Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley
Summary
В этом протоколе описывается методология выделения и идентификации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), полученных из жировой ткани, от крыс Sprague Dawley.
Abstract
Взрослые мезенхимальные клетки произвели революцию в молекулярной и клеточной биологии в последние десятилетия. Они могут дифференцироваться в различные специализированные типы клеток, в дополнение к их большой способности к самообновлению, миграции и пролиферации. Жировая ткань является одним из наименее инвазивных и наиболее доступных источников мезенхимальных клеток. Также сообщалось, что он имеет более высокие урожаи по сравнению с другими источниками, а также превосходные иммуномодулирующие свойства. В последнее время были опубликованы различные процедуры получения взрослых мезенхимальных клеток из разных источников тканей и видов животных. Оценив критерии некоторых авторов, мы стандартизировали методологию, которая применима к разным целям и легко воспроизводима. Пул стромально-васкулярной фракции (СВФ) из околопочечной и придатковой жировой ткани позволил разработать первичные культуры с оптимальной морфологией и функциональностью. Наблюдалось, что клетки прилипали к пластиковой поверхности в течение 24 часов и проявляли фибробластоподобную морфологию с удлинениями и тенденцией к образованию колоний. Методы проточной цитометрии (ФК) и иммунофлуоресценции (ИФ) использовались для оценки экспрессии мембранных маркеров CD105, CD9, CD63, CD31 и CD34. Способность стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ИСС), дифференцироваться в адипогенную линию также оценивалась с использованием коктейля факторов (инсулин 4 мкМ, 3-метил-изо-бутилксантин 0,5 мМ и дексаметазон 1 мкМ). Через 48 ч наблюдалась постепенная потеря морфологии фибробластоидов, а через 12 дней было подтверждено наличие липидных капель, положительных для окрашивания масла в красный цвет. Таким образом, предложена процедура получения оптимальных и функциональных культур ASC для применения в регенеративной медицине.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) оказали сильное влияние на регенеративную медицину из-за их высокой способности к самообновлению, пролиферации, миграции и дифференцировке в различные клеточные линии 1,2. В настоящее время большое количество исследований сосредоточено на их потенциале для лечения и диагностики различных заболеваний.
Существуют различные источники мезенхимальных клеток: костный мозг, скелетные мышцы, амниотическая жидкость, волосяные фолликулы, плацента и жировая ткань. Их получают от разных видов, включая людей, мышей, крыс, собак и лошадей3. МСК, полученные из костного мозга (BMSC), уже много лет используются в качестве основного источника стволовых клеток в регенеративной медицине и в качестве альтернативы использованию эмбриональных стволовых клеток4. Тем не менее, МСК, полученные из жировой ткани, или стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ASC), являются важной альтернативой с большими преимуществами из-за простоты их сбора и выделения, а также выхода клеток, полученных на грамм жировой ткани 5,6. Сообщалось, что урожайность ИСС, как правило, выше, чем у БМСК7. Первоначально было высказано предположение, что репаративная/регенеративная способность ИСС обусловлена их способностью дифференцироваться в другие клеточные линии8. Однако исследования последних лет подтвердили первостепенную роль паракринных факторов, выделяемых ИСС, в их репаративном потенциале 9,10.
Жировая ткань (АТ), помимо того, что является энергетическим резервом, взаимодействует с эндокринной, нервной и сердечно-сосудистой системами. Он также участвует в постнатальном росте и развитии, поддержании гомеостаза тканей, восстановлении и регенерации тканей. АТ состоит из адипоцитов, клеток гладких мышц сосудов, эндотелиальных клеток, фибробластов, моноцитов, макрофагов, лимфоцитов, преадипоцитов и ИСС. Последние играют важную роль в регенеративной медицине из-за их низкой иммуногенности11,12. ASC могут быть получены путем ферментативного расщепления и механической обработки или эксплантатами жировой ткани. Первичные культуры ИСС легко поддерживать, выращивать и расширять. Фенотипическая характеристика ИСС имеет важное значение для проверки идентичности клеток путем оценки экспрессии специфических мембранных маркеров с использованием таких методов, как иммунофлуоресценция и проточная цитометрия13. Международная федерация жировой терапии и науки (IFATS) и Международное общество клеточной терапии (ISCT) определили, что ASC экспрессируют CD73, CD90 и CD105, в то время как в них отсутствует экспрессия CD11b, CD14, CD19, CD45 и HLA-DR14. Таким образом, эти маркеры, как положительные, так и отрицательные, считаются надежными для характеристики ИСС.
Этот проект был сосредоточен на описании процедуры выделения и идентификации взрослых мезенхимальных клеток, извлеченных из АТ крыс, поскольку этот источник клеток не представляет этических проблем, в отличие от эмбриональных стволовых клеток. Это делает процедуру жизнеспособным вариантом из-за простоты доступа и минимально инвазивного метода по сравнению со стволовыми клетками, полученными из костного мозга.
Мезенхимальные клетки из этого тканевого источника играют важную роль в регенеративной медицине из-за их иммуномодулирующих способностей и низкого иммунного отторжения. Таким образом, настоящее исследование является фундаментальной частью будущих исследований их секретома и их применения в качестве регенеративной терапии при различных заболеваниях, включая метаболические заболевания, такие как диабет.
Protocol
Representative Results
Discussion
За последние четыре десятилетия с момента открытия МСК несколько групп исследователей описали процедуры получения МСК из разных тканей и видов. Одним из преимуществ использования крыс в качестве животной модели является простота их содержания и быстрого развития, а также легкость по?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Мексиканскому институту социального обеспечения (IMSS) и Детской больнице Мексики Федерико Гомесу (HIMFG) и сотрудникам Bioterio Исследовательской координации IMSS за поддержку, оказанную для реализации этого проекта. Мы благодарим Национальный совет по науке и технологиям за стипендию AOC (815290) и Антонио Дуарте Рейеса за техническую поддержку в аудиовизуальных материалах.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. . Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
