering, blev mRNA-niveauerne analyseret via qPCR. Signifikant nedregulering i både Lgr5 (97%, p = 0,0023) og Ki67 (75%, p = 0,0007) niveauer blev observeret i de differentierede colonoider (n = 6) sammenlignet med colonoiderne dyrket i en traditionel kulturindstilling (n = 6; Supplerende figur 2A,B). Man ville også forvente, at de differentierede kolonier primært bestod af slimudskillende bægerceller. Derudover blev MUC2 faktisk opreguleret næsten to gange i de differentierede koloider sammenlignet med deres traditionelt dyrkede modstykker (n = 3, p = 0,0433, supplerende figur 3). Når de tages sammen, tyder disse data på, at koloiderne med succes blev differentieret og var klar til nedstrøms eksperimenter. Dernæst blev inflammatoriske mediatorer tilsat i differentieringsmediet, som beskrevet i afsnit 5 i protokollen. Protein og RNA blev opsamlet op til 72 timer efter indførelsen af de inflammatoriske mediatorer til analyse. Imidlertid blev der ved 72 timer lejlighedsvis observeret øget celledød.

For at vurdere, om introduktionen af inflammatoriske mediatorer til differentierede koloider kunne efterligne mitokondriebiogenesesvigt observeret i både human IBD og en akut model for murine colitis, blev proteinekspressionen af PGC1α og transkriptionsfaktor A, mitokondrier (TFAM) vurderet via western blot-analyse i differentierede colonoider (n = 5) behandlet med inflammatoriske mediatorer over 72 timer. PGC1α-ekspression har vist sig at være nedsat i murine modeller for colitis, såvel som i human IBD¹⁵. TFAM, et protein, der driver både transkription og replikation af mitokondriegenomet, har også vist sig at være nedsat i murine modeller af colitis, og dets genekspression har vist sig at være nedsat i human IBD^15,20. Vi observerede en lignende nedregulering i både PGC1α (50,4%, p = 0,0442) og TFAM (88,9%, p = 0,004) ekspression i de differentierede koloider efter 72 timers eksponering for disse inflammatoriske mediatorer (figur 3). Samlet set tyder dette på, at behandlingen af differentierede koloider med cytokiner er en ideel model til at studere mitokondriedynamik in vitro.

Mens forskellige cellulære og molekylære funktioner kan undersøges i 3D-kolonikulturindstillinger, er 2D-monolagskultursystemer overlegne, når man vurderer barrierefunktion, værtspatogeninteraktioner og virkningen af oralt absorberede lægemidler på inflammation^21,22. Dannelsen af et kontinuerligt lag af sammenflydende celler med en intakt barriere gør det muligt let at placere forskellige biologiske eller kemiske agenser på den apikale og / eller basale side af cellerne. Denne protokol gør det muligt at etablere 2D-monolagskulturer fra allerede eksisterende WT-kolosjer, der er blevet passeret to gange. Colonoider, der er blevet enzymatisk og mekanisk forstyrret, er belagt på cellekulturindsatser belagt med kældermembranmatrix. Ved første plettering vises de fragmenterede kolonioider i cellulære klynger fra 15 til 150 celler (figur 4A). På dag 3 er cellerne begyndt at flade ud og langsomt dække cellekulturindsatsen og når generelt sammenløb (figur 4B). I løbet af de næste par dage fortsætter monolagene med at vokse og danner en kontinuerlig barriere, der kan måles kvantitativt ved TEER (figur 4C, D). Interessant nok svinger TEER-målingerne over dag 3 til dag 5. Monolagene har højere værdier tidligere med et bredt interval (200-800 Ω·cm 2), men disse værdier konvergerer langsomt på et lavere tal på dag 5 (115-150 Ω·cm², figur 5A). Når monolagene når en stabil tilstand, kan de bruges til nedstrøms eksperimentering.

For at karakterisere epitelresponsen af colonoidafledte monolag til inflammation blev inflammatoriske mediatorer anbragt på basalsiden (ydersiden af indsatsen) af cellerne i 48 timer. RNA'et blev ekstraheret, og mRNA-niveauerne af forskellige stam- og celledifferentieringsmarkører samt forbindelsesproteiner blev analyseret via qPCR. Lgr5 blev ikke påvist i nogen af tilstandene, men en anden stamcellemarkør, mTERT, blev reduceret med næsten 60% i de betændte monolag sammenlignet med den ubehandlede kontrol (supplerende figur 4A). Dernæst analyserede vi ekspressionen af to markører af differentierede celletyper, Muc2 og alkalisk fosfatase (Alpi). Begge mRNA-transkripter var lavere i de betændte monolag sammenlignet med kontrolcellerne (supplerende figur 4A). Både stamceller og postmitotiske celler reduceres almindeligvis under tyktarmsbetændelse^23,24,25, og et lignende respons blev observeret i monolagsmodellen opnået i denne undersøgelse.

En fordel ved enkeltlagssystemet er evnen til at vurdere barriereresponsen. For at afgøre, om barrieren var kompromitteret i den immunstimulerede tilstand, målte vi TEER-værdierne efter 48 timer. TEER-værdierne for kontrolmonolagene (n = 2) var i gennemsnit 129,16 Ω·cm 2, men faldt signifikant (p = 0,0087) til et gennemsnit på 98,54 Ω·cm² i de betændte monolag (figur 5B). For yderligere at bekræfte, at barrieren blev kompromitteret i den inflammatoriske tilstand, vurderede vi mRNA-niveauerne for tre forskellige stramme forbindelsesmarkører, Zo-1, Occludin og Claudin. Alle tre markører havde reducerede niveauer i den betændte tilstand sammenlignet med deres ikke-betændte modstykker (supplerende figur 4B). Samlet set viser disse data, at barrieredysfunktion er til stede i de betændte monolag og efterligner barrieredysfunktionen observeret under IBD-patogenese.

Figur 1: Indledende isolering af murinkrypter til etablering af langvarig kolonikultur. (A) På dag 0 blev 300-500 krypter belagt i kældermembranmatrix (billede opnået 5 timer efter plettering), og væksten af colonoiderne blev fanget på (B) dag 1, (C) dag 3 og (D) dag 5. På dag 5 var kolonierne klar til at blive passeret. Forstørrelse = 10x; skalabjælke = 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Etablering af terminalt differentierede koloider fra traditionel kolonikultur. Differentieringsmedium blev anbragt på colonoiderne 48 timer efter passage af murine colonoids. Efter (A) 24 timer og (B) 48 timer bliver colonoiderne beriget med terminalt differentierede celler. Forstørrelse = 10x; skalabjælke = 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: PGC1α og TFAM-proteinekspression i murindifferentierede kolonoider behandlet med inflammatoriske mediatorer. Medium suppleret med inflammatoriske mediatorer blev anbragt på de differentierede colonoider, og protein blev opsamlet 0 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer efter eksponering. (A) Proteinekspressionen af PGC1α viste et samlet signifikant fald (p = 0,0442) over 72 timer. TFAM blev signifikant nedreguleret (p = 0,004) efter eksponering for inflammatoriske mediatorer ved 72 timer, og (B) der var en nedadgående tendens i proteinekspression ved 24 timer, 48 timer og 72 timer, når de blev analyseret af ANOVA. Data præsenteret som gennemsnitlig ± standardafvigelse. *p < 0,05, **p < 0,005. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Etablering og vækst af monolag fra allerede eksisterende kolonier. Colonoider, der var blevet enzymatisk og mekanisk forstyrret, blev belagt på cellekulturindsatser belagt med en kældermembranmatrix. Ved første plettering optrådte de fragmenterede koloider i (A) cellulære klynger, og ved (B) dag 3 var de begyndt at flade ud og langsomt dække cellekulturindsatsen. (C) På dag 5 og (D) dag 7 fortsatte monolagene med at vokse og dannede en kontinuerlig barriere, der kunne måles kvantitativt ved TEER. Forstørrelse = 10x; skalabjælke = 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: TEER-værdier til bestemmelse af monolag afledt af colonoid og betændte monolag. (A) TEER-værdierne blev målt ved hjælp af et voltohmmeter fra dag 3 til dag 5. Monolagene havde højere værdier tidligere med et bredt interval, men konvergerede langsomt på et lavere tal på dag 5. Når monolagene når en stabil tilstand, kan de bruges til nedstrøms eksperimentering. (B) TEER-værdierne var lavere i de betændte monolag (n = 2) sammenlignet med de ikke-betændte kontroller (n = 2). Kontrolmonolagene havde en gennemsnitlig TEER på 129,16 ohm·cm 2, og TEER for de betændte monolag var signifikant lavere (p = 0,0087) med et gennemsnit på 98,54 Ω·cm², når de blev analyseret ved hjælp af en t-test. **p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Tabel over opløsningssammensætning. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: PGC1α-proteinekspression i murine colonoider dyrket i traditionelt colonoidmedium isoleret fra WT-kontroller og 2% DSS-behandlede mus. Colonoiderne blev afledt af både 8 uger gamle WT-kontrolmus og 2% DSS-behandlede mus efter 7 dage. Protein blev isoleret fra colonoider passeret to gange og på dag 4 efter plettering. Der var ingen forskel i PGC1α-proteinekspression (p = 0,9996) i kolonoiderne afledt af kontrolmusene sammenlignet med musene udsat for 2% DSS i 7 dage, når de blev analyseret ved en uparret t-test. Data præsenteret som gennemsnitlig ± standardafvigelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Reduceret Lgr5 og Ki67 mRNA-ekspression i differentierede kolonoider. Murinkolostoider passerede 48 timer tidligere blev udsat for differentieringsmedium i 48 timer, før RNA- og cDNA-syntesen blev isoleret. MRNA-niveauerne blev bestemt via qPCR og analyseret ved den komparative CT-metode. (A) Lgr5 og (B) Ki67 blev signifikant reduceret i de differentierede kolonoider, når de blev statistisk analyseret ved hjælp af en t-test (p = 0,0023, p = 0,0007). Data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse.**p < 0,005. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Forhøjede mucinudskillende bægerceller i differentierede murine colonoider. Murinkolonoider passeret 48 timer tidligere blev udsat for differentieringsmedium i 48 timer. Cellerne blev lyseret i RIPA buffer, og protein blev visualiseret ved western blot analyse. (A) MUC2-ekspression blev øget i hvert sæt differentierede koloider sammenlignet med de udifferentierede kolonoder. (B) En næsten dobbelt ændring i MUC2-protein blev observeret under de differentierende betingelser, hvilket var signifikant, når det blev analyseret ved hjælp af en t-test (p = 0,0433). Data præsenteret som gennemsnitlig ± standardafvigelse. *p < 0,05. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Reduceret ekspression af stilk- og differentieringsmarkører samt stramme forbindelsesmarkører i monolag behandlet med inflammatoriske mediatorer. Murine colonoid-afledte monolag (dag 5) blev udsat for inflammatoriske mediatorer i 48 timer, RNA blev efterfølgende opsamlet, og cDNA blev syntetiseret (n = 2). MRNA-niveauerne af stamme-, differentierings- og forbindelsesmarkører blev bestemt via qPCR og analyseret ved den komparative CT-metode. (A) Stamcellemarkøren, Lgr5, blev ikke påvist i nogen af tilstandene, men mTERT blev væsentligt reduceret ved inflammatoriske tilstande. Bægercellemarkøren, Muc2, og colonocytmarkøren, Alpi, blev begge reduceret i de betændte monolag sammenlignet med de ubehandlede monolag. (B) De tætte forbindelsesmarkører, Zo-1, Occludin og Claudin, var alle lavere i inflammatoriske behandlede monolag sammenlignet med kontrollen. Data præsenteret som gennemsnitlig ± standardafvigelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Liste over primere. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Organoid udvikling har revolutioneret den måde, det videnskabelige samfund studerer organsystemer in vitro med evnen til delvist at rekapitulere cellulær struktur og funktion fra et dyr eller menneske i en skål. Desuden tilbyder organoidsystemer afledt af mennesker med sygdomme et lovende værktøj til personlig medicin, der kan styre terapeutisk beslutningstagning. Her beskriver vi en kryptisoleringsprotokol, der fungerer godt og introducerer vigtige trin, der gør det muligt at rydde op i overskydende snavs i isoleringen inden plettering. Derudover forklarer vi en nøgledetalje, der ofte overses i processen - evnen til nøjagtigt at tælle krypterne til plettering. Når koloiderne er etableret, skitserer vi nøglemanipulationer, der muliggør deres cellulære differentiering eller enkeltlagsdannelse, hvilket kan forbedre evnen til at studere ændringer i tarmepitelet under IBD.

Krypt-villus-aksen i tyktarmepitelet hos pattedyr er en kompleks struktur sammensat af forskellige celletyper med forskellige funktioner. Vedligeholdelsen af denne akse afhænger af både indre og ydre cellulære faktorer, som tilsammen hjælper med at opretholde epitelhomeostase¹⁸. Vi har bemærket, at murinkolonoider dyrket i traditionelt medium primært afspejler stamceller i modsætning til konglomereringen af både stamceller og terminalt differentierede celler, der ses in vivo. Desuden er murinkolonoisoder dyrket og vedligeholdt på denne måde cirkulære strukturer i modsætning til flade monolag. Disse forskelle har potentielle konsekvenser for vores forsøg på at studere tarmsygdomme in vitro. Specifikt er vi begrænsede i vores evne til at bruge organoider til at studere ændringer i barrierefunktion samt virkningerne af inflammation på terminalt differentierede intestinale epitelceller.

Her beskriver vi protokoller for ikke kun isolering af murinkrypter for at dyrke kolonier, men også for manipulation af disse kolonier for at studere intestinal epitelfysiologi og epitelresponset på betændelse. Blandt flere ydre faktorer, der fremmer gradienten af pluripotente stamceller og terminalt differentierede celler, er Wnt's kanoniske vej, som er rig på krypter og fremmer stamcellesundhed. Wnt-signalering mindskes ved spidsen af kryptaksen, sammenfaldende med udviklingen af stamceller til terminalt differentierede celler²⁶. Vi har beskrevet en protokol, der muliggør terminal differentiering af colonoidceller. Som andre differentierer vi ved at fjerne Wnt fra vækstmediet, men vi bruger en lavere koncentration af R-spondin (500 ng/ml versus 1 μg/ml R-spondin)¹⁷. Overraskende nok påvirker en 50% reduktion i R-spondin ikke den vellykkede differentiering af organoiderne. Evnen til at differentiere med en lavere koncentration hjælper med at etablere et mindre kunstigt system, der måske mere ligner det fysiologiske miljø in vivo. Selvom denne protokol resulterer i endelig terminal differentiering (supplerende figur 2 og supplerende figur 3) og manglende evne til at opretholde cellulær udødelighed, er det ikke desto mindre en nyttig metode til bedre forståelse af det fysiologiske bidrag fra det terminalt differentierede epitel, herunder colonocytter, enteroendokrine celler og bægerceller, til IBD og andre sygdomstilstande. Desuden viser vi, at supplering af specifikke cytokiner i dette medium, som traditionelt er forhøjet hos patienter med IBD, leder det differentierede organoidsystem mod en inflammatorisk tilstand. I løbet af 72 timer afspejler differentierede kolosider behandlet med inflammatoriske cytokiner bedre nogle af de metaboliske fund, der er vist i andre etablerede modeller for colitis og human IBD (figur 3). Desuden er differentierede koloider behandlet på denne måde sandsynligvis mere reflekterende for virkningerne af inflammation på cellulær homeostase på det differentierede epitel. Vi har også skitseret en protokol til udvikling af monolag, som muliggør dannelsen af både en apikal og basal side af epitelet, hvilket muliggør en analyse af barrierefunktionen in vivo. Dette system er nyttigt til at studere mekanismer for barrieredysfunktion uden behov for differentiering og dyrke nye terapeutiske mål for behandling.

Flere begrænsninger og potentielle faldgruber vedrørende protokollerne beskrevet ovenfor skal bemærkes. Den vellykkede isolering af krypter og udviklingen af kolonier kan begrænses af kryptudbyttet fra hvert dyr, nøjagtigheden af at tælle krypterne og renheden af forberedelsen. Hastigheden af at tælle de isolerede krypter efter resuspension, variationer i krypternes mekaniske dissociation fra de underliggende muscularis, og antallet af vaske og centrifugale spins bidrager til vellykket colonoid kultur. Desuden er det afgørende ikke fuldt ud at adskille organoiderne i enkeltceller under passaging eller plating for 2D monolagskultur. Klynger på 30 til 50 celler er ideelle til at lade kulturen formere sig til langvarig kultur. Ovenstående protokoller noterer områder med potentielle faldgruber og valgfrie yderligere trin til fejlfinding af disse problemer. I sidste ende kan protokollen kræve optimering af den person, der udfører isoleringen på grund af iboende variation i færdighedssæt og manøvrer (dvs. rystelse) samt variation i hvert dyr. Yderligere optimering kan være påkrævet af slutbrugeren for at fange den genetiske og molekylære mangfoldighed, der findes i IBD.

I sidste ende, mens kolonisystemet er et yderst nyttigt værktøj til at rekapitulere centrale aspekter af menneskelig fysiologi og sygdom in vivo, er dette system i sidste ende begrænset i sin evne til at studere alle aspekter af menneskelig sygdom. Traditionelle metoder til colonoid udvikling har belyst centrale aspekter af stamcelledynamik; Imidlertid afspejler disse fund ofte ikke tilstrækkeligt resultaterne i terminalt differentierede celler i værtsepitelet. De strategier, der er skitseret i denne undersøgelse, giver efterforskere en relativt hurtig, billig model for organoid manipulation, der, når den anvendes korrekt, kan kaste lys over centrale aspekter af tarmepitelstruktur og funktion under inflammation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)