Summary
Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.
Abstract
As células mesenquimais adultas revolucionaram a biologia molecular e celular nas últimas décadas. Podem diferenciar-se em diferentes tipos celulares especializados, além de sua grande capacidade de auto-renovação, migração e proliferação. O tecido adiposo é uma das fontes menos invasivas e mais acessíveis de células mesenquimais. Também tem sido relatado para ter rendimentos mais elevados em comparação com outras fontes, bem como propriedades imunomoduladoras superiores. Recentemente, diferentes procedimentos para obtenção de células mesenquimais adultas de diferentes fontes teciduais e espécies animais têm sido publicados. Após avaliação dos critérios de alguns autores, padronizamos uma metodologia aplicável a diferentes propósitos e facilmente reprodutível. Um pool de fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo perirrenal e epididimal nos permitiu desenvolver culturas primárias com morfologia e funcionalidade ideais. As células foram observadas aderidas à superfície plástica por 24 h e exibiram morfologia semelhante a fibroblastos, com prolongamentos e tendência a formar colônias. As técnicas de citometria de fluxo (CF) e imunofluorescência (IF) foram utilizadas para avaliar a expressão dos marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. A capacidade das células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs) de se diferenciar na linhagem adipogênica também foi avaliada usando um coquetel de fatores (4 μM de insulina, 0,5 mM de 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM de dexametasona). Após 48 h, observou-se perda gradual da morfologia fibroblastóide e, aos 12 dias, confirmou-se a presença de gotículas lipídicas positivas para coloração vermelho oleoso. Em resumo, propõe-se um procedimento para obtenção de culturas de ASC ótimas e funcionais para aplicação em medicina regenerativa.
Introduction
As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm forte impacto na medicina regenerativa devido à sua alta capacidade de auto-renovação, proliferação, migração e diferenciação em diferentes linhagens celulares 1,2. Atualmente, uma grande quantidade de pesquisas está se concentrando em seu potencial para o tratamento e diagnóstico de várias doenças.
Existem diferentes fontes de células mesenquimais: medula óssea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta, tecido adiposo, entre outros. São obtidos de diferentes espécies, incluindo humanos, camundongos, ratos, cães e cavalos3. As CTMs derivadas da medula óssea (CTMs) têm sido utilizadas há muitos anos como uma importante fonte de células-tronco na medicina regenerativa e como uma alternativa ao uso de células-tronco embrionárias4. Entretanto, as CTMs derivadas do tecido adiposo, ou células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs), são uma alternativa importante com grandes vantagens devido à facilidade de coleta e isolamento, bem como ao rendimento de células obtidas por grama de tecido adiposo 5,6. Tem sido relatado que a taxa de colheita de CTAs é geralmente maior do que a deCTMs 7. Foi inicialmente proposto que a capacidade reparadora/regenerativa das CTAs era devida à sua capacidade de se diferenciar em outras linhagens celulares8. No entanto, pesquisas nos últimos anos têm reforçado o papel primário dos fatores parácrinos liberados pelas CTAs em seu potencialreparador9,10.
O tecido adiposo (TA), além de ser uma reserva energética, interage com os sistemas endócrino, nervoso e cardiovascular. Também está envolvida no crescimento e desenvolvimento pós-natal, na manutenção da homeostase tecidual, reparo tecidual e regeneração. O TA é composto por adipócitos, células musculares lisas vasculares, células endoteliais, fibroblastos, monócitos, macrófagos, linfócitos, pré-adipócitos e ASCs. Estes últimos possuem importante papel na medicina regenerativa devido à sua baixa imunogenicidade11,12. As CTAs podem ser obtidas por digestão enzimática e processamento mecânico ou por explantes de tecido adiposo. As culturas primárias de ASCs são fáceis de manter, cultivar e expandir. A caracterização fenotípica das CTAs é essencial para verificar a identidade das células, avaliando a expressão de marcadores específicos de membrana por meio de métodos como imunofluorescência e citometria defluxo13. A International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) e a International Society for Cellular Therapy (ISCT) definiram que as CTAs expressam CD73, CD90 e CD105, enquanto não expressam CD11b, CD14, CD19, CD45 e HLA-DR14. Esses marcadores, tanto positivos quanto negativos, são, portanto, considerados confiáveis para a caracterização das CTAs.
Este projeto teve como foco descrever um procedimento para o isolamento e identificação de células mesenquimais adultas extraídas da TA de ratos, uma vez que esta fonte de células não apresenta desafios éticos, ao contrário das células-tronco embrionárias. Isso solidifica o procedimento como uma opção viável devido à facilidade de acesso e método minimamente invasivo em comparação com células-tronco derivadas da medula óssea.
As células mesenquimais dessa fonte de tecido têm um papel importante na medicina regenerativa devido à sua capacidade imunomoduladora e baixa rejeição imunológica. Portanto, o presente estudo é parte fundamental de futuras pesquisas sobre seu secretoma e sua aplicação como terapia regenerativa em diferentes doenças, incluindo doenças metabólicas como o diabetes.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo as Diretrizes Mexicanas para Cuidados com Animais, baseadas nas recomendações da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, México). O protocolo foi revisado, aprovado e registrado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Saúde do Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Remoção de tecido adiposo de ratos por ressecção cirúrgica
- Preparar dois tubos cônicos com 20 mL de solução antimicótica salina-antimicótica tamponada com fosfato 1x (PBS-AA) estéril (1x PBS, gentamicina [20 μg/mL] e anfotericina [0,5 μg/mL]) e manter no gelo.
- Selecionar dois ratos Sprague Dawley machos adultos (R. norvegicus) em boas condições de saúde. Certifique-se de que os ratos têm entre 3-4 meses de idade e têm um peso coporal de 350-450 g.
- Proceder à sedação com 20 mg/kg de cloridrato de xilazina e, 5 minutos após, administrar um anestésico com uma dose de 120 mg/kg de cloridrato de quetamina por via intraperitoneal. Lubrifique ambos os olhos com uma pomada oftálmica para evitar o ressecamento. Em seguida, confirme a profundidade da anestesia através da ausência do reflexo pedal.
- Raspar e desinfetar a região abdominal e inguinal com uma solução de iodo. Aplicar campos cirúrgicos para manter a esterilidade. Em seguida, faça uma incisão longitudinal mediana do esterno até a região testicular.
- Remova o tecido adiposo ao redor do epidídimo e dos rins com pinça estéril e coloque na solução de 1x PBS-AA. Mantenha as amostras no gelo.
- Sutura da incisão fechada se necessário de acordo com as diretrizes institucionais e eutanásia dos animais com dose intracardíaca de 40 mg/kg de pentobarbital sódico. Uma vez confirmado o óbito, descarte a carcaça seguindo procedimento(s) institucional(is).
NOTA: A morte provoca mecanismos de sinalização que afetam o imunofenótipo, a capacidade de diferenciação e o efeito parácrino das células mesenquimais. Assim, a coleta de tecidos é realizada antes da eutanásia.
2. Isolamento de células mesenquimais do tecido adiposo
- Remova o tecido adiposo com pinça estéril dentro de um armário de biossegurança e coloque-o sobre papel de filtro estéril em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro para absorver o excesso de PBS.
- Transferir o tecido adiposo para outra placa de Petri e realizar três lavagens por 5 min cada com 10 mL de solução 1x PBS-AA usando uma pipeta de 10 mL.
- Desagregar mecanicamente o tecido em fragmentos de aproximadamente 1cm2 com tesoura e bisturi.
- Preparar colagenase tipo IV (0,075%) em 20 mL de meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco não suplementado. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,22 μm e manter a 37 °C.
- Adicionar a solução de colagenase (20 ml) preparada no passo 2.4 num copo de cristal com o tecido fragmentado e uma barra magnética. Selar o recipiente e incubar sob agitação lenta e contínua a 37 °C.
NOTA: A digestão enzimática leva aproximadamente 90 min (manter a agitação lenta para preservar a integridade das membranas celulares). - Filtrar o homogeneizado através de um filtro de aço inoxidável, tela de 40 mm, abertura de 0,38 mm em uma placa de Petri de 100 mm e coletar a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 50 mL.
- Adicionar 20 mL de DMEM aquecido e suplementado (10% de soro fetal bovino [SFB], 2 mM de glutamina, 2 mM de piruvato de sódio, 100x solução de aminoácidos não essenciais e 100x de solução antimicótica antimicótica [AA]). Suspender cuidadosamente a fração vascular estromal (VED).
- Centrifugar a suspensão celular a 290 x g por 10 min, descartar o sobrenadante com pipeta de 25 mL e lavar suavemente as células com 40 mL de meio DMEM não suplementado.
- Repita esta etapa. Use um novo tubo cônico estéril entre os passos para arrastar a menor quantidade de detritos celulares e gordura.
- Suspender o pellet em 5 mL de DMEM suplementado com pipeta de 5 mL e transferir para um frasco T-25 cm2 . Incubar durante 24 h a 37 °C e 5% CO2.
- No dia seguinte, realizar três lavagens com 5 mL de PBS-AA aquecido 1x e duas lavagens com DMEM não suplementado para remoção de restos celulares e células não aderentes. Adicione 5 mL de DMEM fresco, aquecido e suplementado com uma pipeta de 5 mL e troque o meio a cada 3-4 dias.
3. Manutenção e expansão das culturas primárias da ASC
- Quando as células atingirem 90%-100% de confluência (8 ± 2 dias), lavar duas vezes com 5 mL de DMEM não suplementado. Adicionar 1 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,025% aquecido a 0,025% mM e incubar por 5-7 min a 37 °C.
- Quando a monocamada celular estiver destacada, adicionar 4 mL de DMEM suplementado e desagregar suavemente a suspensão celular.
- Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, adicione 5 mL de DMEM aquecido e suplementado e suspenda suavemente para homogeneizar.
- Centrifugar a 290 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e misture suavemente o pellet em 1 mL de DMEM suplementado. Contar as células numa câmara de Neubauer após coloração com azul de Trypan.
- Por fim, semea-se 2,5 x 103 células/cm2 na proporção de 1:4 em frascos T-75. Essa etapa garante a formação de colônias e uma alta taxa de proliferação.
4. Caracterização morfológica de culturas primárias de ASC
- Observar a morfologia das CTAs sob microscopia invertida.
NOTA: Antes da montagem para identificação histológica e ASC, trate as lamínulas com uma solução de gelatina a 1%. Irradiar com UV por 15 min.- Retire as lamínulas da solução de etanol a 70% e deixe-as secar por 5 min.
- Mergulhe as lamínulas em uma solução estéril de gelatina a 1%, escorra e seque à temperatura ambiente (TR).
- Coloque cada tampa em cada poço de uma placa de 6 poços e irradie as placas com luz UV por 15 min.
- Semeando uma gota contendo 25 x 103 células no centro do poço, aguardar 1 min e adicionar 1 mL de meio DMEM suplementado. Incubar durante 96 h a 37 °C e 5% CO2.
- Retire o meio e realize três lavagens com 1x PBS-AA usando uma pipeta de transferência.
- Adicione 1 mL de formalina neutra a 3,5% em cada poço e incube por 1 h no TR. Retire cuidadosamente a formalina e adicione 1 mL de etanol 70% frio a cada poço.
- Sele a placa com parafilme até o uso, para evitar o ressecamento.
NOTA: A morfologia celular das ASCs também é avaliada pela coloração de hematoxilina-eosina durante diferentes passagens. - Retire o etanol 70% de cada poço e hidrate as células por 5 min com água destilada. Enquanto isso, filtre as soluções de coloração.
- Remover a água e manchar as células sob agitação lenta por 15 min com solução de hematoxilina de Harris.
- Retire a solução corante e realize duas lavagens com 1x PBS.
- Manchar as células com solução de eosina sob agitação lenta por 1 min. Em seguida, retire a solução e realize duas lavagens com 1x PBS.
- Remova cuidadosamente as lamínulas de cada poço e monte as lâminas em uma gota de solução de montagem PBS-glicerol (1:1 v/v).
- Coloque uma linha de verniz de unha ao redor da lamínula e observe as lâminas histológicas sob o microscópio de luz.
5. Marcadores de expressão de ASCs por imunofluorescência
- Prepare o tampão de lavagem contendo 1x PBS-0,05% Tween 20. Realizar as lavagens em RT e com agitação lenta. Lavar as placas três vezes com 2 mL de tampão/poço (incubar por 3 min para cada lavagem).
- Colocar 1 mL de reagente bloqueador (1:10) e incubar com agitação lenta por 20 min.
- Adicionar 200 μL (diluição 1:50) dos seguintes anticorpos primários a cada poço: CD9 (camundongo monoclonal), CD34 (coelho policlonal) e anti-CD63 (cabra policlonal). Incubar durante a noite a 4 °C.
- Lavar novamente as placas três vezes e incubar com 200 μL (diluição 1:50) dos seguintes anticorpos secundários: cabra conjugada IgG FITC anti rato, IgG IgG DyeLight 550 anticabra e IgG Cy3 anti-coelho de cabra.
- Lavar três vezes com 1x PBS-0,05% Tween 20 e contra-corar os núcleos celulares com 100 μL de DRAQ-7 (diluição: 17 μL em 1 mL de água bidestilada) por 20 min.
- Lave mais três vezes e monte as lâminas de acordo com os passos 4.1.12-4.1.13. Conservar as amostras protegidas da luz e congeladas até à utilização.
- Visualize as amostras sob microscopia confocal de epifluorescência utilizando as configurações e softwares adequados recomendados para este equipamento.
6. Marcadores de expressão de CTAs por citometria de fluxo
- Ajustar uma suspensão de célula única de células tripsinizadas ou descongeladas (subpassagens 3 ou 4) a uma concentração de 1 x 106 células/mL de 1x PBS-5% FBS. Alíquota 100 μL com 100.000 células em tubos centrífugos de 1,5 mL. Use uma alíquota sem etiquetagem para o controle de autofluorescência.
- Adicione ao repouso todas as quantidades adequadas de Anti-CD105 AF-594 e Anti-CD31 AF-680, de acordo com as instruções do fabricante. Incubar no escuro durante 20 minutos a 4 °C.
- Lavar o excesso de coloração com 1 mL de 1x PBS-5% FBS por centrifugação a 250 x g por 5 min e suspender em 300 μL de formalina a 1%.
- Realizar a aquisição da amostra em citômetro de fluxo. A estratégia de gating das células é baseada em FSC-A vs. SSC-A gating, células únicas fechadas usando SSC-H vs. SSC-A seguido por FSC-A vs. FSC-H.
- Use o detector Y610-mCherry-A para CD105 AF-594 e o detector R660-APC-A para CD31 AF-680.
7. Diferenciação das CTAs para a linhagem adipogênica
- Em uma placa de 6 poços, semeie 1 x 10 4 células (P-4) por cm 2 e incube a 37 °C, 5% CO2, até 60-80% de confluência (~72-96 h). Induzir diferenciação, aplicando diretamente ao meio de cultura: 4 μM de insulina, 1 μM de 21-acetato de dexametasona (Dxa) e 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Troque o meio de diferenciação a cada 2-3 dias.
- Preparar uma solução-mãe de 800 μM de insulina em 2 ml de água ultrapura estéril (adicionar 20 μL de HCl 1 N para garantir a dissolução completa) e conservar a -20 °C. Adicionar 10 μL de estoque de insulina, previamente diluído 1:100, e aplicar 10 μL em um volume final de 2 mL por poço.
- Preparar uma solução-mãe de 1 mM Dxa em 5 ml de água ultrapura estéril (note que não ocorre dissolução total). Conservar a 4 °C. Adicionar 40 μL/poço de uma diluição 1:4 do caldo de Dxa.
- Preparar um estoque de 100 mM de MIX em 2,5 mL de NaOH 0,1 N, vórtice, e adicionar 40 μL de NaOH 1 N para dissolução completa. Conservar a -70 °C. Adicionar 10 μL/poço de caldo MIX.
- Filtrar as soluções-mãe através de um filtro de seringa estéril de 0,22 μm antes do armazenamento.
- No dia 12, lavar as células três vezes com 1x PBS e incubar com 500 μL de formalina a 4% por 1 h em RT. Lave cada poço duas vezes com água destilada seguida, com isopropanol a 60% por 5 min e deixe secar.
- Adicionar 0,5% de óleo vermelho O diluído em isopropanol a 60% (500 μL/poço) e incubar por 20 min em TR. Lavar com 1 mL de água destilada três vezes e observar em microscópio invertido.
NOTA: Para reagentes, equipamentos e materiais necessários, consulte a Tabela de Materiais.
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Representative Results
O tecido adiposo foi obtido de ratos adultos da raça Sprague Dawley, com idade entre 3 e 4 meses de idade e peso corporal de 401 ± 41 g (média geométrica ± DP). O valor médio de 3,8 g de tecido adiposo epididimal e perirrenal correspondeu à análise de 15 extrações experimentais. Após 24 h de cultivo, as populações celulares permaneceram aderidas à superfície plástica e exibiram morfologia heterogênea. A primeira passagem foi realizada aos 8 ± 2 dias, com rendimento de 1,4 ± 0,6 x10,6 células em um total de oito experimentos. A observação direta de campo claro (Figura 1) e a coloração pela hematoxilina-eosina (Figura 2) facilitaram a caracterização morfológica com microscopia óptica. Um extenso citoplasma era visível com prolongamentos alongados e microfilamentos intracelulares abundantes, uma característica das células estromais mesenquimais.
As CSA expressaram marcadores de superfície especificamente visualizados por imunofluorescência indireta em diferentes subpassagens (1, 3, 7 e 9) (Figura 3). As CTAs foram 100% positivas para marcadores de superfície CD9 em todas as subpassagens testadas. A porcentagem é o número de células positivas em relação ao número de células totais contadas em cinco micrografias tomadas aleatoriamente. As células (100%) expressaram marcadores CD63 nas subpassagens 1, 3 e 9 (P-1, P-3, P-9), enquanto 49,3% expressaram em P-7. O marcador CD34 foi negativo nas passagens 1, 7 e 9, mas resultados positivos de marcação foram observados na passagem 3. Além disso, a imunofenotipagem por FCM mostrou que 98,7% da população celular foi positiva para CD105, enquanto apenas 5,88% expressaram o marcador CD31 (Figura 4).
Finalmente, as CTAs expostas a um coquetel de fatores de diferenciação por 12 dias mostraram sua capacidade de diferenciação em relação à linhagem adipogênica (Figura 5). Após 48 h, observamos as primeiras mudanças na morfologia; As células diminuíram de tamanho e exibiram uma forma arredondada. Após 7 dias, vesículas lipídicas estavam visíveis, as quais foram positivas para coloração vermelho oleoso 12 dias após a diferenciação.
Figura 1: Fração vascular estromal (FVS) extraída do tecido adiposo de ratos e digerida com colagenase a 0,075% (24 h). (A) FVS (20x). (B) FVS após cinco lavagens (10x). As células aderidas à superfície plástica exibem morfologia heterogênea: arredondadas, estreladas e fibroblastóides (microscópio invertido). A barra de escala representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização morfológica pela coloração hematoxilina-eosina. (A) ASCs, P-1 (10x). (B) ASCs, P-1, (C) P-3 e (D) P-9 (100x). A barra de escala representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação de diferentes marcadores de expressão de CTAs e exossomos por FI. Eixo X: passagens 1, 3, 7 e 9. Eixo Y: CD9: cabra conjugada IgG FITC anti ratinho; CD63: cabra anti coelho IgG Cy3; e CD34: burro anticabra IgG DyeLight 550. Núcleos corados em azul com DraQ7 (aumento de 40x, zoom de 1x). A barra de escala representa 100 μm em cada painel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Identificação da ASC por citometria de fluxo. (A-C) Amostras selecionadas com base no FSC-A vs. SSC-A gating, células únicas fechadas usando SSC-H vs. SSC-A seguido por FSC-A vs. FSC-H. (D,E) Controle de autofluorescência (células não marcadas). (F,G) ASCs marcadas com anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; marcador positivo) e anti-CD31 AF-680 (detector R660-APC-A; marcador negativo), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação funcional das células estromais mesenquimais do tecido adiposo de ratos. (A) Controle (10x). (B) Diferenciação adipogênica 10x, (C) 20x e (D) 40x. Gotículas lipídicas intracitoplasmáticas positivas para corante vermelho oleoso aos 12 dias de indução (microscopia de contraste de fase). A barra de escala representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nas últimas quatro décadas, desde a descoberta das CTMs, vários grupos de pesquisadores descreveram procedimentos para a obtenção de CTMs de diferentes tecidos e espécies. Uma das vantagens do uso de ratos como modelo animal é a sua fácil manutenção e rápido desenvolvimento, bem como a facilidade de obtenção de CTMs a partir do tecido adiposo. Diferentes fontes teciduais têm sido descritas para a obtenção de CTAs, como gordura visceral, perirrenal, epididimal e subcutânea12,13,14,15,16.
Em relação ao procedimento de extração aqui empregado, os autores recomendam que os ratos pesem entre 350-450 g, alcançáveis nos primeiros 4 meses de vida. Quando os animais pesavam entre 450-600 g e tinham até 8 meses de idade, a quantidade de tecido adiposo por rato (5,5 ± 2,1; média ± DP) foi maior; no entanto, o número de CTAs não aumentou proporcionalmente (dados não mostrados). Essas observações estão em correspondência com as de González3, que também referiu populações com maior viabilidade e adesividade à superfície de cultura obtida do tecido subcutâneo, quando comparadas a outras fontes. Por outro lado, as CTMs provenientes da ressecção por biópsia apresentam maior viabilidade, frequência e capacidade replicativa quando comparadas àquelas obtidas por lipoaspiração7. No presente estudo, o tecido subcutâneo dos ratos nas idades estudadas foi muito escasso. Decidimos, portanto, remover o tecido adiposo adjacente ao epidídimo e a área perirrenal, que estão envolvidos na síntese e secreção de adipocinas relevantes para a regulação de glicose e lipídios, bem como inflamação16, por ressecção cirúrgica.
Os protocolos atuais para o isolamento das CTMs derivadas do tecido adiposo baseiam-se em procedimentos de processamento livre de enzimas, como a cultura de explantes17, bem como o uso de tratamentos enzimáticos para alcançar desagregação tecidual próxima da total18. O procedimento proposto é relativamente simples e inclui desagregação mecânica, desagregação enzimática e lavagens sucessivas para a suspensão celular. Este último é realizado para remover o maior número possível de células não relacionadas das células progenitoras e, assim, obter expressão mínima (<5%) de seus marcadores de superfície. Curiosamente, as quantidades de FVA a serem obtidas podem depender do tipo de colagenase utilizada na desagregação enzimática do tecido adiposo. A colagenase tipo I é altamente recomendada para o isolamento de adipócitos, embora o uso do tipoII19 e do tipo VIII também seja relatado20,21. No presente trabalho, utilizamos colagenase tipo IV, com baixa atividade enzimática, usualmente utilizada para processar o tecido pancreático. Assim, obtém-se menor rendimento de ASCs, mas também menor dano à membrana. Isso pode modificar a expressão de alguns marcadores de superfície e, portanto, sua funcionalidade. Por outro lado, a baixa parcelamento utilizada na expansão da cultura permitiu a formação de colônias e maior capacidade proliferativa.
De acordo com a morfologia, existem três tipos principais de células mesenquimais: células pequenas, células alongadas e células grandes, achatadas, com núcleos grandes que demoram a se multiplicar. Essas formas provavelmente estão relacionadas a qualidades intrínsecas, como seu potencial dediferenciação22. A morfologia observada nas culturas primárias de CTAs é consistente com os resultados relatados por esses autores. Um número abundante de microfilamentos no citoplasma também foi visível em todos os estádios avaliados, o que corrobora a morfologia fibroblastóide das CTAs obtidas no estudo23,24,25. Além disso, a imunofenotipagem é necessária para confirmar a natureza mesenquimal das células isoladas. O ISCT e o IFATS recomendam o uso de alguns marcadores, embora outras alternativas também sejam possíveis. Sabe-se que as CTMs podem produzir grandes quantidades de exossomos26, que são pequenas vesículas secretadas para o meio extracelular com um determinado conteúdo proteico. Por sua origem endossômica, contêm proteínas de fusão e transporte de membrana (GTPases, anexinas e flotillina), tetraspaninas (CD9, CD63, CD81, CD82), entre outras, também expressas na superfície das células de onde se originam17,18. Uma limitação deste estudo é que um amplo painel de marcadores não é avaliado. No entanto, aceita-se o uso de pelo menos dois marcadores positivos e negativos no mesmo teste.
Neste trabalho, a imunofluorescência indireta com marcadores exossômicos revelou sinal positivo de ASCs para CD9 e CD63 nas subpassagens 1, 3, 7 e 9. Como o sinal observado na passagem 7 foi fraco, seria importante utilizar os marcadores recomendados pela ISCT e pela RIFI para obter melhores resultados. CD34 é um antígeno de superfície reconhecido como marcador de células endoteliais e hematopoiéticas e um marcador positivo de células derivadas da FAV do tecido adiposo. Entretanto, sua expressão em ASCs nativas correlaciona-se negativamente com a expansão celular in vitro27. A porcentagem de células CD34+ depende do método de coleta de tecido adiposo, do grau de hemorragia vascular e das técnicas subsequentes de digestão e isolamento. Embora as CTAs expressem consistentemente diferentes marcadores, sua dinâmica tem se modificado durante a expansão in vitro 28,29, como evidenciado pelos resultados obtidos com a metodologia proposta.
Atualmente, não existe um protocolo padronizado para a obtenção das CTAs. Os resultados são variáveis, uma vez que diferentes fatores modificam sua morfologia e funcionalidade. A idade e o estado de saúde do doador, a fonte e as condições de cultura das CTAs são alguns desses fatores. A metodologia proposta está focada na padronização de uma metodologia reprodutível que contemple os propósitos de diversas investigações. A comunidade científica está se esforçando para encontrar novas opções terapêuticas para o diagnóstico, controle e tratamento de várias doenças metabólicas, incluindo o diabetes. Portanto, a divulgação de procedimentos metodológicos também é relevante.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Instituto Mexicano de Seguridade Social (IMSS) e ao Hospital Infantil do México, Federico Gomez (HIMFG) e à equipe de Biotério da Coordenação de Pesquisa do IMSS, pelo apoio dado para a realização deste projeto. Agradecemos ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia pela bolsa AOC (815290) e a Antonio Duarte Reyes pelo apoio técnico no material audiovisual.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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