Summary
该协议描述了从Sprague Dawley大鼠中分离和鉴定脂肪组织来源的间充质干细胞（MSCs）的方法。
Abstract
近几十年来，成人间充质细胞彻底改变了分子和细胞生物学。它们可以分化成不同的特化细胞类型，此外还有强大的自我更新、迁移和增殖能力。脂肪组织是间充质细胞侵入性最小、最容易获得的来源之一。据报道，与其他来源相比，它具有更高的产量，以及优越的免疫调节特性。最近，已经发表了从不同组织来源和动物物种获得成年间充质细胞的不同程序。在评估了一些作者的标准后，我们标准化了一种适用于不同目的且易于复制的方法。来自肾周和附睾脂肪组织的基质血管分数（SVF）池使我们能够开发具有最佳形态和功能的原代培养物。观察到细胞粘附在塑料表面上24小时，并表现出成纤维细胞样形态，具有延长和形成集落的趋势。流式细胞术（FC）和免疫荧光（IF）技术用于评估膜标志物CD105，CD9，CD63，CD31和CD34的表达。脂肪来源的干细胞（ASCs）分化成成脂肪谱系的能力也使用多种因素（4μM胰岛素，0.5mM 3-甲基异丁基黄嘌呤和1μM地塞米松）进行评估。48小时后，观察到成纤维细胞样形态逐渐丧失，并且在12天时，确认存在对油红色染色阳性的脂滴。总之，提出了一种程序来获得最佳和功能性ASC培养物以应用于再生医学。
Introduction
间充质干细胞（MSCs）因其自我更新，增殖，迁移和分化为不同细胞谱系的高能力而强烈影响再生医学1，2。目前，大量的研究集中在它们治疗和诊断各种疾病的潜力上。
间充质细胞有不同的来源：骨髓、骨骼肌、羊水、毛囊、胎盘和脂肪组织等。它们是从不同的物种获得的，包括人类、小鼠、大鼠、狗和马3.骨髓来源的间充质干细胞（BMSC）多年来一直被用作再生医学中干细胞的主要来源，并作为胚胎干细胞使用的替代品4。然而，脂肪来源的MSCs或脂肪来源的干细胞（ASCs）是一种重要的替代品，由于其易于收集和分离，以及每克脂肪组织获得的细胞产量5，6，具有很大的优势。据报道，ASC的收获率普遍高于BMSCs7。最初提出ASC的修复/再生能力是由于它们分化成其他细胞谱系的能力8。然而，近年来的研究加强了ASC释放的旁分泌因子在其修复潜力中的主要作用9，10。
脂肪组织（AT）除了作为能量储备外，还与内分泌，神经和心血管系统相互作用。它还参与出生后的生长发育、维持组织稳态、组织修复和再生。AT 由脂肪细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、前脂肪细胞和 ASC 组成。后者由于其低免疫原性而在再生医学中具有重要作用11，12。ASC可以通过酶消化和机械加工或通过脂肪组织外植体获得。ASC的原代培养物易于维持、生长和扩增。通过使用免疫荧光和流式细胞术等方法评估特定膜标志物的表达，ASC 的表型表征对于验证细胞的身份至关重要13.国际脂肪治疗与科学联合会（IFATS）和国际细胞治疗学会（ISCT）已经定义ASC表达CD73，CD90和CD105，而缺乏CD11b，CD14，CD19，CD45和HLA-DR14的表达。因此，这些阳性和阴性标志物被认为对ASC的表征是可靠的。
该项目的重点是描述从大鼠AT中提取的成年间充质细胞的分离和鉴定程序，因为与胚胎干细胞不同，这种细胞来源不存在伦理挑战。这巩固了该程序作为可行选择的地位，因为与骨髓来源的干细胞相比，该方法易于访问和微创方法。
来自这种组织来源的间充质细胞因其免疫调节能力和低免疫排斥反应而在再生医学中起着重要作用。因此，本研究是未来研究其分泌组及其在不同疾病（包括糖尿病等代谢性疾病）中作为再生疗法应用的基础部分。
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Protocol
所有实验程序均按照墨西哥动物护理指南进行，该指南基于国际实验动物护理评估和认证协会（墨西哥官方规范NOM-062-200-1999，墨西哥）的建议。该协议由墨西哥社会研究所健康研究伦理委员会审查、批准和注册 （R-2021-785-092）。
1.通过手术切除从大鼠身上去除脂肪组织
- 用 20 mL 无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水-抗生素抗真菌剂 （PBS-AA） 溶液（1 x PBS、庆大霉素 [20 μg/mL] 和两性霉素 [0.5 μg/mL]）制备两个锥形管，并保持在冰上。
- 选择两只健康状况良好的成年雄性Sprague Dawley大鼠 （R. norvegicus）。 确保大鼠在3-4个月大之间，体重为350-450克。
- 用20mg / kg盐酸甲苯噻嗪进行镇静，5分钟后，腹膜内给予剂量为120mg / kg盐酸氯胺酮的麻醉剂。用眼药膏润滑双眼以防止干燥。然后，通过缺乏踏板反射确认麻醉深度。
- 用碘溶液剃须和消毒腹部和腹股沟区域。使用手术单以保持无菌。然后，从胸骨到睾丸区域做一个正中纵向切口。
- 用无菌镊子去除附睾和肾脏周围的脂肪组织，并放入1x PBS-AA溶液中。将样品放在冰上。
- 如果需要，根据机构指南缝合切口，并用40mg / kg戊巴比妥钠的心内剂量对动物实施安乐死。一旦确认死亡，按照机构程序处理尸体。
注意：死亡引发影响间充质细胞免疫表型、分化能力和旁分泌作用的信号传导机制。因此，组织收集是在安乐死之前进行的。
2. 从脂肪组织中分离间充质细胞
- 在生物安全柜内用无菌镊子取出脂肪组织，并将其放在直径为100毫米的培养皿中的无菌滤纸上以吸收多余的PBS。
- 将脂肪组织转移到另一个培养皿中，并使用10mL移液管用10mL的1x PBS-AA溶液进行三次洗涤，每次洗涤5分钟。
- 使用剪刀和手术刀将组织机械分解成约1cm2 的碎片。
- 在 20 mL 未补充的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中制备 IV 型胶原酶 （0.075%）。通过0.22μm注射器过滤器过滤并保持在37°C。
- 将步骤2.4中制备的胶原酶溶液（20mL）加入带有碎裂组织和磁棒的水晶烧杯中。密封容器并在37°C下缓慢和连续搅拌孵育。
注意：酶消化大约需要90分钟（保持缓慢搅拌以保持细胞膜的完整性）。 - 通过不锈钢，40目，0.38mm孔径过滤器在100mm培养皿上过滤匀浆，并将细胞悬液收集在无菌的50mL锥形管中。
- 加入 20 mL 温热的补充 DMEM（10% 胎牛血清 [FBS]、2 mM 谷氨酰胺、2 mM 丙酮酸钠、100 x 非必需氨基酸溶液和 100x 抗生素抗真菌溶液 [AA]）。小心地悬浮基质血管部分（SVE）。
- 以 290 x g 离心细胞悬液 10 分钟，用 25 mL 移液管弃去上清液，并用 40 mL 未补充的 DMEM 培养基轻轻洗涤细胞。
- 重复此步骤。在步骤之间使用新的无菌锥形管，以拖动最少量的细胞碎屑和脂肪。
- 用 5 mL 移液管将沉淀悬浮在 5 mL 补充的 DMEM 中，并转移到 T-25 cm2 瓶中。在37°C和5%CO2下孵育24小时。
- 第二天，用 5 mL 加热的 1x PBS-AA 进行三次洗涤，用未补充的 DMEM 进行两次洗涤，以去除细胞碎片和非贴壁细胞。用 5 mL 移液管加入 5 mL 新鲜、温热、补充的 DMEM，每 3-4 天更换一次培养基。
3. ASC原代培养物的维持和扩展
- 一旦细胞达到90%-100%汇合（8±2天），用5mL未补充的DMEM洗涤两次。加入1mL加热的0.025%胰蛋白酶-2mM乙二胺四乙酸（EDTA），并在37°C孵育5-7分钟。
- 当细胞单层分离时，加入 4 mL 补充的 DMEM 并轻轻分解细胞悬液。
- 将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，加入 5 mL 加热、补充的 DMEM，轻轻悬浮以匀浆。
- 以290 x g 离心5分钟。弃去上清液，将沉淀轻轻混合在 1 mL 补充的 DMEM 中。用台盼蓝染色后，在Neubauer室中计数细胞。
- 最后，在T-75烧瓶中以1：4的分流比接种2.5 x 103 细胞/cm 2 。此步骤可确保菌落形成和高增殖率。
4. ASC原代培养物的形态学表征
- 在倒置显微镜下观察ASC的形态。
注意：在安装进行组织学和ASC鉴定之前，请用1%明胶溶液处理盖玻片。用紫外线照射15分钟。- 从70%乙醇溶液中取出盖玻片，并使其干燥5分钟。
- 将盖玻片浸入无菌的 1% 明胶溶液中，沥干水分，并在室温 （RT） 下干燥。
- 将每个盖玻片放入6孔板的每个孔中，并用紫外线照射板15分钟。
- 在孔中心播种含有 25 x 103 个 细胞的液滴，等待 1 分钟，然后加入 1 mL 补充的 DMEM 培养基。在37°C和5%CO2下孵育96小时。
- 取出培养基，并使用移液管用1x PBS-AA进行三次洗涤。
- 向每个孔中加入 1 mL 3.5% 中性福尔马林，并在室温下孵育 1 小时。 小心地取出福尔马林并向每个孔中加入 1 mL 冷的 70% 乙醇。
- 用封口膜密封板直到使用，以防止变干。
注意：ASC的细胞形态也通过不同传代期间的苏木精 - 伊红染色进行评估。 - 从每个孔中取出70%乙醇，并用蒸馏水水合细胞5分钟。同时，过滤染色溶液。
- 除去水，用哈里斯苏木精溶液缓慢搅拌染色细胞15分钟。
- 取出染色溶液，用1x PBS进行两次洗涤。
- 用伊红溶液缓慢搅拌1分钟对细胞进行染色。然后，取出溶液并用1x PBS进行两次洗涤。
- 小心地从每个孔中取出盖玻片，并将载玻片安装在一滴PBS-甘油安装溶液（1：1 v / v）上。
- 在盖玻片周围放置一行指甲油，并在光学显微镜下观察组织学载玻片。
5. 免疫荧光对ASC的表达标志物
- 制备含有1x PBS-0.05%吐温20的洗涤缓冲液。在室温下进行洗涤并缓慢摇动。用 2 mL 缓冲液/孔洗涤板 3 次（每次洗涤孵育 3 分钟）。
- 放入 1 mL 封闭试剂 （1：10） 并缓慢搅拌孵育 20 分钟。
- 向每个孔中加入 200 μL（1：50 稀释度）以下一抗：CD9（单克隆小鼠）、CD34（多克隆兔）和抗 CD63（多克隆山羊）。在4°C孵育过夜。
- 再次洗涤板三次，并与以下二抗的 200 μL（1：50 稀释液）孵育：抗小鼠 IgG FITC偶联山羊、驴抗山羊 IgG DyeLight 550 和山羊抗兔 IgG Cy3。
- 用 1x PBS-0.05% 吐温 20 洗涤 3 次，并用 100 μL DRAQ-7（稀释：1 μL 在 1 mL 双蒸水中）复染细胞核 20 分钟。
- 再清洗三次，然后按照步骤4.1.12-4.1.13安装载玻片。将样品避光保存并冷冻直至使用。
- 使用本设备推荐的正确设置和软件在落射荧光共聚焦显微镜下可视化样品。
6. 流式细胞术对ASC的表达标志物
- 从胰蛋白酶消化或解冻的细胞（子传代 3 或 4）中调整单细胞悬液，浓度为 1 x 106 细胞/mL 的 1x PBS-5% FBS。将 100 μL 与 100，000 个细胞分装在 1.5 mL 离心管中。使用一个不带标记的等分试样进行自发荧光对照。
- 根据制造商的说明，添加所有适量的抗CD105 AF-594和抗CD31 AF-680。在4°C下在黑暗中孵育20分钟。
- 用 1 mL 的 1x PBS-5% FBS 洗涤多余的污渍，以 250 x g 离心 5 分钟，并悬浮在 300 μL 1% 福尔马林中。
- 在流式细胞仪上进行样品采集。细胞的门控策略基于FSC-A与SSC-A门控，单细胞使用SSC-H与SSC-A进行门控，然后FSC-A与FSC-H。
- 将 Y610-mCherry-A 检测器用于 CD105 AF-594，将 R660-APC-A 检测器用于 CD31 AF-680。
7. ASC与脂肪谱系的分化
- 在6孔板中，每cm 2接种1 x 104个细胞（P -4），并在37°C，5%CO2下孵育，直到60-80%汇合（~72-96小时）。诱导分化，直接应用于培养基：4 μM 胰岛素、1 μM 地塞米松 21-乙酸酯 （Dxa） 和 0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 （MIX）。每2-3天更换一次分化培养基。
- 在2mL无菌超纯水中制备800μM胰岛素的储备溶液（加入20μL的1N HCl以确保完全溶解）并储存在-20°C。 加入 10 μL 胰岛素原液（先前以 1：100 稀释），并以每孔 2 mL 的最终体积施用 10 μL。
- 在 5 mL 无菌超纯水中制备 1 mM Dxa 的储备溶液（请注意，不会发生完全溶解）。储存在4°C。 加入 40 μL/孔的 1：4 稀释度的 Dxa 储备液。
- 在 2.5 mL 的 0.1 N NaOH 中制备 100 mM MIX 储备液，涡旋，然后加入 40 μL 1 N NaOH 以完全溶解。储存在-70°C。 加入 10 μL/孔的 MIX 储备液。
- 储存前通过0.22μm无菌注射器过滤器过滤储备溶液。
- 在第12天，用1x PBS洗涤细胞三次，并在室温下与500μL的4%福尔马林孵育1小时。 用蒸馏水洗涤每个孔两次，然后用60%异丙醇洗涤5分钟，然后晾干。
- 加入在60%异丙醇（500μL/孔）中稀释的0.5%油红O，并在室温下孵育20分钟。 用1mL蒸馏水洗涤三次，并在倒置显微镜下观察。
注意：有关所需的试剂、设备和材料，请参阅 材料表。
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Representative Results
脂肪组织取自3-4个月大的成年Sprague Dawley大鼠，体重为401±41g（几何平均值±SD）。附睾和肾周脂肪组织的平均值为3.8g对应于15次实验提取的分析。培养24小时后，细胞群仍然粘附在塑料表面上并表现出异质形态。第一次传代在8±2天实现，在总共8个实验中±0.6 x 106 个细胞的产量为1.4。直接明场观察（图1）和苏木精-伊红染色（图2）有助于用光学显微镜进行形态学表征。可以看到广泛的细胞质，具有细长的延长和丰富的细胞内微丝，这是间充质基质细胞的标志。
ASC表达在不同子传代（1、3、7和9）中通过间接免疫荧光特异性可视化的表面标志物（图3）。在所有测试的子传代中，ASC对CD9表面标志物均100%阳性。百分比是阳性细胞的数量相对于五个随机拍摄的显微照片中计数的总细胞数量。细胞（100%）在子传代1，3和9（P-1，P-3，P-9）中表达CD63标志物，而在P-7中表达49.3%。CD34标记物在第1、7和9代中为阴性，但在第3代中观察到阳性标记结果。此外，FCM的免疫表型分析显示，98.7%的细胞群对CD105呈阳性，而只有5.88%的细胞群表达CD31标志物（图4）。
最后，暴露于分化因子混合物12天的ASC显示出它们向脂肪谱系分化的能力（图5）。48小时后，我们观察到形态的第一次变化;细胞尺寸减小并呈现圆形。7 天后，可见脂质囊泡，分化后 12 天呈油红色染色阳性。
图1：从大鼠脂肪组织中提取的基质血管部分（SVF）并用0.075%胶原酶消化（24小时）。 （A） 储值支付工具（20倍）。（B）SVF随后进行了五次洗涤（10倍）。粘附在塑料表面上的细胞表现出异质形态：圆形，星形和纤维母细胞样外观（倒置显微镜）。比例尺代表 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：苏木精-伊红染色的形态学表征。 （A） ASC，P-1（10x）。（b） ASC、P-1、（C） P-3和（D） P-9（100x）。比例尺代表 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：IF评估ASC和外泌体的不同表达标志物。 轴 X：通道 1、3、7 和 9。 轴 Y：CD9：抗小鼠 IgG FITC共轭山羊;CD63：山羊抗兔IgG Cy3;和CD34：驴防山羊IgG染料灯550。用DraQ7染色成蓝色的细胞核（40倍放大倍率，1倍变焦）。比例尺在每个面板中代表 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：通过流式细胞术鉴定ASC。 （A-C）根据FSC-A与SSC-A门控选择的样品，使用SSC-H与SSC-A进行门控的单细胞，然后FSC-A与FSC-H进行门控。（D，E）自体荧光对照（未标记细胞）。（法，八）ASC分别用抗CD105 AF-594（Y610 mCherry;阳性标志物）和抗CD31 AF-680（R660-APC-A检测器;阴性标记物）标记。请点击此处查看此图的大图。
图5：大鼠脂肪组织间充质基质细胞的功能评估。 （A） 控制 （10x）。（B）脂肪分化10倍，（C）20倍和（D）40倍。诱导12天时卵胞浆内脂滴呈油红色染料阳性（相差显微镜）。比例尺代表 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
自发现间充质干细胞以来的过去四十年中，几组研究人员已经描述了从不同组织和物种获得间充质干细胞的程序。使用大鼠作为动物模型的优点之一是它们易于维护和快速发育，以及易于从脂肪组织获得MSC。已经描述了用于获得ASC的不同组织来源，例如内脏，肾周，附睾和皮下脂肪12，13，14，15，16。
关于这里采用的提取程序，作者建议大鼠的体重应在350-450克之间，可以在生命的前4个月内实现。当动物体重在450-600g之间且年龄达8个月时，每只大鼠的脂肪组织量（5.5±2.1;平均±SD）较高;然而，ASC的数量并没有成比例地增加（数据未显示）。这些观察结果与González 3的观察结果一致，与其他来源相比，González3还将具有更高活力和粘附性的人群转介到从皮下组织获得的培养表面。另一方面，与抽脂术获得的ASC相比，活检切除术的ASC表现出更大的活力，频率和复制能力7。在本研究中，所研究年龄的大鼠的皮下组织非常稀少。因此，我们决定通过手术切除去除附睾和肾周区域附近的脂肪组织，这些脂肪组织参与与葡萄糖和脂质调节相关的脂肪因子的合成和分泌，以及炎症16。
目前用于分离脂肪组织来源的MSC的方案依赖于无酶处理程序，例如外植体培养17，以及使用酶处理来实现近乎全组织的解聚18。所提出的程序相对简单，包括机械解聚，酶解聚和连续洗涤细胞悬液。后者用于从祖细胞中去除尽可能多的不相关细胞，从而获得其表面标志物的最小表达（<5%）。有趣的是，获得的SVF量可能取决于脂肪组织酶解聚中使用的胶原酶的类型。强烈建议将I型胶原酶用于脂肪细胞分离，尽管也报道使用II型19 和VIII型20，21。在本工作中，我们使用IV型胶原酶，具有低酶活性，通常用于处理胰腺组织。因此，获得较低的ASC产量，但也存在较少的膜损伤。这可以修改某些表面标记的表达式，从而修改其功能。另一方面，用于扩展培养物的低分裂率允许菌落的形成和更大的增殖能力。
根据形态学，间充质细胞主要有三种类型：小细胞、细长细胞和具有大细胞核的大扁平细胞，繁殖缓慢。这些形式可能与内在品质有关，例如它们的分化潜力22。在ASC原代培养物中观察到的形态与这些作者报告的结果一致。在评估的所有阶段，细胞质中也可以看到大量微丝，这证实了研究中获得的ASC的成纤维细胞形态23，24，25。此外，需要免疫表型来确认分离细胞的间充质性质。ISCT和IFATS建议使用一些标记，尽管其他替代方法也是可能的。众所周知，MSCs可以产生大量的外泌体26，这些外泌体26是分泌到具有特定蛋白质含量的细胞外培养基中的小囊泡。由于它们的内体起源，它们含有融合和膜转运蛋白（GTP酶，膜联蛋白和flotlin），四蛋白（CD9，CD63，CD81和CD82）等，也表达在它们起源的细胞表面17，18。这项研究的局限性是没有评估广泛的标志物。但是，在同一测试中使用至少两个阳性和阴性标记是可以接受的。
在这项工作中，具有外泌体标记物的间接免疫荧光揭示了从ASC到子传代1，3，7和9中的CD9和CD63标记物的阳性信号。由于在第7通道中观察到的信号很弱，因此使用ISCT和IFATS推荐的那些标记以获得更好的结果非常重要。CD34是一种表面抗原，被认为是内皮和造血细胞标志物，也是脂肪组织SVF来源细胞的阳性标志物。然而，它在天然ASC上的表达与体外细胞扩增呈负相关27。CD34+细胞百分比取决于脂肪组织收获的方法，血管出血的程度以及随后的消化和分离技术。尽管ASC始终表达不同的标志物，但它们的动力学已被证明在体外扩增期间发生变化28，29，正如使用所提出的方法获得的结果所证明的那样。
目前，没有获取ASC的标准化协议。结果是可变的，因为不同的因素会改变其形态和功能。供体的年龄和健康状况、来源和ASC的培养条件是其中一些因素。拟议方法的重点是涵盖各种调查目的的可重复方法的标准化。科学界正在努力寻找新的治疗方案，用于诊断、控制和治疗包括糖尿病在内的各种代谢疾病。因此，方法程序的披露也是相关的。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢墨西哥社会保障研究所（IMSS）和墨西哥儿童医院，Federico Gomez（HIMFG）和IMSS研究协调的Bioterio工作人员为开展该项目提供的支持。我们感谢国家科学技术委员会提供的AOC（815290）奖学金和安东尼奥·杜阿尔特·雷耶斯在视听材料方面的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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