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Biology

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64804
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 2,3
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Describimos un protocolo que detalla el aislamiento de criptas colónicas murinas para el desarrollo de colonoides tridimensionales. Los colonoides establecidos se pueden diferenciar terminalmente para reflejar la composición celular del epitelio del huésped antes de recibir un desafío inflamatorio o ser dirigidos a establecer una monocapa epitelial.

Abstract

El epitelio intestinal juega un papel esencial en la salud humana, proporcionando una barrera entre el huésped y el medio externo. Esta capa celular altamente dinámica proporciona la primera línea de defensa entre las poblaciones microbianas e inmunitarias y ayuda a modular la respuesta inmunitaria intestinal. La alteración de la barrera epitelial es una característica distintiva de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y es de interés para la orientación terapéutica. El sistema de cultivo de colonoides tridimensionales es un modelo in vitro extremadamente útil para estudiar la dinámica de las células madre intestinales y la fisiología de las células epiteliales en la patogénesis de la EII. Idealmente, el establecimiento de colonoides a partir del tejido epitelial inflamado de los animales sería más beneficioso para evaluar las influencias genéticas y moleculares en la enfermedad. Sin embargo, hemos demostrado que los cambios epiteliales in vivo no se retienen necesariamente en colonoides establecidos a partir de ratones con inflamación aguda. Para abordar esta limitación, hemos desarrollado un protocolo para tratar los colonoides con un cóctel de mediadores inflamatorios que suelen estar elevados durante la EII. Si bien este sistema se puede aplicar de forma ubicua a diversas condiciones de cultivo, este protocolo enfatiza el tratamiento tanto en colonoides diferenciados como en monocapas bidimensionales derivadas de colonoides establecidos. En un entorno de cultivo tradicional, los colonoides se enriquecen con células madre intestinales, lo que proporciona un entorno ideal para estudiar el nicho de las células madre. Sin embargo, este sistema no permite un análisis de las características de la fisiología intestinal, como la función barrera. Además, los colonoides tradicionales no ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta celular de las células epiteliales terminalmente diferenciadas a los estímulos proinflamatorios. Los métodos aquí presentados proporcionan un marco experimental alternativo para abordar estas limitaciones. El sistema de cultivo monocapa bidimensional también ofrece una oportunidad para el cribado terapéutico de fármacos ex vivo. Esta capa polarizada de células puede ser tratada con mediadores inflamatorios en el lado basal de la célula y concomitantemente con terapias putativas por vía apical para determinar su utilidad en el tratamiento de la EII.

Introduction

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica, remitente y recurrente caracterizada por episodios de inflamación y quiescencia clínica. La etiología de la EII es multifactorial, pero los rasgos característicos clave de la enfermedad incluyen una función de barrera defectuosa y un aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal, además de cascadas de señalización proinflamatoria activadas dentro del compartimento epitelial 1,2. Se han utilizado varios modelos in vitro e in vivo para recapitular la respuesta epitelial durante la EII, incluyendo cultivos celulares y modelos murinos de inflamación3. Sin embargo, todos estos sistemas tienen importantes deficiencias que limitan su capacidad para recapitular los cambios epiteliales durante la EII4. La mayoría de las líneas celulares utilizadas para estudiar la EII están transformadas, tienen la capacidad de formar una monocapa y pueden diferenciarse3 pero propagarse intrínsecamente de manera diferente a las células epiteliales intestinales no transformadas en el huésped. Para estudiar la EII se utilizan varios modelos murinos diferentes de inflamación, algunos de los cuales incluyen modelos knockout, modelos infecciosos, modelos inflamatorios químicos y modelos de transferencia de células T 5,6,7,8. Si bien cada uno puede estudiar ciertos aspectos etiológicos de la EII, como las predisposiciones genéticas, la disfunción de barrera, la desregulación inmunitaria y el microbioma, su capacidad para estudiar la naturaleza multifactorial de la enfermedad está limitada.

Los organoides intestinales, incluidos los enteroides y los colonoides, se han establecido en la última década como un modelo in vitro útil para estudiar no solo la dinámica de las células madre intestinales, sino también su papel que desempeñan la integridad de la barrera y la función del epitelio intestinal en la homeostasis y la enfermedad intestinales. Estas entidades han contribuido significativamente a nuestra comprensión de la patogénesis de la EII9 y han abierto nuevas oportunidades para la medicina personalizada. Los colonoides, o cultivos de tejido autoorganizados derivados de células madre del colon, se han desarrollado a partir de tejido murino y humano en un proceso que permite que las células madre ubicadas dentro de las criptas intestinales se propaguen y se mantenganindefinidamente. El nicho de las células madre in vivo se basa en factores extracelulares para apoyar su crecimiento, en particular la señalización canónica Wnt y las vías de señalización de proteínas morfogénicas óseas11. La adición de estos factores promueve la salud y la longevidad de los colonoides, pero también conduce el cultivo hacia un estado similar al de las células madre que no refleja la arquitectura celular epitelial in vivo, que consiste tanto en células que se renuevan a sí mismas como en células diferenciadas terminalmente12,13. Si bien la funcionalidad del epitelio intestinal depende de la interferencia continua entre el compartimento de las células madre y las células diferenciadas, la capacidad de tener ambos en un sistema de cultivo de colonoides es bastante limitada. A pesar de estas limitaciones, el sistema de cultivo de organoides sigue siendo el estándar de oro para estudiar las propiedades intrínsecas del epitelio ex vivo. No obstante, es posible que sea necesario considerar estrategias de cultura alternativas para responder a la pregunta científica en cuestión.

Se ha demostrado que los ratones en un régimen continuo de 7 días de sulfato de sodio de dextrano (DSS) desarrollan inflamación epitelial y disfunción de barrera14. Además, el fallo de la biogénesis mitocondrial y la reprogramación metabólica dentro del epitelio intestinal, que han demostrado ser evidentes en la EII humana, también se han capturado en este modelo DSS de colitis15. Sin embargo, nuestros datos preliminares demuestran que las características de la falla de la biogénesis mitocondrial no se conservan en los colonoides derivados de las criptas de los animales tratados con DSS (Figura suplementaria 1). Por lo tanto, se deben utilizar métodos de cultivo alternativos cuando se examina cómo la inflamación impulsa los cambios epiteliales durante la inflamación intestinal murina. Aquí, describimos un protocolo que hemos desarrollado que describe 1) cómo aislar criptas de tejido colónico completo para el establecimiento de colonoides murinos, 2) cómo diferenciar terminalmente esta población celular para reflejar la población celular tal como se encuentra in vivo, y 3) cómo inducir inflamación en este modelo in vitro . Para estudiar las interacciones farmacológicas dentro del epitelio inflamado, hemos desarrollado un protocolo para establecer monocapas bidimensionales (2D) a partir de colonoides murinos que pueden ser tratadas basalmente con mediadores inflamatorios y tratadas apicalmente con terapias farmacológicas.

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Protocol

Toda la experimentación con tejidos murinos descritos en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pittsburgh y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Investigación y Cuidado Animal de la Universidad de Pittsburgh y UPMC.

1. Preparación para la cultura

NOTA: Todos los reactivos se enumeran en la sección Tabla de materiales y todas las composiciones de la solución se pueden encontrar en la tabla de composición de la solución (Tabla 1).

  1. Prepare el medio de lavado del ratón como se describe en la Tabla 1. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
  2. Prepare el búfer de aislamiento de cripta 1 (CIB1) como se describe en la Tabla 1. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
    PRECAUCIÓN: El ditiotreitol (DTT) es considerado peligroso por el Estándar de Comunicación de Peligros de OSHA debido a la posible toxicidad aguda si se ingiere y al daño en la piel y los ojos si esas áreas están expuestas a él. Se deben usar guantes protectores, protección para los ojos y protección facial cuando se manipule este producto químico.
  3. Prepare el búfer de aislamiento de cripta 2 (CIB2) como se describe en la Tabla 1. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
  4. Preparar el medio acondicionado con L-WRN de acuerdo con un protocolo previamente publicado16.
  5. Prepare el medio colonoide completo como se describe en la Tabla 1. El medio de crecimiento colonoide completo se puede almacenar hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.
  6. Prepare el medio de diferenciación como se describe en la Tabla 1. Este protocolo fue modificado a partir de un artículo publicado anteriormente17. El medio de diferenciación puede almacenarse hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.
  7. Prepare el medio mediador de la inflamación como se describe en la Tabla 1. Este protocolo fue modificado a partir de un artículo publicado anteriormente18. El medio mediador de la inflamación puede almacenarse hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.
  8. Prepare el medio monocapa murino. Omita Y-27632 cuando desafíe las monocapas con factores inflamatorios y/o fármacos. El medio monocapa murino puede almacenarse hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.
  9. Prepare el medio mediador de inflamación monocapa. El medio monocapa mediador de la inflamación puede almacenarse hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.

2. Aislamiento de criptas del tejido colónico murino

NOTA: Transfiera el tejido sobre hielo. Retire la cantidad adecuada de matriz de membrana basal del almacenamiento de -20 °C y descongele con hielo. Cada 24 pocillos está recubierto con 15 μL de matriz de membrana basal. Prepare CIB1, CIB2 y el medio de crecimiento colonoide completo como se describe en la sección 1.

  1. Sacrificar a un ratón C57BL/6J (6-8 semanas de edad) de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, y extraer el extremo distal (aproximadamente 5-7 cm) del colon con pinzas y tijeras limpias.
    NOTA: En este estudio, los sujetos fueron sacrificados utilizando la incubación en cámara de dióxido de carbono durante 2-3 minutos seguida de una luxación cervical.
    1. Para ello, coloca al ratón boca arriba, haz una incisión horizontal justo debajo de la caja torácica y luego una incisión vertical desde la mitad de la incisión horizontal hacia la base de la cola para exponer la cavidad abdominal.
    2. Con unas pinzas, mueva el intestino delgado fuera del campo, identifique el colon y sígalo hasta la base de la cola. Rompe la pelvis con unas tijeras para exponer completamente el colon distal si es necesario. Utiliza las tijeras para cortar los 5-7 cm más distales del colon.
  2. Coloque el tejido del colon sobre una superficie limpia. Eliminar el exceso de grasa serosa que rodea el colon. Elimine la materia fecal enjuagando el contenido luminal del colon con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco usando una jeringa conectada a una aguja de 18 G 1 1/2. Luego, coloque el colon en un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de DPBS helado y colóquelo sobre hielo.
    NOTA: Si aísla el colon de más de un animal, coloque el tejido en hielo antes de continuar con el siguiente animal.
  3. Transfiera el tejido del colon a una placa de Petri con 10 ml de DPBS helado e irriga el lumen dos veces con DPBS con una pipeta P1,000.
  4. Abra el colon longitudinalmente con unas tijeras y agite suavemente con unas pinzas durante ~30 s en el DPBS para eliminar cualquier resto de contenido fecal.
  5. Transfiera el tejido a una nueva placa de Petri con 10 ml de DPBS helado y vuelva a agitar suavemente con unas pinzas antes de cortar el colon en trozos de 2 cm con unas tijeras y colocarlos en un tubo cónico de 50 ml con 7 ml de CIB1 helado. Incubar el tejido en CIB1 en hielo durante 20 min.
    NOTA: Los pasos restantes se realizan dentro de una cabina de seguridad biológica.
  6. Transfiera el tejido con pinzas a un tubo cónico precalentado de 50 ml que contenga 7 ml de CIB2 e incube en un baño de agua a 37 ° C durante 5 min.
  7. Retire el CIB2 del tubo cónico de 50 ml dejando que el tejido se asiente en el fondo del tubo cónico y luego pipeteando el CIB2. Luego, agregue 10 ml de medio de lavado de ratón helado al mismo tubo cónico.
  8. Obtenga un nuevo tubo cónico de 50 ml y coloque un filtro de 70 μm en la parte superior del tubo abierto.
  9. Mientras sostiene el tubo con el contenido del colon, gire la mano aproximadamente 45°. Agite el tubo de manera oscilante y vigorosa durante 45 s para liberar las criptas. A continuación, vierta la suspensión de la cripta a través del filtro de células de 70 μm en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
  10. Con unas pinzas, vuelva a colocar el tejido del colon en el tubo cónico vacío de 50 ml y agregue 10 ml de medio de lavado de ratón helado. Obtenga un nuevo filtro de células de 70 μm y colóquelo encima del tubo cónico de 50 ml que contiene la solución filtrada anterior.
  11. De nuevo, toma el tubo de 50 ml que contiene los fragmentos de la cripta y agítalo de la misma manera que en el paso 2.9. Filtrar el medio a través del filtro celular de 70 μm en el tubo cónico de 50 mL para combinarlo con las criptas previamente filtradas.
    NOTA: Si el rendimiento de la cripta es bajo, agite el tejido del colon una vez más colocando el tejido en un tubo cónico vacío de 50 ml con 10 ml de medio de lavado para ratones. Agite el pañuelo durante 45-50 segundos para liberar las criptas. Además, si el rendimiento de la cripta es bajo, aumente la vigorosidad de la agitación. Por último, si el rendimiento global de la cripta es bajo, tanto las pipetas como los tubos pueden recubrirse con suero fetal bovino (FBS) para evitar la adherencia del tejido al plástico.
  12. Centrifugar el tubo cónico de 50 mL que contiene las criptas filtradas a 300 x g durante 5 min a 4°C.
    NOTA: Se debe observar un gránulo en la parte inferior del tubo cónico de 50 ml.
  13. Decantar el medio pipeteando, volver a suspender las criptas pipeteando hacia arriba y hacia abajo con 10 ml de medio de lavado de ratón helado y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4°C.
  14. Para obtener una preparación más limpia, lave las criptas con 10 ml adicionales de medio para lavar ratones. Decantar el medio anterior y volver a suspender las criptas pipeteando hacia arriba y hacia abajo en 10 ml de medio de lavado de ratón. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4°C utilizando un tubo cónico de 15 mL.
    NOTA: Se debe tener cuidado al pipetear el medio porque, a veces, el gránulo no se centrifuga herméticamente. Si el gránulo no está apretado, pipetee la mayor parte del medio, dejando de 500 μL a 1 mL. A continuación, vuelva a suspender el gránulo pipeteándolo en 10 ml de medio de lavado para ratones y transfiera la solución a un tubo cónico de 15 ml. La centrifugación en un tubo cónico más pequeño puede mejorar la estanqueidad del gránulo.
  15. Decantar el medio y volver a suspender las criptas pipeteando hacia arriba y hacia abajo con 10 ml de medio de lavado de ratón helado. Una vez resuspendidas, cuente las criptas bajo un microscopio de campo claro pipeteando inmediatamente 10 μL del medio en un portaobjetos de vidrio.
    1. Coloque dos gotas de 10 μL en extremos separados del portaobjetos y cuente el número de criptas en cada gota. Calcule el promedio de los números entre las dos gotas para determinar el número de criptas por 10 μL. Multiplique este número por 100 para obtener el número de criptas en 1 ml.
      NOTA: Para un recuento preciso, se deben retirar inmediatamente 10 μL de la suspensión de la cripta después de la resuspensión. De lo contrario, las criptas caerán al fondo del tubo, lo que dará como resultado un recuento inexacto.
  16. Con el objetivo de sembrar de 300 a 500 criptas por pocillo, transfiera el volumen apropiado de criptas resuspendidas en el medio de lavado de ratones a un nuevo tubo cónico de 15 ml y lleve a 10 ml con medio de lavado de ratones helado. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 4°C. Un pequeño gránulo debe ser visible en la parte inferior del tubo.
  17. Retire el sobrenadante con una pipeta eléctrica. Utilice una pipeta P200 para eliminar con cuidado cualquier medio residual, dejando solo el gránulo.
  18. Vuelva a suspender el gránulo en la cantidad adecuada de matriz de membrana basal helada pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Tenga cuidado de no introducir burbujas al volver a suspender el gránulo de la cripta. Placa 300-500 criptas/15 μL de matriz de membrana basal en cada pocillo de una placa. Después de la siembra, invierta la placa de cultivo de tejidos y colóquela en una incubadora a 37 °C durante 10-20 minutos.
  19. Vuelva a colocar la placa y agregue 500 μL del medio colonoide de ratón completo a cada pocillo. Cambie el medio cada dos días hasta que estén listos para pasar. Pasar los colonoides cada 3-5 días.

3. Pasar los colonoides

NOTA: Por lo general, cada pozo puede pasar de 1:4 a 1:6 de acuerdo con la densidad del pozo original. Tome la cantidad adecuada de matriz de membrana basal fuera de -20 ° C y colóquela sobre hielo para descongelar. Los colonoides se pueden usar para experimentos después de dos pasadas. Al pasar colonoides, los pasos se realizan en una cabina de seguridad biológica para evitar la contaminación.

  1. Retire el medio de los pocillos que se van a pasar.
    1. Si hay escombros dentro de la matriz de la membrana basal, lo que puede suceder durante el aislamiento inicial, se puede usar el siguiente protocolo para limpiar los escombros:
      1. Añadir 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) helada al 0,1% en DPBS sin Ca 2+ o Mg2+ a cada pocillo. Déjalo reposar durante 5 minutos en el armario de seguridad biológica.
      2. Pipetear hacia arriba y hacia abajo de tres a siete veces con una pipeta P1000 para romper la matriz de la membrana basal y recolectar el contenido de los pocillos en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar los colonoides en un total de 5-10 mL de BSA al 0,1% en DPBS sin Ca 2+ o Mg2+. Hacer hasta el volumen adecuado con 0,1% BSA.
      3. Centrifugar a 150 x g durante 5 min a 4°C para pellet los colonoides pero no los residuos.
      4. Decantar el DPBS pipeteando, dejando el pellet. Agregue 1 ml de reactivo de disociación enzimática a temperatura ambiente (RT) y pipetee de tres a cinco veces.
      5. Colocar el tubo cónico de 15 ml con el reactivo de disociación enzimática y los colonoides alterados en un baño de agua a 37 °C durante 3-4 min.
      6. Retire el tubo del baño de agua, pipetee de 3 a 5 veces y luego lleve a 10 ml con medio de lavado de ratón. Continúe con el paso 3.6.
  2. Coloque 500 μL de reactivo de disociación enzimática RT en cada pocillo y déjelo reposar durante aproximadamente 1 minuto antes de pipetear hacia arriba y hacia abajo de tres a siete veces para romper la matriz de la membrana basal.
  3. Coloque la placa en una incubadora a 37 ° C durante 3-4 minutos.
  4. Retire la placa de la incubadora y pipetee hacia arriba y hacia abajo de tres a siete veces con una pipeta P1000 para disociar los colonoides.
  5. Transfiera el contenido a un tubo cónico de 15 ml y prepare hasta 10 ml con un medio de lavado de ratón helado.
  6. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min a 4°C.
  7. Retire el medio con una pipeta eléctrica y una pipeta P200 según sea necesario para que solo quede un gránulo en el tubo cónico.
  8. Vuelva a suspender en una cantidad adecuada de matriz de membrana basal helada pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo de acuerdo con la cantidad de pocillos que se van a recubrir. No introduzca burbujas al pipetear. Colocar los fragmentos de colonoides en 15 μL de gotas de matriz de membrana basal por pocillo.
  9. Coloque la placa en las criptas, invierta la placa de cultivo de tejidos y luego coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 10-20 minutos.
  10. Finalmente, revierta la placa y agregue 500 μL de medio colonoide de ratón completo a cada pocillo. Cambie el medio cada dos días hasta que hayan crecido lo suficiente como para volver a pasar en aproximadamente 3-5 días.

4. Diferenciación terminal de las células colonoides

  1. Pase los colonoides como se indicó anteriormente y agregue 500 μL del medio colonoide de ratón completo a cada pocillo.
  2. Al menos 48 h después del pase, retirar el medio colonoide de ratón completo y añadir 500 μL del medio diferenciador a cada pocillo (ver sección 1).
  3. Incubar los colonoides con medios de diferenciación durante 48 h, después de lo cual se pueden utilizar en experimentos, incluida la recolección de ARN y proteínas.
    NOTA: La diferenciación de los colonoides se puede evaluar mediante la recolección de ARN y la evaluación de la expresión de Lgr5 y Ki67, un marcador de células madre y un marcador de proliferación celular, respectivamente, a través de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (qPCR) cuantitativa. Las células terminalmente diferenciadas deben tener una expresión relativamente baja de Lgr5 y Ki67 en comparación con los colonoides cultivados en un medio colonoide tradicional, donde las células son más parecidas a las madres. Es posible que sea necesario optimizar la duración del tiempo que los colonoides necesitan para incubar en el medio de diferenciación para cada laboratorio individual. Consulte la Tabla Suplementaria 1 para ver la lista de cebadores.

5. Inducir inflamación en colonoides diferenciados con mediadores inflamatorios

  1. Después de que los colonoides se hayan incubado durante 2-3 días con el medio de diferenciación, retire el medio existente y agregue 500 μL del medio mediador de inflamación a cada pocillo.
  2. Deje que los pocillos se incuben durante 24-72 h antes de recolectar el ARN y la proteína (o evaluar otros parámetros posteriores). Cambia el medio todos los días.

6. Monocapas epiteliales intestinales derivadas de colonoides murinos establecidos

NOTA: Las monocapas epiteliales intestinales murinas se derivan de colonoides murinos que han sido expulsados un mínimo de dos veces. Para permitir la formación exitosa de monocapas en 3-5 días, es imperativo no separar los colonoides en células individuales. Los organoides fragmentados que se han disociado enzimáticamente en grupos celulares son ideales para el crecimiento.

  1. Prepare todos los reactivos antes de comenzar el experimento. Descongele la matriz de la membrana basal en hielo. Prepare el medio monocapa murino como se describe en la sección 1. Diluir la membrana basal descongelada 1:20 con el medio monocapa murino frío. Mantener en hielo.
  2. Utilice pinzas estériles para colocar un inserto de cultivo celular transparente de 0,4 μm en un solo pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Tabla de materiales). Tome una punta de esquina del inserto y transfiérala al pozo. Repita hasta que se disponga del número adecuado de insertos de cultivo celular para el cultivo.
    NOTA: Asegúrese de recubrir un pozo de control adicional solo con la matriz de la membrana basal. Este inserto de cultivo celular se utilizará para medir la resistencia de fondo del inserto de cultivo celular sin células presentes, como se describe en el paso siguiente (paso 6.3).
  3. Con una pipeta P200, cubra la superficie apical (superior) de cada inserto de cultivo celular con 150 μL de matriz de membrana basal diluida. Coloque la punta de la pipeta en el centro del inserto sin tocar la membrana del inserto y expulse suavemente la solución. Coloque la placa en una incubadora estéril a 37 °C con 5% de CO2 durante al menos 1 h.
  4. Retire suavemente la matriz de la membrana basal antes de su uso y deje que los insertos de cultivo celular se sequen en una cabina de seguridad biológica durante un mínimo de 10 minutos.
    1. Para quitar la matriz de la membrana basal, gire la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45°. Coloque un solo dedo en la esquina de la punta para estabilizar el inserto y, con una pipeta P200, coloque suavemente la punta de la pipeta a lo largo de la parte inferior del inserto y retire la matriz.
    2. Eliminar cualquier exceso de residuo lavando cada inserto de cultivo celular con 150 μL de DPBS estéril sin Ca 2+ o Mg2+.
  5. Después de 10 min de secado, añadir 400 μL del medio monocapa murino en la parte inferior del inserto de cultivo celular y 75 μL en la parte superior. Repita hasta que todos los insertos de cultivo celular estén sumergidos. Deje la placa en el gabinete de seguridad biológica o vuelva a colocarla en la incubadora hasta que la necesite.
  6. Retire la placa de 24 pocillos de colonoides intestinales maduros (organoides en los días 3-5 de crecimiento) de la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 y colóquela debajo del gabinete de seguridad biológica. Retire el medio con puntas estériles y lave cada pocillo con 1 ml de DPBS estéril RT (sin Ca 2+ ni Mg2+).
    NOTA: Un pocillo individual de 75-125 colonoides maduros se divide en una proporción de 1:4.
  7. Retirar el DPBS sin Ca 2+ o Mg2+ utilizando puntas estériles, y digerir cada tapón de la matriz de la membrana basal colocando 500 μL de reactivo de disociación enzimática RT en cada pocillo a pasar.
  8. Pipetee cada pocillo hacia arriba y hacia abajo aproximadamente de 6 a 10 veces para romper el tapón. No raye la parte inferior de la placa para quitar el tapón. En su lugar, gire la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45°, coloque la punta de la pipeta en el borde del tapón y desaloje suavemente.
  9. Vuelva a colocar la placa de 24 pocillos en una incubadora estéril de 37 °C y 5% de CO2 durante 3-4 minutos.
  10. Retire la placa y pipetee el reactivo de disociación enzimática hacia arriba y hacia abajo de cinco a siete veces para cada pocillo debajo de una cabina de seguridad biológica. Transfiera los colonoides disociados de cada pocillo a un tubo cónico estéril de 15 ml. Lleve hasta un volumen de 10 ml con un medio de lavado de mouse helado.
  11. Centrifugar los colonoides parcialmente digeridos a 300 x g a 4 °C durante 5 min en una centrífuga de cubo oscilante.
  12. Debajo de la cabina de seguridad biológica, retire el sobrenadante del gránulo con una pipeta de 10 ml. Retire cualquier medio restante con una pipeta P200. Resuspender el gránulo de colonoide en medio monocapa murino. Añadir 75 μL de medio por cada inserto de cultivo celular de colonoides fragmentados que se vayan a sembrar.
  13. Añadir 75 μL de suspensión colonoide en el centro de cada inserto de cultivo celular. Antes de agregar la suspensión colonoide a cada pocillo, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo una o dos veces antes de eliminar los 75 μL, lo que permite una siembra más uniforme.
  14. Coloque la placa de 24 pocillos con insertos de cultivo celular en una plataforma giratoria durante 10 minutos para permitir una dispersión uniforme en todo el inserto de cultivo celular.
  15. Coloque la placa en una incubadora estéril a 37 °C y 5% de CO2 .
  16. Al día siguiente (Día 1), desaloje los fragmentos de colonoides sueltos pipeteando el medio hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces con una pipeta P200. Coloque suavemente la punta junto al interior del inserto de cultivo celular para no alterar las células intestinales adheridas. No introduzca burbujas en el medio, ya que esto impide la eliminación de todos los fragmentos sueltos.
  17. Retire inmediatamente la mezcla de medio y colonoide. Repita hasta que se hayan limpiado todos los insertos de cultivo celular.
  18. Añadir suavemente 150 μL de medio monocapa murino precalentado en el lado apical de cada inserto de cultivo celular. Agregue 400 μL de medio monocapa murino calentado a cada pocillo de una nueva placa de 24 pocillos. Transfiera el inserto de cultivo celular a la nueva placa agarrando su punta con pinzas estériles. Cambie el medio cada dos días hasta la confluencia.
    NOTA: Los fragmentos de colonoides deben formar una monocapa confluente de 3 a 5 días después de la siembra.

7. Medición de la resistencia neta de las monocapas epiteliales utilizando un voltohmímetro en los días 3 y 5 de cultivo de monocapas

NOTA: Los electrodos de los palillos se asemejan a pinzas y tienen una longitud asimétrica. El brazo más largo de la sonda es el electrodo basolateral y el brazo más corto es el electrodo apical. La sonda puede ser difícil de insertar entre el interior y el exterior del inserto de cultivo celular. Colocar la sonda en un ligero ángulo al insertarla, seguido de enderezar verticalmente la sonda, evitará que la sonda se atasque. Asegúrese de leer la resistencia neta de cada inserto de cultivo celular en un ángulo similar, ya que esto puede afectar los valores.

  1. Coloque el voltohmetro y todos los reactivos dentro de una cabina de seguridad biológica.
    1. Conecte el voltohmímetro a la toma de CA más cercana y conecte el conector modular de plástico de la sonda de electrodo en el conector INPUT de la pantalla frontal.
    2. Para colocar el voltohmímetro en un ángulo de 45°, gire el brazo de metal en la parte posterior del equipo hacia afuera hasta que encaje en su lugar.
    3. Ahora, encienda el voltohmímetro girando el interruptor de encendido hacia arriba en la pantalla frontal. Por último, gire el interruptor hacia OHMS para mostrar la lectura en esta métrica.
  2. Retire la placa de 24 pocillos de la incubadora de 37 °C con 5 % de CO2 y colóquela plana en la cabina de seguridad biológica. La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) es sensible a la temperatura. Retire la placa inmediatamente antes de leer el TEER.
  3. Esterilice la sonda del electrodo en etanol precalentado al 70% durante 30 s a 1 min. Retire la sonda, inviértala y muévala una o dos veces para eliminar el exceso de etanol. Deje que la sonda se seque al aire durante aproximadamente 30 s.
  4. Lave cualquier resto de etanol que quede en la sonda con un medio de lavado de ratón precalentado.
    PRECAUCIÓN: No permita que ninguna de las gotas de etanol restantes en la parte superior de la sonda caiga en el inserto de cultivo celular. Al lavar el etanol con medio, no deje que el medio pase por encima del campo de etanol estéril. Esto podría hacer que el medio contaminado entre en el inserto de cultivo celular.
  5. Sostenga la sonda perpendicular al inserto de cultivo celular. Inserte el electrodo basolateral (extremo más largo de la sonda) en el exterior del inserto de cultivo celular hasta que toque la base de la placa de 24 pocillos. Deslice el electrodo apical (extremo más corto de la sonda) en el inserto de cultivo celular. No varíe la distancia de los dos electrodos de un pocillo a otro. Esto afectará a la medición de TEER.
  6. Verifique que el electrodo apical no toque la base del inserto de cultivo celular antes de leer el TEER. Comience con el inserto de cultivo celular de control en segundo plano y registre el valor. El valor se mostrará automáticamente digitalmente en la parte frontal del voltohmetro.
  7. Repita los pasos 7.5-7.6 para cada inserto de cultivo celular.
    NOTA: Si existen diferentes condiciones experimentales entre los insertos de cultivo celular, esterilice la sonda entre cada nueva condición. Comience en el paso 7.1 y continúe numéricamente a través de los pasos.
  8. Vuelva a colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora una vez que se hayan registrado todas las mediciones de TEER.
  9. Los valores netos a 350 Ω o más son indicativos de formación de monocapas. Repita nuevamente en los días siguientes hasta que se haya logrado la formación de una sola capa.
    NOTA: Por lo general, los valores de 1.000 Ω o más se pueden capturar en el día 3, pero con el tiempo, todos convergerán en un número más bajo alrededor de 350 Ω.

8. Cálculo del TEER utilizando mediciones de resistencia neta del voltohmetro

NOTA: La formación exitosa de monocapas de los colonoides dará mediciones de TEER superiores a 115 Ω·cm2.

  1. Tome los valores de resistencia neta individuales y reste la resistencia neta del pozo de fondo. Los insertos de cultivo celular recubiertos con la membrana de la matriz basal darán una lectura neta de alrededor de 100 Ω.
  2. Tome las medidas de resistencia neta restados de fondo y multiplíquelas por el área de superficie del inserto de cultivo celular. Un inserto de cultivo celular de 24 pocillos tiene una superficie de 0,33cm2.
  3. Si los valores son de 115 Ω·cm2 o superiores, se procederá a los ensayos experimentales posteriores.

9. Inducir inflamación en las monocapas epiteliales con mediadores inflamatorios

  1. Una vez que se hayan formado monocapas exitosas, agregue mediadores inflamatorios al cultivo en el lado basal del cultivo. Prepare el medio mediador de inflamación monocapa, como se describe en el paso 1.9, y agregue 400 μL a cada pocillo en una nueva placa de 24 pocillos.
  2. Retire el medio del lado apical del inserto de cultivo celular y agregue 150 μL del medio monocapa murino sin Y-27632. No complemente este lado con mediadores inflamatorios. Sin embargo, si la muerte celular parece excesiva, deje el Y-27632 en los medios de comunicación. Esto debe ser determinado por el usuario final.
  3. Transfiera los insertos de cultivo celular a una nueva placa de 24 pocillos y colóquelos en los pocillos complementados con el medio monocapa mediador de inflamación.
  4. Estimular las monocapas con mediadores inflamatorios durante 24-72 h, dependiendo del experimento.
  5. Para probar las respuestas a los fármacos utilizando este modelo inflamatorio, complemente el medio monocapa en el lado apical del inserto de cultivo celular con el fármaco de elección. El fármaco puede añadirse en cualquier momento del experimento, dependiendo del mecanismo de acción del fármaco y de los parámetros posteriores a evaluar.

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Representative Results

El sistema de cultivo de colonoides intestinales en 3D es una herramienta inestimable para estudiar la contribución intrínseca del epitelio a la homeostasis de la mucosa intestinal. El protocolo descrito proporciona instrucciones detalladas sobre cómo aislar criptas de ratones C57BL/6J (WT) a las 8 semanas de edad y establecer un sistema de cultivo de colonoides a largo plazo que pueda manipularse para múltiples aplicaciones posteriores. Tras el aislamiento y la colocación de placas en la matriz de la membrana basal, las criptas parecen densas y de estructura multicelular cuando se visualizan mediante microscopía de campo claro. Pueden ser de forma esférica o alargadas y cilíndricas, asemejándose a la estructura única en forma de cripta que normalmente se observa dentro de la arquitectura intestinal in vivo (Figura 1A). Para el día 1, la mayoría de las criptas forman una estructura compacta y esférica, con unos pocos colonoides que comienzan a desarrollar una luz interior (espacio vacío) desprovista de células epiteliales (Figura 1B). A medida que continúan creciendo durante los días siguientes, los diámetros de los colonoides continúan aumentando y los lúmenes de los colonoides se vuelven más definidos (Figura 1C). Para el día 5, cada colonoide tiene aproximadamente 100-250 μm de diámetro, formando una luz grande y prominente rodeada por una fina capa de células madre epiteliales (Figura 1D). En este punto, los colonoides se alteran enzimática y mecánicamente para el paso. Después de dos pasadas, se pueden utilizar para la experimentación posterior.

Para evaluar si los cambios metabólicos observados en los raspados colónicos de ratones tratados con DSS se conservan en colonoides derivados de ratones con el mismo régimen de DSS, los ratones WT de 8 semanas de edad fueron tratados con DSS al 2% en agua potable ad libitum. A los animales control de WT emparejados por edad y sexo se les dio agua potable ad libitum sin DSS. Después de 7 días, los ratones fueron sacrificados y se aislaron las criptas de los colones tanto del control (n = 3, macho) como de los animales tratados con DSS (n = 3, macho) para establecer colonoides. Después de dos pasadas, se aisló la proteína de cada conjunto de colonoides, y se evaluó la expresión del receptor proliferador-activador de peroxisomas-coactivador gamma-1α (PGC1α), la proteína reguladora maestra de la biogénesis mitocondrial, mediante análisis de Western blot (Figura suplementaria 1). No hubo diferencias significativas en la expresión de PGC1α al comparar los colonoides establecidos a partir de los ratones tratados con DSS frente a los colonoides establecidos a partir de los ratones control, lo que sugiere que esta metodología de cultivo de colonoides no refleja adecuadamente los cambios metabólicos in vivo que se observan en los ratones15.

El fracaso de PGC1α para iniciar la biogénesis mitocondrial durante una agresión inflamatoria intestinal se localiza principalmente en el epitelio colónico diferenciado15,19. Para reflejar los cambios observados in vivo, decidimos dirigir los colonoides hacia un estado más diferenciado. Para inducir este cambio, los colonoides se incubaron inicialmente con medio colonoide tradicional. Después de 24 h a 48 h, los colonoides se cambiaron a un medio de diferenciación durante 48 h adicionales. Durante la diferenciación, un pequeño porcentaje de colonoides pasó de una arquitectura esférica a estructuras enjutadas enriquecidas con células caliciformes y colonocitos17 (Figura 2A,B). Los colonoides cultivados en medio suplementado con WRN se enriquecieron con células madre Lgr5+ que se dividen rápidamente. Para confirmar que tanto las células madre Lgr5+ como otras células proliferantes salían del ciclo celular durante la diferenciación, se analizaron los niveles de ARNm mediante qPCR. Se observó una disminución significativa en los niveles de Lgr5 (97%, p = 0,0023) y Ki67 (75%, p = 0,0007) en los colonoides diferenciados (n = 6) en comparación con los colonoides cultivados en un entorno de cultivo tradicional (n = 6; Figura complementaria 2A,B). También se esperaría que los colonoides diferenciados estuvieran compuestos principalmente por células caliciformes secretoras de moco. Además, de hecho, MUC2 se reguló al alza casi el doble en los colonoides diferenciados en comparación con sus contrapartes cultivadas tradicionalmente (n = 3, p = 0.0433, Figura suplementaria 3). Cuando se toman en conjunto, estos datos sugieren que los colonoides se diferenciaron con éxito y estaban listos para la experimentación posterior. A continuación, se añadieron mediadores inflamatorios en el medio de diferenciación, tal y como se describe en la sección 5 del protocolo. La proteína y el ARN se recogieron hasta 72 h después de la introducción de los mediadores inflamatorios para su análisis. Sin embargo, a las 72 h se observó ocasionalmente un aumento de la muerte celular.

Para evaluar si la introducción de mediadores inflamatorios en colonoides diferenciados podría imitar el fallo de biogénesis mitocondrial observado tanto en la EII humana como en un modelo agudo de colitis murina, se evaluó la expresión proteica de PGC1α y del factor de transcripción A, mitocondrias (TFAM) mediante análisis de Western blot en colonoides diferenciados (n = 5) tratados con mediadores inflamatorios durante 72 h. Se ha demostrado que la expresión de PGC1α está disminuida en modelos murinos de colitis. así como en la EII humana15. También se ha demostrado que el TFAM, una proteína que impulsa tanto la transcripción como la replicación del genoma mitocondrial, está disminuido en modelos murinos de colitis, y se ha demostrado que su expresión génica está disminuida en la EII humana15,20. Observamos una regulación negativa similar tanto en la expresión de PGC1α (50,4%, p = 0,0442) como en la de TFAM (88,9%, p = 0,004) en los colonoides diferenciados después de 72 h de exposición a estos mediadores inflamatorios (Figura 3). En conjunto, esto sugiere que el tratamiento de colonoides diferenciados con citocinas es un modelo ideal para estudiar la dinámica mitocondrial in vitro.

Si bien se pueden examinar varias funciones celulares y moleculares en entornos de cultivo de colonoides 3D, los sistemas de cultivo de monocapa 2D son superiores cuando se evalúa la función de barrera, las interacciones huésped-patógeno y el impacto de las terapias absorbidas por vía oral en la inflamación21,22. La formación de una capa continua de células confluentes con una barrera intacta permite colocar diferentes agentes biológicos o químicos en el lado apical y/o basal de las células con facilidad. Este protocolo permite establecer cultivos monocapa 2D a partir de colonoides WT preexistentes que han sido pasados dos veces. Los colonoides que han sido alterados enzimática y mecánicamente se siembran en insertos de cultivo celular recubiertos con matriz de membrana basal. Tras la siembra inicial, los colonoides fragmentados aparecen en grupos celulares que van de 15 a 150 células (Figura 4A). Para el día 3, las células han comenzado a aplanarse y cubrir lentamente el inserto de cultivo celular, generalmente alcanzando la confluencia (Figura 4B). Durante los dos días siguientes, las monocapas continúan creciendo y formando una barrera continua que puede medirse cuantitativamente mediante TEER (Figura 4C, D). Curiosamente, las mediciones de TEER fluctúan entre el día 3 y el día 5. Las monocapas tienen valores más altos al principio con un rango amplio (200-800 Ω·cm2), pero estos valores convergen lentamente en un número más bajo en el día 5 (115-150 Ω·cm2, Figura 5A). Cuando las monocapas alcanzan un estado estacionario, se pueden utilizar para la experimentación posterior.

Para caracterizar la respuesta epitelial de las monocapas derivadas de colonoides a la inflamación, se colocaron mediadores inflamatorios en el lado basal (el exterior del inserto) de las células durante 48 h. Se extrajo el ARN y se analizaron los niveles de ARNm de varios marcadores de diferenciación madre y celular, así como proteínas de unión, mediante qPCR. Lgr5 no se detectó en ninguna de las dos afecciones, pero otro marcador de células madre, mTERT, se redujo en casi un 60% en las monocapas inflamadas en comparación con el control no tratado (Figura suplementaria 4A). A continuación, analizamos la expresión de dos marcadores de tipos celulares diferenciados, Muc2 y fosfatasa alcalina (Alpi). Ambas transcripciones de ARNm fueron más bajas en las monocapas inflamadas en comparación con las células de control (Figura suplementaria 4A). Tanto las células madre como las postmitóticas suelen estar disminuidas durante la inflamación colónica23,24,25, y se observó una respuesta similar en el modelo monocapa obtenido en este estudio.

Una ventaja del sistema monocapa es la capacidad de evaluar la respuesta de barrera. Para determinar si la barrera estaba comprometida en la condición inmunoestimulada, medimos los valores de TEER después de 48 h. Los valores de TEER para las monocapas de control (n = 2) promediaron 129,16 Ω·cm2, pero disminuyeron significativamente (p = 0,0087) a un promedio de 98,54 Ω·cm2 en las monocapas inflamadas (Figura 5B). Para confirmar aún más que la barrera estaba comprometida en la condición inflamatoria, evaluamos los niveles de ARNm para tres marcadores diferentes de unión estrecha, Zo-1, Ocludin y Claudin. Los tres marcadores tenían niveles reducidos en la afección inflamada en comparación con sus contrapartes no inflamadas (Figura suplementaria 4B). En conjunto, estos datos muestran que la disfunción de barrera está presente en las monocapas inflamadas e imita la disfunción de barrera observada durante la patogénesis de la EII.

Figure 1
Figura 1: Aislamiento inicial de criptas murinas para el establecimiento de cultivo de colonoides a largo plazo. (A) En el día 0, se sembraron entre 300 y 500 criptas en la matriz de membrana basal (imagen obtenida 5 h después de la siembra), y el crecimiento de los colonoides se capturó en (B) el día 1, (C) el día 3 y (D) el día 5. El día 5, los colonoides estaban listos para ser transitados. Aumento = 10x; barra de escala = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Establecimiento de colonoides terminalmente diferenciados del cultivo tradicional de colonoides. El medio de diferenciación se colocó en los colonoides 48 h después del paso de los colonoides murinos. Después de (A) 24 h y (B) 48 h, los colonoides se enriquecen con células terminalmente diferenciadas. Aumento = 10x; barra de escala = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Expresión de las proteínas PGC1α y TFAM en colonoides murinos diferenciados tratados con mediadores inflamatorios. Se colocó medio suplementado con mediadores inflamatorios en los colonoides diferenciados, y la proteína se recolectó 0 h, 24 h, 48 h y 72 h después de la exposición. (A) La expresión proteica de PGC1α mostró una disminución significativa general (p = 0,0442) durante 72 h. TFAM se reguló significativamente a la baja (p = 0,004) después de la exposición a mediadores inflamatorios a las 72 h, y (B) hubo una tendencia a la baja en la expresión proteica a las 24 h, 48 h y 72 h cuando se analizó mediante ANOVA. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. *p < 0,05, **p < 0,005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Establecimiento y crecimiento de monocapas a partir de colonoides preexistentes. Los colonoides que habían sido alterados enzimática y mecánicamente se sembraron en insertos de cultivo celular recubiertos con una matriz de membrana basal. Tras la siembra inicial, los colonoides fragmentados aparecieron en (A) grupos celulares, y para el día 3 de (B), habían comenzado a aplanarse y cubrir lentamente el inserto de cultivo celular. (C) En el día 5 y (D) en el día 7, las monocapas continuaron creciendo hasta formar una barrera continua que podía medirse cuantitativamente mediante TEER. Aumento = 10x; barra de escala = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Valores de TEER para establecer monocapas derivadas de colonoides y monocapas inflamadas. (A) Los valores de TEER se midieron utilizando un voltohmetro desde el día 3 hasta el día 5. Las monocapas tenían valores más altos al principio con un rango amplio, pero convergieron lentamente en un número más bajo para el día 5. Una vez que las monocapas alcanzan un estado estacionario, se pueden utilizar para la experimentación posterior. (B) Los valores de TEER fueron menores en las monocapas inflamadas (n = 2) en comparación con los controles no inflamados (n = 2). Las monocapas control tuvieron un promedio de TEER de 129,16 ohmios·cm2, y el TEER de las monocapas inflamadas fue significativamente menor (p = 0,0087), con un promedio de 98,54 Ω·cm2, cuando se analizaron mediante una prueba t. **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Tabla de composición de la solución. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura suplementaria 1: Expresión de la proteína PGC1α en colonoides murinos cultivados en medio colonoide tradicional aislado de controles WT y ratones tratados con DSS al 2%. Los colonoides se derivaron tanto de ratones de control de WT de 8 semanas de edad como de ratones tratados con DSS al 2% después de 7 días. La proteína se aisló de los colonoides pasados dos veces y en el día 4 después de la siembra. No hubo diferencias en la expresión de la proteína PGC1α (p = 0,9996) en los colonoides derivados de los ratones de control en comparación con los ratones expuestos al 2% de DSS durante 7 días cuando se analizaron mediante una prueba t no apareada. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Reducción de la expresión de ARNm de Lgr5 y Ki67 en colonoides diferenciados. Los colonoides murinos pasados 48 h antes se expusieron a un medio de diferenciación durante 48 h antes de aislar la síntesis de ARN y ADNc. Los niveles de ARNm se determinaron mediante qPCR y se analizaron mediante el método de TC comparativo. (A) Lgr5 y (B) Ki67 disminuyeron significativamente en los colonoides diferenciados cuando se analizaron estadísticamente mediante una prueba t (p = 0,0023, p = 0,0007). Los datos se presentan como media ± desviación estándar.**p < 0,005. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Aumento de las células caliciformes secretoras de mucina en colonoides murinos diferenciados. Los colonoides murinos pasados 48 h antes se expusieron al medio de diferenciación durante 48 h. Las células se lisaron en tampón RIPA y la proteína se visualizó mediante análisis de Western blot. (A) La expresión de MUC2 aumentó en cada conjunto de colonoides diferenciados en comparación con los colonoides indiferenciados. (B) Se observó un cambio de casi el doble en la proteína MUC2 en las condiciones de diferenciación, lo cual fue significativo cuando se analizó mediante una prueba t (p = 0,0433). Los datos se presentan como media ± desviación estándar. *p < 0,05. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Reducción de la expresión de marcadores de tallo y diferenciación, así como de marcadores de unión estrecha, en monocapas tratadas con mediadores inflamatorios. Las monocapas derivadas de colonoides murinos (día 5) se expusieron a mediadores inflamatorios durante 48 h, posteriormente se recolectó ARN y se sintetizó ADNc (n = 2). Los niveles de ARNm de los marcadores madre, diferenciación y unión se determinaron mediante qPCR y se analizaron mediante el método de TC comparativo. (A) El marcador de células madre, Lgr5, no se detectó en ninguna de las dos afecciones, pero mTERT se redujo sustancialmente en las afecciones inflamatorias. El marcador de células caliciformes, Muc2, y el marcador de colonocitos, Alpi, disminuyeron en las monocapas inflamadas en comparación con las monocapas no tratadas. (B) Los marcadores de unión estrecha, Zo-1, Ocludin y Claudin, fueron todos más bajos en las monocapas tratadas con inflamación en comparación con el control. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Lista de cebadores. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El desarrollo de organoides ha revolucionado la forma en que la comunidad científica estudia los sistemas de órganos in vitro con la capacidad de recapitular parcialmente la estructura y función celular de un animal o humano en un plato. Además, los sistemas organoides derivados de humanos con enfermedades ofrecen una herramienta prometedora para la medicina personalizada que podría guiar la toma de decisiones terapéuticas. Aquí, describimos un protocolo de aislamiento de criptas que funciona bien e introduce pasos clave que permiten limpiar el exceso de escombros en el aislamiento antes de enchapar. Además, explicamos un detalle clave que a menudo se pasa por alto en el proceso: la capacidad de contar con precisión las criptas para el enchapado. Una vez establecidos los colonoides, describimos las manipulaciones clave que permiten su diferenciación celular o la formación de monocapas, lo que podría mejorar la capacidad de estudiar los cambios en el epitelio intestinal durante la EII.

El eje cripta-vellosidades en el epitelio colónico en los mamíferos es una estructura compleja compuesta por diferentes tipos de células con diferentes funciones. El mantenimiento de este eje depende de factores celulares intrínsecos y extrínsecos, que en conjunto ayudan a mantener la homeostasis epitelial18. Hemos observado que los colonoides murinos cultivados en medio tradicional reflejan principalmente células madre en contraposición a la conglomeración de células madre y células terminalmente diferenciadas que se observa in vivo. Además, los colonoides murinos cultivados y mantenidos de esta manera son estructuras circulares en lugar de monocapas planas. Estas diferencias tienen implicaciones potenciales para nuestros intentos de estudiar la enfermedad intestinal in vitro. Específicamente, estamos limitados en nuestra capacidad de usar organoides para estudiar los cambios en la función de barrera, así como los efectos de la inflamación en las células epiteliales intestinales terminalmente diferenciadas.

Aquí, describimos protocolos no solo para el aislamiento de criptas murinos para cultivar colonoides, sino también para la manipulación de estos colonoides para estudiar la fisiología epitelial intestinal y la respuesta epitelial a la inflamación. Entre varios factores extrínsecos que promueven el gradiente de células madre pluripotentes y células terminalmente diferenciadas se encuentra la vía canónica Wnt, que es rica en criptas y promueve la salud de las células madre. La señalización Wnt disminuye en la punta del eje de la cripta, coincidiendo con la evolución de las células madre en células terminalmente diferenciadas26. Hemos descrito un protocolo que permite la diferenciación terminal de las células colonoides. Al igual que otros, nos diferenciamos por la eliminación de Wnt del medio de cultivo, pero utilizamos una concentración más baja de R-espondina (500 ng/mL frente a 1 μg/mL de R-espondina)17. Sorprendentemente, una reducción del 50% en R-espondina no afecta la diferenciación exitosa de los organoides. La capacidad de diferenciarse con una concentración más baja ayuda a establecer un sistema menos artificial que podría parecerse más al entorno fisiológico in vivo. Aunque este protocolo da lugar a una diferenciación terminal finita (Figura suplementaria 2 y figura suplementaria 3) y a la incapacidad de mantener la inmortalidad celular, es un método útil para comprender mejor la contribución fisiológica del epitelio terminalmente diferenciado, incluidos los colonocitos, las células enteroendocrinas y las células caliciformes, a la EII y otros estados patológicos. Además, demostramos que la suplementación de citoquinas específicas en este medio, que tradicionalmente están elevadas en pacientes con EII, dirige el sistema organoide diferenciado hacia un estado inflamatorio. A lo largo de 72 h, los colonoides diferenciados tratados con citoquinas inflamatorias reflejan más fielmente algunos de los hallazgos metabólicos mostrados en otros modelos establecidos de colitis y EII humana (Figura 3). Además, es probable que los colonoides diferenciados tratados de esta manera reflejen mejor los efectos de la inflamación sobre la homeostasis celular en el epitelio diferenciado. También hemos esbozado un protocolo para el desarrollo de monocapas, que permite la formación de un lado apical y otro basal del epitelio, lo que permite un análisis de la función barrera in vivo. Este sistema es útil para estudiar los mecanismos de disfunción de barrera sin necesidad de diferenciación y cultivar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento.

Deben tenerse en cuenta varias limitaciones y posibles escollos con respecto a los protocolos descritos anteriormente. El aislamiento exitoso de las criptas y el desarrollo de colonoides pueden verse limitados por el rendimiento de las criptas de cada animal, la precisión del conteo de las criptas y la limpieza de la preparación. La velocidad de conteo de las criptas aisladas después de la resuspensión, las variaciones en la disociación mecánica de las criptas de la muscular subyacente y el número de lavados y giros centrífugos contribuyen al éxito del cultivo de colonoides. Además, es fundamental no disociar completamente los organoides en células individuales durante el paso o la siembra para el cultivo de monocapa 2D. Los grupos de 30 a 50 células son ideales para permitir que el cultivo se propague para el cultivo a largo plazo. Los protocolos anteriores señalan las áreas de posibles escollos y los pasos adicionales opcionales para solucionar estos problemas. En última instancia, el protocolo puede requerir la optimización por parte de la persona que realiza el aislamiento debido a la variabilidad inherente en el conjunto de habilidades y maniobras (es decir, sacudidas), así como a la variación en cada animal. Es posible que el usuario final requiera una optimización adicional para capturar la diversidad genética y molecular que se encuentra en la EII.

En última instancia, si bien el sistema colonoide es una herramienta muy útil para recapitular aspectos clave de la fisiología y la enfermedad humana in vivo, este sistema está limitado en última instancia en su capacidad para estudiar todos los aspectos de la enfermedad humana. Los métodos tradicionales para el desarrollo de colonoides han dilucidado aspectos clave de la dinámica de las células madre; Sin embargo, estos hallazgos a menudo no reflejan adecuadamente los hallazgos en células terminalmente diferenciadas dentro del epitelio del huésped. Las estrategias descritas en este estudio proporcionan a los investigadores un modelo relativamente rápido y económico para la manipulación de organoides que, cuando se emplea correctamente, puede arrojar luz sobre aspectos clave de la estructura y función epitelial intestinal durante la inflamación.

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Disclosures

Los autores colaboradores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Grants R01DK120986 (a K.P.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

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References

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Biología Número 196
Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal <em>in vitro</em> en colonoides murinos establecidos
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Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, … More

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

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