Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking in vitro op gevestigde murine colonoïden

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64804
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 2,3
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven een protocol dat de isolatie van murine coloncrypten beschrijft voor de ontwikkeling van 3-dimensionale colonoïden. De gevestigde colonoïden kunnen vervolgens terminaal worden gedifferentieerd om de cellulaire samenstelling van het gastheerepitheel weer te geven voordat ze een ontstekingsuitdaging krijgen of worden gericht op het vaststellen van een epitheliale monolaag.

Abstract

Het darmepitheel speelt een essentiële rol in de menselijke gezondheid en vormt een barrière tussen de gastheer en de externe omgeving. Deze zeer dynamische cellaag vormt de eerste verdedigingslinie tussen microbiële en immuunpopulaties en helpt de intestinale immuunrespons te moduleren. Verstoring van de epitheliale barrière is een kenmerk van inflammatoire darmziekte (IBD) en is van belang voor therapeutische targeting. Het 3-dimensionale colonoïde cultuursysteem is een uiterst nuttig in vitro model voor het bestuderen van intestinale stamceldynamica en epitheelcelfysiologie in IBD-pathogenese. Idealiter zou het vestigen van colonoïden uit het ontstoken epitheelweefsel van dieren het meest gunstig zijn bij het beoordelen van de genetische en moleculaire invloeden op ziekten. We hebben echter aangetoond dat in vivo epitheliale veranderingen niet noodzakelijkerwijs worden behouden in colonoïden die zijn vastgesteld bij muizen met acute ontsteking. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om colonoïden te behandelen met een cocktail van ontstekingsmediatoren die meestal verhoogd zijn tijdens IBD. Hoewel dit systeem alomtegenwoordig kan worden toegepast op verschillende kweekomstandigheden, benadrukt dit protocol de behandeling van zowel gedifferentieerde colonoïden als 2-dimensionale monolagen afgeleid van gevestigde colonoïden. In een traditionele kweekomgeving worden colonoïden verrijkt met darmstamcellen, wat een ideale omgeving biedt om de stamcelniche te bestuderen. Dit systeem laat echter geen analyse toe van de kenmerken van de darmfysiologie, zoals de barrièrefunctie. Verder bieden traditionele colonoïden niet de mogelijkheid om de cellulaire respons van terminaal gedifferentieerde epitheelcellen op pro-inflammatoire stimuli te bestuderen. De hier gepresenteerde methoden bieden een alternatief experimenteel kader om deze beperkingen aan te pakken. Het 2-dimensionale monolaagse kweeksysteem biedt ook de mogelijkheid voor therapeutische geneesmiddelenscreening ex vivo. Deze gepolariseerde laag cellen kan worden behandeld met ontstekingsmediatoren aan de basale kant van de cel en gelijktijdig met vermeende therapieën apisch om hun nut bij IBD-behandeling te bepalen.

Introduction

Inflammatoire darmziekte (IBD) is een chronische, remitterende en recidiverende ziekte die wordt gekenmerkt door episodes van ontsteking en klinische rust. De etiologie van IBD is multifactorieel, maar belangrijke kenmerkende kenmerken van de ziekte zijn een defecte barrièrefunctie en verhoogde permeabiliteit van het darmepitheel, naast pro-inflammatoire signaalcascades geactiveerd in het epitheelcompartiment 1,2. Verschillende in vitro en in vivo modellen zijn gebruikt om de epitheliale respons tijdens IBD samen te vatten, waaronder celkweek en muizenmodellen van ontsteking3. Al deze systemen hebben echter belangrijke tekortkomingen die hun vermogen beperken om de epitheliale veranderingen tijdens IBD4 samen te vatten. De meeste cellijnen die worden gebruikt om IBD te bestuderen, zijn getransformeerd, hebben het vermogen om een monolaag te vormen en kunnen3 onderscheiden, maar zich intrinsiek anders voortplanten dan niet-getransformeerde darmepitheelcellen in de gastheer. Verschillende muizenmodellen van ontsteking worden gebruikt om IBD te bestuderen, waarvan sommige knock-outmodellen, infectieuze modellen, chemische ontstekingsmodellen en T-celoverdrachtsmodellen 5,6,7,8 omvatten. Hoewel elk bepaalde etiologische aspecten van IBD kan bestuderen, zoals genetische aanleg, barrièredisfunctie, immuunderegulatie en het microbioom, zijn ze beperkt in hun vermogen om de multifactoriële aard van de ziekte te bestuderen.

Intestinale organoïden, waaronder enteroïden en colonoïden, zijn het afgelopen decennium vastgesteld als een nuttig in vitro model voor het bestuderen van niet alleen de dynamiek van intestinale stamcellen, maar ook hun rol de barrière-integriteit en functie van het darmepitheel spelen in intestinale homeostase en ziekte. Deze entiteiten hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van de pathogenese van IBD9 en hebben nieuwe mogelijkheden geopend voor gepersonaliseerde geneeskunde. Colonoïden, of stamcel-afgeleide, zelforganiserende weefselculturen uit de dikke darm, zijn ontwikkeld uit zowel murine als menselijk weefsel in een proces dat stamcellen in darmcrypten in staat stelt zich te verspreiden en voor onbepaalde tijd te worden onderhouden10. De stamcelniche in vivo is afhankelijk van extracellulaire factoren om de groei ervan te ondersteunen, met name de canonieke Wnt-signalering en botmorfogene eiwitsignaleringsroutes11. De toevoeging van deze factoren bevordert de gezondheid en levensduur van colonoïden, maar drijft de cultuur ook naar een stamcelachtige toestand die geen weerspiegeling is van de in vivo epitheliale cellulaire architectuur, die bestaat uit zowel zelfvernieuwende als terminaal gedifferentieerde cellen12,13. Hoewel de functionaliteit van het darmepitheel afhankelijk is van de voortdurende overspraak tussen het stamcelcompartiment en gedifferentieerde cellen, is het vermogen om beide in een colonoïde kweeksysteem te hebben vrij beperkt. Ondanks deze beperkingen blijft het organoïde cultuursysteem de gouden standaard om de intrinsieke eigenschappen van het epitheel ex vivo te bestuderen. Niettemin moeten alternatieve cultuurstrategieën mogelijk worden overwogen om de wetenschappelijke vraag te beantwoorden.

Het is aangetoond dat muizen op een continu 7-daags regime van dextransonnatriumsulfaat (DSS) zowel epitheliale ontsteking als barrièredisfunctie ontwikkelen14. Bovendien zijn mitochondriaal biogenesefalen en metabole herprogrammering binnen het darmepitheel, waarvan is aangetoond dat ze duidelijk zijn bij menselijke IBD, ook vastgelegd in dit DSS-model van colitis15. Onze voorlopige gegevens tonen echter aan dat de kenmerken van mitochondriaal biogenesefalen niet behouden blijven in colonoïden die zijn afgeleid van de crypten van met DSS behandelde dieren (aanvullende figuur 1). Daarom moeten alternatieve kweekmethoden worden gebruikt bij het onderzoeken hoe ontsteking epitheliale veranderingen veroorzaakt tijdens muriene darmontsteking. Hier schetsen we een protocol dat we hebben ontwikkeld dat beschrijft 1) hoe crypten te isoleren van heel colonweefsel voor de oprichting van muriene colonoïden, 2) hoe deze celpopulatie terminaal te differentiëren om de celpopulatie weer te geven zoals deze in vivo staat, en 3) hoe ontsteking te induceren in dit in vitro model. Om geneesmiddelinteracties binnen het ontstoken epitheel te bestuderen, hebben we een protocol ontwikkeld om 2-dimensonale (2D) monolagen van murine colonoïden vast te stellen die basaal kunnen worden behandeld met ontstekingsmediatoren en apisch kunnen worden behandeld met medicamenteuze therapieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten met muizenweefsels die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Pittsburgh en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Research and Care Committee van de University of Pittsburgh en UPMC.

1. Voorbereiding op cultuur

OPMERKING: Alle reagentia zijn opgenomen in de sectie Materiaaltabel en alle samenstellingen van de oplossing zijn te vinden in de tabel met de samenstelling van de oplossing (tabel 1).

  1. Bereid het wasmedium voor muizen zoals beschreven in tabel 1. Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 2 maanden.
  2. Bereid crypte-isolatiebuffer 1 (CIB1) voor zoals beschreven in tabel 1. Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 2 maanden.
    LET OP: Dithiothreitol (DTT) wordt door de OSHA Hazard Communication Standard als gevaarlijk beschouwd vanwege de potentiële acute toxiciteit bij inname en huid- en oogbeschadiging als die gebieden eraan worden blootgesteld. Beschermende handschoenen, oogbescherming en gezichtsbescherming moeten worden gebruikt bij het hanteren van deze chemische stof.
  3. Bereid cryptisolatiebuffer 2 (CIB2) voor zoals beschreven in tabel 1. Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 2 maanden.
  4. Bereid L-WRN-geconditioneerd medium volgens een eerder gepubliceerd protocol16.
  5. Bereid volledig colonoïde medium zoals beschreven in tabel 1. Compleet colonoïde groeimedium kan tot 5 dagen bij 4°C worden bewaard zonder verlies van activiteit.
  6. Bereid het differentiatiemedium voor zoals beschreven in tabel 1. Dit protocol is aangepast ten opzichte van een eerder gepubliceerd artikel17. Het differentiatiemedium kan tot 5 dagen bij 4°C worden bewaard zonder verlies van activiteit.
  7. Bereid het ontstekingsmediatormedium voor zoals beschreven in tabel 1. Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerd artikel18. Het ontstekingsmediatormedium kan tot 5 dagen bij 4°C worden bewaard zonder verlies van activiteit.
  8. Bereid het murine monolayer medium voor. Laat Y-27632 weg bij het uitdagen van de monolagen met ontstekingsfactoren en/of geneesmiddel(en). Het murine monolayer medium kan tot 5 dagen bewaard worden bij 4°C zonder verlies van activiteit.
  9. Bereid het monolaagse medium van de ontstekingsmediator voor. Het monolaagse medium van de ontstekingsmediator kan tot 5 dagen bij 4°C worden bewaard zonder verlies van activiteit.

2. Crypte isolatie van murine colonweefsel

OPMERKING: Breng het weefsel over op ijs. Haal de juiste hoeveelheid keldermembraanmatrix uit de opslag van −20 °C en ontdooi op ijs. Elke 24-put is verguld met 15 μL keldermembraanmatrix. Bereid CIB1, CIB2 en volledig colonoïde groeimedium voor zoals beschreven in rubriek 1.

  1. Euthanaseer een C57BL / 6J-muis (6-8 weken oud) volgens het door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde protocol en extraheer het distale uiteinde (ongeveer 5-7 cm) van de dikke darm met een schoon pincet en een schaar.
    OPMERKING: In deze studie werden de proefpersonen geëuthanaseerd met behulp van koolstofdioxidekamerincubatie gedurende 2-3 minuten gevolgd door cervicale dislocatie.
    1. Plaats hiervoor de muis op zijn rug, maak een horizontale incisie net onder de ribbenkast en vervolgens een verticale incisie vanuit het midden van de horizontale incisie naar de basis van de staart om de buikholte bloot te leggen.
    2. Beweeg met een pincet de dunne darm uit het veld, identificeer de dikke darm en volg deze tot aan de basis van de staart. Breek het bekken met een schaar om de distale dikke darm indien nodig volledig bloot te leggen. Gebruik de schaar om de meest distale 5-7 cm van de dikke darm te knippen.
  2. Plaats het darmweefsel op een schoon oppervlak. Verwijder het overtollige serosaalvet dat de dikke darm omringt. Verwijder de fecale materie door de luminale inhoud van de dikke darm te spoelen met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met behulp van een spuit bevestigd aan een 18 G 1 1/2 naald. Plaats vervolgens de dikke darm in een conische buis van 50 ml met 10 ml ijskoude DPBS en plaats deze op ijs.
    OPMERKING: Als u de dikke darm van meer dan één dier isoleert, plaatst u het weefsel op ijs voordat u doorgaat naar het volgende dier.
  3. Breng het darmweefsel over in een petrischaal met 10 ml ijskoude DPBS en irrigeer het lumen tweemaal met DPBS met behulp van een P1.000-pipet.
  4. Open de dikke darm in de lengterichting met een schaar en schud voorzichtig met een pincet gedurende ~ 30 s in de DPBS om de resterende fecale inhoud te verwijderen.
  5. Breng het weefsel over in een nieuwe petrischaal met 10 ml ijskoude DPBS en schud opnieuw voorzichtig met een pincet voordat u de dikke darm in stukken van 2 cm snijdt met een schaar en deze in een conische buis van 50 ml plaatst met 7 ml ijskoude CIB1. Incubeer het weefsel in CIB1 op ijs gedurende 20 minuten.
    OPMERKING: De overige stappen worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.
  6. Breng het weefsel met een pincet over in een voorverwarmde conische buis van 50 ml met 7 ml CIB2 en incubeer gedurende 5 minuten in een waterbad bij 37 °C.
  7. Verwijder de CIB2 uit de 50 ml conische buis door het weefsel op de bodem van de conische buis te laten bezinken en vervolgens de CIB2 af te pipetteren. Voeg vervolgens 10 ml ijskoud wasmedium voor muizen toe aan dezelfde conische buis.
  8. Verkrijg een nieuwe conische buis van 50 ml en plaats een filter van 70 μm bovenop de open buis.
  9. Terwijl u de buis met de inhoud van de dikke darm vasthoudt, draait u de hand ongeveer 45°. Schud de buis op een schommelende en krachtige manier gedurende 45 s om de crypten vrij te geven. Giet vervolgens de cryptuspensie door de 70 μm celzeef in een nieuwe conische buis van 50 ml.
  10. Plaats met een pincet het darmweefsel terug in de lege conische buis van 50 ml en voeg 10 ml ijskoud wasmedium toe. Verkrijg een nieuwe 70 μm celzeef en plaats deze op de conische buis van 50 ml met de vorige gefilterde oplossing.
  11. Nogmaals, pak de buis van 50 ml met de cryptefragmenten en schud deze op dezelfde manier als in stap 2.9. Filter het medium door de 70 μm celzeef in de 50 ml conische buis om te combineren met de eerder gefilterde crypten.
    OPMERKING: Als de crypteopbrengst laag is, schud het darmweefsel dan een extra keer door het weefsel in een lege conische buis van 50 ml met 10 ml muiswasmedium te plaatsen. Schud het weefsel gedurende 45-50 s om de crypten vrij te geven. Als de opbrengst van de crypte laag is, verhoog dan de kracht van het schudden. Ten slotte, als de totale crypteopbrengst laag is, kunnen zowel de pipetten als de buizen worden bedekt met foetaal runderserum (FBS) om de hechting van het weefsel aan het plastic te voorkomen.
  12. Centrifugeer de 50 ml conische buis met de gefilterde crypten op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Een pellet moet worden waargenomen aan de onderkant van de 50 ml conische buis.
  13. Decanteer het medium door pipetteren, resuspensie van de crypten door op en neer te pipetteren met 10 ml ijskoud muizenwasmedium en breng het over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4°C.
  14. Om een schonere bereiding te verkrijgen, wast u de crypten met een extra 10 ml muizenwasmiddel. Decanteer het vorige medium en resuspensie van de crypten door op en neer te pipetteren in 10 ml wasmedium voor muizen. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4°C met behulp van een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het pipetteren van het medium, omdat de pellet soms niet strak wordt gecentrifugeerd. Als de pellet niet strak is, pipetteer dan het grootste deel van het medium, waardoor 500 μL tot 1 ml overblijft. Breng vervolgens de pellet terug door te pipetteren in 10 ml wasmedium voor muizen en breng de oplossing over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeren in een kleinere conische buis kan de dichtheid van de pellet verbeteren.
  15. Decanteer het medium en resuspenseer de crypten door op en neer te pipetteren met 10 ml ijskoud wasmedium voor muizen. Eenmaal geresuspeerd, tel de crypten onder een helderveldmicroscoop door onmiddellijk 10 μL van het medium op een glasplaat te pipetteren.
    1. Plaats twee druppels van 10 μL op afzonderlijke uiteinden van de dia en tel het aantal crypten in elke druppel. Gemiddelde van de getallen tussen de twee druppels om het aantal crypten per 10 μL te bepalen. Vermenigvuldig dit aantal met 100 om het aantal crypten in 1 ml te krijgen.
      OPMERKING: Voor een nauwkeurige telling moet 10 μL van de cryptensuspensie onmiddellijk na resuspensie worden verwijderd. Zo niet, dan vallen de crypten op de bodem van de buis, wat resulteert in een onnauwkeurige telling.
  16. Met als doel om 300-500 crypten per put te platen, brengt u het juiste volume crypten geresuspendeerd in het wasmedium van de muis over naar een nieuwe conische buis van 15 ml en brengt u deze op 10 ml met ijskoud muiswasmedium. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4°C. Een kleine pellet moet zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis.
  17. Verwijder het supernatant met een powerpipet. Gebruik een P200-pipet om voorzichtig restmedium te verwijderen, waardoor alleen de pellet overblijft.
  18. Resuspendeer de pellet in de juiste hoeveelheid ijskoude keldermembraanmatrix door langzaam op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat u geen bubbels introduceert bij het opnieuw ophangen van de cryptekorrel. Plaat 300-500 crypten/15 μL keldermembraanmatrix in elke put van een plaat. Keer na het plateren de weefselkweekplaat om en plaats deze gedurende 10-20 minuten in een incubator van 37 °C.
  19. Draai de plaat terug en voeg 500 μL van het volledige muiscolonoïde medium toe aan elke put. Verander het medium om de dag totdat ze klaar zijn om te passeren. Passeer de colonoïden om de 3-5 dagen.

3. Het passeren van de colonoïden

OPMERKING: Elke put kan over het algemeen 1:4 tot 1:6 worden gepasseerd, afhankelijk van de dichtheid van de oorspronkelijke put. Neem de juiste hoeveelheid keldermembraanmatrix uit −20°C en plaats deze op ijs om te ontdooien. Colonoïden kunnen na twee passages worden gebruikt voor experimenten. Bij het passeren van colonoïden worden de stappen uitgevoerd in een biologische veiligheidskast om besmetting te voorkomen.

  1. Verwijder het medium uit de te passeren putten.
    1. Als er puin in de keldermembraanmatrix zit, wat kan gebeuren tijdens de eerste isolatie, kan het volgende protocol worden gebruikt om het puin op te ruimen:
      1. Voeg 1 ml ijskoude 0,1% runderserumalbumine (BSA) in DPBS zonder Ca 2+ of Mg2+ toe aan elk putje. Laat het 5 minuten staan in de biologische veiligheidskast.
      2. Pipetteer drie tot zeven keer op en neer met behulp van een P1000-pipet om de keldermembraanmatrix te verstoren en verzamel de inhoud van de putten in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de colonoïden in een totaal van 5-10 ml 0,1% BSA in DPBS zonder Ca 2+ of Mg2+. Vul aan tot het juiste volume met 0,1% BSA.
      3. Centrifugeer op 150 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de colonoïden te pelleteren, maar niet het puin.
      4. Decanteer de DPBS door pipetteren, waardoor de pellet achterblijft. Voeg 1 ml enzymatisch dissociatiereagens op kamertemperatuur (RT) toe en pipetteer drie tot vijf keer.
      5. Plaats de 15 ml conische buis met het enzymatische dissociatiereagens en verstoorde colonoïden gedurende 3-4 minuten in een waterbad van 37 °C.
      6. Verwijder de buis uit het waterbad, pipetteer 3-5 keer en breng vervolgens op 10 ml met muiswasmedium. Ga verder met stap 3.6.
  2. Plaats 500 μL RT enzymatisch dissociatiereagens in elk putje en laat het ongeveer 1 minuut zitten voordat het drie tot zeven keer op en neer pipeteert om de keldermembraanmatrix te verstoren.
  3. Plaats de plaat in een incubator van 37°C gedurende 3-4 minuten.
  4. Verwijder de plaat uit de couveuse en pipetteer drie tot zeven keer op en neer met behulp van een P1000-pipet om de colonoïden te dissociëren.
  5. Breng de inhoud over in een conische buis van 15 ml en vul aan tot 10 ml met ijskoud wasmedium voor muizen.
  6. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 4°C op 300 x g .
  7. Verwijder het medium indien nodig met behulp van een powerpipet en een P200-pipet, zodat er alleen een pellet overblijft in de conische buis.
  8. Resuspendeer in een geschikte hoeveelheid ijskoude keldermembraanmatrix door voorzichtig op en neer te pipetteren volgens het aantal putten dat moet worden verguld. Introduceer geen bubbels bij het pipetteren. Plaats de colonoïde fragmenten in 15 μL keldermembraanmatrixdruppels per put.
  9. Plaats de crypten, keer de weefselkweekplaat om en plaats de plaat vervolgens gedurende 10-20 minuten in een incubator van 37 °C.
  10. Draai ten slotte de plaat om en voeg 500 μL volledig muiscolonoïde medium toe aan elke put. Verander het medium om de dag totdat ze groot genoeg zijn geworden om binnen ongeveer 3-5 dagen opnieuw te worden doorgelaten.

4. Terminaal differentiëren van de colonoïde cellen

  1. Passeer de colonoïden zoals hierboven en voeg 500 μL van het volledige muiscolonoïde medium toe aan elke put.
  2. Verwijder ten minste 48 uur na het passeren het volledige colonoïde medium van de muis en voeg 500 μL van het differentiërende medium toe aan elke put (zie rubriek 1).
  3. Incubeer de colonoïden met differentiatiemedia gedurende 48 uur, waarna ze kunnen worden gebruikt in experimenten, waaronder het verzamelen van RNA en eiwit.
    OPMERKING: Colonoïden kunnen worden beoordeeld voor differentiatie door RNA te verzamelen en de expressie van Lgr5 en Ki67, respectievelijk een stamcelmarker en celproliferatiemarker, te beoordelen via kwantitatieve reverse transcriptase-polymerasekettingreactie (qPCR). Terminaal gedifferentieerde cellen moeten een relatief lage expressie van Lgr5 en Ki67 hebben in vergelijking met colonoïden gekweekt in traditioneel colonoïde medium, waar de cellen meer stamachtig zijn. De tijdsduur die de colonoïden nodig hebben om in het differentiatiemedium te incuberen, moet mogelijk voor elk individueel laboratorium worden geoptimaliseerd. Zie aanvullende tabel 1 voor de lijst van primers.

5. Het induceren van ontsteking in gedifferentieerde colonoïden met ontstekingsmediatoren

  1. Nadat de colonoïden gedurende 2-3 dagen zijn geïncubeerd met het differentiatiemedium, verwijdert u het bestaande medium en voegt u 500 μL van het ontstekingsmediatormedium toe aan elk putje.
  2. Laat de putjes 24-72 uur incuberen voordat u het RNA en eiwit verzamelt (of andere stroomafwaartse parameters beoordeelt). Verander het medium elke dag.

6. Intestinale epitheliale monolagen afgeleid van gevestigde murine colonoïden

OPMERKING: Murine intestinale epitheliale monolagen zijn afgeleid van murine colonoïden die minimaal twee keer zijn gepasseerd. Om een succesvolle monolaagvorming in 3-5 dagen mogelijk te maken, is het noodzakelijk om de colonoïden niet in afzonderlijke cellen te scheiden. Gefragmenteerde organoïden die enzymatisch zijn gedissocieerd in cellulaire clusters zijn ideaal voor groei.

  1. Bereid alle reagentia voor voordat u met het experiment begint. Ontdooi de keldermembraanmatrix op ijs. Bereid het muizenmonolaagmedium voor zoals beschreven in rubriek 1 . Verdun het ontdooide keldermembraan 1:20 met het koude murine monolayer medium. Blijf op ijs.
  2. Gebruik een steriele tang om een transparante celkweekinzet van 0,4 μm in een enkele put van een 24-well weefselkweekplaat te plaatsen (Table of Materials). Pak een hoekpin van het inzetstuk en breng het over in de put. Herhaal dit totdat het juiste aantal celkweekinzetstukken beschikbaar is voor kweek.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u een extra controleput alleen met de keldermembraanmatrix bedekt. Deze celkweekinzet zal worden gebruikt om de achtergrondweerstand van de celkweekinzet zonder aanwezige cellen te meten, zoals beschreven in de volgende stap (stap 6.3).
  3. Bedek met behulp van een P200-pipet het apicale (bovenste) oppervlak van elke celkweekinzet met 150 μL verdunde keldermembraanmatrix. Plaats de pipetpunt in het midden van de insert zonder het membraan van de insert aan te raken en verwijder de oplossing voorzichtig. Plaats de plaat in een steriele 37°C incubator met 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur.
  4. Verwijder de keldermembraanmatrix voorzichtig voor gebruik en laat de celkweekinzetstukken minimaal 10 minuten drogen in een biologische veiligheidskast.
    1. Om de keldermembraanmatrix te verwijderen, draait u de 24-putplaat in een hoek van 45°. Plaats een enkele vinger op de hoek van de pin om de insert te stabiliseren en plaats met behulp van een P200-pipet voorzichtig de pipetpunt langs de onderkant van de insert en verwijder de matrix.
    2. Verwijder overtollige resten door elke celkweekinzet te wassen met 150 μL steriele DPBS zonder Ca 2+ of Mg2+.
  5. Voeg na 10 minuten drogen 400 μL van het murine monolayer medium toe aan de onderkant van de celkweekinzet en 75 μL bovenop. Herhaal dit totdat alle celkweekinzetstukken zijn ondergedompeld. Laat de plaat in de biologische veiligheidskast of plaats hem terug in de couveuse totdat deze nodig is.
  6. Verwijder de 24-well plaat van volwassen (organoïden op dag 3-5 van de groei) darm colonoïden uit de 37 ° C, 5% CO2 incubator, en plaats het onder de biologische veiligheidskast. Verwijder het medium met steriele tips en was elk goed met 1 ml RT steriele DPBS (zonder Ca 2+ of Mg2+).
    OPMERKING: Een individuele put van 75-125 volwassen colonoïden wordt gesplitst in een verhouding van 1: 4.
  7. Verwijder de DPBS zonder Ca 2+ of Mg2+ met behulp van steriele tips en verteer elke plug van de keldermembraanmatrix door 500 μL RT enzymatisch dissociatiereagens in elk te passeren put te plaatsen.
  8. Pipetteer elk putje ongeveer 6-10 keer op en neer om de plug te breken. Kras niet op de onderkant van de plaat om de plug te verwijderen. Draai in plaats daarvan de 24-putplaat in een hoek van 45°, plaats de punt van de pipet aan de rand van de plug en maak deze voorzichtig los.
  9. Plaats de 24-well plaat terug in een steriele 37°C, 5% CO2 incubator gedurende 3-4 min.
  10. Verwijder de plaat en pipetteer het enzymatische dissociatiereagens vijf tot zeven keer op en neer voor elke put onder een biologische veiligheidskast. Breng de gedissocieerde colonoïden van elke put over in een steriele, 15 ml conische buis. Breng tot een volume van 10 ml met ijskoud wasmedium voor muizen.
  11. Centrifugeer de gedeeltelijk verteerde colonoïden bij 300 x g bij 4°C gedurende 5 minuten in een draaiende emmercentrifuge.
  12. Verwijder onder de biologische veiligheidskast het supernatant uit de pellet met behulp van een pipet van 10 ml. Verwijder het resterende medium met een P200-pipet. Resuspendie van de colonoïde pellet in murine monolayer medium. Voeg 75 μL medium toe per celkweekinzet van gefragmenteerde colonoïden die moeten worden verguld.
  13. Voeg 75 μL colonoïde suspensie toe aan het midden van elke celkweekinzet. Voordat u de colonoïde suspensie aan elke put toevoegt, pipet u voorzichtig een of twee keer op en neer voordat u de 75 μL verwijdert, wat een meer uniforme beplating mogelijk maakt.
  14. Plaats de 24-putplaat met celkweekinzetstukken gedurende 10 minuten op een roterend platform om een uniforme verspreiding over de celkweekinzet mogelijk te maken.
  15. Plaats de plaat in een steriele 37°C, 5% CO2 incubator.
  16. Maak de volgende dag (dag 1) de onaangetaste colonoïdefragmenten los door het medium drie tot vijf keer op en neer te pipetteren met een P200-pipet. Plaats de punt voorzichtig langs de binnenkant van de celkweekinzet om de aangehechte darmcellen niet te verstoren. Breng geen bubbels in het medium, omdat dit voorkomt dat alle niet-vastgemaakte fragmenten worden verwijderd.
  17. Verwijder onmiddellijk het medium en het colonoïdemengsel. Herhaal dit totdat alle celkweekinzetstukken zijn schoongemaakt.
  18. Voeg voorzichtig 150 μL voorverwarmd murine monolayer medium toe aan de apicale zijde van elke celkweekinzet. Voeg 400 μL verwarmd murine monolayer medium toe aan elke put van een nieuwe 24-well plaat. Breng de celkweekinzet over op de nieuwe plaat door de pin vast te pakken met een steriele tang. Verander het medium om de dag tot samenvloeiing.
    OPMERKING: De colonoïde fragmenten moeten 3-5 dagen na het plateren een confluente monolaag vormen.

7. Het meten van de netto weerstand van de epitheliale monolagen met behulp van een voltohmmeter op dag 3 - 5 van monolaagcultuur

OPMERKING: De eetstokelektroden lijken op een tang en zijn asymmetrisch van lengte. De langere arm van de sonde is de basolaterale elektrode en de kortere arm is de apicale elektrode. De sonde kan moeilijk in te brengen zijn tussen de binnen- en buitenkant van de celkweekinzet. Door de sonde bij het inbrengen onder een lichte hoek te plaatsen, gevolgd door het verticaal rechttrekken van de sonde, voorkomt u dat de sonde vast komt te zitten. Zorg ervoor dat u de nettoweerstand van elke celkweekinzet onder een vergelijkbare hoek leest, omdat dit de waarden kan beïnvloeden.

  1. Plaats de voltohmmeter en alle reagentia in een biologische veiligheidskast.
    1. Sluit de voltohmmeter aan op het dichtstbijzijnde stopcontact en sluit de plastic modulaire connector van de elektrodesonde aan op de INPUT-aansluiting op het display aan de voorzijde.
    2. Om de voltohmmeter in een hoek van 45° te plaatsen, zwaait u de metalen arm aan de achterkant van de apparatuur naar buiten totdat deze op zijn plaats vergrendelt.
    3. Schakel nu de voltohmmeter in door de aan / uit-schakelaar UP op het display aan de voorkant om te draaien. Draai ten slotte de schakelaar omhoog naar OHMS om de meting in deze statistiek weer te geven.
  2. Verwijder de 24-well plaat van de 37°C, 5% CO2 incubator, en leg de plaat plat in de biologische veiligheidskast. De transepitheliale elektrische weerstand (TEER) is temperatuurgevoelig. Verwijder de plaat alleen vlak voordat de TEER wordt gelezen.
  3. Steriliseer de elektrodesonde in voorverwarmde 70% ethanol gedurende 30 s tot 1 min. Verwijder de sonde, keer deze om en veeg er een tot twee keer mee om de overtollige ethanol te verwijderen. Laat de sonde ongeveer 30 s aan de lucht drogen.
  4. Was de resterende ethanol die op de sonde achterblijft met voorverwarmd wasmedium voor muizen.
    LET OP: Laat geen van de resterende ethanoldruppels hoger op de sonde in de celkweekinzet vallen. Laat bij het afwassen van de ethanol met medium het medium niet boven het steriele ethanolveld komen. Dit kan ertoe leiden dat besmet medium de celkweekinzet binnendringt.
  5. Houd de sonde loodrecht op de celkweekinzet. Plaats de basolaterale elektrode (langer uiteinde van de sonde) aan de buitenkant van de celkweekinzet totdat deze de basis van de 24-putplaat raakt. Schuif de apicale elektrode (korter uiteinde van de sonde) in de celkweekinzet. Varieer de afstand van de twee elektroden niet van goed tot put. Dit heeft invloed op de TEER-meting.
  6. Controleer of de apicale elektrode de basis van de celkweekinzet niet raakt voordat u de TEER leest. Begin met de invoeging van de achtergrondbesturingscelcultuur en noteer de waarde. De waarde wordt automatisch digitaal weergegeven op de voorkant van de voltohmmeter.
  7. Herhaal stap 7.5-7.6 voor elke celkweekinzet.
    OPMERKING: Als er verschillende experimentele omstandigheden bestaan tussen de celkweekinzetstukken, steriliseer de sonde dan tussen elke nieuwe toestand. Begin bij stap 7.1 en doorloop de stappen numeriek.
  8. Plaats de 24-putplaat terug in de incubator zodra alle TEER-metingen zijn geregistreerd.
  9. De nettowaarden bij 350 Ω of meer zijn indicatief voor monolaagvorming. Herhaal dit nogmaals op de volgende dagen totdat monolaagvorming is bereikt.
    OPMERKING: Over het algemeen kunnen waarden van 1.000 Ω of meer worden vastgelegd op dag 3, maar na verloop van tijd zullen ze allemaal convergeren naar een lager getal rond 350 Ω.

8. Berekening van de TEER met behulp van netto weerstandsmetingen van de voltohmmeter

OPMERKING: Succesvolle monolaagvorming van de colonoïden geeft TEER-metingen groter dan 115 Ω ·cm2.

  1. Neem individuele netto weerstandswaarden en trek de netto weerstand goed af van de achtergrond. De celkweekinzetstukken bedekt met het keldermatrixmembraan geven een netto aflezing van ongeveer 100 Ω.
  2. Neem de nettoweerstandsmetingen met achtergrondaftrek en vermenigvuldig deze met het oppervlak van de celkweekinzet. Een 24-well celkweekinzetstuk heeft een oppervlakte van 0,33 cm2.
  3. Als de waarden 115 Ω cm2 of hoger zijn, ga dan verder met de downstream experimentele assays.

9. Het induceren van ontsteking in de epitheliale monolagen met ontstekingsmediatoren

  1. Zodra succesvolle monolagen zich hebben gevormd, voegt u ontstekingsmediatoren toe aan de cultuur aan de basale kant van de cultuur. Bereid het monolaagmedium van de ontstekingsmediator voor, zoals beschreven in stap 1.9, en voeg 400 μL toe aan elke put in een nieuwe plaat met 24 putten.
  2. Verwijder het medium van de apicale zijde van de celkweekinzet en voeg 150 μL van het muriene monolaagmedium zonder Y-27632 toe. Vul deze kant niet aan met ontstekingsmediatoren. Als de celdood echter buitensporig lijkt, laat de Y-27632 dan in de media. Dit moet door de eindgebruiker worden bepaald.
  3. Breng de celkweekinzetstukken over op een nieuwe 24-putplaat en plaats ze in de putjes aangevuld met het monolaagse medium van de ontstekingsmediator.
  4. Stimuleer de monolagen met ontstekingsmediatoren gedurende 24-72 uur, afhankelijk van het experiment.
  5. Om geneesmiddelreacties te testen met behulp van dit ontstekingsmodel, vult u het monolaagmedium aan de apicale kant van de celcultuurinzet aan met het medicijn van keuze. Het medicijn kan op elk moment in het experiment worden toegevoegd, afhankelijk van het werkingsmechanisme van het medicijn en de stroomafwaartse parameters die moeten worden beoordeeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het 3D-darmcolonoïdcultuursysteem is een waardevol hulpmiddel om de intrinsieke bijdrage van het epitheel aan de intestinale mucosale homeostase te bestuderen. Het beschreven protocol biedt gedetailleerde instructies voor het isoleren van crypten van C57BL / 6J (WT) muizen op een leeftijd van 8 weken en het opzetten van een langdurig colonoïde cultuursysteem dat kan worden gemanipuleerd voor meerdere downstream-toepassingen. Bij de isolatie en beplating van crypten in de keldermembraanmatrix lijken de crypten dicht en meercellig van structuur wanneer ze worden gevisualiseerd door helderveldmicroscopie. Ze kunnen bolvormig of langwerpig en cilindrisch zijn, vergelijkbaar met de enkele, crypte-achtige structuur die normaal wordt waargenomen binnen de in vivo darmarchitectuur (figuur 1A). Op dag 1 vormen de meeste crypten een compacte, bolvormige structuur, met een paar colonoïden die een inwendig lumen (lege ruimte) beginnen te ontwikkelen zonder epitheelcellen (figuur 1B). Naarmate ze de komende dagen blijven groeien, blijven de diameters van de colonoïden toenemen en worden de lumen van de colonoïden meer gedefinieerd (figuur 1C). Op dag 5 heeft elke colonoïde een diameter van ongeveer 100-250 μm en vormt een groot, prominent lumen omgeven door een dunne laag epitheelstamcellen (figuur 1D). Op dit punt zijn de colonoïden zowel enzymatisch als mechanisch verstoord voor passaging. Na twee passages kunnen ze worden gebruikt voor downstream-experimenten.

Om te beoordelen of de metabole veranderingen waargenomen in de colonschraapsels van met DSS behandelde muizen worden vastgehouden in colonoïden afgeleid van muizen met hetzelfde DSS-regime, werden 8 weken oude WT-muizen behandeld met 2% DSS in drinkwater ad libitum. Leeftijdsgematchte en geslachtsgematchte WT-controledieren kregen ad libitum drinkwater zonder DSS. Na 7 dagen werden de muizen geofferd en werden crypten geïsoleerd uit de colons van zowel de controledieren (n = 3, mannelijk) als DSS-behandelde dieren (n = 3, mannelijk) om colonoïden te vestigen. Na twee passages werd eiwit geïsoleerd uit elke set colonoïden en werd de expressie van peroxisoom proliferator-activator receptor-gamma coactivator-1α (PGC1α), het hoofdregulatoreiwit van mitochondriale biogenese, beoordeeld via western blot-analyse (aanvullende figuur 1). Er was geen significant verschil in PGC1α-expressie bij het vergelijken van de colonoïden vastgesteld uit de met DSS behandelde muizen versus de colonoïden vastgesteld uit de controlemuizen, wat suggereert dat deze colonoïde cultuurmethodologie niet op de juiste manier de in vivo metabole veranderingen weerspiegelt die worden waargenomen bij muizen15.

Het falen van PGC1α om mitochondriale biogenese te initiëren tijdens een intestinale inflammatoire belediging is voornamelijk gelokaliseerd in het gedifferentieerde colonepitheel15,19. Om de veranderingen die in vivo werden waargenomen te weerspiegelen, besloten we de colonoïden naar een meer gedifferentieerde toestand te leiden. Om deze verschuiving te induceren, werden de colonoïden aanvankelijk geïncubeerd met traditioneel colonoïde medium. Na 24 uur tot 48 uur werden de colonoïden nog eens 48 uur overgeschakeld op differentiatiemedium. Tijdens differentiatie ging een klein percentage colonoïden over van een bolvormige architectuur naar budded structuren verrijkt met bokaalcellen en colonocyten17 (figuur 2A, B). De colonoïden gekweekt in WRN-aangevuld medium werden verrijkt met snel delende Lgr5+ stamcellen. Om te bevestigen dat zowel de Lgr5+ stamcellen als andere prolifererende cellen de celcyclus verlieten tijdens differentiatie, werden de mRNA-niveaus geanalyseerd via qPCR. Significante downregulatie in zowel Lgr5 (97%, p = 0,0023) als Ki67 (75%, p = 0,0007) niveaus werd waargenomen in de gedifferentieerde colonoïden (n = 6) in vergelijking met de colonoïden gekweekt in een traditionele cultuuromgeving (n = 6; Aanvullende figuur 2A,B). Men zou ook verwachten dat de gedifferentieerde colonoïden voornamelijk bestaan uit slijmafscheidende bokaalcellen. Bovendien was MUC2 in feite bijna tweevoudig geupreguleerd in de gedifferentieerde colonoïden in vergelijking met hun traditioneel gekweekte tegenhangers (n = 3, p = 0,0433, aanvullende figuur 3). Wanneer ze samen worden genomen, suggereren deze gegevens dat de colonoïden met succes werden gedifferentieerd en klaar waren voor downstream-experimenten. Vervolgens werden ontstekingsmediatoren toegevoegd aan het differentiatiemedium, zoals beschreven in rubriek 5 van het protocol. Eiwit en RNA werden verzameld tot 72 uur na de introductie van de ontstekingsmediatoren voor analyse. Na 72 uur werd echter af en toe een verhoogde celdood waargenomen.

Om te beoordelen of de introductie van ontstekingsmediatoren in gedifferentieerde colonoïden het falen van de mitochondriale biogenese kon nabootsen dat werd waargenomen bij zowel menselijke IBD als een acuut model van murine colitis, werd de eiwitexpressie van PGC1α en transcriptiefactor A, mitochondriën (TFAM) beoordeeld via western blot-analyse in gedifferentieerde colonoïden (n = 5) behandeld met ontstekingsmediatoren gedurende 72 uur. PGC1α-expressie is aangetoond dat deze is afgenomen in muizenmodellen van colitis, evenals bij menselijke IBD15. TFAM, een eiwit dat zowel de transcriptie als de replicatie van het mitochondriale genoom aandrijft, is ook verminderd in muizenmodellen van colitis en de genexpressie ervan is verminderd bij menselijke IBD15,20. We zagen een vergelijkbare downregulatie in zowel PGC1α (50,4 %, p = 0,0442) als TFAM (88,9%, p = 0,004) expressie in de gedifferentieerde colonoïden na 72 uur blootstelling aan deze ontstekingsmediatoren (figuur 3). Gezamenlijk suggereert dit dat de behandeling van gedifferentieerde colonoïden met cytokines een ideaal model is om mitochondriale dynamica in vitro te bestuderen.

Hoewel verschillende cellulaire en moleculaire functies kunnen worden onderzocht in 3D-colonoïde cultuuromgevingen, zijn 2D-monolaagcultuursystemen superieur bij het beoordelen van de barrièrefunctie, gastheer-pathogeeninteracties en de impact van oraal geabsorbeerde therapieën op ontsteking21,22. De vorming van een continue laag van confluente cellen met een intacte barrière maakt het mogelijk om verschillende biologische of chemische agentia gemakkelijk op de apicale en / of basale kant van de cellen te plaatsen. Dit protocol maakt het mogelijk om 2D-monolaagculturen vast te stellen uit reeds bestaande WT-colonoïden die twee keer zijn gepasseerd. Colonoïden die enzymatisch en mechanisch zijn verstoord, worden geplateerd op celkweekinzetstukken bedekt met keldermembraanmatrix. Bij de eerste plating verschijnen de gefragmenteerde colonoïden in cellulaire clusters variërend van 15 tot 150 cellen (figuur 4A). Op dag 3 zijn de cellen begonnen af te vlakken en langzaam de celkweekinzet te bedekken, waarbij ze over het algemeen confluentie bereiken (figuur 4B). In de komende dagen blijven monolagen groeien en vormen ze een continue barrière die kwantitatief kan worden gemeten met TEER (figuur 4C, D). Interessant is dat de TEER-metingen fluctueren van dag 3 tot dag 5. De monolagen hebben eerder hogere waarden met een breed bereik (200-800 Ω ·cm 2), maar deze waarden convergeren langzaam naar een lager getal op dag 5 (115-150 Ω cm2, figuur 5A). Wanneer de monolagen een steady state bereiken, kunnen ze worden gebruikt voor downstream-experimenten.

Om de epitheliale respons van van colonoïden afgeleide monolagen op ontsteking te karakteriseren, werden ontstekingsmediatoren gedurende 48 uur aan de basale zijde (de buitenkant van de insert) van de cellen geplaatst. Het RNA werd geëxtraheerd en de mRNA-niveaus van verschillende stam- en celdifferentiatiemarkers, evenals junctionele eiwitten, werden geanalyseerd via qPCR. Lgr5 werd in geen van beide omstandigheden gedetecteerd, maar een andere stamcelmarker, mTERT, was met bijna 60% verminderd in de ontstoken monolagen in vergelijking met de onbehandelde controle (aanvullende figuur 4A). Vervolgens analyseerden we de expressie van twee markers van gedifferentieerde celtypen, Muc2 en Alkalische fosfatase (Alpi). Beide mRNA-transcripten waren lager in de ontstoken monolagen in vergelijking met de controlecellen (aanvullende figuur 4A). Zowel stam- als post-mitotische cellen zijn gewoonlijk verminderd tijdens darmontsteking23,24,25, en een vergelijkbare respons werd waargenomen in het monolaagmodel dat in deze studie werd verkregen.

Een voordeel van het monolayer-systeem is de mogelijkheid om de barrièrerespons te beoordelen. Om te bepalen of de barrière in de immuungestimuleerde toestand was aangetast, hebben we de TEER-waarden na 48 uur gemeten. De TEER-waarden voor de controlemonolagen (n = 2) bedroegen gemiddeld 129,16 Ω cm 2, maar daalden aanzienlijk (p = 0,0087) tot een gemiddelde van 98,54 Ω cm2 in de ontstoken monolagen (figuur 5B). Om verder te bevestigen dat de barrière was aangetast in de ontstekingstoestand, beoordeelden we de mRNA-niveaus voor drie verschillende tight junction-markers, Zo-1, Occludin en Claudin. Alle drie de markers hadden lagere niveaus in de ontstoken toestand in vergelijking met hun niet-ontstoken tegenhangers (aanvullende figuur 4B). Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat barrièredisfunctie aanwezig is in de ontstoken monolagen en de barrièredisfunctie nabootst die wordt waargenomen tijdens IBD-pathogenese.

Figure 1
Figuur 1: Initiële isolatie van muizencrypten voor de oprichting van langdurige colonoïdecultuur. (A) Op dag 0 werden 300-500 crypten geplateerd in keldermembraanmatrix (foto verkregen 5 uur na plating), en de groei van de colonoïden werd vastgelegd op (B) Dag 1, (C) Dag 3 en (D) Dag 5. Op dag 5 waren de colonoïden klaar om gepasseerd te worden. Vergroting = 10x; schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Vestiging van terminaal gedifferentieerde colonoïden van de traditionele colonoïdecultuur. Differentiatiemedium werd 48 h na het passeren van de muriene colonoïden op de colonoïden geplaatst. Na (A) 24 h en (B) 48 h worden de colonoïden verrijkt met terminaal gedifferentieerde cellen. Vergroting = 10x; schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: PGC1α en TFAM eiwitexpressie in murine gedifferentieerde colonoïden behandeld met ontstekingsmediatoren. Medium aangevuld met ontstekingsmediatoren werd op de gedifferentieerde colonoïden geplaatst en eiwit werd 0 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur na blootstelling verzameld. (A) De eiwitexpressie van PGC1α vertoonde een algehele significante afname (p = 0,0442) gedurende 72 uur. TFAM was significant gedownreguleerd (p = 0,004) na blootstelling aan ontstekingsmediatoren na 72 uur, en (B) er was een neerwaartse trend in eiwitexpressie na 24 uur, 48 uur en 72 uur na analyse door ANOVA. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking. *p < 0,05, **p < 0,005. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Vestiging en groei van monolagen uit reeds bestaande colonoïden. Colonoïden die enzymatisch en mechanisch waren verstoord, werden geplateerd op celkweekinzetstukken bedekt met een keldermembraanmatrix. Bij de eerste beplating verschenen de gefragmenteerde colonoïden in (A) cellulaire clusters en tegen (B) Dag 3 begonnen ze af te vlakken en langzaam de celkweekinzet te bedekken. (C) Op dag 5 en (D) dag 7 bleven de monolagen groeien tot een continue barrière die kwantitatief kon worden gemeten met TEER. Vergroting = 10x; schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: TEER-waarden voor het vaststellen van van colonoïden afgeleide monolagen en ontstoken monolagen. (A) De TEER-waarden werden gemeten met behulp van een voltohmmeter van dag 3 tot dag 5. De monolagen hadden eerder hogere waarden met een breed bereik, maar convergeerden langzaam naar een lager aantal op dag 5. Zodra de monolagen een steady state bereiken, kunnen ze worden gebruikt voor downstream-experimenten. (B) De TEER-waarden waren lager in de ontstoken monolagen (n = 2) in vergelijking met de niet-ontstoken bedieningselementen (n = 2). De controlemonolagen hadden een gemiddelde TEER van 129,16 ohm·cm 2 en de TEER van de ontstoken monolagen was significant lager (p = 0,0087), met een gemiddelde van 98,54 Ω·cm2, wanneer geanalyseerd met behulp van een t-test. **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstellingstabel van de oplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: PGC1α-eiwitexpressie in muizencolonoïden gekweekt in traditioneel colonoïde medium geïsoleerd uit WT-controles en 2% DSS-behandelde muizen. De colonoïden waren afgeleid van zowel 8 weken oude WT-controlemuizen als 2% DSS-behandelde muizen na 7 dagen. Eiwit werd geïsoleerd uit colonoïden die tweemaal en op dag 4 na plating werden gepasseerd. Er was geen verschil in PGC1α-eiwitexpressie (p = 0,9996) in de colonoïden afgeleid van de controlemuizen in vergelijking met de muizen die gedurende 7 dagen werden blootgesteld aan 2% DSS bij analyse door een ongepaarde t-test. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Verminderde Lgr5- en Ki67-mRNA-expressie in gedifferentieerde colonoïden. Murine colonoïden die 48 uur eerder waren gepasseerd, werden gedurende 48 uur blootgesteld aan differentiatiemedium voordat de RNA- en cDNA-synthese werd geïsoleerd. De mRNA-niveaus werden bepaald via qPCR en geanalyseerd met de vergelijkende CT-methode. (A) Lgr5 en (B) Ki67 waren significant afgenomen in de gedifferentieerde colonoïden bij statistische analyse met behulp van een t-test (p = 0,0023, p = 0,0007). Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking.**p < 0,005. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Verhoogde mucine-afscheidende bokaalcellen in gedifferentieerde muriene colonoïden. Murine colonoïden die 48 h eerder waren gepasseerd, werden gedurende 48 uur blootgesteld aan differentiatiemedium. De cellen werden gelyseerd in RIPA-buffer en eiwit werd gevisualiseerd door western blot-analyse. (A) MUC2-expressie was verhoogd in elke set gedifferentieerde colonoïden in vergelijking met de ongedifferentieerde colonoïden. (B) Een bijna tweevoudige verandering in MUC2-eiwit werd waargenomen in de differentiërende omstandigheden, die significant was bij analyse met behulp van een t-test (p = 0,0433). Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking. *p < 0,05. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Verminderde expressie van stengel- en differentiatiemarkers, evenals strakke junctionele markers, in monolagen behandeld met ontstekingsmediatoren. Murine colonoïde-afgeleide monolagen (dag 5) werden gedurende 48 uur blootgesteld aan ontstekingsmediatoren, RNA werd vervolgens verzameld en cDNA werd gesynthetiseerd (n = 2). De mRNA-niveaus van stam, differentiatie en junctionele markers werden bepaald via qPCR en geanalyseerd met de vergelijkende CT-methode. (A) De stamcelmarker, Lgr5, werd in geen van beide omstandigheden gedetecteerd, maar mTERT was aanzienlijk verminderd bij ontstekingsaandoeningen. De bokaalcelmarker, Muc2, en de colonocytenmarker, Alpi, waren beide afgenomen in de ontstoken monolagen in vergelijking met de onbehandelde monolagen. (B) De tight junction markers, Zo-1, Occludin en Claudin, waren allemaal lager in inflammatoir behandelde monolagen in vergelijking met de controle. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Lijst van primers. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ontwikkeling van organoïden heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop de wetenschappelijke gemeenschap orgaansystemen in vitro bestudeert met het vermogen om de cellulaire structuur en functie van een dier of mens gedeeltelijk in een schaal samen te vatten. Verder bieden organoïde systemen afgeleid van mensen met ziekten een veelbelovend hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde die therapeutische besluitvorming zou kunnen begeleiden. Hier beschrijven we een crypte-isolatieprotocol dat goed werkt en belangrijke stappen introduceert die het mogelijk maken om overtollig vuil in de isolatie op te ruimen voordat het wordt platgelegd. Bovendien leggen we een belangrijk detail uit dat vaak over het hoofd wordt gezien in het proces- de mogelijkheid om de crypten nauwkeurig te tellen voor plating. Zodra de colonoïden zijn vastgesteld, schetsen we belangrijke manipulaties die hun cellulaire differentiatie of monolaagvorming mogelijk maken, wat het vermogen om veranderingen in het darmepitheel tijdens IBD te bestuderen zou kunnen verbeteren.

De crypte-villusas in het colonepitheel bij zoogdieren is een complexe structuur die bestaat uit verschillende celtypen met verschillende functies. Het onderhoud van deze as hangt af van zowel intrinsieke als extrinsieke cellulaire factoren, die samen helpen bij het handhaven van epitheliale homeostase18. We hebben opgemerkt dat murine colonoïden gekweekt in traditioneel medium voornamelijk stamcellen weerspiegelen in tegenstelling tot de conglomeratie van zowel stamcellen als terminaal gedifferentieerde cellen die in vivo wordt gezien. Bovendien zijn murine colonoïden die op deze manier worden gekweekt en onderhouden cirkelvormige structuren in tegenstelling tot platte monolagen. Deze verschillen hebben potentiële implicaties voor onze pogingen om darmziekten in vitro te bestuderen. In het bijzonder zijn we beperkt in ons vermogen om organoïden te gebruiken om veranderingen in de barrièrefunctie te bestuderen, evenals de effecten van ontsteking op terminaal gedifferentieerde darmepitheelcellen.

Hier beschrijven we protocollen voor niet alleen de isolatie van muizencrypten om colonoïden te laten groeien, maar ook voor de manipulatie van deze colonoïden om intestinale epitheliale fysiologie en de epitheliale reactie op ontsteking te bestuderen. Een van de vele extrinsieke factoren die de gradiënt van pluripotente stamcellen en terminaal gedifferentieerde cellen bevorderen, is de Wnt canonieke route, die rijk is aan crypten en de gezondheid van stamcellen bevordert. Wnt-signalering neemt af aan de punt van de crypte-as, samenvallend met de evolutie van stamcellen tot terminaal gedifferentieerde cellen26. We hebben een protocol beschreven dat de terminale differentiatie van colonoïde cellen mogelijk maakt. Net als anderen differentiëren we door Wnt uit het groeimedium te verwijderen, maar we gebruiken een lagere concentratie R-spondin (500 ng / ml versus 1 μg / ml R-spondin)17. Verrassend genoeg heeft een vermindering van 50% in R-spondin geen invloed op de succesvolle differentiatie van de organoïden. Het vermogen om te differentiëren met een lagere concentratie helpt bij het opzetten van een minder kunstmatig systeem dat meer lijkt op de fysiologische omgeving in vivo. Hoewel dit protocol resulteert in eindige terminale differentiatie (aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3) en een onvermogen om cellulaire onsterfelijkheid te behouden, is het niettemin een nuttige methode voor een beter begrip van de fysiologische bijdrage van het terminaal gedifferentieerde epitheel, inclusief colonocyten, entero-endocriene cellen en bokaalcellen, aan IBD en andere ziektetoestanden. Bovendien tonen we aan dat het aanvullen van specifieke cytokines in dit medium, die traditioneel verhoogd zijn bij patiënten met IBD, het gedifferentieerde organoïde systeem naar een ontstekingstoestand leidt. In de loop van 72 uur weerspiegelen gedifferentieerde colonoïden behandeld met inflammatoire cytokines beter enkele van de metabole bevindingen die worden getoond in andere gevestigde modellen van colitis en menselijke IBD (figuur 3). Bovendien zijn gedifferentieerde colonoïden die op deze manier worden behandeld waarschijnlijk meer een weerspiegeling van de effecten van ontsteking op cellulaire homeostase op het gedifferentieerde epitheel. We hebben ook een protocol opgesteld voor het ontwikkelen van monolagen, dat de vorming van zowel een apicale als een basale kant van het epitheel mogelijk maakt, waardoor een analyse van de barrièrefunctie in vivo mogelijk is. Dit systeem is nuttig bij het bestuderen van mechanismen van barrièredisfunctie zonder de noodzaak van differentiatie en het cultiveren van nieuwe therapeutische doelen voor behandeling.

Verschillende beperkingen en potentiële valkuilen met betrekking tot de hierboven beschreven protocollen moeten worden opgemerkt. De succesvolle isolatie van crypten en de ontwikkeling van colonoïden kan worden beperkt door de crypteopbrengst van elk dier, de nauwkeurigheid van het tellen van de crypten en de netheid van de voorbereiding. De snelheid van het tellen van de geïsoleerde crypten na resuspensie, variaties in de mechanische dissociatie van de crypten van de onderliggende muscularis, en het aantal wasbeurten en centrifugale spins dragen bij aan een succesvolle colonoïdecultuur. Bovendien is het van cruciaal belang om de organoïden niet volledig te dissociëren in afzonderlijke cellen tijdens het passeren of plating voor 2D-monolaagcultuur. Clusters van 30 tot 50 cellen zijn ideaal om de cultuur te laten voortplanten voor langdurige kweek. De bovenstaande protocollen vermelden gebieden met mogelijke valkuilen en optionele aanvullende stappen om deze problemen op te lossen. Uiteindelijk kan het protocol optimalisatie vereisen door het individu dat de isolatie uitvoert vanwege inherente variabiliteit in vaardigheden en manoeuvres (d.w.z. schudden), evenals variatie in elk dier. Aanvullende optimalisatie kan nodig zijn door de eindgebruiker om de genetische en moleculaire diversiteit in IBD vast te leggen.

Uiteindelijk, terwijl het colonoïdesysteem een zeer nuttig hulpmiddel is voor het samenvatten van belangrijke aspecten van de menselijke fysiologie en ziekte in vivo, is dit systeem uiteindelijk beperkt in zijn vermogen om alle aspecten van menselijke ziekten te bestuderen. Traditionele methoden voor de ontwikkeling van colonoïden hebben belangrijke aspecten van stamceldynamiek opgehelderd; Deze bevindingen weerspiegelen echter vaak niet adequaat de bevindingen in terminaal gedifferentieerde cellen in het gastheerepitheel. De strategieën die in deze studie worden beschreven, bieden onderzoekers een relatief snel, goedkoop model voor organoïde manipulatie dat, wanneer het op de juiste manier wordt gebruikt, licht kan werpen op belangrijke aspecten van de intestinale epitheelstructuur en -functie tijdens ontstekingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De bijdragende auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01DK120986 (aan K.P.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

Tags

Biologie Nummer 196
Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking <em>in vitro</em> op gevestigde murine colonoïden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, … More

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter