Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley
Summary
Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.
Abstract
As células mesenquimais adultas revolucionaram a biologia molecular e celular nas últimas décadas. Podem diferenciar-se em diferentes tipos celulares especializados, além de sua grande capacidade de auto-renovação, migração e proliferação. O tecido adiposo é uma das fontes menos invasivas e mais acessíveis de células mesenquimais. Também tem sido relatado para ter rendimentos mais elevados em comparação com outras fontes, bem como propriedades imunomoduladoras superiores. Recentemente, diferentes procedimentos para obtenção de células mesenquimais adultas de diferentes fontes teciduais e espécies animais têm sido publicados. Após avaliação dos critérios de alguns autores, padronizamos uma metodologia aplicável a diferentes propósitos e facilmente reprodutível. Um pool de fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo perirrenal e epididimal nos permitiu desenvolver culturas primárias com morfologia e funcionalidade ideais. As células foram observadas aderidas à superfície plástica por 24 h e exibiram morfologia semelhante a fibroblastos, com prolongamentos e tendência a formar colônias. As técnicas de citometria de fluxo (CF) e imunofluorescência (IF) foram utilizadas para avaliar a expressão dos marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. A capacidade das células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs) de se diferenciar na linhagem adipogênica também foi avaliada usando um coquetel de fatores (4 μM de insulina, 0,5 mM de 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM de dexametasona). Após 48 h, observou-se perda gradual da morfologia fibroblastóide e, aos 12 dias, confirmou-se a presença de gotículas lipídicas positivas para coloração vermelho oleoso. Em resumo, propõe-se um procedimento para obtenção de culturas de ASC ótimas e funcionais para aplicação em medicina regenerativa.
Introduction
As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm forte impacto na medicina regenerativa devido à sua alta capacidade de auto-renovação, proliferação, migração e diferenciação em diferentes linhagens celulares 1,2. Atualmente, uma grande quantidade de pesquisas está se concentrando em seu potencial para o tratamento e diagnóstico de várias doenças.
Existem diferentes fontes de células mesenquimais: medula óssea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta, tecido adiposo, entre outros. São obtidos de diferentes espécies, incluindo humanos, camundongos, ratos, cães e cavalos3. As CTMs derivadas da medula óssea (CTMs) têm sido utilizadas há muitos anos como uma importante fonte de células-tronco na medicina regenerativa e como uma alternativa ao uso de células-tronco embrionárias4. Entretanto, as CTMs derivadas do tecido adiposo, ou células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs), são uma alternativa importante com grandes vantagens devido à facilidade de coleta e isolamento, bem como ao rendimento de células obtidas por grama de tecido adiposo 5,6. Tem sido relatado que a taxa de colheita de CTAs é geralmente maior do que a deCTMs 7. Foi inicialmente proposto que a capacidade reparadora/regenerativa das CTAs era devida à sua capacidade de se diferenciar em outras linhagens celulares8. No entanto, pesquisas nos últimos anos têm reforçado o papel primário dos fatores parácrinos liberados pelas CTAs em seu potencialreparador9,10.
O tecido adiposo (TA), além de ser uma reserva energética, interage com os sistemas endócrino, nervoso e cardiovascular. Também está envolvida no crescimento e desenvolvimento pós-natal, na manutenção da homeostase tecidual, reparo tecidual e regeneração. O TA é composto por adipócitos, células musculares lisas vasculares, células endoteliais, fibroblastos, monócitos, macrófagos, linfócitos, pré-adipócitos e ASCs. Estes últimos possuem importante papel na medicina regenerativa devido à sua baixa imunogenicidade11,12. As CTAs podem ser obtidas por digestão enzimática e processamento mecânico ou por explantes de tecido adiposo. As culturas primárias de ASCs são fáceis de manter, cultivar e expandir. A caracterização fenotípica das CTAs é essencial para verificar a identidade das células, avaliando a expressão de marcadores específicos de membrana por meio de métodos como imunofluorescência e citometria defluxo13. A International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) e a International Society for Cellular Therapy (ISCT) definiram que as CTAs expressam CD73, CD90 e CD105, enquanto não expressam CD11b, CD14, CD19, CD45 e HLA-DR14. Esses marcadores, tanto positivos quanto negativos, são, portanto, considerados confiáveis para a caracterização das CTAs.
Este projeto teve como foco descrever um procedimento para o isolamento e identificação de células mesenquimais adultas extraídas da TA de ratos, uma vez que esta fonte de células não apresenta desafios éticos, ao contrário das células-tronco embrionárias. Isso solidifica o procedimento como uma opção viável devido à facilidade de acesso e método minimamente invasivo em comparação com células-tronco derivadas da medula óssea.
As células mesenquimais dessa fonte de tecido têm um papel importante na medicina regenerativa devido à sua capacidade imunomoduladora e baixa rejeição imunológica. Portanto, o presente estudo é parte fundamental de futuras pesquisas sobre seu secretoma e sua aplicação como terapia regenerativa em diferentes doenças, incluindo doenças metabólicas como o diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nas últimas quatro décadas, desde a descoberta das CTMs, vários grupos de pesquisadores descreveram procedimentos para a obtenção de CTMs de diferentes tecidos e espécies. Uma das vantagens do uso de ratos como modelo animal é a sua fácil manutenção e rápido desenvolvimento, bem como a facilidade de obtenção de CTMs a partir do tecido adiposo. Diferentes fontes teciduais têm sido descritas para a obtenção de CTAs, como gordura visceral, perirrenal, epididimal e subcutânea12,13,14,15,16.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Instituto Mexicano de Seguridade Social (IMSS) e ao Hospital Infantil do México, Federico Gomez (HIMFG) e à equipe de Biotério da Coordenação de Pesquisa do IMSS, pelo apoio dado para a realização deste projeto. Agradecemos ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia pela bolsa AOC (815290) e a Antonio Duarte Reyes pelo apoio técnico no material audiovisual.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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