Summary
В этом протоколе описывается методология выделения и идентификации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), полученных из жировой ткани, от крыс Sprague Dawley.
Abstract
Взрослые мезенхимальные клетки произвели революцию в молекулярной и клеточной биологии в последние десятилетия. Они могут дифференцироваться в различные специализированные типы клеток, в дополнение к их большой способности к самообновлению, миграции и пролиферации. Жировая ткань является одним из наименее инвазивных и наиболее доступных источников мезенхимальных клеток. Также сообщалось, что он имеет более высокие урожаи по сравнению с другими источниками, а также превосходные иммуномодулирующие свойства. В последнее время были опубликованы различные процедуры получения взрослых мезенхимальных клеток из разных источников тканей и видов животных. Оценив критерии некоторых авторов, мы стандартизировали методологию, которая применима к разным целям и легко воспроизводима. Пул стромально-васкулярной фракции (СВФ) из околопочечной и придатковой жировой ткани позволил разработать первичные культуры с оптимальной морфологией и функциональностью. Наблюдалось, что клетки прилипали к пластиковой поверхности в течение 24 часов и проявляли фибробластоподобную морфологию с удлинениями и тенденцией к образованию колоний. Методы проточной цитометрии (ФК) и иммунофлуоресценции (ИФ) использовались для оценки экспрессии мембранных маркеров CD105, CD9, CD63, CD31 и CD34. Способность стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ИСС), дифференцироваться в адипогенную линию также оценивалась с использованием коктейля факторов (инсулин 4 мкМ, 3-метил-изо-бутилксантин 0,5 мМ и дексаметазон 1 мкМ). Через 48 ч наблюдалась постепенная потеря морфологии фибробластоидов, а через 12 дней было подтверждено наличие липидных капель, положительных для окрашивания масла в красный цвет. Таким образом, предложена процедура получения оптимальных и функциональных культур ASC для применения в регенеративной медицине.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) оказали сильное влияние на регенеративную медицину из-за их высокой способности к самообновлению, пролиферации, миграции и дифференцировке в различные клеточные линии 1,2. В настоящее время большое количество исследований сосредоточено на их потенциале для лечения и диагностики различных заболеваний.
Существуют различные источники мезенхимальных клеток: костный мозг, скелетные мышцы, амниотическая жидкость, волосяные фолликулы, плацента и жировая ткань. Их получают от разных видов, включая людей, мышей, крыс, собак и лошадей3. МСК, полученные из костного мозга (BMSC), уже много лет используются в качестве основного источника стволовых клеток в регенеративной медицине и в качестве альтернативы использованию эмбриональных стволовых клеток4. Тем не менее, МСК, полученные из жировой ткани, или стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ASC), являются важной альтернативой с большими преимуществами из-за простоты их сбора и выделения, а также выхода клеток, полученных на грамм жировой ткани 5,6. Сообщалось, что урожайность ИСС, как правило, выше, чем у БМСК7. Первоначально было высказано предположение, что репаративная/регенеративная способность ИСС обусловлена их способностью дифференцироваться в другие клеточные линии8. Однако исследования последних лет подтвердили первостепенную роль паракринных факторов, выделяемых ИСС, в их репаративном потенциале 9,10.
Жировая ткань (АТ), помимо того, что является энергетическим резервом, взаимодействует с эндокринной, нервной и сердечно-сосудистой системами. Он также участвует в постнатальном росте и развитии, поддержании гомеостаза тканей, восстановлении и регенерации тканей. АТ состоит из адипоцитов, клеток гладких мышц сосудов, эндотелиальных клеток, фибробластов, моноцитов, макрофагов, лимфоцитов, преадипоцитов и ИСС. Последние играют важную роль в регенеративной медицине из-за их низкой иммуногенности11,12. ASC могут быть получены путем ферментативного расщепления и механической обработки или эксплантатами жировой ткани. Первичные культуры ИСС легко поддерживать, выращивать и расширять. Фенотипическая характеристика ИСС имеет важное значение для проверки идентичности клеток путем оценки экспрессии специфических мембранных маркеров с использованием таких методов, как иммунофлуоресценция и проточная цитометрия13. Международная федерация жировой терапии и науки (IFATS) и Международное общество клеточной терапии (ISCT) определили, что ASC экспрессируют CD73, CD90 и CD105, в то время как в них отсутствует экспрессия CD11b, CD14, CD19, CD45 и HLA-DR14. Таким образом, эти маркеры, как положительные, так и отрицательные, считаются надежными для характеристики ИСС.
Этот проект был сосредоточен на описании процедуры выделения и идентификации взрослых мезенхимальных клеток, извлеченных из АТ крыс, поскольку этот источник клеток не представляет этических проблем, в отличие от эмбриональных стволовых клеток. Это делает процедуру жизнеспособным вариантом из-за простоты доступа и минимально инвазивного метода по сравнению со стволовыми клетками, полученными из костного мозга.
Мезенхимальные клетки из этого тканевого источника играют важную роль в регенеративной медицине из-за их иммуномодулирующих способностей и низкого иммунного отторжения. Таким образом, настоящее исследование является фундаментальной частью будущих исследований их секретома и их применения в качестве регенеративной терапии при различных заболеваниях, включая метаболические заболевания, такие как диабет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с мексиканскими рекомендациями по уходу за животными, основанными на рекомендациях Международной ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Протокол был рассмотрен, одобрен и зарегистрирован Комитетом по этике исследований в области здравоохранения Мексиканского социального института (R-2021-785-092).
1. Удаление жировой ткани у крыс путем хирургической резекции
- Подготовьте две конические пробирки с 20 мл стерильного 1x фосфатного буферного физиологического раствора антибиотика (PBS-AA) (1x PBS, гентамицин [20 мкг / мл] и амфотерицин [0,5 мкг / мл]) и держите на льду.
- Выберите двух взрослых самцов крыс породы Sprague Dawley (R. norvegicus) в хорошем состоянии здоровья. Убедитесь, что крысы находятся в возрасте от 3 до 4 месяцев и имеют общий вес 350-450 г.
- Приступайте к седации 20 мг / кг гидрохлорида ксилазина, а через 5 минут введите анестетик в дозе 120 мг / кг гидрохлорида кетамина внутрибрюшинно. Смажьте оба глаза офтальмологической мазью, чтобы предотвратить высыхание. Затем подтвердите глубину анестезии с помощью отсутствия педального рефлекса.
- Побрейте и продезинфицируйте брюшную и паховую область раствором йода. Применяйте хирургические простыни для поддержания стерильности. Затем сделайте срединный продольный разрез от грудины до области яичек.
- Удалите жировую ткань, окружающую придаток яичка и почки, стерильными щипцами и поместите в 1x раствор PBS-AA. Храните образцы на льду.
- Зашивайте разрез, если это требуется в соответствии с руководящими принципами учреждения, и усыпляйте животных внутрисердечной дозой 40 мг / кг пентобарбитала натрия. Как только смерть будет подтверждена, утилизируйте тушу в соответствии с институциональной процедурой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смерть вызывает сигнальные механизмы, которые влияют на иммунофенотип, способность к дифференцировке и паракринный эффект мезенхимальных клеток. Следовательно, сбор тканей проводится перед эвтаназией.
2. Выделение мезенхимальных клеток из жировой ткани
- Удалите жировую ткань стерильными щипцами в шкафу биобезопасности и поместите ее на стерильную фильтровальную бумагу в чашку Петри диаметром 100 мм, чтобы поглотить излишки PBS.
- Перенесите жировую ткань в другую чашку Петри и выполните три промывки в течение 5 минут каждое 10 мл 1x раствора PBS-AA с помощью пипетки объемом 10 мл.
- Механически разложите ткань на фрагменты примерно по 1 см2 с помощью ножниц и скальпеля.
- Приготовьте коллагеназу IV типа (0,075%) в 20 мл модифицированной среды Дульбекко (DMEM) без добавок. Фильтруйте через шприцевой фильтр 0,22 мкм и храните при температуре 37 °C.
- Добавьте раствор коллагеназы (20 мл), приготовленный на этапе 2.4, в кристаллический стакан с фрагментированной тканью и магнитным стержнем. Закройте контейнер и инкубируйте при медленном и непрерывном перемешивании при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативное переваривание занимает около 90 минут (поддерживайте медленное перемешивание, чтобы сохранить целостность клеточных мембран). - Отфильтруйте гомогенат через фильтр из нержавеющей стали 40 меш с апертурой 0,38 мм на чашке Петри диаметром 100 мм и соберите клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
- Добавьте 20 мл подогретого ДМЭМ (10% фетальная бычья сыворотка [FBS], 2 мМ глютамина, 2 мМ пирувата натрия, 100-кратный раствор заменимых аминокислот и 100-кратный антимикотический раствор антибиотика [АА]). Осторожно суспендировать стромально-васкулярную фракцию (СВЕ).
- Центрифугируйте клеточную суспензию при 290 x g в течение 10 мин, выбросьте надосадочную жидкость пипеткой объемом 25 мл и осторожно промойте клетки 40 мл среды DMEM без добавок.
- Повторите этот шаг. Используйте новую стерильную коническую трубку между шагами, чтобы протащить наименьшее количество клеточного детрита и жира.
- Суспендировать гранулы в 5 мл дополненного ДМЭМ с помощью пипетки объемом 5 мл и переложить во флакон Т-25 см2 . Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2.
- На следующий день выполните три промывания 5 мл подогретого 1x PBS-AA и два промывания без добавок DMEM для удаления клеточного мусора и неадгезивных клеток. Добавьте 5 мл свежего, подогретого, дополненного ДМЭМ пипеткой объемом 5 мл и меняйте среду каждые 3-4 дня.
3. Сохранение и расширение первичных культур ИСС
- Как только клетки достигнут слияния 90%-100% (8 ± 2 дня), дважды промойте 5 мл ДМЭМ без добавок. Добавьте 1 мл подогретого 0,025% трипсина-2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубируйте в течение 5-7 минут при 37 ° C.
- Когда клеточный монослой отслоится, добавьте 4 мл дополненного DMEM и аккуратно дезагрегируйте клеточную суспензию.
- Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл, добавьте 5 мл нагретого дополненного DMEM и осторожно суспендируйте для гомогенизации.
- Центрифуга при 290 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и аккуратно смешайте гранулы с 1 мл добавленного ДМЭМ. Подсчитайте клетки в камере Нойбауэра после окрашивания трипановым синим.
- Наконец, высевают 2,5 x 103 ячейки / см2 с соотношением сторон 1: 4 в колбах Т-75. Этот этап обеспечивает образование колоний и высокую скорость пролиферации.
4. Морфологическая характеристика первичных культур ИСС
- Наблюдайте морфологию ИСС при инвертированной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед установкой для гистологии и идентификации ASC обработайте покровные стекла 1% раствором желатина. Облучать ультрафиолетом в течение 15 мин.- Извлеките покровные стекла из 70% раствора этанола и дайте им высохнуть в течение 5 минут.
- Погрузите покровные стекла в стерильный 1% раствор желатина, слейте воду и высушите при комнатной температуре (RT).
- Поместите каждое покровное стекло в каждую лунку 6-луночной пластины и облучайте пластины ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
- Засейте каплю, содержащую 25 x 103 клеток, в центр лунки, подождите 1 минуту и добавьте 1 мл добавленной среды DMEM. Инкубировать в течение 96 ч при 37 °C и 5% CO2.
- Удалите среду и выполните три стирки 1x PBS-AA с помощью пипетки для переноса.
- Добавьте 1 мл 3,5% нейтрального формалина в каждую лунку и инкубируйте в течение 1 ч при RT. Осторожно удалите формалин и добавьте 1 мл холодного 70% этанола в каждую лунку.
- Запечатайте пластину парапленкой до использования, чтобы предотвратить высыхание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная морфология ИСС также оценивается путем окрашивания гематоксилин-эозином во время различных пассажей. - Удалите 70% этанола из каждой лунки и гидратируйте клетки в течение 5 минут дистиллированной водой. Тем временем отфильтруйте окрашивающие растворы.
- Удалите воду и окрашивайте клетки при медленном перемешивании в течение 15 минут раствором гематоксилина Харриса.
- Удалите пятновыводящий раствор и выполните две стирки с 1x PBS.
- Окрашивают клетки раствором эозина при медленном перемешивании в течение 1 мин. Затем удалите раствор и выполните две стирки с 1x PBS.
- Осторожно снимите покровные стекла с каждой лунки и установите направляющие на каплю монтажного раствора PBS-глицерина (1:1 v/v).
- Нанесите линию лака для ногтей вокруг покровного стекла и понаблюдайте за гистологическими предметными стеклами под световым микроскопом.
5. Маркеры экспрессии ИСС методом иммунофлюоресценции
- Подготовьте буфер для стирки, содержащий 1x PBS-0,05% Tween 20. Выполняйте стирку при RT и медленном встряхивании. Вымойте пластины три раза с 2 мл буфера/лунки (выдерживайте в течение 3 минут при каждой стирке).
- Поместите 1 мл блокирующего реагента (1:10) и инкубируйте при медленном перемешивании в течение 20 минут.
- Добавьте 200 мкл (разведение 1:50) следующих первичных антител в каждую лунку: CD9 (моноклональная мышь), CD34 (поликлональный кролик) и анти-CD63 (поликлональная коза). Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
- Вымойте пластины еще раз три раза и инкубируйте с 200 мкл (разведение 1:50) следующих вторичных антител: конъюгированный козий IgG FITC против мыши, IgG DyeLight 550 против осла и IgG Cy3 против коз против кролика.
- Промойте три раза 1x PBS-0,05% Tween 20 и покрасьте ядра клеток 100 мкл DRAQ-7 (разведение: 17 мкл в 1 мл двойной дистиллированной воды) в течение 20 мин.
- Вымойте еще три раза и установите горки в соответствии с шагами 4.1.12-4.1.13. Храните образцы в защищенном от света и замороженном месте до использования.
- Визуализируйте образцы при эпифлуоресцентной конфокальной микроскопии, используя соответствующие настройки и программное обеспечение, рекомендованное для этого оборудования.
6. Маркеры экспрессии ИСС методом проточной цитометрии
- Отрегулируйте одноклеточную суспензию из трипсинизированных или размороженных клеток (субпассажи 3 или 4) в концентрации 1 x 106 клеток / мл 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 мкл со 100 000 клеток в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Используйте одну аликвоту без маркировки для контроля автофлуоресценции.
- Добавьте в остальное все необходимое количество Anti-CD105 AF-594 и Anti-CD31 AF-680 в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать в темноте 20 мин при 4 °C.
- Отмойте излишки пятна 1 мл 1x PBS-5% FBS центрифугированием при 250 x g в течение 5 мин и суспендируйте в 300 мкл 1% формалина.
- Выполните сбор образца на проточном цитометре. Стратегия стробирования ячеек основана на стробировании FSC-A против SSC-A, одиночные клетки закрыты с использованием SSC-H против SSC-A, за которыми следует FSC-A против FSC-H.
- Используйте детектор Y610-mCherry-A для CD105 AF-594 и детектор R660-APC-A для CD31 AF-680.
7. Дифференциация ИСС в адипогенную линию
- В 6-луночную пластину высевают 1 x 10 4 клеток (P-4) на см 2 и инкубируют при 37 ° C, 5% CO2, до слияния 60-80% (~ 72-96 ч). Индуцируют дифференцировку, применяя непосредственно к питательной среде: 4 мкМ инсулина, 1 мкМ дексаметазона 21-ацетата (Dxa) и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (MIX). Меняйте дифференцированную среду каждые 2-3 дня.
- Приготовьте исходный раствор 800 мкМ инсулина в 2 мл стерильной сверхчистой воды (добавьте 20 мкл 1 N HCl для обеспечения полного растворения) и храните при -20 °C. Добавьте 10 мкл инсулина, предварительно разбавленного 1:100, и внесите 10 мкл в конечном объеме 2 мл на лунку.
- Приготовьте исходный раствор 1 мМ Dxa в 5 мл стерильной сверхчистой воды (обратите внимание, что полного растворения не происходит). Хранить при температуре 4 °C. Добавьте 40 мкл на лунку разбавления Dxa в соотношении 1:4.
- Приготовьте запас из 100 мМ MIX в 2,5 мл 0,1 N NaOH, вихревой и добавьте 40 мкл 1 N NaOH для полного растворения. Хранить при температуре -70 °C. Добавьте 10 мкл / лунку бульона MIX.
- Перед хранением отфильтруйте исходные растворы через стерильный шприцевой фильтр размером 0,22 мкм.
- На 12-й день трижды промойте клетки 1x PBS и инкубируйте с 500 мкл 4% формалина в течение 1 ч при ЛТ. Промойте каждую лунку дважды дистиллированной водой, затем 60% изопропанолом в течение 5 мин и дайте высохнуть.
- Добавьте 0,5% масляный красный O, разбавленный 60% изопропанолом (500 мкл / лунка), и инкубируйте в течение 20 мин при RT. Промойте 1 мл дистиллированной воды три раза и наблюдайте под перевернутым микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о необходимых реагентах, оборудовании и материалах см. в таблице материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жировая ткань была получена от взрослых крыс Sprague Dawley в возрасте 3-4 месяцев и с массой тела 401 ± 41 г (среднее геометрическое ± SD). Среднее значение 3,8 г придатка яичка и околопочечной жировой ткани соответствовало анализу 15 экспериментальных экстракций. После 24 ч культивирования клеточные популяции оставались прилипшими к пластиковой поверхности и демонстрировали гетерогенную морфологию. Первый пассаж был реализован через 8 ± 2 дня с выходом 1,4 ± 0,6 х 106 клеток в общей сложности в восьми экспериментах. Прямое наблюдение в светлом поле (рис. 1) и окрашивание гематоксилин-эозином (рис. 2) облегчили морфологическую характеристику с помощью световой микроскопии. Была видна обширная цитоплазма с удлиненными продолжениями и обильными внутриклеточными микрофиламентами, что является отличительной чертой мезенхимальных стромальных клеток.
ИСС экспрессировали поверхностные маркеры, специфически визуализированные с помощью непрямой иммунофлуоресценции в различных подпассерах (1, 3, 7 и 9) (рис. 3). ASC были на 100% положительными на поверхностные маркеры CD9 во всех протестированных подпроходах. Процент - это количество положительных клеток по отношению к общему количеству клеток, подсчитанных на пяти случайно взятых микрофотографиях. Клетки (100%) экспрессировали маркеры CD63 в подпасах 1, 3 и 9 (Р-1, Р-3, Р-9), в то время как 49,3% - в Р-7. Маркер CD34 был отрицательным в проходах 1, 7 и 9, но положительные результаты маркировки наблюдались в проходе 3. Кроме того, иммунофенотипирование с помощью FCM показало, что 98,7% клеточной популяции были положительными на CD105, в то время как только 5,88% экспрессировали маркер CD31 (рис. 4).
Наконец, ИСС, подвергшиеся воздействию коктейля факторов дифференцировки в течение 12 дней, показали свою способность дифференцироваться в сторону адипогенной линии (рис. 5). Через 48 ч мы наблюдали первые изменения морфологии; Клетки уменьшились в размерах и приобрели округлую форму. Через 7 дней были видны липидные везикулы, которые были положительными для окрашивания масла в красный цвет через 12 дней после дифференцировки.
Рисунок 1: Стромально-васкулярная фракция (SVF), извлеченная из жировой ткани крысы и расщепленная 0,075% коллагеназой (через 24 часа). (А) SVF (20x). (B) SVF последовал за пятью промывками (10x). Клетки, прилипшие к пластиковой поверхности, имеют гетерогенную морфологию: округлые, звездообразные и фибробластоидные по внешнему виду (перевернутый микроскоп). Масштабная линейка представляет собой 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфологическая характеристика при окрашивании гематоксилин-эозином. (A) ASC, С-1 (10x). b) ИСУ, С-1, С) С-3 и D) С-9 (100x). Масштабная линейка представляет собой 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка различных маркеров экспрессии ИСС и экзосом с помощью ИФ. Ось X: проходы 1, 3, 7 и 9. Ось Y: CD9: конъюгированная коза IgG FITC против мыши; CD63: козий антикролик IgG Cy3; и CD34: ослиный антикозий краситель IgG DyeLight 550. Ядра окрашены в синий цвет с помощью DraQ7 (40-кратное увеличение, 1-кратное увеличение). Масштабная линейка представляет 100 мкм в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Идентификация ASC с помощью проточной цитометрии. (A-C) Образцы, отобранные на основе стробирования FSC-A по сравнению с SSC-A, одиночные клетки, закрытые с использованием SSC-H по сравнению с SSC-A, за которыми следует FSC-A по сравнению с FSC-H. (Д,Е) Контроль автофлуоресценции (немеченые клетки). (Ф,Г) ASC, помеченные анти-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; положительный маркер) и анти-CD31 AF-680 (детектор R660-APC-A; отрицательный маркер) соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Функциональная оценка мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани крысы. (А) Контроль (10x). (B) Адипогенная дифференцировка 10x, (C) 20x и (D) 40x. Интрацитоплазматические липидные капли положительны на масляный красный краситель через 12 дней индукции (фазово-контрастная микроскопия). Масштабная линейка представляет собой 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
За последние четыре десятилетия с момента открытия МСК несколько групп исследователей описали процедуры получения МСК из разных тканей и видов. Одним из преимуществ использования крыс в качестве животной модели является простота их содержания и быстрого развития, а также легкость получения МСК из жировой ткани. Для получения ИСС были описаны различные тканевые источники, такие как висцеральный, перипочечный, придатковый и подкожный жир 12,13,14,15,16.
Что касается используемой здесь процедуры экстракции, авторы рекомендуют, чтобы крысы весили от 350 до 450 г, что достижимо в первые 4 месяца жизни. Когда животные весили от 450 до 600 г и были в возрасте до 8 месяцев, количество жировой ткани на крысу (5,5 ± 2,1; среднее значение ± SD) было выше; однако количество ИСС не увеличивалось пропорционально (данные не показаны). Эти наблюдения согласуются с наблюдениями, сделанными Гонсалесом3, который также отнес популяции с более высокой жизнеспособностью и адгезивностью к поверхности культуры, полученной из подкожной клетчатки, по сравнению с другими источниками. С другой стороны, ИСС от биопсийной резекции демонстрируют большую жизнеспособность, частоту и репликативную способность по сравнению с теми, которые получены с помощью липосакции7. В настоящем исследовании подкожная клетчатка крыс в изучаемом возрасте была очень скудной. Поэтому мы решили удалить жировую ткань, прилегающую к придатку яичка и околопочечной области, которые участвуют в синтезе и секреции адипокинов, имеющих отношение к регуляции глюкозы и липидов, а также к воспалению16, путем хирургической резекции.
Современные протоколы выделения МСК, полученных из жировой ткани, основаны на процедурах обработки без ферментов, таких как эксплантная культура17, а также на использовании ферментативных методов лечения для достижения почти полной дезагрегациитканей 18. Предлагаемая процедура относительно проста и включает механическую дезагрегацию, ферментативную дезагрегацию и последовательную промывку клеточной суспензии. Последний выполняется для удаления как можно большего количества неродственных клеток из клеток-предшественников и, таким образом, получения минимальной экспрессии (<5%) их поверхностных маркеров. Интересно, что количество SVF для получения может зависеть от типа коллагеназы, используемой при ферментативной дезагрегации жировой ткани. Коллагеназа I типа настоятельно рекомендуется для выделения адипоцитов, хотя также сообщается об использовании типа II19 и типа VIII20,21. В настоящей работе мы использовали коллагеназу IV типа, обладающую низкой ферментативной активностью, обычно используемую для обработки ткани поджелудочной железы. Таким образом, получается меньший выход ИСС, но и меньшее повреждение мембраны. Это может изменить экспрессию некоторых поверхностных маркеров и, следовательно, их функциональность. С другой стороны, низкий коэффициент расщепления, используемый при расширении культуры, позволил сформировать колонии и повысить пролиферативную способность.
Согласно морфологии, существует три основных типа мезенхимальных клеток: мелкие клетки, удлиненные клетки и большие уплощенные клетки с большими ядрами, которые медленно размножаются. Эти формы, вероятно, связаны с внутренними качествами, такими как их дифференциирующий потенциал22. Морфология, наблюдаемая в первичных культурах ИСС, согласуется с результатами, представленными этими авторами. Большое количество микрофиламентов в цитоплазме также было видно на всех оцениваемых стадиях, что подтверждает фибробластоидную морфологию ИСС, полученную в исследовании23,24,25. Дополнительно требуется иммунофенотипирование для подтверждения мезенхимальной природы выделенных клеток. ISCT и IFATS рекомендуют использовать некоторые маркеры, хотя возможны и другие альтернативы. Известно, что МСК могут продуцировать большое количество экзосом26, которые представляют собой небольшие везикулы, секретируемые во внеклеточную среду с определенным содержанием белка. Из-за своего эндосомального происхождения они содержат слитые и мембранные транспортные белки (ГТФазы, аннексины и флотиллин), тетраспанины (CD9, CD63, CD81 и CD82), среди прочих, также экспрессируемые на поверхности клеток, из которых они происходят17,18. Ограничением этого исследования является то, что широкая панель маркеров не оценивается. Тем не менее, допускается использование как минимум двух положительных и отрицательных маркеров в одном и том же тесте.
В этой работе непрямая иммунофлюоресценция с экзосомальными маркерами выявила положительный сигнал от ASC к маркерам CD9 и CD63 в подпассажах 1, 3, 7 и 9. Поскольку сигнал, наблюдаемый в отрывке 7, был слабым, было бы важно использовать те маркеры, которые рекомендованы МСКТ и IFATS, для получения лучших результатов. CD34 является поверхностным антигеном, признанным маркером эндотелиальных и гемопоэтических клеток и положительным маркером клеток, полученных из SVF жировой ткани. Однако его экспрессия на нативных ИСС отрицательно коррелирует с экспансией клеток in vitro27. Процентное содержание CD34+ клеток зависит от способа забора жировой ткани, степени сосудистого кровоизлияния и последующих методов пищеварения и выделения. Несмотря на то, что ИСС последовательно экспрессируют разные маркеры, показано, что их динамика изменяется при расширении in vitro 28,29, о чем свидетельствуют результаты, полученные с помощью предложенной методики.
В настоящее время не существует стандартизированного протокола получения ИСС. Результаты варьируются, так как различные факторы изменяют его морфологию и функциональность. Возраст и состояние здоровья донора, источник и условия культивирования ИСС являются одними из этих факторов. Предлагаемая методология ориентирована на стандартизацию воспроизводимой методологии, охватывающей цели различных исследований. Научное сообщество стремится найти новые терапевтические возможности для диагностики, контроля и лечения различных метаболических заболеваний, включая диабет. Поэтому раскрытие методологических процедур также актуально.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Мексиканскому институту социального обеспечения (IMSS) и Детской больнице Мексики Федерико Гомесу (HIMFG) и сотрудникам Bioterio Исследовательской координации IMSS за поддержку, оказанную для реализации этого проекта. Мы благодарим Национальный совет по науке и технологиям за стипендию AOC (815290) и Антонио Дуарте Рейеса за техническую поддержку в аудиовизуальных материалах.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
