スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud,Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI,Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science,Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations,Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)
Summary
このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。
Abstract
成体間葉系細胞は、ここ数十年で分子生物学と細胞生物学に革命をもたらしました。それらは、自己複製、遊走、および増殖のための優れた能力に加えて、異なる特殊な細胞型に分化することができます。脂肪組織は、間葉系細胞の最も侵襲性が低く、最もアクセスしやすい供給源の1つです。また、他の供給源と比較して高い収率、および優れた免疫調節特性を有することが報告されている。最近、異なる組織源および動物種から成体間葉系細胞を得るための異なる手順が公開されている。一部の著者の基準を評価した後、さまざまな目的に適用でき、簡単に再現できる方法論を標準化しました。腎周囲脂肪組織および精巣上体脂肪組織からの間質血管画分(SVF)のプールにより、最適な形態と機能を備えた初代培養を開発することができました。細胞は24時間プラスチック表面に接着して観察され、線維芽細胞様の形態を示し、延長およびコロニーを形成する傾向を示した。フローサイトメトリー(FC)および免疫蛍光(IF)技術を用いて、膜マーカーCD105、CD9、CD63、CD31、およびCD34の発現を評価しました。脂肪由来幹細胞(ASC)が脂肪生成系統に分化する能力も、因子(4 μMインスリン、0.5 mM 3-メチル-イソ-ブチル-キサンチン、および1 μMデキサメタゾン)のカクテルを使用して評価されました。48時間後、線維芽細胞様形態の漸進的な消失が観察され、12日目にオイルレッド染色陽性の脂肪滴の存在が確認された。要約すると、再生医療への応用に最適で機能的なASC培養物を得るための手順が提案されています。
Introduction
間葉系幹細胞(MSC)は、自己複製、増殖、遊走、および異なる細胞系譜への分化能力が高いため、再生医療に大きな影響を与えています1,2。現在、さまざまな病気の治療と診断の可能性に焦点を当てた多くの研究が行われています。
間葉系細胞には、骨髄、骨格筋、羊水、毛包、胎盤、脂肪組織など、さまざまな供給源があります。それらは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマなどのさまざまな種から得られます3。骨髄由来MSC(BMSC)は、再生医療における幹細胞の主要な供給源として、また胚性幹細胞の使用に代わるものとして長年使用されてきました4。しかしながら、脂肪由来MSC、または脂肪由来幹細胞(ASC)は、それらの収集および単離の容易さ、ならびに脂肪組織のグラム当たりに得られる細胞の収量のために大きな利点を有する重要な代替物である5,6。ASCの収穫率は一般的にBMSCよりも高いことが報告されています7。当初、ASCの修復/再生能力は、他の細胞系譜に分化する能力によるものであると提案されました8。しかし、近年の研究により、ASCによって放出されるパラクリン因子の修復可能性における主要な役割が強化されています9,10。
脂肪組織(AT)は、エネルギー貯蔵量であることに加えて、内分泌系、神経系、および心血管系と相互作用します。また、出生後の成長と発達、組織の恒常性の維持、組織の修復、および再生にも関与しています。ATは、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、単球、マクロファージ、リンパ球、前駆脂肪細胞、およびASCで構成されています。後者は免疫原性が低いため、再生医療において重要な役割を果たしています11,12。ASCは、酵素消化および機械的処理によって、または脂肪組織外植片によって得ることができる。ASCの初代培養は、維持、成長、および拡張が容易です。ASCの表現型の特徴付けは、免疫蛍光法やフローサイトメトリーなどの方法を用いて特異的膜マーカーの発現を評価することにより、細胞の同一性を検証するために不可欠です13。国際脂肪治療科学連盟(IFATS)と国際細胞治療学会(ISCT)は、ASCがCD73、CD90、およびCD105を発現する一方で、CD11b、CD14、CD19、CD45、およびHLA-DR14の発現を欠くと定義しています。したがって、これらのマーカーは、ポジティブとネガティブの両方で、ASCの特性評価に信頼できると見なされます。
このプロジェクトは、ラットのATから抽出された成体間葉系細胞の単離と同定の手順を説明することに焦点を当てていましたが、この細胞源は胚性幹細胞とは異なり、倫理的な課題を提示しません。これは、骨髄由来幹細胞と比較してアクセスが容易で低侵襲な方法であるため、実行可能な選択肢として手順を固めます。
この組織源から得られる間葉系細胞は、その免疫調節能力と低い免疫拒絶反応のために、再生医療において重要な役割を果たしています。したがって、本研究は、それらのセクレトームと、糖尿病などの代謝性疾患を含むさまざまな疾患における再生医療としての応用に関する将来の研究の基本的な部分です。
Protocol
すべての実験手順は、実験動物ケア国際評価認定協会(Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999、メキシコ)の勧告に基づいて、動物ケアに関するメキシコのガイドラインに従って実施されました。プロトコルは、メキシカーノデルセグロ社会研究所の健康研究のための倫理委員会によってレビュー、承認、および登録されました(R-2021-785-092)。 1. 外科的切除によるラットからの?…
Representative Results
脂肪組織は、生後3〜4ヶ月齢で体重401±41g(幾何平均±SD)の成体Sprague Dawleyラットから得られた。精巣上体脂肪組織および腎周囲脂肪組織の平均値3.8gは、15回の実験的抽出の分析に対応していた。24時間の培養後、細胞集団はプラスチック表面に付着したままであり、不均一な形態を示した。最初の継代は8±2日目に実現され、合計8回の実験で1.4±0.6 x 106 細胞の収量が得られました。明視?…
Discussion
間葉系幹細胞の発見から過去40年間、いくつかの研究者グループが、さまざまな組織や種から間葉系幹細胞を取得するための手順を説明してきました。ラットを動物モデルとして使用する利点の1つは、その容易な維持および迅速な発生、ならびに脂肪組織からのMSCの入手の容易さである。ASCを得るために、内臓脂肪、腎周囲脂肪、精巣上体脂肪、および皮下脂肪などの異なる組織源が記載さ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、メキシコ社会保障研究所(IMSS)とメキシコ小児病院、フェデリコ・ゴメス(HIMFG)、およびIMSS研究調整のBioterioスタッフに、このプロジェクトを実施するために与えられた支援に感謝しています。AOC(815290)奨学金を提供してくれた全米科学技術評議会と、視聴覚資料の技術サポートを提供してくれたアントニオドゥアルテレイエスに感謝します。
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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Keywords:
Mesenchymal Stem CellsAdipose-derived Mesenchymal Stem CellsSprague Dawley RatsCellular CommunicationParacrine FunctionPancreatic RegenerationDiabetesCell TherapiesSecretomeMiRNAsOxidative StressCell DifferentiationSelf-renewalMigrationProliferationStromal Vascular FractionFlow CytometryImmunofluorescence
Cite This Article
Oliva Cárdenas, A., Zamora-Rodríguez, B. C., Batalla-García, K. A., Ávalos-Rodríguez, A., Contreras-Ramos, A., Ortega-Camarillo, C. Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats. J. Vis. Exp. (194), e65172, doi:10.3791/65172 (2023).