Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rats Sprague Dawley
Summary
Ce protocole décrit une méthodologie pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSM) de rats Sprague Dawley.
Abstract
Les cellules mésenchymateuses adultes ont révolutionné la biologie moléculaire et cellulaire au cours des dernières décennies. Ils peuvent se différencier en différents types de cellules spécialisées, en plus de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de migration et de prolifération. Le tissu adipeux est l’une des sources les moins invasives et les plus accessibles de cellules mésenchymateuses. Il a également été rapporté pour avoir des rendements plus élevés par rapport à d’autres sources, ainsi que des propriétés immunomodulatrices supérieures. Récemment, différentes procédures pour obtenir des cellules mésenchymateuses adultes à partir de différentes sources de tissus et d’espèces animales ont été publiées. Après avoir évalué les critères de certains auteurs, nous avons normalisé une méthodologie applicable à différents usages et facilement reproductible. Un pool de fraction vasculaire stromale (SVF) provenant de tissus adipeux périrénaux et épididymaires nous a permis de développer des cultures primaires avec une morphologie et une fonctionnalité optimales. Les cellules ont été observées collées à la surface plastique pendant 24 h et présentaient une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste, avec des prolongements et une tendance à former des colonies. Des techniques de cytométrie en flux (FC) et d’immunofluorescence (IF) ont été utilisées pour évaluer l’expression des marqueurs membranaires CD105, CD9, CD63, CD31 et CD34. La capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSA) à se différencier dans la lignée adipogène a également été évaluée à l’aide d’un cocktail de facteurs (4 μM d’insuline, 0,5 mM de 3-méthyl-iso-butyl-xanthine et 1 μM de dexaméthasone). Après 48 h, une perte progressive de la morphologie fibroblastoïde a été observée, et à 12 jours, la présence de gouttelettes lipidiques positives à la coloration rouge d’huile a été confirmée. En résumé, une procédure est proposée pour obtenir des cultures d’ASC optimales et fonctionnelles pour une application en médecine régénérative.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont fortement impacté la médecine régénérative en raison de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de prolifération, de migration et de différenciation en différentes lignées cellulaires 1,2. Actuellement, de nombreuses recherches se concentrent sur leur potentiel pour le traitement et le diagnostic de diverses maladies.
Il existe différentes sources de cellules mésenchymateuses: moelle osseuse, muscle squelettique, liquide amniotique, follicules pileux, placenta et tissu adipeux, entre autres. Ils sont obtenus à partir de différentes espèces, y compris les humains, les souris, les rats, les chiens et les chevaux3. Les CSM dérivées de la moelle osseuse (CSMB) sont utilisées depuis de nombreuses années comme source majeure de cellules souches en médecine régénérative et comme alternative à l’utilisation de cellules souches embryonnaires4. Cependant, les CSM dérivées du tissu adipeux, ou cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSA), sont une alternative importante avec de grands avantages en raison de leur facilité de collecte et d’isolement, ainsi que du rendement en cellules obtenues par gramme de tissu adipeux 5,6. Il a été signalé que le taux de récolte des ASC est généralement plus élevé que celui des CSB7. Il a été initialement proposé que la capacité réparatrice / régénérative des ASC était due à leur capacité à se différencier en d’autres lignées cellulaires8. Cependant, les recherches menées ces dernières années ont renforcé le rôle primordial des facteurs paracrines libérés par les ASC dans leur potentiel réparateur 9,10.
Le tissu adipeux (AT), en plus d’être une réserve d’énergie, interagit avec les systèmes endocrinien, nerveux et cardiovasculaire. Il est également impliqué dans la croissance et le développement postnatals, le maintien de l’homéostasie tissulaire, la réparation des tissus et la régénération. L’AT est composé d’adipocytes, de cellules musculaires lisses vasculaires, de cellules endothéliales, de fibroblastes, de monocytes, de macrophages, de lymphocytes, de préadipocytes et d’ASC. Ces derniers possèdent un rôle important en médecine régénérative en raison de leur faible immunogénicité11,12. Les ASC peuvent être obtenus par digestion enzymatique et traitement mécanique ou par explants de tissu adipeux. Les cultures primaires des ASC sont faciles à maintenir, à développer et à développer. La caractérisation phénotypique des ASC est essentielle pour vérifier l’identité des cellules en évaluant l’expression de marqueurs membranaires spécifiques à l’aide de méthodes telles que l’immunofluorescence et la cytométrie en flux13. L’International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) et l’International Society for Cellular Therapy (ISCT) ont défini que les ASC expriment CD73, CD90 et CD105, tout en manquant de l’expression de CD11b, CD14, CD19, CD45 et HLA-DR14. Ces marqueurs, tant positifs que négatifs, sont donc considérés comme fiables pour la caractérisation des ASC.
Ce projet était axé sur la description d’une procédure d’isolement et d’identification de cellules mésenchymateuses adultes extraites de l’AT de rats, car cette source de cellules ne présente pas de défis éthiques, contrairement aux cellules souches embryonnaires. Cela solidifie la procédure en tant qu’option viable en raison de la facilité d’accès et de la méthode peu invasive par rapport aux cellules souches dérivées de la moelle osseuse.
Les cellules mésenchymateuses de cette source tissulaire jouent un rôle important dans la médecine régénérative en raison de leurs capacités immunomodulatrices et de leur faible rejet immunitaire. Par conséquent, la présente étude est un élément fondamental de la recherche future sur leur sécrétome et leur application en tant que thérapie régénérative dans différentes maladies, y compris les maladies métaboliques telles que le diabète.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours des quatre dernières décennies, depuis la découverte des CSM, plusieurs groupes de chercheurs ont décrit des procédures pour obtenir des CSM à partir de différents tissus et espèces. L’un des avantages de l’utilisation de rats comme modèle animal est leur facilité d’entretien et leur développement rapide, ainsi que la facilité d’obtenir des CSM à partir de tissu adipeux. Différentes sources tissulaires ont été décrites pour obtenir des ASC, telles que la graisse viscérale, périrénale,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient l’Institut mexicain de sécurité sociale (IMSS) et l’Hôpital pour enfants du Mexique, Federico Gomez (HIMFG) et le personnel Bioterio de la coordination de recherche de l’IMSS, pour le soutien apporté à la réalisation de ce projet. Nous remercions le Conseil national de la science et de la technologie pour la bourse AOC (815290) et Antonio Duarte Reyes pour le soutien technique dans le matériel audiovisuel.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. . Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
