이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
성인 중간엽 세포는 최근 수십 년 동안 분자 및 세포 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 그들은 자가 재생, 이동 및 증식을 위한 큰 능력 외에도 다양한 특수 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 지방 조직은 중간엽 세포의 가장 침습적이지 않고 가장 접근하기 쉬운 공급원 중 하나입니다. 또한 다른 공급원에 비해 수율이 높고 면역 조절 특성이 우수한 것으로 보고되었습니다. 최근에, 상이한 조직 공급원 및 동물 종으로부터 성체 중간엽 세포를 얻기 위한 상이한 절차가 발표되었다. 일부 저자의 기준을 평가한 후 다양한 목적에 적용할 수 있고 쉽게 재현할 수 있는 방법론을 표준화했습니다. 신장 주위 및 부고환 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF) 풀을 통해 최적의 형태와 기능을 갖춘 1차 배양을 개발할 수 있었습니다. 세포는 24시간 동안 플라스틱 표면에 부착된 것으로 관찰되었으며, 연장 및 콜로니 형성 경향과 함께 섬유아세포와 유사한 형태를 나타냈습니다. 유세포 분석 (FC) 및 면역 형광 (IF) 기술을 사용하여 막 마커 CD105, CD9, CD63, CD31 및 CD34의 발현을 평가했습니다. 지방 유래 줄기 세포(ASC)가 지방 유래 계통으로 분화하는 능력은 또한 인자 칵테일(4μM 인슐린, 0.5mM 3-메틸-이소-부틸-크산틴 및 1μM 덱사메타손)을 사용하여 평가되었습니다. 48시간 후, 섬유아세포양 형태의 점진적인 손실이 관찰되었고, 12일째에 오일 레드 염색에 양성인 지질 방울의 존재가 확인되었습니다. 요약하면, 재생 의학에 적용하기 위한 최적의 기능적 ASC 배양을 얻기 위한 절차가 제안됩니다.
서론
중간엽 줄기세포(MSC)는 자가 재생, 증식, 이동 및 다른 세포 계통으로의 분화 능력이 높기 때문에 재생 의학에 큰 영향을 미쳤습니다 1,2. 현재 많은 연구가 다양한 질병의 치료 및 진단 가능성에 초점을 맞추고 있습니다.
중간엽 세포의 출처는 골수, 골격근, 양수, 모낭, 태반, 지방 조직 등 다양합니다. 그들은 인간, 생쥐, 쥐, 개, 말3을 포함한 다양한 종에서 얻습니다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSC)는 재생 의학에서 줄기세포의 주요 공급원이자 배아 줄기 세포 사용의 대안으로 수년 동안 사용되어 왔다4. 그러나 지방 유래 중간엽 줄기 세포 또는 지방 유래 줄기 세포 (ASC)는 수집 및 분리가 용이하고 지방 조직 5,6 그램 당 얻은 세포의 수율로 인해 큰 이점을 가진 중요한 대안입니다. ASCs의 수확량은 일반적으로 BMSCs의 수확량보다 높다고 보고되었다7. 처음에는 ASC의 회복/재생 능력....
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프로토콜
모든 실험 절차는 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico)의 권장 사항에 따라 멕시코 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 Instituto Mexicano del Seguro Social의 건강 연구 윤리 위원회(R-2021-785-092)에서 검토, 승인 및 등록했습니다.
1. 외과적 절제술에 의한 쥐의 지방조직 제거
- 20mL의 멸균 1x 인산염 완충 식염수-항생제 항진균제(PBS-AA) 용액(1x PBS, 겐타마이신[20μg/mL] 및 암포테리신[0.5μg/mL])으로 두 개의 원뿔형 튜브를 준비하고 얼음 위에 유지합니다.
- 건강 상태가 양호한 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐 (R. norvegicus) 두 마리를 선택합니다. 쥐가 생후 3-4개월 사이이고 코랄 무게가 350-450g인지 확인하십시오.
- 자일라진 염산염 20mg/kg으로 진정을 진행하고 5분 후 케타민 염산염 120mg/kg을 복강 주사하여 마취제를 투여합니다. 건조를 방지하기 위해 안과 용 연고로 양쪽 눈을 윤활하십시오. 그런 다음 페달 반사 부족을 통해 마취 ....
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결과
지방 조직은 생후 3-4개월의 성인 Sprague Dawley 쥐에서 얻었으며 체중은 401g± 41g(기하 평균 ± SD)입니다. 부고환 및 신장 주위 지방 조직의 평균값 3.8 g은 15 개의 실험 추출 분석에 해당한다. 배양 24시간 후, 세포 집단은 플라스틱 표면에 부착된 상태를 유지하고 이질적인 형태를 나타냈습니다. 첫 번째 계대배양은 8 ± 2일째에 실현되었으며, 총 8번의 실험에서 0.6 x 106 세포± 1.4 수율로 실현되었다. 직접 명시야 관찰(그림 1)과 헤마톡실린-에오신 염색(그림 2)은 광학 현미경으로 형태학적 특성 분석을 용이하게 했습니다. 길쭉한 연장과 풍부한 세포 내 미세 필라멘트, 중간 엽 기질 세포의 특징과 함께 광범위한 세포질이 보였습니다.
ASC는 서로 다른 하위 통로(1, 3, 7 및 9)에서 간접 면역형광에 의해 구.......
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토론
중간엽 줄기세포가 발견된 이후 지난 40년 동안 여러 그룹의 연구자들이 다양한 조직과 종에서 중간엽 줄기세포를 얻는 절차를 설명했습니다. 쥐를 동물 모델로 사용하는 장점 중 하나는 유지 관리가 쉽고 발달이 빠르며 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다. ASC를 얻기 위한 상이한 조직 공급원, 예컨대 내장, 주위지방, 부고환 및 피하 지방 12,13,14,15,16이 기재되어 있다.
여기에 사용 된 추출 절차와 관련하여 저자는 쥐의 체중이 350-450g 사이 여야하며 생후 첫 4 개월 동안 달성 할 수 있다고 권장합니다. 동물의 체중이 450-600g이고 생후 8개.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는이 프로젝트를 수행하기 위해 제공 된 지원에 대해 멕시코 사회 보장 연구소 (IMSS)와 멕시코 아동 병원, 페데리코 고메즈 (HIMFG) 및 IMSS 연구 조정의 Bioterio 직원에게 감사드립니다. AOC (815290) 장학금에 대한 국립 과학 기술위원회와 시청각 자료에 대한 기술 지원에 대해 Antonio Duarte Reyes에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| 분석 저울 | Sartorius | AX224 | |
| 항체 항 CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| 항체 항 CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| 항체 항 C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| 항체 항 Endoglin / CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | sc-18838A594 | |
| 항체 anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | sc-18916AF680 | |
| 항체 염소 anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| 항체 당나귀 anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| 항체 anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD 시스템. | No. F103B | |
| 보틀 탑 필터 멸균 | 코닝 | 10718003 | |
| 세포 및 조직 배양 플라스크 | BIOFIL | 170718-312B | |
| 세포 계수기 Bright-Line 혈구계(세포 계수 챔버 슬라이드 포함 | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell well: 뚜껑이 있는 6웰 | CORNING | 25810 | |
| 원심분리기 원추형 튜브 | HeTTICH | ROTANA460R | |
| 원심분리기 에펜도르프 튜브 | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| 배양 튜브 | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | 무료 버전 | |
| CytoFlex LX 세포분석기 | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 염료 | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| 에오신 황색 | Hycel | 300 | |
| 에탄올 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon 튜브 15mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon 튜브 50mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 소 태아 혈청 | CORNING | 35-010-CV | |
| 젤라틴, | 시그마, 알드리치 | , 128111163 | |
| 겐타마이신 | GIBCO | 15750045 | |
| 글리세린-고순도 | Herschi, 트레이딩 | 56-81-5 | |
| AMRESCO | 0701-25G | ||
| , 헤라셀, 240i, CO2 인큐베이터 | Thermo Sc. | ||
| 케타민 애완 동물 (케타민 클로 히드 레이트) | 아란다 | SV057430 | |
| L- 글루타민 | GIBCO / Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM 소프트웨어 Zen 2009 V5.5 | 무료 버전 | ||
| 생물 안전 캐비닛 클래스 II | NuAire | 12082100801 | |
| 에피 형광 현미경 | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| 도립 현미경 | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| 비 필수 아미노산 100X | GIBCO | 11140050 | |
| 마이크로 튜브 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| 마이크로 튜브 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| 마이크로 피펫 0.2-2 μ L | Finnpipette | E97743 | |
| 마이크로 피펫 2-20 μ L | Finnpipette | F54167 | |
| 마이크로 피펫 20-200 μ L | Finnpipette | G32419 | |
| 마이크로 피펫 100-1000 μ L | Finnpipette | FJ39895 | |
| 질소 탱크 액체 | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| 파라포름알데히드 | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | GIBCO/Thermo Sc. | ||
| 페트리 접시 세포 배양 | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate | Dibasic J.T Baker | 2139900 | |
| S1 피펫 필러 | Thermo Sc | 9531 | |
| 혈청 학적 피펫 5 mL | PYREX | L010005 | |
| 혈청 학적 피펫 10 mL | PYREX | L010010 | |
| 중탄산 나트륨 | J.T Baker | 144-55-8 | |
| 염화나트륨 | J.T.Baker | 15368426 | |
| 인산 나트륨 이염 기성 무수 | J.T 베이커 | 7558-79-4 | |
| 나트륨 피루브산 | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| 주사기 필터 멸균 | CORNING | 431222 | |
| 분광 광도계 | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| 역가 플레이트 쉐이커 | LAB-LINE | 1250 | |
| 트랜스퍼 피펫 | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue 돼지 | GIBCO | ||
| 트립신 | 염색 SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| 유니버설 블로킹 시약 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet' s 제약 | Q-7972-025 |
참고문헌
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J.
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재인쇄 및 허가
