Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별
Summary
이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.
Abstract
성인 중간엽 세포는 최근 수십 년 동안 분자 및 세포 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 그들은 자가 재생, 이동 및 증식을 위한 큰 능력 외에도 다양한 특수 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 지방 조직은 중간엽 세포의 가장 침습적이지 않고 가장 접근하기 쉬운 공급원 중 하나입니다. 또한 다른 공급원에 비해 수율이 높고 면역 조절 특성이 우수한 것으로 보고되었습니다. 최근에, 상이한 조직 공급원 및 동물 종으로부터 성체 중간엽 세포를 얻기 위한 상이한 절차가 발표되었다. 일부 저자의 기준을 평가한 후 다양한 목적에 적용할 수 있고 쉽게 재현할 수 있는 방법론을 표준화했습니다. 신장 주위 및 부고환 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF) 풀을 통해 최적의 형태와 기능을 갖춘 1차 배양을 개발할 수 있었습니다. 세포는 24시간 동안 플라스틱 표면에 부착된 것으로 관찰되었으며, 연장 및 콜로니 형성 경향과 함께 섬유아세포와 유사한 형태를 나타냈습니다. 유세포 분석 (FC) 및 면역 형광 (IF) 기술을 사용하여 막 마커 CD105, CD9, CD63, CD31 및 CD34의 발현을 평가했습니다. 지방 유래 줄기 세포(ASC)가 지방 유래 계통으로 분화하는 능력은 또한 인자 칵테일(4μM 인슐린, 0.5mM 3-메틸-이소-부틸-크산틴 및 1μM 덱사메타손)을 사용하여 평가되었습니다. 48시간 후, 섬유아세포양 형태의 점진적인 손실이 관찰되었고, 12일째에 오일 레드 염색에 양성인 지질 방울의 존재가 확인되었습니다. 요약하면, 재생 의학에 적용하기 위한 최적의 기능적 ASC 배양을 얻기 위한 절차가 제안됩니다.
Introduction
중간엽 줄기세포(MSC)는 자가 재생, 증식, 이동 및 다른 세포 계통으로의 분화 능력이 높기 때문에 재생 의학에 큰 영향을 미쳤습니다 1,2. 현재 많은 연구가 다양한 질병의 치료 및 진단 가능성에 초점을 맞추고 있습니다.
중간엽 세포의 출처는 골수, 골격근, 양수, 모낭, 태반, 지방 조직 등 다양합니다. 그들은 인간, 생쥐, 쥐, 개, 말3을 포함한 다양한 종에서 얻습니다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSC)는 재생 의학에서 줄기세포의 주요 공급원이자 배아 줄기 세포 사용의 대안으로 수년 동안 사용되어 왔다4. 그러나 지방 유래 중간엽 줄기 세포 또는 지방 유래 줄기 세포 (ASC)는 수집 및 분리가 용이하고 지방 조직 5,6 그램 당 얻은 세포의 수율로 인해 큰 이점을 가진 중요한 대안입니다. ASCs의 수확량은 일반적으로 BMSCs의 수확량보다 높다고 보고되었다7. 처음에는 ASC의 회복/재생 능력이 다른 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력 때문이라고 제안되었다8. 그러나 최근 몇 년 동안의 연구는 ASC가 회복 잠재력에서 방출하는 측분비 인자의 주요 역할을 강화했습니다 9,10.
지방 조직(AT)은 에너지를 비축할 뿐만 아니라 내분비계, 신경계 및 심혈관계와 상호 작용합니다. 또한 출생 후 성장 및 발달, 조직 항상성 유지, 조직 복구 및 재생에 관여합니다. AT는 지방세포, 혈관 평활근 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 단핵구, 대식세포, 림프구, 지방전구세포 및 ASC로 구성됩니다. 후자는 면역 원성이 낮기 때문에 재생 의학에서 중요한 역할을합니다11,12. ASC는 효소 분해 및 기계적 처리 또는 지방 조직 외식편에 의해 얻을 수 있습니다. ASC의 기본 문화는 유지 관리, 성장 및 확장이 쉽습니다. ASC의 표현형 특성 분석은 면역형광 및 유세포 분석과 같은 방법을 사용하여 특정 막 마커의 발현을 평가함으로써 세포의 정체성을 검증하는 데 필수적이다13. IFATS(International Federation for Adipose Therapeutics and Science)와 ISCT(International Society for Cellular Therapy)는 ASC가 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 반면 CD11b, CD14, CD19, CD45 및 HLA-DR14의 발현은 부족하다고 정의했습니다. 따라서 양성 및 음성 모두 이러한 마커는 ASC의 특성화에 신뢰할 수 있는 것으로 간주됩니다.
이 프로젝트는 쥐의 AT에서 추출한 성체 중간엽 세포의 분리 및 식별 절차를 설명하는 데 중점을 두었는데, 이 세포 공급원은 배아 줄기 세포와 달리 윤리적 문제를 나타내지 않기 때문입니다. 이것은 골수 유래 줄기 세포에 비해 접근이 용이하고 최소 침습적 방법으로 인해 실행 가능한 옵션으로 절차를 굳건히 합니다.
이 조직 공급원의 중간엽 세포는 면역 조절 능력과 낮은 면역 거부 반응으로 인해 재생 의학에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 본 연구는 그들의 세크레톰과 당뇨병과 같은 대사 질환을 포함한 다양한 질병에서 재생 요법으로서의 적용에 대한 향후 연구의 근본적인 부분입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중간엽 줄기세포가 발견된 이후 지난 40년 동안 여러 그룹의 연구자들이 다양한 조직과 종에서 중간엽 줄기세포를 얻는 절차를 설명했습니다. 쥐를 동물 모델로 사용하는 장점 중 하나는 유지 관리가 쉽고 발달이 빠르며 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다. ASC를 얻기 위한 상이한 조직 공급원, 예컨대 내장, 주위지방, 부고환 및 피하 지방 12,13,14,15,16이 기재되어 있다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로젝트를 수행하기 위해 제공 된 지원에 대해 멕시코 사회 보장 연구소 (IMSS)와 멕시코 아동 병원, 페데리코 고메즈 (HIMFG) 및 IMSS 연구 조정의 Bioterio 직원에게 감사드립니다. AOC (815290) 장학금에 대한 국립 과학 기술위원회와 시청각 자료에 대한 기술 지원에 대해 Antonio Duarte Reyes에게 감사드립니다.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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