Studera epiteleffekterna av tarminflammation in vitro på etablerade murina kolonioider

Summary

Vi beskriver ett protokoll som beskriver isoleringen av murina kolonkrypter för utveckling av 3-dimensionella kolonoider. De etablerade kolonoiderna kan sedan differentieras terminalt för att återspegla värdepitelets cellulära sammansättning innan de får en inflammatorisk utmaning eller riktas för att etablera ett epitelialt monolager.

Abstract

Tarmepitelet spelar en viktig roll för människors hälsa, vilket ger en barriär mellan värden och den yttre miljön. Detta mycket dynamiska cellskikt ger den första försvarslinjen mellan mikrobiella och immunpopulationer och hjälper till att modulera tarmens immunsvar. Störning av epitelbarriären är ett kännetecken för inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och är av intresse för terapeutisk inriktning. Det 3-dimensionella kolonoidodlingssystemet är en extremt användbar in vitro-modell för att studera tarmstamcellsdynamik och epitelcellsfysiologi vid IBD-patogenes. Helst skulle etablering av kolonoider från inflammerad epitelvävnad hos djur vara mest fördelaktigt vid bedömning av genetiska och molekylära influenser på sjukdom. Vi har emellertid visat att epitelförändringar in vivo inte nödvändigtvis behålls i kolonoider etablerade från möss med akut inflammation. För att ta itu med denna begränsning har vi utvecklat ett protokoll för att behandla kolonoider med en cocktail av inflammatoriska mediatorer som vanligtvis är förhöjda under IBD. Även om detta system kan tillämpas allestädes närvarande på olika odlingsförhållanden, betonar detta protokoll behandling på både differentierade kolonoider och 2-dimensionella monolager härledda från etablerade kolonoider. I en traditionell odlingsmiljö berikas kolonoider med tarmstamceller, vilket ger en idealisk miljö för att studera stamcellsnischen. Detta system tillåter emellertid inte en analys av funktionerna i tarmfysiologin, såsom barriärfunktion. Vidare erbjuder traditionella kolonoider inte möjlighet att studera det cellulära svaret hos terminalt differentierade epitelceller till proinflammatoriska stimuli. De metoder som presenteras här ger en alternativ experimentell ram för att hantera dessa begränsningar. Det 2-dimensionella monolagerkultursystemet erbjuder också en möjlighet till terapeutisk läkemedelsscreening ex vivo. Detta polariserade skikt av celler kan behandlas med inflammatoriska mediatorer på cellens basala sida och samtidigt med förmodade terapeutiska medel apikalt för att bestämma deras användbarhet vid IBD-behandling.

Introduction

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) är en kronisk, remitterande och återfallande sjukdom som kännetecknas av episoder av inflammation och klinisk lugn. Etiologin för IBD är multifaktoriell, men viktiga karakteristiska egenskaper hos sjukdomen inkluderar defekt barriärfunktion och ökad permeabilitet i tarmepitelet, förutom proinflammatoriska signalkaskader aktiverade i epitelfacket ^1,2. Flera in vitro- och in vivo-modeller har använts för att rekapitulera epitelsvaret under IBD, inklusive cellodling och murina modeller av inflammation³. Alla dessa system har dock viktiga brister som begränsar deras förmåga att rekapitulera epitelförändringarna under IBD⁴. De flesta cellinjer som används för att studera IBD transformeras, har förmågan att bilda ett monolager och kan differentiera³ men i sig sprida sig annorlunda än icke-transformerade tarmepitelceller i värden. Flera olika murina modeller av inflammation används för att studera IBD, varav några inkluderar knockoutmodeller, infektiösa modeller, kemiska inflammatoriska modeller och T-cellöverföringsmodeller 5,6,7,8. Medan var och en kan studera vissa etiologiska aspekter av IBD, såsom genetiska predispositioner, barriärdysfunktion, immunavreglering och mikrobiomet, är de begränsade i sin förmåga att studera sjukdomens multifaktoriella natur.

Intestinala organoider, inklusive enteroider och kolonoider, har etablerats under det senaste decenniet som en användbar in vitro-modell för att studera inte bara dynamiken hos tarmstamceller utan också deras roll, barriärens integritet och funktion av tarmepitelet spelar i tarmhomeostas och sjukdom. Dessa enheter har väsentligt bidragit till vår förståelse av patogenesen av IBD⁹ och har öppnat nya möjligheter för personlig medicin. Colonoids, eller stamcellshärledda, självorganiserande vävnadskulturer från tjocktarmen, har utvecklats från både murin och mänsklig vävnad i en process som tillåter stamceller som finns i tarmkrypter att sprida sig och bibehållas på obestämd tid¹⁰. Stamcellsnischen in vivo förlitar sig på extracellulära faktorer för att stödja dess tillväxt, särskilt den kanoniska Wnt-signaleringen och benmorfogena proteinsignalvägar¹¹. Tillägget av dessa faktorer främjar hälsan och livslängden hos colonoids men driver också kulturen mot ett stamcellsliknande tillstånd som inte återspeglar in vivo-epitelcellulär arkitektur, som består av både självförnyande och terminalt differentierade celler^12,13. Medan funktionaliteten hos tarmepitelet är beroende av den kontinuerliga överhörningen mellan stamcellsfacket och differentierade celler, är förmågan att ha båda i ett kolonoidodlingssystem ganska begränsad. Trots dessa begränsningar förblir organoidodlingssystemet guldstandarden för att studera epitelets inneboende egenskaper ex vivo. Ändå kan alternativa kulturstrategier behöva övervägas för att svara på den vetenskapliga frågan.

Det har visats att möss på en kontinuerlig 7-dagars regim av dextrannatriumsulfat (DSS) utvecklar både epitelinflammation och barriärdysfunktion¹⁴. Vidare har mitokondriell biogenessvikt och metabolisk omprogrammering inom tarmepitelet, som har visat sig vara uppenbara vid human IBD, också fångats i denna DSS-modell av kolit¹⁵. Våra preliminära data visar dock att egenskaperna hos mitokondriell biogenesfel inte bibehålls i kolonoider härledda från krypterna hos DSS-behandlade djur (kompletterande figur 1). Således måste alternativa odlingsmetoder användas när man undersöker hur inflammation driver epitelförändringar under murin tarminflammation. Här beskriver vi ett protokoll som vi har utvecklat som beskriver 1) hur man isolerar krypter från hel kolonvävnad för etablering av murina colonoider, 2) hur man terminalt differentierar denna cellpopulation för att återspegla cellpopulationen som den står in vivo, och 3) hur man inducerar inflammation i denna in vitro-modell . För att studera läkemedelsinteraktioner inom det inflammerade epitelet har vi utvecklat ett protokoll för att etablera 2-dimensonala (2D) monolager från murina kolonoider som i grunden kan behandlas med inflammatoriska mediatorer och behandlas apikalt med läkemedelsterapier.

Protocol

Alla experiment med murina vävnader som beskrivs här godkändes av Institutional Review Board vid University of Pittsburgh och genomfördes i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Animal Research and Care Committee vid University of Pittsburgh och UPMC.

1. Förberedelse för kultur

OBS: Alla reagenser listas i avsnittet Materialförteckning och alla lösningskompositioner finns i lösningssammansättningstabellen (tabell 1).

1. Förbered mustvättmedel enligt beskrivningen i tabell 1. Förvaras vid 4°C i upp till 2 månader.
2. Förbered kryptisoleringsbuffert 1 (CIB1) enligt beskrivningen i tabell 1. Förvaras vid 4°C i upp till 2 månader.
   VARNING: Ditiotreitol (DTT) anses vara farligt enligt OSHA Hazard Communication Standard på grund av den potentiella akuta toxiciteten vid förtäring och hud- och ögonskador om dessa områden utsätts för det. Skyddshandskar, ögonskydd och ansiktsskydd bör användas vid hantering av denna kemikalie.
3. Förbered kryptisoleringsbuffert 2 (CIB2) enligt beskrivningen i tabell 1. Förvaras vid 4°C i upp till 2 månader.
4. Förbered L-WRN-konditionerat medium enligt ett tidigare publicerat protokoll¹⁶.
5. Bered fullständigt kolonoidmedium enligt beskrivningen i tabell 1. Komplett kolonoidtillväxtmedium kan lagras i upp till 5 dagar vid 4 ° C utan förlust av aktivitet.
6. Bered differentieringsmediet enligt beskrivningen i tabell 1. Detta protokoll modifierades från en tidigare publicerad artikel¹⁷. Differentieringsmediet kan lagras i upp till 5 dagar vid 4 °C utan förlust av aktivitet.
7. Bered inflammationsmediatormediet enligt beskrivningen i tabell 1. Detta protokoll modifierades från en tidigare publicerad artikel¹⁸. Inflammationsmediatormediet kan lagras i upp till 5 dagar vid 4 ° C utan förlust av aktivitet.
8. Förbered det murina monolagermediet. Utelämna Y-27632 när du utmanar monolagren med inflammatoriska faktorer och/eller läkemedel. Det murina monolagermediet kan förvaras i upp till 5 dagar vid 4 ° C utan förlust av aktivitet.
9. Förbered inflammationsmediatorn monolagermedium. Inflammationsmediatorn monolayer medium kan lagras i upp till 5 dagar vid 4 ° C utan förlust av aktivitet.

2. Kryptisolering från murin kolonvävnad

OBS: Överför vävnaden på is. Ta ut lämplig mängd basalmembranmatris från -20 ° C och tina på is. Varje 24-brunn pläteras med 15 μL basalmembranmatris. Bered CIB1, CIB2 och komplett kolonoidtillväxtmedium enligt beskrivningen i avsnitt 1.

1. Avliva en C57BL / 6J-mus (6-8 veckor gammal) enligt det institutionella djurvårds- och användningskommitténs godkända protokoll och extrahera den distala änden (cirka 5-7 cm) av tjocktarmen med ren pincett och sax.
   OBS: I denna studie avlivades försökspersonerna med hjälp av koldioxidkammarinkubation i 2-3 minuter följt av cervikal dislokation.
   1. För detta, placera musen på ryggen, gör ett horisontellt snitt strax under bröstkorgen och sedan ett vertikalt snitt från mitten av det horisontella snittet mot svansens botten för att exponera bukhålan.
   2. Med pincett, flytta tunntarmen ur fältet, identifiera tjocktarmen och följ den ner till svansens botten. Bryt bäckenet med sax för att helt exponera distala tjocktarmen om det behövs. Använd saxen för att klippa de mest distala 5-7 cm av tjocktarmen.
2. Placera kolonvävnaden på en ren yta. Ta bort överflödigt serosasalt fett som omger tjocktarmen. Ta bort avföringen genom att spola luminalinnehållet i tjocktarmen med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med en spruta fäst vid en 18 G 1 1/2 nål. Placera sedan tjocktarmen i ett 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml iskall DPBS och placera den på is.
   OBS: Om du isolerar tjocktarmen från mer än ett djur, placera vävnaden på is innan du fortsätter till nästa djur.
3. Överför kolonvävnaden till en petriskål med 10 ml iskall DPBS och bevattna lumen två gånger med DPBS med en P1,000-pipett.
4. Öppna tjocktarmen i längdriktningen med sax och skaka försiktigt med pincett i ~ 30 s i DPBS för att ta bort eventuellt återstående fekalt innehåll.
5. Överför vävnaden till en ny petriskål med 10 ml iskall DPBS och skaka igen försiktigt med pincett innan du skär tjocktarmen i 2 cm bitar med sax och placerar dem i ett 50 ml koniskt rör med 7 ml iskall CIB1. Inkubera vävnaden i CIB1 på is i 20 minuter.
   OBS: De återstående stegen utförs inuti ett biologiskt säkerhetsskåp.
6. Överför vävnaden med pincett till ett förvärmt 50 ml koniskt rör innehållande 7 ml CIB2 och inkubera i ett vattenbad vid 37 °C i 5 minuter.
7. Ta bort CIB2 från det 50 ml koniska röret genom att låta vävnaden sätta sig i botten av det koniska röret och sedan pipettera av CIB2. Tillsätt sedan 10 ml iskallt mustvättmedium till samma koniska rör.
8. Skaffa ett nytt 50 ml koniskt rör och placera ett 70 μm filter ovanpå det öppna röret.
9. Medan du håller röret med tjocktarmsinnehållet, vrid handen ungefär 45 °. Skaka röret på ett gungande och kraftfullt sätt i 45 sekunder för att frigöra krypterna. Häll sedan kryptsuspensionen genom 70 μm cellsilen i ett nytt 50 ml koniskt rör.
10. Använd pincett, placera kolonvävnaden tillbaka i det tomma 50 ml koniska röret och tillsätt 10 ml iskallt mustvättmedium. Skaffa en ny 70 μm cellsil och placera den ovanpå det 50 ml koniska röret som innehåller den tidigare filtrerade lösningen.
11. Återigen, plocka upp 50 ml röret som innehåller kryptfragmenten och skaka det på samma sätt som i steg 2.9. Filtrera mediet genom 70 μm cellsilen i det 50 ml koniska röret för att kombinera med de tidigare filtrerade krypterna.
    OBS: Om kryptutbytet är lågt, skaka kolonvävnaden ytterligare en gång genom att placera vävnaden i ett tomt 50 ml koniskt rör med 10 ml mustvättmedium. Skaka vävnaden i 45-50 s för att frigöra krypterna. Om kryptutbytet är lågt, öka sedan skakningens kraft. Slutligen, om det totala kryptutbytet är lågt, kan både pipetter och rör beläggas med fetalt bovint serum (FBS) för att förhindra att vävnaden fäster vid plasten.
12. Centrifugera det 50 ml koniska röret som innehåller de filtrerade krypterna vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
    OBS: En pellet bör observeras i botten av det 50 ml koniska röret.
13. Dekantera mediet genom pipettering, suspendera kryptorna igen genom pipettering upp och ner med 10 ml iskallt mustvättmedium och överför till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
14. För att få ett renare preparat, tvätta krypterna med ytterligare 10 ml mustvättmedium. Dekantera föregående medium och återsuspendera kryptorna genom pipettering upp och ner i 10 ml mustvättmedium. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C med ett 15 ml koniskt rör.
    OBS: Försiktighet bör iakttas vid pipettering av mediet eftersom pelleten ibland inte centrifugeras tätt. Om pelleten inte är tät, pipettera bort det mesta av mediet och lämna 500 μL till 1 ml. Återsuspendera sedan pelleten genom pipettering i 10 ml mustvättmedium och överför lösningen till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugering i ett mindre koniskt rör kan förbättra pelletsens täthet.
15. Dekantera mediet och återsuspendera kryptorna genom att pipettera upp och ner med 10 ml iskallt mustvättmedium. När de har återsuspenderats, räkna krypterna under ett ljusfältmikroskop genom att omedelbart pipettera 10 μL av mediet på en glasskiva.
    1. Placera två 10 μL droppar på separata ändar av bilden och räkna antalet krypter i varje droppe. Medelvärdet av siffrorna mellan de två dropparna för att bestämma antalet krypter per 10 μL. Multiplicera detta nummer med 100 för att få antalet krypter i 1 ml.
       OBS: För noggrann räkning måste 10 μL av kryptsuspensionen omedelbart avlägsnas efter resuspension. Om inte, kommer krypterna att falla till botten av röret, vilket kommer att resultera i ett felaktigt antal.
16. Med ett mål att plätera 300-500 krypter per brunn, överför lämplig volym krypter som återsuspenderas i mustvättmediet till ett nytt 15 ml koniskt rör och bringa till 10 ml med iskallt mustvättmedium. Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min vid 4 °C. En liten pellets ska vara synlig längst ner på röret.
17. Ta bort supernatanten med en strömpipett. Använd en P200-pipett för att försiktigt ta bort eventuellt kvarvarande medium och lämna endast pelleten.
18. Återsuspendera pelleten i lämplig mängd iskall basalmembranmatris genom att långsamt pipettera upp och ner. Var försiktig så att du inte introducerar bubblor när du återsuspenderar kryptpelleten. Platta 300-500 krypter/15 μL basalmembranmatris i varje brunn på en platta. Efter plätering, vänd vävnadsodlingsplattan och placera den i en 37 ° C inkubator i 10-20 minuter.
19. Återställ plattan och tillsätt 500 μL av hela muskolonoidmediet till varje brunn. Byt medium varannan dag tills de är redo för passaging. Passera colonoids var 3-5 dagar.

3. Passerar kolonioiderna

OBS: Varje brunn kan i allmänhet passeras 1:4 till 1:6 beroende på densiteten hos den ursprungliga brunnen. Ta ut lämplig mängd basalmembranmatris från -20 ° C och placera den på is för att tina. Colonoids kan användas för experiment efter två passager. Vid passage av colonoids utförs stegen i ett biologiskt säkerhetsskåp för att förhindra kontaminering.

1. Ta bort mediet från brunnarna som ska passeras.
   1. Om det finns skräp i basalmembranmatrisen, vilket kan hända under den första isoleringen, kan följande protokoll användas för att städa upp skräpet:
      1. Tillsätt 1 ml iskall 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i DPBS utan Ca 2+ eller Mg²⁺ till varje brunn. Låt den sitta i 5 min i det biologiska säkerhetsskåpet.
      2. Pipettera upp och ner tre till sju gånger med en P1000-pipett för att störa basalmembranmatrisen och samla innehållet i brunnarna i ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera kolonoiderna i totalt 5-10 ml 0,1% BSA i DPBS utan Ca 2+ eller Mg²⁺. Fyll till lämplig volym med 0,1 % BSA.
      3. Centrifugera vid 150 x g i 5 min vid 4 °C för att pellet kolonioiderna men inte skräpet.
      4. Dekantera DPBS genom pipettering och lämna pelleten. Tillsätt 1 ml enzymatiskt dissociationsreagens vid rumstemperatur (RT) och pipettera tre till fem gånger.
      5. Placera det 15 ml koniska röret med det enzymatiska dissociationsreagenset och störda kolonioider i ett 37 ° C vattenbad i 3-4 minuter.
      6. Ta bort röret från vattenbadet, pipettera 3-5 gånger och sätt sedan till 10 ml med mustvättmedium. Gå vidare till steg 3.6.
2. Placera 500 μL RT-enzymatiskt dissociationsreagens i varje brunn och låt det sitta i cirka 1 minut innan pipettering upp och ner tre till sju gånger för att störa basalmembranmatrisen.
3. Placera plattan i en 37°C inkubator i 3-4 min.
4. Ta bort plattan från inkubatorn och pipettera upp och ner tre till sju gånger med en P1000-pipett för att dissociera kolonoiderna.
5. Överför innehållet till ett 15 ml koniskt rör och fyll på upp till 10 ml med iskallt mustvättmedel.
6. Centrifugera provet vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
7. Ta bort mediet med en kraftpipett och en P200-pipett efter behov så att endast en pellets finns kvar i det koniska röret.
8. Återsuspendera i en lämplig mängd iskall basalmembranmatris genom att försiktigt pipettera upp och ner beroende på hur många brunnar som ska pläteras. Introducera inte bubblor vid pipettering. Placera kolonoidfragmenten i 15 μL basalmembranmatrisdroppar per brunn.
9. Platta kryptorna, vänd vävnadsodlingsplattan och placera sedan plattan i en 37 ° C inkubator i 10-20 minuter.
10. Slutligen återställ plattan och tillsätt 500 μL komplett muskolonoidmedium till varje brunn. Byt medium varannan dag tills de har blivit tillräckligt stora för att passera igen om cirka 3-5 dagar.

4. Terminalt differentiering av kolonoidcellerna

1. För kolonoiderna enligt ovan och tillsätt 500 μL av hela muskolonoidmediet till varje brunn.
2. Minst 48 timmar efter passning, avlägsna hela muskolonoidmediet och tillsätt 500 μL av differentieringsmediet till varje brunn (se avsnitt 1).
3. Inkubera kolonoiderna med differentieringsmedia i 48 timmar, varefter de kan användas i experiment, inklusive insamling av RNA och protein.
   OBS: Colonoids kan bedömas för differentiering genom att samla RNA och bedöma uttrycket av Lgr5 och Ki67, en stamcellsmarkör respektive cellproliferationsmarkör, via kvantitativ omvänd transkriptas-polymeraskedjereaktion (qPCR). Terminalt differentierade celler bör ha ett relativt lågt uttryck av Lgr5 och Ki67 jämfört med kolonoider odlade i traditionellt kolonoidmedium, där cellerna är mer stamliknande. Den tid som kolonioiderna behöver inkubera i differentieringsmediet kan behöva optimeras för varje enskilt laboratorium. Se kompletterande tabell 1 för en förteckning över primers.

5. Inducera inflammation i differentierade kolonoider med inflammatoriska mediatorer

1. Efter att kolonoiderna har inkuberats i 2-3 dagar med differentieringsmediet, avlägsna det befintliga mediet och tillsätt 500 μL av inflammationsmediatormediet till varje brunn.
2. Låt brunnarna inkubera i 24-72 timmar innan RNA och protein samlas in (eller andra nedströmsparametrar). Byt medium varje dag.

6. Intestinala epiteliala monolager härrörande från etablerade murina kolonoider

OBS: Murina intestinala epiteliala monolager härrör från murina kolonoider som har passerat minst två gånger. För att möjliggöra framgångsrik monolagerbildning på 3-5 dagar är det absolut nödvändigt att inte separera kolonoiderna i enskilda celler. Fragmenterade organoider som enzymatiskt har dissocierats i cellulära kluster är idealiska för tillväxt.

1. Förbered alla reagens innan experimentet påbörjas. Tina basalmembranmatrisen på is. Bered det murina monolagermediet enligt beskrivningen i avsnitt 1. Späd det tinade källarmembranet 1:20 med det kalla murina monolagermediet. Håll på is.
2. Använd sterila pincett för att placera en 0,4 μm transparent cellodlingsinsats i en enda brunn på en 24-brunns vävnadsodlingsplatta (materialtabell). Ta tag i en hörnstift på insatsen och överför den till brunnen. Upprepa tills lämpligt antal cellodlingsinsatser finns tillgängliga för odling.
   OBS: Se till att belägga en extra kontrollbrunn endast med basalmembranmatrisen. Denna cellodlingsinsats kommer att användas för att mäta bakgrundsmotståndet hos cellodlingsinsatsen utan celler närvarande, enligt beskrivningen i nästa steg (steg 6.3).
3. Använd en P200-pipett och täck den apikala (övre) ytan på varje cellodlingsinsats med 150 μL utspädd basalmembranmatris. Placera pipetspetsen i mitten av insatsen utan att vidröra skärets membran och driv försiktigt ut lösningen. Placera plattan i en steril 37°C inkubator med 5%_CO2 i minst 1 timme.
4. Ta försiktigt bort basalmembranmatrisen före användning och låt cellodlingsinsatserna torka i ett biologiskt säkerhetsskåp i minst 10 minuter.
   1. För att avlägsna basalmembranmatrisen, vrid plattan med 24 brunnar i 45° vinkel. Placera ett finger på stiftets hörn för att stabilisera skäret och placera försiktigt pipetspetsen längs skärets undersida med en P200-pipett och ta bort matrisen.
   2. Ta bort överflödiga rester genom att tvätta varje cellodlingsinsats med 150 μl steril DPBS utan Ca 2+ eller Mg²⁺.
5. Efter 10 minuters torkning tillsätts 400 μL av det murina monolagermediet till botten av cellodlingsinsatsen och 75 μL ovanpå. Upprepa tills alla cellodlingsinsatser är nedsänkta. Lämna plattan i det biologiska säkerhetsskåpet eller lägg tillbaka den i inkubatorn tills den behövs.
6. Ta bort 24-brunnsplattan av mogna (organoider på dag 3-5 av tillväxt) tarmkolonoider från 37 ° C, 5% CO_2-inkubatorn och placera den under det biologiska säkerhetsskåpet. Ta bort mediet med sterila spetsar och tvätta varje brunn med 1 ml RT steril DPBS (utan Ca 2+ eller Mg²⁺).
   OBS: En individuell brunn med 75-125 mogna kolonioider delas i förhållandet 1: 4.
7. Ta bort DPBS utan Ca 2+ eller Mg²⁺ med sterila spetsar och smält varje plugg i basalmembranmatrisen genom att placera 500 μL RT enzymatiskt dissociationsreagens i varje brunn som ska passeras.
8. Pipettera varje brunn upp och ner cirka 6-10 gånger för att bryta upp pluggen. Repa inte plattans botten för att ta bort kontakten. Vrid istället plattan med 24 brunnar i 45 ° vinkel, placera pipettens spets vid pluggens kant och lossa den försiktigt.
9. Lägg tillbaka plattan med 24 brunnar i en steril 37 ° C, 5% CO₂ inkubator i 3-4 minuter.
10. Ta bort plattan och pipettera det enzymatiska dissociationsreagenset upp och ner fem till sju gånger för varje brunn under ett biologiskt säkerhetsskåp. Överför de disassocierade colonoiderna från varje brunn till ett sterilt 15 ml koniskt rör. Ta upp till en volym på 10 ml med iskallt mustvättmedium.
11. Centrifugera de delvis rötade kolonioiderna vid 300 x g vid 4 °C i 5 minuter i en svängande hinkcentrifug.
12. Under det biologiska säkerhetsskåpet, ta bort supernatanten från pelleten med en 10 ml pipet. Ta bort eventuellt kvarvarande medium med en P200-pipett. Återsuspendera kolonoidpelleten i murint monolagermedium. Tillsätt 75 μl medium per cellodlingsinsats av fragmenterade kolonoider som ska pläteras.
13. Tillsätt 75 μL kolonoidsuspension till mitten av varje cellodlingsinsats. Innan kolonoidsuspensionen tillsätts i varje brunn, pipettera försiktigt upp och ner en eller två gånger innan du tar bort 75 μL, vilket möjliggör en mer enhetlig plätering.
14. Placera plattan med 24 brunnar med cellodlingsinsatser på en roterande plattform i 10 minuter för att ytterligare möjliggöra enhetlig spridning över cellodlingsinsatsen.
15. Placera plattan i en steril 37 ° C, 5% CO₂ inkubator.
16. Nästa dag (dag 1), lossa de obundna kolonoidfragmenten genom att pipettera mediet upp och ner tre till fem gånger med en P200-pipet. Placera försiktigt spetsen längs insidan av cellodlingsinsatsen för att inte störa de bifogade tarmcellerna. För inte in bubblor i mediet, eftersom detta förhindrar borttagning av alla obundna fragment.
17. Ta omedelbart bort mediet och kolonoidblandningen. Upprepa tills alla cellodlingsinsatser har rengjorts.
18. Tillsätt försiktigt 150 μL förvärmt murint monolagermedium till den apikala sidan av varje cellodlingsinsats. Tillsätt 400 μL uppvärmt murint monolagermedium till varje brunn på en ny 24-brunnsplatta. Överför cellodlingsinsatsen till den nya plattan genom att ta tag i stiftet med sterila pincett. Byt medium varannan dag tills sammanflödet.
    OBS: Kolonoidfragmenten ska bilda ett konfluent monolager 3-5 dagar efter plätering.

7. Mätning av nettomotståndet hos epitelmonolagren med hjälp av en voltohmmeter på dagarna 3 - 5 av enskiktskulturen

OBS: Ätstickelektroderna liknar pincett och är asymmetriska i längd. Sondens längre arm är den basolaterala elektroden, och den kortare armen är den apikala elektroden. Sonden kan vara svår att sätta in mellan cellodlingsinsatsens inre och yttre. Att placera sonden i en liten vinkel vid införandet, följt av vertikal rätning av sonden, förhindrar att sonden fastnar. Se till att läsa nettomotståndet för varje cellodlingsinsats i en liknande vinkel, eftersom detta kan påverka värdena.

1. Placera voltohmmetern och alla reagens i ett biologiskt säkerhetsskåp.
   1. Anslut voltohmmetern till närmaste vägguttag och anslut elektrodsondens plastmodulära kontakt till INPUT-uttaget på frontpanelens display.
   2. För att placera voltohmmetern i 45 ° vinkel, sväng metallarmen på baksidan av utrustningen ut tills den låses på plats.
   3. Slå nu på voltohmmetern genom att vrida strömbrytaren UPP på frontpanelens display. Slutligen, vänd omkopplaren upp mot OHMS för att visa avläsningen i detta mått.
2. Ta bort plattan med 24 brunnar från inkubatorn på 37 °C, 5 % CO₂ , och lägg plattan platt i det biologiska säkerhetsskåpet. Det transepiteliala elektriska motståndet (TEER) är temperaturkänsligt. Ta bara bort skylten omedelbart innan TEER läses.
3. Sterilisera elektrodsonden i förvärmd 70% etanol i 30 s till 1 min. Ta bort sonden, vänd och vrid den en till två gånger för att ta bort överflödig etanol. Låt sonden lufttorka i cirka 30 sekunder.
4. Tvätta eventuell kvarvarande etanol kvar på sonden med förvärmt mustvättmedel.
   VARNING: Låt inte någon av de återstående etanoldropparna högre upp på sonden falla in i cellodlingsinsatsen. När du tvättar bort etanolen med medium, låt inte mediet gå över det sterila etanolfältet. Detta kan orsaka att förorenat medium kommer in i cellodlingsinsatsen.
5. Håll sonden vinkelrätt mot cellodlingsinsatsen. Sätt in den basolaterala elektroden (sondens längre ände) på utsidan av cellodlingsinsatsen tills den vidrör basen på 24-brunnsplattan. Skjut den apikala elektroden (sondens kortare ände) in i cellodlingsinsatsen. Variera inte avståndet mellan de två elektroderna från brunn till brunn. Detta kommer att påverka TEER-mätningen.
6. Kontrollera att den apikala elektroden inte vidrör basen på cellodlingsinsatsen innan du läser TEER. Börja med cellodlingsinsatsen för bakgrundskontroll och registrera värdet. Värdet visas automatiskt digitalt på voltohmmeterns framsida.
7. Upprepa steg 7.5–7.6 för varje cellodlingsinsats.
   OBS: Om olika experimentella betingelser finns mellan cellodlingsinsatserna, sterilisera sonden mellan varje nytt tillstånd. Börja med steg 7.1 och fortsätt numeriskt genom stegen.
8. Placera plattan med 24 brunnar tillbaka i inkubatorn när alla TEER-mätningar har registrerats.
9. Nettovärdena vid 350 Ω eller högre indikerar enskiktsbildning. Upprepa igen de följande dagarna tills monolagerbildning har uppnåtts.
   OBS: I allmänhet kan värden på 1 000 Ω eller högre fångas på dag 3, men med tiden kommer de alla att konvergera på ett lägre tal runt 350 Ω.

8. Beräkning av TEER med hjälp av nettomotståndsmätningar från voltohmmetern

OBS: Framgångsrik monolagerbildning av kolonioiderna ger TEER-mätningar större än 115 Ω · cm².

1. Ta individuella nettomotståndsvärden och subtrahera nettomotståndet från bakgrundsbrunnen. Cellodlingsinsatserna belagda med basalmatrismembranet ger en nettoavläsning på cirka 100 Ω.
2. Ta de bakgrundssubtraherade nettomotståndsmätningarna och multiplicera dem med ytan på cellodlingsinsatsen. En cellodlingsinsats med 24 brunnar har en yta på 0,33 cm².
3. Om värdena är 115 Ω cm² eller mer, fortsätt till de experimentella nedströmstesterna.

9. Inducera inflammation i epitelmonolagren med inflammatoriska mediatorer

1. När framgångsrika monolager har bildats, tillsätt inflammatoriska mediatorer till kulturen på kulturens basala sida. Bered monolagermediet för inflammationsmediatorn enligt beskrivningen i steg 1.9 och tillsätt 400 μL till varje brunn i en ny platta med 24 brunnar.
2. Ta bort mediet från den apikala sidan av cellodlingsinsatsen och tillsätt 150 μL av det murina monolagermediet utan Y-27632. Komplettera inte denna sida med inflammatoriska mediatorer. Men om celldöden verkar överdriven, lämna Y-27632 i media. Detta måste bestämmas av slutanvändaren.
3. Överför cellodlingsinsatserna till en ny 24-brunnsplatta och placera dem i brunnarna kompletterade med inflammationsmediatorn monolagermedium.
4. Stimulera monolagren med inflammatoriska mediatorer i 24-72 h, beroende på experimentet.
5. För att testa läkemedelssvar med denna inflammatoriska modell, komplettera monolagermediet på den apikala sidan av cellodlingsinsatsen med det valda läkemedlet. Läkemedlet kan tillsättas när som helst i experimentet, beroende på läkemedlets verkningsmekanism och nedströmsparametrarna som ska bedömas.

Representative Results

3D-tarmkolonoidodlingssystemet är ett ovärderligt verktyg för att studera epitelets inneboende bidrag till tarmmukosal homeostas. Det beskrivna protokollet ger detaljerade instruktioner om hur man isolerar krypter från C57BL / 6J (WT) möss vid 8 veckors ålder och etablerar ett långsiktigt kolonoidodlingssystem som kan manipuleras för flera nedströms applikationer. Vid isolering och plätering av krypter i basalmembranmatrisen verkar krypterna täta och multicellulära i struktur när de visualiseras med ljusfältmikroskopi. De kan vara sfäriska i form eller långsträckta och cylindriska, som liknar den enda, kryptliknande strukturen som normalt observeras inom in vivo tarmarkitekturen (figur 1A). Vid dag 1 bildar majoriteten av krypterna en kompakt, sfärisk struktur, med några kolonoider som börjar utveckla en inre lumen (tomt utrymme) utan epitelceller (figur 1B). När de fortsätter att växa under de närmaste dagarna fortsätter kolonoidernas diametrar att öka och kolonoidernas lumen blir mer definierade (figur 1C). Vid dag 5 är varje kolonoid ungefär 100-250 μm i diameter och bildar en stor, framträdande lumen omgiven av ett tunt lager av epitelstamceller (figur 1D). Vid denna tidpunkt störs kolonoiderna både enzymatiskt och mekaniskt för passering. Efter två passager kan de användas för nedströms experiment.

För att bedöma om de metaboliska förändringarna som observerats i kolonskrapningarna hos DSS-behandlade möss behålls i kolonoider härrörande från möss på samma DSS-regim, behandlades 8 veckor gamla WT-möss med 2% DSS i dricksvatten ad libitum. Åldersmatchade och könsmatchade WT-kontrolldjur fick dricksvatten ad libitum utan DSS. Efter 7 dagar offrades mössen och krypter isolerades från kolon hos både kontrolldjur (n = 3, hane) och DSS-behandlade djur (n = 3, hane) för att etablera kolonioider. Efter två passager isolerades protein från varje uppsättning kolonoider, och uttrycket av peroxisomproliferatoraktivatorreceptor-gamma-koaktivator-1α (PGC1α), masterregulatorproteinet för mitokondriell biogenes, bedömdes via western blot-analys (kompletterande figur 1). Det fanns ingen signifikant skillnad i PGC1α-uttryck när man jämförde de kolonoider som etablerats från de DSS-behandlade mössen jämfört med de kolonoider som etablerats från kontrollmössen, vilket tyder på att denna kolonoidodlingsmetodik inte på lämpligt sätt återspeglar de metaboliska förändringar in vivo som observeras hos möss¹⁵.

Misslyckandet av PGC1α att initiera mitokondriell biogenes under en intestinal inflammatorisk förolämpning är primärt lokaliserad till det differentierade kolonepitelet^15,19. För att spegla de förändringar som observerats in vivo bestämde vi oss för att rikta kolonioiderna mot ett mer differentierat tillstånd. För att inducera detta skifte inkuberades kolonioiderna initialt med traditionellt kolonoidmedium. Efter 24 timmar till 48 timmar byttes kolonioiderna till differentieringsmedium i ytterligare 48 timmar. Under differentieringen övergick en liten andel kolonoider från en sfärisk arkitektur till knoppade strukturer berikade med bägarceller och kolonocyter¹⁷ (figur 2A, B). Kolonoiderna som odlades i WRN-kompletterat medium berikades med snabbt delande Lgr5⁺ stamceller. För att bekräfta att både Lgr5⁺ stamcellerna och andra prolifererande celler lämnade cellcykeln under differentiering analyserades mRNA-nivåerna via qPCR. Signifikant nedreglering i både Lgr5 (97%, p = 0,0023) och Ki67 (75%, p = 0,0007) nivåer observerades i de differentierade kolonoiderna (n = 6) jämfört med kolonoiderna odlade i en traditionell kulturmiljö (n = 6; Kompletterande figur 2A, B). Man kan också förvänta sig att de differentierade kolonioiderna huvudsakligen består av slemutsöndrande bägarceller. Dessutom uppreglerades faktiskt MUC2 nästan dubbelt i de differentierade kolonoiderna jämfört med deras traditionellt odlade motsvarigheter (n = 3, p = 0,0433, kompletterande figur 3). När de tas tillsammans tyder dessa data på att kolonioiderna framgångsrikt differentierades och var redo för nedströms experiment. Därefter tillsattes inflammatoriska mediatorer i differentieringsmediet, såsom beskrivs i avsnitt 5 i protokollet. Protein och RNA samlades upp till 72 timmar efter introduktionen av inflammatoriska mediatorer för analys. Vid 72 timmar observerades emellertid ibland ökad celldöd.

För att bedöma om införandet av inflammatoriska mediatorer till differentierade kolonoider kunde efterlikna den mitokondriella biogenessvikt som observerats vid både human IBD och en akut modell av murin kolit, bedömdes proteinuttrycket av PGC1α och transkriptionsfaktor A, mitokondrier (TFAM) via western blot-analys i differentierade kolonoider (n = 5) behandlade med inflammatoriska mediatorer över 72 timmar. PGC1α-uttrycket har visat sig minska i murina modeller av kolit, såväl som i human IBD¹⁵. TFAM, ett protein som driver både transkription och replikation av mitokondriellt genom, har också visat sig minska i murina modeller av kolit, och dess genuttryck har visat sig minska i human IBD^15,20. Vi observerade en liknande nedreglering i både PGC1α (50,4%, p = 0,0442) och TFAM (88,9%, p = 0,004) uttryck i de differentierade kolonoiderna efter 72 timmars exponering för dessa inflammatoriska mediatorer (figur 3). Sammantaget tyder detta på att behandling av differentierade kolonoider med cytokiner är en idealisk modell för att studera mitokondriell dynamik in vitro.

Medan olika cellulära och molekylära funktioner kan undersökas i 3D-kolonoidodlingsinställningar, är 2D-monolagerkultursystem överlägsna vid bedömning av barriärfunktion, värd-patogeninteraktioner och effekterna av oralt absorberade terapier på inflammation^21,22. Bildandet av ett kontinuerligt lager av konfluenta celler med en intakt barriär gör att olika biologiska eller kemiska medel enkelt kan placeras på den apikala och / eller basala sidan av cellerna. Detta protokoll gör det möjligt att etablera 2D-monolagerkulturer från befintliga WT-kolonier som har passerat två gånger. Kolonoider som har blivit enzymatiskt och mekaniskt störda pläteras på cellodlingsinsatser belagda med basalmembranmatris. Vid initial plätering uppträder de fragmenterade kolonioiderna i cellulära kluster som sträcker sig från 15 till 150 celler (figur 4A). Vid dag 3 har cellerna börjat plana ut och långsamt täcka cellodlingsinsatsen och når i allmänhet sammanflödet (figur 4B). Under de närmaste dagarna fortsätter monolager att växa och bildar en kontinuerlig barriär som kan mätas kvantitativt med TEER (figur 4C, D). Intressant nog fluktuerar TEER-mätningarna över dag 3 till dag 5. Monolagren har högre värden tidigare med ett brett intervall (200-800 Ω·cm 2), men dessa värden konvergerar långsamt på ett lägre tal vid dag 5 (115-150 Ω·cm², figur 5A). När monolagren når ett stabilt tillstånd kan de användas för nedströms experiment.

För att karakterisera epitelsvaret hos kolonoid-härledda monolager till inflammation placerades inflammatoriska mediatorer på cellens basala sida (utsidan av insatsen) i 48 timmar. RNA extraherades och mRNA-nivåerna av olika stam- och celldifferentieringsmarkörer, liksom korsningsproteiner, analyserades via qPCR. Lgr5 detekterades inte i något av tillstånden, men en annan stamcellsmarkör, mTERT, reducerades med nästan 60% i de inflammerade monolagren jämfört med den obehandlade kontrollen (kompletterande figur 4A). Därefter analyserade vi uttrycket av två markörer av differentierade celltyper, Muc2 och alkaliskt fosfatas (Alpi). Båda mRNA-transkripten var lägre i de inflammerade monolagren jämfört med kontrollcellerna (kompletterande figur 4A). Både stamceller och postmitotiska celler minskar vanligen under koloninflammation^23,24,25, och ett liknande svar observerades i monolagermodellen som erhölls i denna studie.

En fördel med monolagersystemet är möjligheten att bedöma barriärresponsen. För att avgöra om barriären äventyrades i det immunstimulerade tillståndet mätte vi TEER-värdena efter 48 timmar. TEER-värdena för kontrollmonolagren (n = 2) var i genomsnitt 129,16 Ω cm 2 men sjönk signifikant (p = 0,0087) till i genomsnitt 98,54 Ω cm² i de inflammerade monolagren (figur 5B). För att ytterligare bekräfta att barriären äventyrades i det inflammatoriska tillståndet bedömde vi mRNA-nivåerna för tre olika snäva korsningsmarkörer, Zo-1, Occludin och Claudin. Alla tre markörerna hade reducerade nivåer i inflammerat tillstånd jämfört med deras oinflammerade motsvarigheter (kompletterande figur 4B). Sammantaget visar dessa data att barriärdysfunktion är närvarande i de inflammerade monolagren och efterliknar barriärdysfunktionen som observerats under IBD-patogenesen.

Figur 1: Initial isolering av murina krypter för etablering av långsiktig kolonoidkultur. (A) På dag 0 pläterades 300-500 krypter i basalmembranmatris (bild erhållen 5 timmar efter plätering), och kolonoidernas tillväxt fångades på (B) dag 1, (C) dag 3 och (D) dag 5. På dag 5 var kolonioiderna redo att passeras. Förstoring = 10x; skalstapel = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Etablering av terminalt differentierade kolonoider från traditionell kolonoidkultur. Differentieringsmedium placerades på kolonoiderna 48 timmar efter att ha passerat murina kolonioider. Efter (A) 24 timmar och (B) 48 timmar blir kolonoiderna berikade med terminalt differentierade celler. Förstoring = 10x; skalstapel = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: PGC1α- och TFAM-proteinuttryck i murina differentierade kolonoider behandlade med inflammatoriska mediatorer. Medium kompletterat med inflammatoriska mediatorer placerades på de differentierade kolonoiderna och protein samlades 0 timmar, 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar efter exponering. (A) Proteinuttrycket av PGC1α visade en övergripande signifikant minskning (p = 0,0442) under 72 timmar. TFAM var signifikant nedreglerat (p = 0,004) efter exponering för inflammatoriska mediatorer vid 72 timmar, och (B) det fanns en nedåtgående trend i proteinuttryck vid 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar när det analyserades av ANOVA. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. *p < 0,05, **p < 0,005. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Etablering och tillväxt av monolager från befintliga kolonioider. Colonoider som hade blivit enzymatiskt och mekaniskt störda pläterades på cellodlingsinsatser belagda med en basalmembranmatris. Vid den första pläteringen uppträdde de fragmenterade kolonioiderna i (A) cellulära kluster, och vid (B) dag 3 hade de börjat plana ut och långsamt täcka cellodlingsinsatsen. (C) Vid dag 5 och (D) dag 7 fortsatte monolagren att växa för att bilda en kontinuerlig barriär som kvantitativt kunde mätas med TEER. Förstoring = 10x; skalstapel = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: TEER-värden för upprättande av kolonoid-härledda monolager och inflammerade monolager. (A) TEER-värdena mättes med en voltohmmeter från dag 3 till dag 5. Monolagren hade högre värden tidigare med ett brett intervall men konvergerade långsamt på ett lägre tal dag 5. När monolagren når ett stabilt tillstånd kan de användas för nedströms experiment. (B) TEER-värdena var lägre i de inflammerade monolagren (n = 2) jämfört med de oinflammerade kontrollerna (n = 2). Kontrollmonolagren hade en genomsnittlig TEER på 129,16 ohm · cm 2, och TEER för de inflammerade monolagren var signifikant lägre (p = 0,0087), med ett genomsnitt på 98,54 Ω^· cm², när de analyserades med ett t-test. **p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Tabell över lösningens sammansättning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande figur 1: PGC1α-proteinuttryck i murina kolonioider odlade i traditionellt kolonoidmedium isolerat från WT-kontroller och 2% DSS-behandlade möss. Kolonoiderna härrörde från både 8 veckor gamla WT-kontrollmöss och 2% DSS-behandlade möss efter 7 dagar. Protein isolerades från kolonoider som passerade två gånger och på dag 4 efter plätering. Det fanns ingen skillnad i PGC1α-proteinuttryck (p = 0,9996) i kolonoiderna härledda från kontrollmössen jämfört med mössen som utsattes för 2% DSS i 7 dagar när de analyserades med ett oparat t-test. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Minskat Lgr5- och Ki67-mRNA-uttryck i differentierade kolonoider. Murina kolonoider passerade 48 timmar tidigare exponerades för differentieringsmedium i 48 timmar innan RNA- och cDNA-syntesen isolerades. MRNA-nivåerna bestämdes via qPCR och analyserades med den jämförande CT-metoden. (A) Lgr5 och (B) Ki67 minskade signifikant i de differentierade kolonioiderna när de analyserades statistiskt med ett t-test (p = 0,0023, p = 0,0007). Data presenterade som medelvärde ± standardavvikelse.**p < 0,005. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Ökade mucinutsöndrande bägarceller i differentierade murina kolonioider. Murina kolonioider passerade 48 timmar tidigare exponerades för differentieringsmedium i 48 timmar. Cellerna lyserades i RIPA-buffert och protein visualiserades genom western blot-analys. (A) MUC2-uttrycket ökade i varje uppsättning differentierade kolonoider jämfört med de odifferentierade kolonoiderna. (B) En nästan tvåfaldig förändring av MUC2-protein observerades under differentieringsförhållandena, vilket var signifikant när det analyserades med ett t-test (p = 0,0433). Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. *p < 0,05. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Minskat uttryck av stam- och differentieringsmarkörer, liksom snäva korsningsmarkörer, i monolager behandlade med inflammatoriska mediatorer. Murina kolonoid-härledda monolager (dag 5) exponerades för inflammatoriska mediatorer i 48 timmar, RNA samlades därefter in och cDNA syntetiserades (n = 2). MRNA-nivåerna av stam-, differentierings- och korsningsmarkörer bestämdes via qPCR och analyserades med den jämförande CT-metoden. (A) Stamcellsmarkören, Lgr5, detekterades inte i något av tillstånden, men mTERT reducerades avsevärt vid inflammatoriska tillstånd. Bägarcellmarkören, Muc2, och kolonocytmarkören, Alpi, minskade båda i de inflammerade monolagren jämfört med de obehandlade monolagren. (B) De snäva korsningsmarkörerna, Zo-1, Occludin och Claudin, var alla lägre i inflammatoriska behandlade monolager jämfört med kontrollen. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 1: Förteckning över primers. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Organoidutveckling har revolutionerat hur det vetenskapliga samfundet studerar organsystem in vitro med förmågan att delvis rekapitulera cellulär struktur och funktion från ett djur eller människa i en maträtt. Vidare erbjuder organoidsystem som härrör från människor med sjukdomar ett lovande verktyg för personlig medicin som kan vägleda terapeutiskt beslutsfattande. Här beskriver vi ett kryptisoleringsprotokoll som fungerar bra och introducerar viktiga steg som gör det möjligt att städa upp överflödigt skräp i isoleringen före plätering. Dessutom förklarar vi en viktig detalj som ofta förbises i processen - förmågan att exakt räkna krypterna för plätering. När kolonoiderna är etablerade beskriver vi viktiga manipuleringar som möjliggör deras cellulära differentiering eller monolagerbildning, vilket kan förbättra förmågan att studera förändringar i tarmepitelet under IBD.

Krypt-villusaxeln i kolonepitelet hos däggdjur är en komplex struktur som består av olika celltyper med olika funktioner. Underhållet av denna axel beror på både inneboende och yttre cellulära faktorer, som tillsammans hjälper till att upprätthålla epitelial homeostas¹⁸. Vi har noterat att murina kolonioider som odlas i traditionellt medium främst återspeglar stamceller i motsats till konglomerationen av både stamceller och terminalt differentierade celler som ses in vivo. Dessutom är murina colonoider som odlas och underhålls på detta sätt cirkulära strukturer i motsats till platta monolager. Dessa skillnader har potentiella konsekvenser för våra försök att studera tarmsjukdom in vitro. Specifikt är vi begränsade i vår förmåga att använda organoider för att studera förändringar i barriärfunktion, liksom effekterna av inflammation på terminalt differentierade tarmepitelceller.

Här beskriver vi protokoll för inte bara isolering av murina krypter för att odla kolonoider utan också för manipulation av dessa kolonoider för att studera tarmepitelfysiologi och epitelsvaret på inflammation. Bland flera yttre faktorer som främjar gradienten av pluripotenta stamceller och terminalt differentierade celler är Wnt kanoniska vägen, som är rik på krypter och främjar stamcellshälsa. Wnt-signaleringen minskar vid kryptaxelns spets, vilket sammanfaller med utvecklingen av stamceller till terminalt differentierade celler²⁶. Vi har beskrivit ett protokoll som möjliggör terminal differentiering av kolonoidceller. Liksom andra differentierar vi genom att ta bort Wnt från tillväxtmediet, men vi använder en lägre koncentration av R-spondin (500 ng / ml mot 1 μg / ml R-spondin)¹⁷. Överraskande påverkar en 50% minskning av R-spondin inte den framgångsrika differentieringen av organoiderna. Förmågan att differentiera med en lägre koncentration hjälper till att etablera ett mindre artificiellt system som mer liknar den fysiologiska miljön in vivo. Även om detta protokoll resulterar i ändlig terminal differentiering (kompletterande figur 2 och kompletterande figur 3) och en oförmåga att upprätthålla cellulär odödlighet, är det ändå en användbar metod för att bättre förstå det fysiologiska bidraget från det terminalt differentierade epitelet, inklusive kolonocyter, enteroendokrina celler och bägarceller, till IBD och andra sjukdomstillstånd. Vidare visar vi att komplettering av specifika cytokiner i detta medium, som traditionellt är förhöjda hos patienter med IBD, leder det differentierade organoidsystemet mot ett inflammatoriskt tillstånd. Under loppet av 72 timmar återspeglar differentierade kolonoider behandlade med inflammatoriska cytokiner närmare några av de metaboliska fynd som visas i andra etablerade modeller av kolit och human IBD (figur 3). Vidare är differentierade kolonoider som behandlas på detta sätt sannolikt mer reflekterande av effekterna av inflammation på cellulär homeostas på det differentierade epitelet. Vi har också skisserat ett protokoll för utveckling av monolager, vilket möjliggör bildandet av både en apikal och basal sida av epitelet, vilket möjliggör en analys av barriärfunktionen in vivo. Detta system är användbart för att studera mekanismer för barriärdysfunktion utan behov av differentiering och odla nya terapeutiska mål för behandling.

Flera begränsningar och potentiella fallgropar angående de protokoll som beskrivs ovan måste noteras. Den framgångsrika isoleringen av krypter och utvecklingen av kolonoider kan begränsas av kryptutbytet från varje djur, noggrannheten att räkna krypterna och förberedelsens renhet. Hastigheten att räkna de isolerade krypterna efter resuspension, variationer i den mekaniska dissociationen av krypterna från den underliggande muscularis och antalet tvättar och centrifugalspinn bidrar till framgångsrik kolonoidkultur. Dessutom är det viktigt att inte helt disassociera organoiderna i enskilda celler under passaging eller plätering för 2D-monolagerkultur. Kluster av 30 till 50 celler är idealiska för att låta kulturen sprida sig för långsiktig odling. Ovanstående protokoll noterar områden med potentiella fallgropar och valfria ytterligare steg för att felsöka dessa problem. I slutändan kan protokollet kräva optimering av individen som utför isoleringen på grund av inneboende variation i färdighetsuppsättning och manövrer (dvs. skakning), liksom variation i varje djur. Ytterligare optimering kan krävas av slutanvändaren för att fånga den genetiska och molekylära mångfalden som finns i IBD.

I slutändan, medan kolonoidsystemet är ett mycket användbart verktyg för att rekapitulera viktiga aspekter av mänsklig fysiologi och sjukdom in vivo, är detta system i slutändan begränsat i sin förmåga att studera alla aspekter av mänsklig sjukdom. Traditionella metoder för kolonoidutveckling har belyst viktiga aspekter av stamcellsdynamik; Dessa fynd återspeglar emellertid ofta inte tillräckligt fynden i terminalt differentierade celler i värdepitelet. De strategier som beskrivs i denna studie ger utredare en relativt snabb, billig modell för organoidmanipulation som, när den används korrekt, kan belysa viktiga aspekter av tarmepitelstruktur och funktion under inflammation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)